Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Hoidon epäonnistuminen suun levyepiteelisyöpä (OSCC) johtaa paikallisen uusiutumisen (t) ja etäpesäkkeitä johtuu pääasiassa lääkeresistenssin. Syöpä kantasolut (CSCS) arvellaan olevan vastuussa lääkeresistenssin kehittymisen. Kuitenkin korrelaatiot CSCS, lääkeresistenssin ja uusi strategia huumeiden resistenssin OSCC jäädä hämäräksi.

Methods

lääkeresistenttiä pallo (DRSP) malli synnytettiin käyttäen takertumattomana kulttuuri järjestelmä aiheuttaa lääkeresistenttiä soluja SCC25 suun syöpäsoluja. Vertaileva analyysi tehtiin välillä vanhemman ohjaus soluja ja DRSPs siihen liittyvän hoidon strategia keskittyy ilmaus epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) -associated markkereita, lääkeresistenssideterminantit liittyviä geenejä, ja CSC ominaisuudet

in vitro

sekä tuumorigeenisyyteen ja hoito kasvaimen regressio

in vivo

.

tulokset

Tuloksemme osoittavat, että läsnä on ilmiö EMT asteittain solujen siirtymistä koskevat epithelioid että mesenkymaaliset kaltaisia ​​sferoidiviljelmiä morfologia induktion aikana lääkeresistenssin. Luonnehdinta DRSPs paljasti ylösajon lääkeaineen vastustuskykyyn liittyviä geenejä

ABCG2

ja

MDR-1

ja CSC-edustajan markkereita, mikä viittaa siihen, että DRSPs sietävät paremmin sisplatiini (cis) ja vahvempi CSC ominaisuuksia kontrolliin verrattuna. Lisäksi yli-ilmentyminen fosforyloidun lämpöisku- proteiini 27 (p-Hsp27) aktivaation kautta p38 MAPK signaloinnin havaittiin DRSPs. Knockdovvn Hsp27 laski Cis kestävyys ja indusoi apoptoosin DRSPs. Lisäksi estäjä Hsp27, quercetin (Qu), tukahdutti p-Hsp27 ilmaisua, jossa korjauksilla EMT allekirjoituksen, joka johtaa edistämiseen apoptoosin DRSPs. Ksenografisen Tutkimus vahvisti myös kasvua kasvaimien in DRSPs. Yhdistelmä Qu ja Cis voi vähentää kasvaimen kasvua ja vähentää lääkeresistenssin OSCC.

Johtopäätökset

p38 MAPK-Hsp27 akseli on tärkeä rooli CSCS välittämää lääkeresistenssin OSCC. Kohdistaminen tämän akselin avulla Qu yhdistetään cis voi olla hoidon strategia parantaa ennustetta potilaille, joilla on OSCC.

Citation: Chen S-F, Nieh S, Jao S-W, Liu C-L, Wu C-H, Chang Y-C, et al. (2012) Quercetin vaimentaa lääkeresistenttiä Kuulat kautta p38 MAPK-Hsp27 Apoptotic Pathway in Oral Cancer Cells. PLoS ONE 7 (11): e49275. doi: 10,1371 /journal.pone.0049275

Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 08 lokakuu 2012; Julkaistu: 12 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain tukee Tri-Service General Hospital ja maanpuolustus Medical Centre: Grant No. TSGH-C101-076; Department of Dental Hygiene, Kiina Medical University: Grant No. CMU99-N1-04-1; National Science Council, Kiina (Taiwan): myöntää No. NSC-98-2314-B-016-019-MY3, NSC 99-2320-B-039-028-MY3 ja NSC 100-2320-B-016- 009; Department of Health, Executive Yuan, Kiina (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) on yksi yleisimmistä ja tappava pään ja kaulan pahanlaatuisia kasvaimia Taiwanissa ja maailmanlaajuisesti [1], [2]. Nykyiset hoidot suun syöpä on rajoitettu teho ehkäistä kasvaimen uusiutumisen ja etenemiseen, ja merkittävä osa potilaista kehittää paikallista invaasiota ja etäpesäkkeiden [3]. Ennuste potilaiden suun kautta syöpä on suhteellisen huono vaikka viime aikoina terapeuttinen edistysaskeleet [4]. Sisplatiini (cis) -pohjaisen kemoterapia on tärkein hoito potilailla, joilla on edennyt suun syöpä ja sitä käytetään ainakin lievittävän tarkoituksiin. Teho kuitenkin kemoterapia on rajallinen, koska

de novo

lääkeresistenssin. Siksi on tärkeää valaista mekanismeista sovittelu chemoresistance ja kehittää uusi strategia hoitoon OSCC.

käsite syövän kantasoluja (CSCS) ehdotettiin vuosikymmeniä sitten perustuu yhtäläisyyksiä syöpäsoluja ja normaaleja kantasoluja [5]. Olemassaolo CSCS ensimmäisen tunnettu yhteydessä leukemia [6]. CSC: n hypoteesi ehdottaa, että kasvaimet käsittävät pienen populaation soluja, joilla on kasvain muodostava ja uudistuva kyvyt [7]. Kertyvät todisteet osoittivat, että CSCS ei vain voi johtaa syöpään uusiutumisen ja etäpesäkkeiden, mutta ne myös osaltaan vastus kasvainten kemoterapiaan [8].

ABCG2 on tunnetuin geeni ja ilmaistaan ​​monenlaisia kantasolujen, joka on toiminut markkerina kantasolujen eri lähteistä [9], [10]. MDR1 ilmentyminen on myös raportoitu erilaisten solunsalpaajaresistentti kasvainten fenotyyppien [11], [12]. Useita mekanismeja on ehdotettu sisplatiinin resistenssin äskettäin [13], [14], joka perustuu siihen, että sisplatiini toimii useita solukohteita, jotka edustavat erilaisia ​​signaalitransduktioreittejä [13]. Yksi tärkeimmistä mekanismeista muu kuin sääntelyyn

ABCG2

ja

MDR-1

yhdessä vastustuskykyä sisplatiinin vähenee kertymiseen solun heikentyneen lääkkeen ottamisesta joihin ylläpitoon kuparin homeostaasin kuten ihmisen kupari transporter 1 ja kaksi kupari efflux kuljettajat ATP7A ja ATP7B jotka säätelevät ulosvirtaus sisplatiinin [15] – [17].

huolimatta yhteys induktio CSCS kasvainsoluissa ja hankinta lääkeresistenssin ja toistumisen kasvaimia, mekanismin taustalla näiden ilmiöiden edelleen suurelta osin tuntemattomia.

Lämpöä sokki proteiineja (Hsp) ovat yleensä aiheuttama ympäristön kuormitus ja toimivat molekyyli saattajia, jotka ovat vastuussa siitä, että oikean konformaation muiden proteiinien . HSP: t luokitellaan korkean molekyylipainon Hsp, kuten Hsp90 ja Hsp70, ja alhaisen molekyylipainon Hsp, kuten Hsp27 [18]. Sen lisäksi tavanomaisia ​​toimivat kaperonia, Hsp27 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt rinta-, munasarja-, ja pään ja kaulan alueen syövissä [19] – [21]. Ilmaisu on Hsp27 on yhteydessä huonoon ennusteet ja eloonjäämisluvut potilailla, joilla eri syöpiä. Lisäksi Hsp27: n on osoitettu liittyvän chemoresistance ja induktio syöpäsolujen joissa kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia rintasyövän ja monien muiden pahanlaatuisten kasvainten. Kuitenkin raportit osallistumista Hsp27 vuonna lääkeresistenssin ja ennusteen, OSCC ovat rajalliset. Quercetin (Qu) on pääasiallinen flavonoidiyhdisteen (3,30,40,5,7-penta-hydroksi-flavanonia) yleisesti uutettu karpalot, mustikat, omenat, ja sipulia. Sillä on laaja kirjo bio-farmakologisia ominaisuuksia [22] ja voi tarjota uusia lupaavia vaihtoehtoja kehitettäessä toimivia chemopreventive ja kemoterapia-strategioita, koska se on voimakas antioksidantti ja vapaiden radikaalien-puhdistusjärjestelmä ominaisuuksia [23]. Aiempi raportti paljasti myös, että Qu on rooli estäjänä Hsp synteesin ja on suojaavia vaikutuksia hiiren maksavaurion solun homeostaasin [24]. Kuitenkin yksityiskohdat suhdetta Qu ja Hsp27 koskien niiden osallistumista lääkeresistenssin syövän tarvitsevat lisätutkimuksia.

Ryhmämme aiemmin perustettu uusi takertumattomana pallo kulttuuri, joka antoi meille mahdollisuuden puhdistaa ja rikastaa asukkaan OSCC solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [25]. Täällä me käytti tätä vakiintunut kulttuurin järjestelmä tutkimaan vastus suun syövän cis ja sen taustalla molekyylitason mekanismi. Perustuen perustamisesta lääkkeille vastustuskykyisten palloja (DRSPs), jonka tavoitteena on nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli vahvistaa mahdollista roolia Hsp27 ja siihen liittyvän signalointireitille moduloinnissa apoptoosin. Lisäksi päätimme yhdistelmä Qu ja Cis mahdollisena terapeuttisena aineena tutkia, kuinka Qu vuorovaikutuksessa Hsp27 ja taustalla oleva mekanismi tehokas Qu välittämää tukahduttaminen chemoresistance ja kasvaimen kasvua OSCC. Tämä tutkimus voi antaa käsityksen lääkeresistenssin ja uusien hoitostrategioiden vastaan ​​lääkeresistenssi, joita voitaisiin käyttää parantamaan ennustetta ja eloonjäämisen potilailla, joilla OSCC.

Methods

Solun ja Sphere Culture

ihmisen kielen syövän solulinja SCC25, saatiin ATCC: stä (ATCC-numero: CRL-1628) viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2. Kennon viljeltiin kulttuuri muovi tavarat kanssa takertumattomana pintaan. 10 cm malja on valmistettu takertumattomana soluille päällystämällä agaroosilla ohutkalvojen. Solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 elävää solua /10 cm malja, ja viljelyalusta vaihdettiin joka toinen päivä, kunnes pallo muodostumista, kuten nähdään edellisessä raportoitu [25].

induktio Drug Resistance solut

SCC25 vanhempien solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 elävää solua /10 cm malja, jatkoi käsittele cis lisättiin loppupitoisuuksiin (1, 5, 10, 20, ja 30 uM) kolmen kuukauteen vuoksi. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja säilyttää alhainen pitoisuus cis (0,5 uM) viljelyalustan ja viljelyväliaine vaihdettiin joka toinen päivä.

elinkykyyn Analysis

cis lisättiin annosnopeuden (5, 10, 20, ja 30 uM). Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 per kuoppa väliaineessa, hoidon jälkeen Cis 48 tuntia, ja analysoitiin MTT-määritystä (Sigma-Aldrich).

RNA-interferenssi

siRNA oligonukleotidin Hsp27 koostui kolmesta tavoitteiden erityistä siRNA suunniteltu pudotus geeniekspressiota. Sekvenssi kolme tavoitteita osoitti alla: sc-29350A: sense: 5’GAGUGGUCGCAGUGGUUAGtt -3 ’; antisense: 5’-CUAACCACUGCGACCACUCtt-3 ’); sc-29350B: sense: GACGAGCUGACGGUCAAGAtt; antisense: UCUUGACCGUCAGCUCGUCtt; sc-29350C: Sense: CCACGCAGUCCAACGAGAUtt; Antisense: AUCUCGUUGGACUGCGUGGtt tai negatiivinen kontrolli siRNA Oligojen ostettiin Santa Cruz Biotechnologies, Inc. 2 x 10

6-solut transfektoitiin lopulliseen pitoisuuteen (100 nM) Hsp27 siRNA käyttäen Lipofectamine 2000: ssa 48 tuntia havaita proteiinin tasolla. Solut, jotka transfektoitiin ei-spesifisiä siRNA (mock ryhmä) rinnakkaisuuden osoitettu.

Western blot -analyysi

Koko solulysaatit erotettiin elektroforeesilla 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvo. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa huoneen lämpötilassa 1 tunti. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin: Hsp27 (Santa Cruz, sc-1049; 1:1000) GAPDH (ab9482; 1:5000 laimennos) (Abcam, Cambridge, MA, USA), Oct-3/4 (sc-8630; 1: 1000), Nanog (sc-81961; 1:1000), Sox2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), ATP-sitova kasetti alaryhmä G osa 2 (ABCG2) (sc-8630; 1: 1000), MDR-1 (sc-8630, 1:1000), p38MAPK (sc-8630, 1:1000), pp38MAPK (sc-8630, 1:1000), capase-3 (sc-8630; 1:1000) ja PARP (sc-81961; 1:1000) TBST-puskurissa, joka sisälsi 3% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa yön yli ja sen jälkeen anti-hiiri- ja anti-vuohi-sekundäärinen vasta-aine, joka oli konjugoitu peroksidaasiin (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) 25 ° C: ssa 1 h. Immunoblottauksia kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin järjestelmä, ja luminesenssi tehtiin näkyväksi röntgenfilmille.

In vivo

Kasvaimia synnyttävä Pitoisuus

in vivo

tuumorigeenisyystesti tutkimus suoritettiin seuraava paikallinen eettinen komitea ohjeita, jotka oli täydellistä hyväksyntää myöntämiä Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care National Defense Medical Center. Hiiriä pidettiin 18-26 ° C: ssa, 30-70% kosteus, ja itsenäisesti ilmastoitu alle 12 h pimeä /12 tunnin valo sykli 7 päivää ennen ksenograftin injektiota. Vanhempien OSCC solut ja palloja injektoitiin BALB /c-nude-hiirissä (6 viikkoa). Solususpensio (100 ml) injektoitiin subkutaanisesti kunkin hiiren eri solujen määrä 1 x 10

6, 1 x 10

5, ja 1 x 10

4 solut. Kasvaimet muodostettiin 7 päivää injektion jälkeen. Kasvainten kokoja tarkkailtiin ja mitattiin kerran viikossa kaavan mukaisesti (pituus x leveys

2) /2. 30 päivän kuluttua tai potilaalle tehdä inokulaation, hiiret lopetettiin anestesiassa. Kaikki eläimet sopeutui ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean National Defense Medical Center (IACUC-11-064).

immunohistokemia

Kudosleikkeet tai selliosasto olivat ke- vahattu ksyleenissä ja niihin lisätään alkoholiin. Antigeeni haku suoritettiin inkuboimalla 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 95 ° C: ssa 40 min. Endogeeninen peroksidaasi salvattiin 0,3% vetyperoksidia 10 minuuttia, sitten inkuboitiin 5% normaalia hevosen seerumia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa estää ei-spesifinen vasta-aine reaktiossa. Pesun jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella plus 0,1% Tween 20: tä (TBST), laseja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden, E-kadheriinin (sc-8426, 1:800) ja fibronektiinin (sc-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. USA). Sen jälkeen, kun huuhdellaan TBST: ssä, laseja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen streptavidiini-biotinyloitu-entsyymin kompleksi (streptABComplexes kit; Dako, Glostrup, Tanska). Sen jälkeen ne värjättiin 0,003% 3, 3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla, vastavärjätään Mayerin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu.

Tilastollinen analyysi

Riippumattoman Studentin t-testiä tai ANOVA käytettiin vertaamaan jatkuva muuttujia ryhmien välillä, kun taas Χ

2 testiä sovellettiin vertailua dikotomista muuttuja. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin 0,05 kaikissa testeissä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS versio 12.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

karakterisointi DRSPs vuonna OSCC Solut

Drug vastustuskykyisten solut (DRC), indusoida SCC25 solulinjaa ensin kautta monivaiheisen cis hoitoja eri pitoisuuksina (0, 5, 10, 20, ja 30 uM). Vain pieni osa DRC (20%) ylläpidettiin pitkällä aikavälillä jälkeen cis hoito 25 uM (kuvio 1A). DRC viljeltiin edelleen käyttämällä takertumattomana kulttuuri järjestelmä, kuten kuvattu edellisessä raportissa. Culture 7 päivää tuotti sferoidin fenotyyppi kutsua lääkeresistenttiä pallo (DRSP). Asteittainen morfologiset muuttamista DRC peräisin epithelioid, monikulmainen ulkonäöltään mesenkymaalisten kaltainen, kara kokoonpano, joka on tyypillinen EMT ilmiön havaittiin aikana induktion vanhemman OSCC solut DRC (kuvio 1 B). Hoidon jälkeen 25 uM cis-48 h, DRSPs olivat paljon vastustuskykyisempiä Cis kuin olivat kontrolli OSCC soluja (kuvio 1C). Sen lisäksi, että niiden muoto muuttui viittaavia EMT ilmiön aikana induktion, DRSPs leimasi lisääntynyt maahanmuutto ja invaasio kykyjä verrattiin kontrolli soluihin (kuvio 1 D). Luonnehdinta DRSPs käyttäen Western-blot-analyysi osoitti, että ylösajon lääkeaineen vastustuskykyyn liittyviä geenejä

ABCG2

ja

MDR-1

ja CSC-edustajan markkereita, mukaan lukien Oct4, Nanog, ja Sox2 , mikä viittaa siihen, että DRSPs sietävät paremmin cis ja vahvempi CSC ominaisuuksia verrattuna kontrolli soluihin. Vertaileva analyysi paljasti muutoksia EMT-liittyvän markkereita, mukaan lukien vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin, lisääntyneen ekspression fibronektiinin ja Twist-1, ja huomattavasti MMP-2 ja MMP-9 DRSPs verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 1 E) .

(A) Drug kestävä OSCC soluja (DRC) perustettiin kautta monivaiheisen cis käsittely eri pitoisuuksina. Vain pieni osa DRC pidettiin pitkällä aikavälillä jälkeen cis hoidon. (B) DRC viljeltiin edelleen käyttämällä takertumattomana kulttuuri järjestelmä, joka tuotti sferoidin fenotyypin kutsutaan lääkeresistenttiä palloja (DRSPs). Asteittainen morfologiset korjauksilla DRC jotka olivat osoitus EMT ilmiö havaittiin aikana induktion. (C) hoidon jälkeen cis, DRSP solut olivat resistenttejä cis kuin oli kontrolli OSCC soluja. (D) DRSPs oli edelleen ominaista lisääntynyt maahanmuutto ja invaasio kykyjä kuin verrokkiryhmän soluihin. (E) vertailut EMT- ja invaasion liittyviä markkereita, lääkeresistenssideterminantit liittyvien geenituotteiden, ja CSC-edustaja markkereita paljasti muutoksia ilmentymisen EMT liittyvien markkereita ja merkittävää voimistumista MMP-2 ja MMP-9, huumeisiin vastus liittyvien geenituotteiden, ja CSC-edustaja merkkiaineiden DRSPs verrattuna kontrolli soluihin.

osallistuminen p38 MAPK-Hsp27 antiapoptoottisten Pathway in Drug Resistance in OSCC

ilmaus p-Hsp27 oli annoksesta riippuvaa korreloi cis hoitoa OSCC soluissa (kuvio 2A). P-Hsp27 yliekspressoitui aktivoimalla ylävirtaan p38 MAPK signalointia DRSPs. Lisätutkimuksessa kautta siRNA of Hsp27 käänteisesti indusoi säätelyä CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP, jolloin edistämisessä apoptoosin DRSPs. Kuitenkin, ei ollut vaikutusta p38 MAPK ilmentymistä (kuvio 2B). Todisteita Western blot-analyysi osoitti, että pudotus p38 MAPK suoraan vaimentua p-Hsp27, että niissä on p38-MAPK-Hsp27 antiapoptoottisten väylän DRSPs (kuvio 2C).

(A): n ekspressio p- Hsp27 oli annosriippuvaisesti korreloi cis hoitoa OSCC soluissa. P-Hsp27 oli correspondently yli-ilmentyy aktivaation kautta ylävirtaan p38 MAPK signalointia DRSPs. (B) knockdovvn Hsp27 käänteisesti indusoi säätelyä CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP, mikä lisää apoptoosia DRSPs. Kuitenkin, ei ollut muuttaminen ylävirtaan p38 MAPK. (C) knockdovvn p38 MAPK suoraan vaimentua p-Hsp27, että niissä on p38 MAPK-Hsp27 antiapoptoottisten väylän DRSPs.

Qu välittämä Estovaikutus p-Hsp27 Tuloksena tehostaminen Apoptotic aktiivisuus DRSPs

MTT-määritys osoitti, että hoito 100gM Qu yhdistettiin 10 uM cis pienentää DRSP kasvua ja merkittävästi chemosensitized DRSPs cIS osoituksena lasku solujen selviytymistä jälkeen cis hoidon DRSPs (

P

0,01). Qu esti tuotteet lääkeresistenssigeenien

ABCG2

annoksella 500 pM ja vähitellen myös heikennettyjä

MDR-1

annoksesta riippuvalla tavalla.

MDR-1

oli alttiimpia Qu kohtelun kuin oli

ABCG2

(kuvio 3A). Knockdovvn Hsp27 tai käytön Qu yhdistettynä cis tuotti samanlaiset apoptoottiset vaikutukset, jotka johtavat downregulation p-Hsp27 ja säätelyä CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP, mutta ei vaikuttanut p38 MAPK DRSPs (kuvio 3B). Muuttoliike ja hyökkäys määritykset osoittivat, että hoito Qu yhdistetään cis merkittävästi vähentynyt muuttoliikkeen ja invaasion kykyjä DRSPs (kuvio 3C). Hoito Qu yhdistettynä Cis käänteinen ilmentymistä EMT-liittyvän markkereita, mikä tuotti säätelyä E-kadheriinin ja downregulation vimentiinista, Twist-1, ja fascin-1 (kuvio 3D).

(A) MTT määrityksessä osoitti, että Qu hoitoa annoksella 100 uM yhdistettynä cis voi estää DRSPs. Qu heikennetty ilmaus tuotteiden lääkeresistenssideterminantit liittyvien geenien

ABCG2

ja

MDR-1

annoksesta riippuvalla tavalla. (B) Sekä knockdovvn Hsp27 ja käytön Qu yhdistettynä cis tehokkaasti indusoi samanlaisia ​​apoptoottisia vaikutuksia, jotka johtivat laskua pHsp27 ja säätelyä CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP DRSPs. (C) Käsittely Qu yhdistettynä Cis merkittävästi vähentynyt muuttoliike ja invaasion kykyjä DRSPs. (D) Käsittely Qu yhdistettynä Cis käänteinen ilmentymistä EMT liittyvien markkereita ja indusoi EMT ilmiö.

Kasvaimen kasvun estäminen ja vaimennus Cis Resistance Qu

in vivo

vahvista kasvaimeen aloittamista ominaisuuksia pallojen

in vivo

, sekä vanhempien solut ja palloja injektoitiin nude hiirille analyysi siirrettyjen kasvainten muodostumiseen. Tulokset Tämän kokeen osoitti suurempaa kykyä tuumoreita in DRSPs verrattuna kontrolli soluihin. DRSPs aiheutti kasvainten injektion jälkeen 1 x 10

4 soluja hiiriin (kaksi kolmesta hiirestä). Sitä vastoin enemmän valvontaa soluja tarvitaan tuottamaan kasvaimia (injektio 1 x 10

6 solua hiiriin, kolme kolmesta hiirestä), mikä viittaa siihen, että DRSPs rikastetaan kasvaimen aloittamiseksi solut vähintään 20-kertainen verrattuna kontrollisolut (kuvio 4A). Koko ja määrä DRSP-tuumoreita olivat merkittävästi korkeammat kuin kasvainten aiheuttamaa kontrollisoluihin. Kasvu eroja kasvainten syntyy vähitellen havaittu ajasta riippuva tavalla injektion jälkeen DRSPs vs kontrolli solut (

P

0,05) (kuvio 4B). Hiiret käsiteltiin Qu yhdistettynä cis osoittivat merkittävää tuumorin kasvun estäminen verrattuna hoidetussa ryhmässä Cis yksin ja kontrolliryhmän (kuvio 4C). Vertaileva analyysi vastaavien immunohistokemiallisella tulokset p-Hsp27 ja EMT liittyvä markkereita otettu kasvain kyhmyt hiirten käsittelyn jälkeen Qu yhdistettynä cis paljasti selvästi downregulation p-Hsp27, vimentiinistä, Twist-1, ja fascin- 1 ja ylössäätely E-kadheriinin in DRSPs verrattuna ryhmään, jotka eivät saaneet hoitoa (kuvio 4D).

(A) suurempi kyky kasvaimien osoitettiin DRSPs verrattuna kontrolli soluihin. (B) koko ja tilavuus DRSP-tuumoreita olivat merkittävästi korkeammat kuin kasvainten aiheuttamaa kontrollisoluihin. Kasvu erot kasvaimia syntyy havaittiin ajasta riippuva tavalla DRSPs vs. kontrolli solut (

P

0,05). (C) Gross ulkonäkö edustavan kasvaimen muodostettu siirrostamalla vanhempien solujen ja liukenevat DRSPs osaksi NOD /SCID-hiirten (n = 3 kussakin ryhmässä). Hiiret käsiteltiin Qu yhdistettynä cis paljastaa tilastollisesti merkittävän kasvun eston verrattuna hoidetussa ryhmässä Cis yksin ja kontrolliryhmän (

P

0,05). (D) Vertaileva analyysi vastaavien immunohistokemiallisella tulokset p-Hsp27 ja EMT-liittyviä markkereita otettu kasvain kyhmyjä on NOD /SCID-hoidon jälkeen Qu yhdistettynä cis paljasti selvästi downregulation p-Hsp27, vimentiinistä, Kierrettävä 1, ja fascin-1 ja säätelyä E-kadheriinin in DRSPs (suurennus, 100 x).

keskustelu

cis kemoterapian käytetään laajasti kliinisessä hoidossa kehittyneiden syöpä. Se parantaa ennustetta ja eloonjäämisaste potilailla, joilla OSCC. Kehitys Cis resistenssin on pidetty suurin syy kasvaimen uusiutumisen, mikä johtaa epäonnistumiseen kliinisen hoidon. Rooli CSCS sisällä kasvainten induktio chemoresistance kemoterapian aikana on tunnettu [26]. Siksi tunnistaminen molekyylimekanismin joka välittää chemoresistance tuntuu ratkaiseva todentaminen korrelaatio toistuminen, Cis vastus, ja CSCS vuonna OSCC. Tässä suhteessa käytimme takertumattomana alalla kulttuurin järjestelmä eristää solujen kantasolujen ominaisuuksia keskuudessa cis-resistenttien solujen ja syntyy DRSPs. Aikana induktion DRSPs huomasimme mielenkiintoinen ja erikoinen EMT ilmiö, mistä on osoituksena asteittainen morfologinen muutos vanhemman OSCC solujen DRC. Tämä merkitsee sitä, että DRC ominaisuus toimia lääkeresistenssi kautta EMT. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että EMT on keskeinen mekanismi syövän aggressiivisuus, ja se on osoitettu korreloivan kehittämiseen chemoresistance [27] – [29]. Nämä hyvin muodostettu DRC kanssa mesenkymaalisten kaltainen fenotyyppi voidaan käsitellä edelleen pallo muodostumista takertumattomana alalla kulttuurin järjestelmä. Vastoinkäyminen täyttämään pallojen takertumattomana keskeytettiin ehtoa ei ainoastaan ​​stimuloida EMT mutta myös kannustaa ilmoittautuminen potentiaalin CSC ominaisuuksista, kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa ym [25], [30].

Perustuu tutkimuksen lisäksi morfologisten muutosten mukana muutosten ilmentymistä EMT-liittyvän markkereita, DRSPs leimasi säätelyä

ABCG2

ja

MDR-1

. Nämä kaksi geenit ovat hyvin tunnettuja, ja niitä ilmaistaan ​​monenlaisia ​​CSCS jotka on toiminut solunsalpaajaresistentti markkereita [9]. DRSPs osoitti myös yli-ilmentyminen CSC-edustaja ja stemness markkereita, mukaan lukien Oct4, Nanog, ja Sox2, joka osoittaa, että DRSPs esiintyy enemmän cis-kestokyvyn ja vahvempi CSC ominaisuudet kuin tehdä ohjaus OSCC soluja. Nämä tiedot paitsi osoittavat, että DRSPs ovat käyttökelpoinen malli lääkeresistenssiselektiomarkke- tutkimuksessa mutta myös hyviä todisteita, jotka tukevat oletusta, että CSCS edistävät lääkeresistenssin kasvainsoluissa Tämän osoittaa tutkimuksemme ja myös raportoitu muiden aiemmin [25] , [31]. Hyödyntämällä DRSPs kuin tutkimuksessa mallin lääkeresistenssi, olemme löytäneet myös merkittävä kasvu ilmentymisen p-Hsp27 in DRSPs, joka korreloi negatiivisesti ekspression CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP-proteiinien, mikä osoittaa, että p -Hsp27 voivat osallistua lääkkeen aiheuttama antiapoptoottisten vaikutus. Kuten aiemmin mainittiin, Hsp27 osallistuu pahanlaatuinen ominaisuudet syöpäsolujen, mukaan lukien lisääntynyt tuumorigeenisyyden, vastus hoitoon, ja apoptoosin estämisestä [32]. Ennuste indikaattoreita, kuten Hsp27 joka korreloi potilas- säilymisen tai hoitovaste, voi toimia uusia terapeuttisia, jotka perustuvat heidän chemoresistance omaisuuden [33]. On yhä enemmän todisteita roolin Hsp27 vuonna lääkeresistenssin ja CSC muodostumista erilaisissa syövissä [29], [34]. Lisäksi toiminto Hsp27 ohjataan posttranslational muutoksia, kuten fosforylaation; p38 MAPK signalointi vastaa fosforylaation Hsp27, joka johtaa sen toiminnallinen induktion [35]. Esillä olevassa tutkimuksessa, ylössäätely fosforylaation Hsp27 aktivaation kautta p38 MAPK signaloinnin havaittiin DRSPs. On ehdotettu, että aktivointi Hsp27 laukaisee kanoninen p38 MAPK Cascade. Lisäksi pudotus on Hsp27 on DRSPs laski Cis kestävyys ja indusoi apoptoosin kautta kaspaasi-signalointia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että joukossa lukuisia signalointireittien, p38 MAPK-riippuvainen signalointi voi olla kriittinen kohde Hsp27. Siksi Hsp27 on keskeinen rooli Cis kestävä DRSPs, todennäköisimmin kautta antiapoptoottisten signalointireitille. Lisätutkimuksessa ilmoittautumalla kliinisistä tapauksista liittyy huono ennuste on uusiutuva tai metastaattinen OSCC on käynnissä ja tavoitteena on leikellä selvä rooli Hsp27 huumeisiin resistenssin kudosleikkeiden immunohistokemiallisesti.

Tuore tutkimus osoitti, että ilmaisu ja Hsp27 lisättiin keuhkojen CSCS ja että hoito näiden solujen yhdistelmä sisplatiinin /gemsitabiini kemoterapiaa ja kasvien flavonoidiyhdisteen Qu inhiboi Hsp27 ilmaisun ja tukahdutti kasvaimen kasvun ja ilmentymisen stemness geenien, mukaan lukien

Oct4

,

Nanog

, ja

Sox2

[24]. Toinen raportti osoitti, että Qu estää pallomainen muodostumista, solujen selviytymisen, ja hyökkäyksen eturauhassyövän kantasolujen [36]. Sovittaa rooli Qu kuin apuainetta on OSCC ja estäjä Hsp27, me edelleen validoitu hypoteesia, että Qu kykenee sen apoptoottisen aktiivisuuden kautta tukahduttaminen lämpöshokin tekijän aktiivisuutta ja siihen liittyvät molekyylitason signalointi, joka on kriittinen OSCC, kuten on raportoitu muissa syövissä [34]. Johtopäätös että Qu toimii tehokkaana chemopreventive aine OSCC perustui näyttöä siitä, että Qu lisää kaspaasi 3 ja PARP, suoraan vaikuttavia loppupään apoptoottista reitti, johon liittyy Hsp27 /kaspaasi 3 /PARP signalointi. Olemme osoittaneet, että Qu voi heikentää ilmentymistä

ABCG2

ja

MDR-1

geenin liittyvien tuotteiden annoksesta riippuvaisella tavalla, ja kääntää ilmentymistä EMT liittyvien proteiinien. Joko knockdovvn Hsp27 tai käytön Qu yhdistettynä cis kohdistaman samanlaisia ​​apoptoottisia vaikutuksia, on osoituksena downregulation p-Hsp27 ja säätelyä CI-kaspaasi 3 ja CI-PARP DRSPs. Lisäksi Qu yhdistettynä cis esti merkittävästi solujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio, joihin oli liitetty muutokset ilmentymistä fascin-1 ja EMT-liittyviä proteiineja DRSPs. Lisäksi Qu yhdistettynä Cis vaimenee tuumorigeenisyyden DRSPs, mikä osoittaa sen voimakas estävä vaikutus vähentää kasvaimen kasvua ja vähentää lääkeresistensseihin

in vivo

seurauksena vaimennussäätely p-Hsp27 ja muutoksia EMT ilmiö. Tietääksemme Tässä tutkimuksessa on ensin osoittaa, että suunniteltu DRSPs on osoittautunut sovellettavissa malli, joka validoi molekyylimekanismin suojattavan Hsp27 välittämää lääkeresistenssin ja siihen liittyvä käsittely strategiaa käyttäen Qu kuin apuainetta sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Yhteenvetona Tutkimuksemme tarjoaa tietoa mekanismia taustalla lääkeresistenssin OSCC. P38 MAPK-Hsp27 akseli on keskeinen rooli CSC välittämää Cis vastus suun syöpä. Kohteekseen akseli käyttämällä Qu yhdistettynä perinteiseen kemoterapiaan voi edustaa hoitostrategiaa parantaa ennustetta potilaille, joilla OSCC.