Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

apolipoproteiini A-II (ApoA-II) on alaspäin säännellään seerumeista haiman adenokarsinooma (PDAC) potilaat, jotka voivat johtua lisätä hyödyntämistä korkea (HDL) lipidin haimasyöpä kudosta. Tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksesta eksogeenisen ApoA-II rasva ottoa ja solujen kasvua haimasyövän (PC) sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Methods

Cryo siirto (TEM) tutkittiin ApoA-II: n vaikutus morfologiasta SMOFLipid emulsio. Vaikutus ApoA-II leviämisen syöpäsolulinjojen määritettiin inkuboimalla niitä lipidi +/- ApoA-II ja anti-SR-B1-vasta-ainetta. Lipid leimattiin fluorofori, DiD, jäljittää lipidien ottoa syöpäsolut

in vitro

konfokaalimikroskopiaa ja

in vivo

in PDAC potilaalla johdettu ksenograftikasvaimissa (PDXT) fluoresenssin kuvantamisen. Sieppaajareseptori B-tyypin 1 (SR-B1) ilmentyminen PDAC solulinjoissa ja PDAC PDXT mitattiin western blottauksella ja Immunohistokemian vastaavasti.

Tulokset

ApoA-II spontaanisti muunnetaan lipidejä emulsio pieniksi unilamellaaristen rHDL kuten rakkuloiden (rHDL /A-II) ja tehostetun lipidien sisäänotto PANC-1, CFPAC-1 ja ensisijainen kasvainsolujen esitetyllä konfokaalimikroskopiaa. SR-B1 ilmentyminen oli 13,2, 10,6, 3,1 ja 2,3 kertaa suurempi PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 solulinjoissa kuin normaali haiman solulinja (HPDE6) ja 3,7-kertaisesti suurempi PDAC kudoksessa kuin normaaleissa haimassa . ApoA-II plus lipidejä lisäsi merkittävästi leimatun lipidin ja edistää solujen kasvua PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 soluja, jotka estyi anti SR-B1-vasta-ainetta. Edelleen, ApoA-II lisäsi ottoa lipidin ksenograftien 3,4 kertaiseksi.

Johtopäätös

Tuloksemme viittaavat siihen, että ApoA-II parantaa potentiaalisia rasva haimasyövän, jotka voivat olla kuvantaminen ja huumeiden toimitus mahdollisuuksille.

Citation: Julovi SM, Xue A Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) apolipoproteiini A-II Plus Lipidiemulsio Paranna Cell Growth kautta SR-B1 ja Target Haimasyöpä

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10,1371 /journal.pone.0151475

Editor: Yingmei Feng, Peking Key laboratorio Diabetes Prevention and Research, Kiina

vastaanotettu: 03 syyskuu 2015; Hyväksytty: 29 helmikuu 2016; Julkaistu: 22 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Julovi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Tietopaketti

Rahoittajat: osa tämän tutkimuksen esitettiin ja palkittiin paras juliste New Horizons 2014 ja tieteellisen tutkimuksen Meeting, 17-19 11, 2014. Tämä tutkimus ei ole on julkaistu muualla vai ei harkitaan julkaisulle. Tutkimuksen tukivat CanSur säätiön ja osittain Ramsay Tutkimus Opetus Fund mutta ei ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen. Kaupallinen kuuluminen on kirjoittajan CSIRO ei mitään merkitystä tutkimuksessa ja ei ollut kilpailevia intressejä, jotka liittyvät työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen ja markkinoi tuotteita.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat eivät eturistiriita. Kaupallinen kuuluminen on kirjoittajan CSIRO ei mitään merkitystä tutkimuksessa ja ei ollut kilpailevia intressejä, jotka liittyvät työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen ja markkinoi tuotteita.

Johdanto

seerumin apolipoproteiini A-II (ApoA-II) havaittiin masentunut haiman syöpäpotilaiden ja oli mahdollinen diagnostinen biomarkkereiden [1]. Tämä työ on vahvistanut Honda ja työtovereiden [2] ja muut [3]. ApoA-II on osa high density lipoprotein (HDL), jossa se on tärkeä rooli ohjata kohtalo aineenvaihdunnan lipidin HDL. Tärkein rooli HDL on toimituksen kolesterolin ääreiskudoksista maksaan, missä se metaboloituu sappisuolojen tai erittyy sappeen. Raadonsyöjä reseptori B-tyypin 1 (SR-B1) on yleistä maksasoluissa ja houkuttelee HDL jossa lipidi endosytoosin [4, 5] tai leviää [6, 7] hepatosyyteissä.

SR-B1 on multi-ligandi-reseptori, ja ilmentyy suuresti eri kasvainsolujen, mukaan lukien eturauhas-, rinta-, paksusuolen ja peräsuolen ja munasarjan syöpäsolujen [8]. Lipoproteiinin pinnalla HDL sitoutuu SR-B1and toimittaa sen lipidejä soluun kautta pore muodostaman SR-B1 lisäämällä ottoa HDL-kolesteryyliesteri- (CE) [9], välttämätön ravintoaine pahanlaatuiseen solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden [10, 11]. Kolmekymmentä prosenttia HDL liittyy ApoA-II, joka on ajateltu tehdä HDL pienempi kuin, että ApoA-I yksin ja tekee HDL /ApoA-II vähemmän puoleensa maksan SR-B1 [12]. Lisäksi ApoA-II pitää HDL osittain estämällä maksan lipaasin [13]. Nämä tulokset on suhteellisesti pidempi kiertoaika HDL /ApoA-II. ApoA-II muuttavat sitoutumisaffi- HDL SR-B1 eri kudoksissa, ja se on erityisen puoleensa steroidien kudoksen [14], jossa kolesteroli on käytetty hormonin synteesiä, mutta nopeasti kasvavien syöpäsolujen edellyttävät myös kolesterolia solukalvojen [15]. Syöpäsolut on lisääntynyt ilmentyminen SR-B1in suhteessa ilme ei-pahanlaatuisten solujen alkuperä [16, 17], ja on mahdollista, että tämä johtaa lisääntyneeseen oton HDL syöpäkudoksessa, joka on selitys vähentämistä seerumin ApoA-II PDAC tapauksissa [1-3]. Mielenkiintoista haimasyövän ei kerry fludeoksiglukoosista (FDG) tarpeeksi voimakkaasti luotettaviksi varjoaineena varten positroniemissiotomografia (PET) [18], joka todennäköisesti osoittaa, että haimasyövän pitää parempana lipidien sen tärkein kalori lähde [19]. Jos lipidi on tärkein energialähde haimasyövän kudos on mahdollista, että HDL on tärkeä lähde tämän lipidejä. Energia-aineenvaihdunnan solujen on mukana monimutkainen karsinogeneesissä [20, 21]. Rooli kolesterolin aineenvaihdunnassa prosessissa syövän on myös raportoitu [22-24] .Cancer ja muut nopeasti lisääntyviä soluja edellyttää kolesteroli ja muut kalvon komponenttien optimoimiseksi kasvua [25]. HDLs ovat sekaantuneet kolesterolin toimitukseen joissakin maligniteetteja, mukaan lukien rintasyövän [26], munasarjasyöpä [8], lisämunuaiskuoren kasvaimet [27] ja eturauhassyövän [28]. On todennäköistä, että haimasyöpä on myös innokkaasti utilsing HDL.

hypoteesi testattiin tässä asiakirjassa on, että ApoA-II nopeuttaa käyttöönottoa rasva osaksi haimasyövän kudokseen ja näin lisätä solujen kasvua. Lisäksi oletamme, että ilmentymistaso ja SR-B1 korreloi ottoa lipidin haiman syöpäsoluissa, ja se on suurempi kuin normaalissa kudoksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell kulttuuri

PANC-1, MiaPaca-2, BxPC3 ja CFPAC-1 haimasyövän solulinjoissa oli lahja prof Barry Allen (St George Hospital, NSW, Australia), ja normaaleihin ihmisen haimatiehyen epiteelin (HPDE6) soluihin [29] olivat tri Chris Scarlett (School of Environmental Life Sciences, University of Newcastle, NSW, Australia). A549 keuhkosyövän solulinjaa, T47D ja MCF7 rintasyövän solulinjat ystävällisesti professori Ross Davey (Kölling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, NSW, Australia). PC3 eturauhassyövän noomasolulinjasta toimittanut Prof. Qihan Dong (Central Clinical School, Bosch Institute, University of Sydney, NSW, Australia). Paitsi HPDE6 solulinja, kaikki solulinjat hankittiin ATCC: ltä. Solulinjat kirjoittama lyhyt peräkkäisen toiston profiloinnin ja ne sopeutui ATCC viitestandardit (CellBank, Westmead, NSW, Australia). BxPC3, CFPAC-1, A549, T47D ja MCF7-solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, PANC-1 ja MiaPaca-2 viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) ja PC3 eturauhasen soluja viljeltiin F-12K (Gibco, BRL) 10% FBS: ää, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; ICN, Aurora, OH) 75 cm

2 pulloissa 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. HPDE6 soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumittomassa (KSF) väliaineessa täydennettynä kasvutekijän ja naudan aivolisäkeuutteella (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).

Ensisijainen kulttuuri

Human haiman kasvain näytteet saatiin Royal North Shore Hospital (Sydney, Australia), jossa niiden tietoisen kirjallisen suostumuksensa, seuraavia protokollia hyväksymä pohjoisen Sydney Local Health District Human Research Ethics Committee (NSLHD HREC) (Protocol numero: 0909-227M, Sydney , Australia). Primaarikasvaimen solujen viljelmät perustettiin explant kasvua pienten fragmenttien (≈1 mm) leikattiin PDAC tuumorikudokset, laitettiin DMEM (pH 7,4), johon oli lisätty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää 50 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Viljelmiä käytettiin puhdistamisen jälkeen 3 välttää jäljellä saastuminen makrofagit [30]. Kaikki viljelmät kerättiin identtisissä kasvun ja seerumin olosuhteissa. Käytimme 24 h seerumia solujen kokeita välttää varhaisen geenin ilmentyminen indusoi seerumin.

leimaus SMOF lipidien kanssa fluorofori DiD

SMOF Lipidiemulsio joka sisältää soijaöljyä, keskipitkän ketju triglyseridi, oliiviöljy ja kalaöljy {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, ja sitä käytetään suonensisäiseen ruokintaan, käytettiin kokeissa leimauksen jälkeen kanssa 0,05% lipofiilinen merkkiaineen fluorofori, DiD (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, CA). SMOF lipidiemulsio kuivattiin pyöröhaihduttimella, kylmäkuivattu ennen sekoitusta hyvin DiD lipidi etanoliliuoksessa. Etanoli lopuksi haihdutettiin ja jäljelle jäänyt lipidikalvo rehydratoitiin lisäämällä steriiliä Baxter vettä niin, että lopullinen pitoisuus on 20% SMOFlipid, jonka jälkeen kova vorteksoimalla ja 30 minuuttia ultraäänihauteessa homogenointi.

kokoelma ja puhdistus ApoA -II

ApoA-II puhdistettiin kuten on kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [31-33]. HDLs olivat ultracentrifugally eristettiin yhdistetyistä näytteistä normaalia ihmisen plasmaa (1.063 d 1,21 g /ml) ja lipidit. Saatu apoHDL käsiteltiin kromatografisesti Q-Speharose Fast Flow -pylvääseen kiinnitetty Akta FPLC-järjestelmä (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, UK). Fraktiot, jotka sisälsivät apo-II yhdistettiin ja puhtaus tarkistettiin SDS-PAGE: lla ja Coommassie värjäyksellä, joka paljasti yhden kaistan. Yhdistetyt näytteet lyofilisoitiin, liuotetaan 3 M guanidiinihydrokloridia /10 mM Tris /0,01% (paino /tilavuus) EDTA-Na

2, ja dialysoitiin endotoksiinivapaalla PBS ennen käyttöä.

Cell lisääntymisen määritys

Soluproliferaatio suoritettiin eri solulinjoissa ja kvantifioidaan kristallivioletti- määritystä, kuten on kuvattu aiemmin [34], jossa MTT-määritys ei ole sopiva lipidi käsitellyissä soluissa [35]. 4 x 10

4 solua /ml soluja siirrostettiin yhdeksänkymmentäkuusi hyvin mikrolevyt, kaikki solulinjat lukuun ottamatta PANC-1 ja MiaPaca-2, jossa 2×10

4 solua /ml siirrostettiin lopulliseen tilavuuteen 200 ui. Seerumivapaassa soluja käsiteltiin kanssa tai ilman SMOFlipid (lipidi) yksin, ApoA-II yksinään tai yhdistelmänä eri pitoisuuksissa ja niitä inkuboitiin 24 h, 48 h ja 72 h. Testata vaikutusta SR-B1, soluja esikäsiteltiin anti SR-B1 (2,5 ug /ml) 2 h ja pestiin median 3 kertaa 5 minuuttia kerrallaan. Sitten soluja käsiteltiin kanssa tai ilman lipidiä ja ApoA-II: ssa 48 tuntia. Viljelyalusta poistettiin ja värjättiin 1 ug /ml kristalliviolettia (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) liuotetaan 25% metanolia (v /v) ja 75% tislattua vettä (v /v). Sitoutunut kristallivioletti solubilisoitiin 0,1% natrium-dodekyyli-sulfaatti (SDS) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Optinen tiheys kussakin kuopassa määritettiin 550 nm: n aallonpituudella. Tulokset ilmaistiin suhteessa kontrolliin. Olemme havainneet, että 1:30 laimennus lipidi- ja 50 ug /ml ApoA-II oli optimaalinen pitoisuudet 48 h, ja tämä ehto käytettiin seuraavassa tutkimuksessa.

immunoblottauksella

immunoblot-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [1]. Lyhyesti, 4 x10

5 solua kutakin solulinjojen siemennettiin 6-kuoppalevyille ja soluja kasvatettiin kunnes konfluentteja. Yhtä suuret määrät proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa, ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo. Ensisijainen aine oli kanin anti-SR-B1 (Novus Biologicals, Littleton, USA). Immunoreaktiivisuus havaittiin kanssa elektrokemiluminesenssiin tunnistusjärjestelmä (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Anti-ihmisen β-aktiini-vasta-aineen mukana normalisoimaan vastaan ​​epätasainen kuormitus.

Konfokaalimikroskopia

otto SMOFlipid leimattu teki tutkittiin Konfokaalimikroskopia. Lyhyesti, 1×10

5 solua /kuoppa ympättiin 8 hyvin kulttuuri dioja (BD Falcon, BD biotieteiden) yön yli ja käsiteltiin lipidien leimattu DiD väriaine 1:30 laimennus tai ilman ApoA-II 48 tuntia. Joissakin kokeissa soluja esi-inkuboitiin the1: 40, 1:30 ja 1:10 laimennukset leimaamatonta SMOFlipid ja anti SR-B1 (2,5 ug /ml) 2 tunnin ajan, pestiin seerumittomalla median ja inkuboitiin lipidi plus ApoA-II 48 tuntia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Univarin, Redmond, WA, USA), permeabilised 0,3% Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hills, NSW, Australia) ja inkuboitiin kanssa tai ilman primaarista vasta-ainetta, vuohen anti-ihmisen ApoA-II ( Abcam, Abcam Inc., MA, USA) 2 tuntia ja sitten inkuboitiin vihreä flurophore konjugoitu isotyyppiä sekundaarisen vasta-aineen (AlexaFlour

A488 aasin anti-vuohi IgG (H + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA) vielä 1 tunnin huoneenlämmössä. Solut asennettu glyserolia median DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja soluunottoa tutkittiin alla Leica konfokaalimikroskopia (Leica, Tokio, Japani).

elävien solujen kuvantamisen, 1×10

5 solua /kuoppa ympättiin μ- Kalvo 4 hyvin IBI Treat Microscopy jaosto (ibidi GmbH Martinsried, Saksa) yön yli ja käsiteltiin lipidien leimattu DiD väriaineen 1:20 ja 1:10 laimennus tai ilman ApoA- II 24 h. sisäänotto soluihin tutkittiin alla Leica konfokaalimikroskopia (Leica, Tokio, Japani). Lipid otto intensiteetti kvantifioitiin Leica Microsystemsin LAS AF (GmbH, Mannheim, Saksa) ja tulokset ilmaistiin suhteellinen intensiteetti.

Cryo siirto (TEM) B

laboratoriossa rakennettu kosteussäädeltyjä lasituksen järjestelmää käytettiin valmistamaan näytteet Cryo-TEM. Kosteus pidettiin lähes 80% kaikista kokeista ja ympäristön lämpötila oli ~22 ° C. A4 ui osa näytteestä pipetoitiin 300 mesh kupari grid päällystetty Lacy formvar-hiili elokuva (Pro-SciTech, Thuringowa, Queensland). 30 s kuluttua adsorption ajan, verkkoon blotattiin manuaalisesti Whatman 541 suodatinpaperia, ja välillä 2 ja 10 s. Hila sitten ajautunut neste etaania jäähdyttää nestemäisellä typellä. Jäädytetyt verkkoja säilytettiin nestetypessä tutkimukseen asti. Näytteet tutkittiin käyttämällä Gatan 626 cryoholder (Gatan, Pleasanton, CA, USA) ja Tecnai 12 siirto elektronimikroskoopilla (FEI, Eindhoven, Alankomaat) on käyttöjännite 120 kV, joka on varustettu FEI Eagle 4k x 4k CCD (FEI, Eindhoven, Alankomaat). Näytteitä nähtävissä 100 000-150 000 kertainen suurennus.

geelielektroforesointi

Vesipitoinen 0,5% m /m agaroosigeelissä valmistettiin ja upotettiin 1 × TBE (Tris-boraatti-EDTA-puskuriin , valmistettu laimentamalla 10x kantaliuoksia, pH 9) puskuri [36, 37], kulkevat vaakasuoraan elektroforeesijärjestelmään (Mini-Sub Cell GT, Biorad, elektrodien väli 15 cm) 45 minuutin ajan 90 V: Gel kuvat otettiin Carestream MI aallonpituudella 650 nm: n virityksellä ja 700 nm emissio.

ApoA-II plus lipidi liuotetaan inkuboimalla 2 ui ApoA-II (2 mg /ml) ja 2 ui leimattua SMOFlipid (10 mg /ml) 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Ennen lastausta geeli näytteen kanssa, jokainen näyte laimennettiin 1: 5 PBS: ssä (pH 7,4) ja lisättiin 2 ui 6 x loading dye-liuosta (# R0611, Fermentas, Life Science) sisältää 10 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,03% bromifenolisini, 0,03% ksyleenisyanoli FF, 60% glyserolia 60 mM EDTA-puskuriin. 12 ui näytettä lisättiin jokaiseen kuoppaan geelin. Kaikki kokeet tehtiin huoneen lämpötilassa.

Generation of PDAC potilaan johdettujen -tuumoriksenografti (PDTX) ei-lihavilla diabeetikko /severe combined immuunivajavaisiin (NOD /SCID) hiiriin

Kaikki eläinkokeet noudatettiin suuntaviivat pohjoisen Sydney Local Health District (NSLHD) eläinten eettisen komitean tässä tutkimuksessa ja sijaitsee osoitteessa Kearns laitos, Kölling Institute of Medical Research, University of Sydney. Protokolla hyväksyttiin NSLHD Animal eettisen komitean (Protocol numero 1011-015A). Kaikki Leikkaus suoritettiin anestesiassa isofluraanilla NO

2 ja happi (2: 1) ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Olemme luoneet PDTX mallia, jonka Wong MH ja Xue A. et al. [38, 39] pöytäkirjan nojalla NSLHD HREC- 0909-227M. Lyhyesti, uros NOD /SCID-hiiriin, iältään 6-8 viikkoa, nukutettiin käyttäen isoflourane NO

2 ja hapen (2: 1). Pieniä paloja potilaan tuore tuumorikudokset ksenosiirrettyjä alle sisälsivät kapselin alle kapseli (SRC) on hiiri. Kahdeksan viikkoa-ksenografti, hiiriä käytettiin tutkimaan

in vivo

lipidien sisäänotto.

sisältämiin eläimiin ensimmäisen sukupolven ksenograftit (F1) satunnaistettiin ja jaettiin kolmeen ryhmään (a) ajoneuvo (suolaliuos); (B) lipidi (c) lipidejä plus ApoA-II ja ruiskutetaan kautta häntälaskimoon. Homogenoida kasvaintilavuudet joitakin F1 kasvaimet olivat kulku muihin ryhmään hiiriä (F2) ja sen jälkeen kulkuväylää F3. Eläin laakeri F3 sukupolven ksenograftikasvaimissa käytettiin validointitutkimukseen. Lipid sisäänotto mitattiin eri ajankohtina by Carestream Molecular Imaging (MI) (Carestream Molecular Imaging, USA). Lopussa kunkin kokeen elimet ja kasvaimet kerättiin ja analysoitiin edelleen.

In vivo kuva-analyysi

in vivo optisen kuvantamisen, kasvain-hiiriin injektoitiin DiD307 leimatun lipidin kanssa tai ilman Apo-AII häntälaskimoinjektiona. Kuvaus suoritettiin välittömästi injektion jälkeen, 4 tunnin, 24 tunnin, 48 tunnin ja 96 tunnin in vivo Carestream MI Imaging System. Hiiret lopetettiin 48 tuntia injektion jälkeen, munuaisen kasvaimen, maksa, perna, haima, keuhkot, aivot ja lihasten kerättiin ja analysoitiin Carestream MI aallonpituudella 650 nm: n virityksellä ja 700 nm emissio.

Histologia ja immunohistokemia

kudosnäytteitä fiksoitiin 10% fosfaattipuskuriforaliinissa ja upotettiin parafiiniin. Formaliini-, parafiiniin upotetut leikkeet leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja värjättiin Mayerin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 tasolla.

Tulokset

ApoA-II: n vaikutus SMOF lipidiemulsion

Kun ApoA-II: ta lisättiin läpinäkymätön lipidiemulsion, faasimuutos tapahtunut ja emulgoitiin läpinäkymätön liuos muuttuu läpinäkyvä selkeä neste alle tunnissa (S1 Kuva). Cryo TEM kuvia SMOF lipidejä ja ApoA-II osoitti, että emulgoitu hiukkaset muuttuu unilaminar vesikkelit (kuvio 1B). Mielenkiintoisempaa on pieni koko näiden rakenteiden, joista monet olivat 10-50 nm halkaisijaltaan, paljon pienempi kuin alkuperäinen emulsiossa. Tämä elimellisen muutoksen rakenteessa ja koko ovat todennäköisesti johtuu vuorovaikutuksesta ja integrointi ApoA-AII sisällä lipidejä itsensä kokoonpanot ja siirtymistä läpinäkyvä liuos, joka sisältää enimmäkseen pieniä unilamellaarivesikkeleitä, kuten on osoitettu Cryo-TEM (kuvio 1A ja 1B).

Cryo-TEM-mikrovalokuva kuvan SMOFlipid emulsion ilman ApoA-II (A) ja kun oli lisätty ApoA-II (B). Huomaa kaksikerroksinen rakenne lipidin pinnan nanohiukkasten kaltaisia ​​rakenteita läsnä ApoA-II (mustat nuolet). (C) Spectral fluoresenssin värivalokuvassa 0,5% jota ajettiin 45 minuutin ajan 90 V 1 × TBE-puskurissa. SMOFlipid merkitty DiD eivät muuttaneet läpi oikein, mutta käyttövalmiiksi merkitty SMOFlipid kanssa ApoA-II liikkui bändi.

geelielektroforesointi osoittaneet, että käyttövalmiiksi ApoA-II plus lipidikompleksit siirtynyt geelin läpi kuin bändi kun taas lipidien yksin vielä jäi hyvin (kuvio 1 C), mikä viittaa siihen, että ApoA-II muuttanut lipidiemulsion ja pienentänyt hiukkaskoko mahdollistaa kulkeutumisen geeli. Tämä on sopusoinnussa cryo TEM tulokset (kuvio 1A ja 1B).

Konfokaalimikroskopia syöpäsolujen kasvatettu lipidiliuokset ja ilman ApoA-II

ottoa lipidin CFPAC-1 soluissa (kuvio 2A3), PANC-1 (S2A kuvio) ja primaarisen kasvaimen solulinjojen (S2B kuvio) on parantunut, kun rekonstruoitu lipidien plus ApoA-II: ta lisättiin elatusaineeseen. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös A549 keuhkosyövän soluja (S2C kuvio). Näissä kokeissa ApoA-II tehtiin näkyväksi ApoA-II vasta-aineet osoittivat, että se paikallistettiin syöpään solukalvojen (kuvio 2A ja S2 kuvassa). Vaikka alentunut fluoresenssin intensiteetti havaittiin CFPAC-1-solut, kun soluja esi inkuboitiin anti SR-B1 esto vasta-aineella (kuvio 2A4). Kun CFPAC-1-soluja pre inkuboitiin leimaamattoman suuri ylimäärä SMOFlipid yksinään (kuvio 2B1) ja inkuboitiin sitten liuoksen kanssa SMOFlipid /ApoA-II /DiD (kuvio 2B2) lisäksi otto ei tapahtunut ja ApoA-II-vasta-aineen värjätään oheiskomponenttia soluja. Niinpä vaikka esi-inkubaation vähensi imeytymistä SMOFlipid /ApoA-II sisäänoton ratkea mekanismin avulla pinnan vetovoima ApoA-II [4, 5]. Kun läsnä on ApoA-II lipidien sisäänotto on merkittävästi suurempi eri konsentraatioina verrattuna lipidi yksinään (kuvio 2C ja 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ApoA-II puoleensa solukalvoon, kun lipidi kuljetuksen PC-soluja. Tämä havainto on kanssa sopimuksen Fan Y

et al

. [4] ja Silver

et al

. [5]. Yhdessä nämä tulokset tukevat ehdotusta, jonka lipidejä nanohiukkasten voidaan endosytoidut.

SMOFlipid leimattiin DiD (punainen), ApoA-II leimattiin vihreiksi sekundaarisen vasta-aineen ja DAPI värjätään ytimien sininen. (A1) käsiteltyjä soluja ApoA-II yksin, (A2) käsiteltyjä soluja lipidien yksin, (A3) käsiteltyjä soluja saatettua lipoproteiineihin lisäämisen jälkeen ApoA-II DID merkitty SMOFlipid (SMOF /A-II) osoittavat suosia ja (A4 ) käsiteltyjä soluja (SMOF /A-II) jälkeen esikäsitellään anti-SR-B1antibodies mikä vähensi lipidien oton (asteikko bar, 20 pm). (B) Soluja esikäsiteltiin leimaamattoman lipidin 1:10 laimennus ja (B2) jälkeen 2 h SMOF /A-II: ta lisättiin, se näytti olevan endosytoosin in sytoplasmisissa vesikkeleissä, kuten on esitetty (B3) ja (B4). ApoA-II (vihreä) on kiinnitetty solukalvon (keltainen nuoli pään) ja samoin sytoplasmassa osittain liittyy lipidien (punainen nuoli pää) in Interferenssikontrasti Contrast (DIC) peittokuvan (asteikko bar 25 pm). (C) Elävät solukuvauksessa koe osoitti suurempaa ottoa rasva soluissa Liuotettu lipoproteiinien lisäämisen jälkeen ApoA-II teki leimattu SMOFlipid lisättiin median lipidien pitoisuuksia 01:20 ja 01:10 (asteikko bar 100 pm). (D) Intensiteetti DiD värjäytyminen oli suurempi, kun 4 näytettä tutkittiin kahdeksasta kahteentoista kiinnostuksen tutkimusta varten, jossa ApoA2 lisäsi ottoa rasva 25,6 ± 2,2,

P

= 0.02 ja 54,8 ± 2,2

P

= 0,004 varten laimennoksia 1:20 ja 01:10 vastaavasti.

SMOFlipid ApoA-II tavoitteet PDAC PDTX in vivo

arvioimiseksi kasvain kohdistaminen kapasiteetti rasva plus ApoA-II käytimme PDAC PDTX malli hiirellä. Lipidi /DiD tai lipidi /ei /ApoA-II: ta injektoitiin häntälaskimoon ensimmäisen sukupolven kasvaimen hiirille. Koko eläin kuvantaminen 48 tunnin kuluttua paljasti lipidien sisäänotto PDAC ksenografteissa kasvaimia rajoittuu Lipidijärjestelmään plus ApoA-II ruiskutettiin hiiriin verrattuna lipidien yksin (kuvio 3A ja S3A kuvassa), mutta myös maksassa, mahassa ja perna. Tämä vahvistettiin sen eksplantoitiin -urut

ex vivo

kuvantamiseen mutta vähän lipidejä havaittiin keuhkoissa ja aivoissa, mutta ei nähdä normaalissa haimassa (kuvio 3B ja S3B kuvassa). Suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti kasvoi 3,4 kertaiseksi kohdennettuja syövän kudoksissa, milloin lipidejä /ApoA-II injektoitiin (kuvio 3C) verrattuna DiD lipidejä, yhdenmukainen kuva 2. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että ApoA-II tavoitteet ihmisen PDAC.

(A) Spectral reflektanssi fluoresenssi kuvia 8 viikon ikäisillä ksenografteissa otetaan 48h jälkeen häntälaskimoon injektion PBS, teki merkitty SMOFlipid ilman tai ApoA-II käyttäen Carestream molekyylikuvantaminen. Huomaa laaja levinneisyys DiD on parempi lokalisoitu kasvaimia ApoA-II on mukana lipidejä. Nuolet osoittavat sivuston kasvaimia. (B) Spectral fluoresenssi kuvaa kudosviljellyn kasvainten ja elinten otetaan 48 h injektion jälkeen hiiristä jälkeen häntälaskimoon injektion joko PBS: ää, lipidi /DiD (n = 2) tai lipidi /DiD sekä ApoA-II (n = 2) (oikea paneeli ) yhdessä H

n

= 3.

sieppaajareseptori B-luokan tyypin 1 (SR-B1) ilmaisu on suurempi ihmisen PDAC

Western-blottauksella, ensimmäistä kertaa, osoitimme, että SR-B1 ilmentyminen oli 13,2, 10,6, 3,1 ja 2,3 kertaa suurempi PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 solulinjoissa vastaavasti verrattuna normaaliin haiman solulinja (HPDE6) (kuvio 4A). Immunohistokemiallinen (IHC) osoittivat, että SR-B1 ilmentyminen oli 3,7 kertaa suurempi vuonna PDAC kudoksessa verrattuna normaaliin haiman (kuvio 4B). Yhdenmukainen kuvio 2, huomasimme, että ApoA-II ilmentyminen oli suurempi kasvaimia hiiriin injisoitiin yhdistelmällä lipidien ja ApoA-II emulsio (kuvio 4C), kun taas ei ollut eroa SR-B1 ilmentyminen kasvaimissa missään ryhmissä ( Kuva 4C).

(A) HPDE6, PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 soluja viljeltiin ja SR-B1 ilmentyminen mitattiin western blottauksella. Kaistan intensiteetti proteiinien normalisoida β-aktiini ja HPDE6 määriteltiin 1. Arvot ovat keskiarvoja kahdesta erillisestä kokeesta. (B) Expression of SR-B1 IHC normaali haima (NP) ja ihmisen PDAC kudoksiin. Inset, IgG edustaa isotypoitiin sovitettu ensisijainen vasta-aine anti SR-B1. Kaavio osoittaa määrällisesti SR-B1 ilmentyminen prosenttiosuus värjättyjen solujen X intensiteettiä 3 erillistä potilaista ja NP määriteltiin 1. (C) Expression of SR-B1 ja ApoA-II IHC vastaavissa ksenosiirrettyjä PDAC kasvaimia 48 h jälkeen häntälaskimoon injektion lipidin kanssa tai ilman ApoA-II. Inset, IgG edustaa isotypoitiin sovitettu ensisijainen vasta-aine anti-ApoA-II. (D) Effects of anti SR-B1 yksin HPDE6, PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 solujen kasvua. (E) Soluja esikäsiteltiin tai ilman SR-B1-vasta-ainetta (2,5 ug /ml) 2 tuntia ja sitten käsiteltiin ApoA-II, lipidi- ja lipidien sekä ApoA-II: ssa 48 tuntia. Kasvu mitattiin kristalliviolettivärjäys- määrityksessä. Arvot ovat keskiarvoja ± SD;

n

= 4. *

, ‡, # ja ± p 0,05 vs. kontrolli, ApoA-II, lipidi- ja lipidi + ApoA-II vastaavasti, käyttämällä varianssianalyysi.

ApoA-II parantaa solun proliferaatiota ihmisen syöpäsoluja

Neljä PC solulinjojen PANC-1, MiaPaca-2, CFPAC-1 ja BxPC3 kasvoivat nopeammin (kuvio 4E), kun he olivat lipidien ja ApoA-II lisätään viljelyalustoissaan verrattuna kontrolleihin, ApoA-II yksin tai lipidejä yksin (paitsi CFPAC-1-soluissa). Vaihtoehtoisesti ApoA-II vaimentua normaalia HPDE6 soluissa (kuvio 4E). Tämä oli ilmeisintä 48 h ja se merkitsee, että yhdistelmä lipidien ja ApoA-II lisäsi ottoa lipidien ja siten energia mahdollistaa PC solut voivat kasvaa nopeammin. Oli samankaltainen vaikutus ihmisen syöpäsolujen linjat keuhko-, rinta- ja eturauhassyövän klo 48 h (S4 kuvio). Kuitenkin, ApoA-II ei edistänyt kasvua rintasyövän MCF7, jotka säilyttivät ominaisuudet erilaistumista ja kasvaa hitaasti [40]. Lisäksi esi-inkubaatio anti SR-B1-vasta kokonaan kääntää lipidejä plus ApoA-II stimuloi soluproliferaatiota in PANC-1, CFPAC-1 ja BXPC3 solut ja osittain, mutta merkittävästi MiaPaca-2-soluissa (kuvio 4E). Mielenkiintoista on, että esto SR-B1 parannettu ApoA-II plus lipidejä indusoi downregulation solujen kasvua HPDE6 (kuvio 4E). Anti SR-B1 yksin 2,5 ug /ml ei ollut merkittävää vaikutusta HPDE6, PANC-1, MiaPaca-2 ja BxPC3 solulinjoissa, kun taas merkittävästi vaimentua CFPAC-1 solun kasvua (kuvio 4D). Tämä voi johtua siitä, että ero tummuusasteen SR-B1 PANC-1, MiaPaca-2, BxPC3 ja CFPAC-1-solulinjoja (kuvio 4A).

Keskustelu

ApoA-II muuttanut fyysinen rakenne SMOF lipidejä pienentämällä lipidin hiukkaset ja indusoimalla kaksikerroksisen kalvon nanoparticle- rakenne. Tämä on sopusoinnussa tunnettu rakenne ja toiminta ApoA-II HDL [41]. Yhdistelmä ApoA-II ja lipidien merkittävästi edistänyt kasvua PC solulinjojen ja solulinjoja keuhko-, rinta- ja eturauhasen syöpiä. Lisäksi, ApoA-II parantaa lipidien sisäänotto PANC-1, CFPAC-1, ensisijainen kasvainsolujen ja PDXT. Käyttöönoton eksogeeninen lipidi- emulsio ApoA-II: PC kasvaimet voivat käyttää SR-B1-reseptorin (kuvio 2A4), koska se muodostaa HDL rakenne, jossa on korkea affiniteetti SR-B1 [26].