Krooninen sairaus

tiivistelmä

Soluttautuminen myelooisen solujen kasvain mikroympäristössä liittyy usein parannettu angiogeneesiin ja syövän etenemiseen, mikä johtaa heikkoon ennusteeseen monissa syöpien riskiä. Polypeptidi kemokiini PK2 (Bv8, PROK2) on osoitettu säätelevän myeloidisolun liikkeelle luuytimestä, aktivoitumiseen johtavat angiogeenisen prosessin, sekä kertymistä makrofagien ja neutrofiilien kasvaimen. Neutraloivia vasta-aineita vastaan, PK2 oli osoitettu olevan voimakas kasvaimen vastainen teho, joka havainnollistaa potentiaalia PK2-antagonistien terapeuttisina aineina syövän hoitoon. Tässä tutkimuksessa osoitamme antituumorivaikutuksen pienen molekyylin PK2 antagonisti, PKRA7, yhteydessä glioblastooma ja haimasyövän ksenografti- kasvainmalleissa. Korkeasti vascularized glioblastooma, PKRA7 liittyi vähentynyt verisuonten tiheyden ja lisääntynyt nekroottinen alueet kasvaimen massan. Yhdenmukainen antiangiogeenisen aktiivisuuden PKRA7

in vivo

, tämä yhdiste vähensi tehokkaasti PK2 aiheuttama mikroverisuonten endoteelisolujen haarautuva

in vitro

. Huonojen vascularized haimasyöpä, ensisijainen kasvaimen vastainen vaikutus PKRA7 näyttää välittyvän tukos myelooisen solumigraation /tunkeutumisen. Molekyylitasolla, PKRA7 estää PK2-indusoima tiettyjen pro-muuttavien kemokiinien ja kemokiinireseptoreita makrofageissa. Yhdistämällä PKRA7 hoito standardin kemoterapeuttisten aineiden johti huomattavia vaikutuksia ksenograftimalleissa molempien kasvain. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että anti-kasvain aktiivisuutta PKRA7 voidaan välittää kaksi erillistä mekanismeja, jotka liittyvät patologiset erityisten syöpätyyppi. Tämä pieni molekyyli PK2 antagonisti pitää lupauksen kehitettävä edelleen tehokas aine monimuotoiset syövän hoidossa.

Citation: Curtis VF, Wang H, Yang P, McLendon RE, Li X, Zhou Q-Y, et al. (2013) PK2 /Bv8 /PROK2 Antagonistiominaisuudet vaimentaa Kasvaimia synnyttävä Prosessit estämällä Angiogeneesi Gliooma ja estäminen myeloidisolun tunkeutuminen Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (1): e54916. doi: 10,1371 /journal.pone.0054916

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 17 joulukuu 2012; Julkaistu: 23 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Curtis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä oli tukee CA151541 ja XFW National Cancer Institute (www.cancer.gov) ja MH67753 ja QYZ National Institutes of Health (www.nimh.nih.gov). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kompleksi kasvain mikroympäristölle on tärkeä tekijä kasvaimien syntyyn. Viime vuosina lisääntynyt painopiste on saatettu kohdistaminen strooman solujen kasvaimen mikroympäristössä, jotka ovat vastuussa eri näkökohtia kasvaimia prosessin. Luuytimestä peräisin myeloidisoluissa, jotka ovat esiasteita makrofagien, neutrofiilien ja myeloidinen johdettuja suppressorisolut, edustavat alapopulaation stroomasolujen, että tärkeä rooli aikana kasvaimen etenemistä [1]. Vastauksena sytokiinien /kemokiinien kasvainsolujen erittämiä, myeloidisoluissa voidaan mobilisoida luuytimestä ja tunkeutuu tuumorikohdissa, jossa ne voivat edistää kasvua, invaasion ja angiogeneesin tukemaan kasvaimen laajenemisen ja etäpesäkkeiden [2]. Esimerkiksi CSF3 (pesäkkeitä stimuloiva tekijä 3), joka tunnetaan myös G-CSF: n, tuotetaan kasvainsolut voivat johtaa erilaistumiseen CD11

+ Gr1

+ myeloidisoluissa huomioon neutrofiilien, makrofagien ja dendriittisolujen, että on osoitettu olevan ylituottavat syöpäpotilailla ja kasvaimen kantavien hiirten [1], [3] – [4]. Tuumoripaikkaan, nämä CD11

+ Gr1

+ myelooista solut erittävät erilaisia ​​tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa suoraan angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua [5] – [6].

Niistä tekijöistä tuotettujen jonka CD11

+ Gr1

+ ydinsoluissa on prokineticin 2 (PROK2), kutsutaan PK2 tässä asiakirjassa, joka tunnetaan myös Bv8. Yhtenä kaksi jäsentä prokineticin perheen, PK2 sitoutuu kahteen erittäin liittyvät G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t), PROKR1, kutsutaan PKR1 ja PROKR2, kutsutaan PKR2, ja vaikuttaa useiden biologisten prosessien, kuten nosiseption, vuorokausirytmin , suoliston toimintaa, neurogenesis, hematopoieesin ja angiogeneesissä [7]. PK2 tuotanto CD11

+ Gr1

+ ydinsoluissa voi johtaa muodostumista positiivisen palautteen silmukka, jossa on parannettu erilaistuminen näiden myelooisen esiastesolujen makrofageihin, sekä lisääntynyt mobilisaatio näiden solujen luuytimestä osaksi verenkiertoon [8]. Jaksotetut makrofagit voivat sitten tunkeutua kasvain mikroympäristön ja jatkaa erittämään enemmän PK2, mikä lisää lisääntymistä ja endoteelisolujen migraation ilmentävien PKR1 ja PKR2, mikä osaltaan parantaa angiogeneesiin [8]. Lisäksi stimuloimalla endoteelisoluja, PK2 on osoitettu vaikuttavan sytokiinituotannon hiiren lymfosyytit, lisäämällä pro-inflammatoristen sytokiinien IL-1B: n ja IL-12 ja vähentämällä anti-tulehduksellisten sytokiinien IL-4 ja IL-10 [9] – [10] . PK2 reseptorit ilmentyvät myös hiiren makrofageissa ja endoteelisolujen; Näin ollen PK2 voi aiheuttaa siirtyminen niihin makrofagien ja vaikuttaa muodostumista kapillaari-rakenteita endoteelisolujen [10] – [13].

Koska tärkeitä rooleja PK2 luomisessa kasvaimen mikroympäris- suosivat kasvaimen kasvuun ja etenemiseen, PK2 on tullut tavoitteeksi kehittää uusia syövän hoitomuotoja. Useat tutkimukset ovat osoittanut vakuuttavasti, että neutraloivia vasta-aineita PK2 voi esiintyä voimakas kasvaimen vastainen vaikutus useita eri ihmisen syöpiä hiirimalleissa [1], [6], [8]. Ne positiiviset tulokset proof-of-periaate tyyppisen kokeilut ovat luoneet perustan kehittää edelleen anti-PK2 aineiden pääsyn terapeuttisia. Tässä tutkimuksessa raportoimme havainnot antituumorivaikutuksen synteettisen pieni molekyyli PK2 antagonisti, PKRA7 joka voi kilpailla sitoutumisesta PK2 sen reseptoreihin PKR1 ja PKR2 näin ollen estämällä kyky PK2 aktivoida alavirtaan polkuja [ ,,,0],Zhou, käsikirjoitus valmisteilla]. Päätimme testata PKRA7 kahdessa kasvaimen tyyppiä, glioblastooma ja haimasyöpä, jotka ovat jatkuvasti esillä pahimmat ennusteet kaikkien syöpien puutteen tehokkaan hoidon. Kaksi syöpien näytön hyvinkin erilainen patologinen ominaisuuksia. Glioblastooma on erittäin vaskularisoitunut, ja se on osoittanut jonkin verran herkkyyttä anti-angiogeenisen terapian, kun taas haimasyöpä on usein huonosti vaskularisoitunut, mutta erittäin fibroottisten suuri osa syöpäkasvaimen koostuu peruskudoskomponentit lukien tunkeutunut makrofagit [14] – [16]. Kuitenkin yksi yhteinen piirre sekä glioblastooma ja haimasyöpä on osallistuminen myeloidisolujen [17] – [20]. Toivoimme onko PKRA7 voisi vaikuttaa kasvaimen kasvua kautta estävä vaikutus myeloidisoluissa. Yhdenmukainen tämän olettamukselle, tuloksemme osoittavat selvästi, että PKRA7 on vahva kasvaimen vastainen aktiivisuus sekä syöpien, vaikka erilaisten mekanismien kautta. Lisäksi meidän tutkimus osoittaa, että PKRA7 on potentiaalia tulla yksi komponentti yhdistelmähoidot perinteiseen hoitoon käytetään nykyisin klinikalla ja tämän yhdisteen lupaava kehittää edelleen hoidossa niitä syöpiä, jotka tällä hetkellä ovat erittäin huonon ennusteen.

tulokset

PKRA7 vaimentaa kasvaimen kasvua Nude (nu /nu) hiiren Vieraslajisiirteen malli glioblastoma kautta Angiogeneesin

Vaikka anti-PK2 neutraloivaa vasta-aineen havaittiin aiempien tutkimusten näyttää anti- antituumorivaikutus, selvitimme mahdollisuus, että pienet molekyylit voidaan kehittää saavuttaa sama antituumoritehoon alhaisemmilla kustannuksilla ja helpommin toimitus. Jälkeen biokemiallisesti määritellään molekyyli- luonteen välistä vuorovaikutusta PK2 ja sen reseptorit [21], olemme määrittäneet heksapeptidin aminohapposekvenssi AVTIGA N-terminus PK2 on täysin keskustellut muun nisäkkään ja ei-nisäkäslajeista ja on kriittinen aktivoimiseksi PKR1 ja PKR2 [22]. Mutaatiot tällä alueella mukaan lukien A1M (alaniini metioniini) korvaamalla tai lisäämällä metioniinin N-päähän näkyy voimakas antagonistiaktiivisuus, kun läsnä on sekä PKR1 ja PKR2 stabiilisti ekspressoituu kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO-solut) [22]. Tämän ensimmäisen löytö, olemme syntetisoitiin yli 200 pienimolekyylisiä yhdisteitä, jotka rakenteellisesti jäljittelevät PK2 N-terminaalinen alue mutantin peptidit ja testataan niiden kyky inhiboida kompetitiivisesti aktivaation PK2 reseptoreihin. Tästä aloitusnäyttö, löysimme yli 60 vesiliukoisia yhdisteitä, joilla on estävä vaikutus PK2-reseptoriin vuorovaikutus sitoutumisvakio alle 20 nM (Zhou, käsikirjoitus valmisteilla). Olemme valinneet yhdiste PKRA7 meidän kokeita, koska se voisi estävän tehokkaasti PK2 reseptoreita, IC 50-arvoilla 5,0 ja 8,2 nM PKR1 ja PKR2, vastaavasti (kuva S1), ja mikä tärkeintä, se voi tunkeutua veri-aivoesteen, joka on ominaisuus, joka voi olla kriittinen hoitoon glioblastooma.

tutkia

in vivo

vaikutus PKRA7 on glioblastoma kasvaimen kasvuun, ensin tuotettu ihonalainen ihmisen glioblastooma kasvain nude-hiirissä. 5 x 10

4 D456MG gliooma soluja istutettiin kymmeneen nude-hiiriin ihon alle, ja hiiret erotettiin kahdeksi hoitoryhmään 14 päivää istutuksen jälkeen. Hiiristä ensimmäinen ryhmä sai intraperitoneaalisesti (IP) valvonta hoitoon PEG400 (polyetyleeniglykoli) laimennettuna 1:10 PBS: llä, kun taas toisen ryhmän hiiret saivat IP-injektioita PKRA7 samassa liuoksessa annoksena 20 mg /kg /päivä. Kasvainten kokoa tarkkailtiin joka kolmas päivä ja kasvua dikäyrät (kuvio 1A). 30 päivää istutuksen jälkeen, kasvaimet eristettiin sen jälkeen, kun hiiret tapettiin ja punnittiin (kuvio 1 B). Hiiret käsiteltiin PKRA7 näkyi selvä lasku molemmissa D456MG kasvaimen kasvu ja kasvaimen paino. Määrittää mekanismia, jolla PKRA7 inhiboi ksenografti kasvaimen kasvua, mittasimme mahdolliset muutokset verisuonten tiheyden ja aste nekroosin D456MG kasvaimia käsiteltyä tai käsittelemätöntä tällä yhdisteellä. Kuten on esitetty kuviossa 1C-F, merkittävä lasku suhteessa verisuonen tiheys ja merkittävä kasvu alueilla nekroottisen alueiden PKRA7-käsitellyt tuumorit havaittiin verrattuna kontrolleihin, mikä viittaa siihen, että PKRA7 voi estää kasvaimen muodostumisen pääasiassa estämällä angiogeneesiä kautta PKR1 ja PKR2 ekspressoituu endoteelisolujen samalla tavalla kuin PK2-neutrolizing vasta-aineet [8], [12] – [13].

(A) D456MG soluja SC injektoitiin nude-hiiriin, ja ohjaus ( n = 5) tai PKRA7 (n = 5), hoito aloitettiin, kun tuumorit olivat visuaalisesti havaittavissa (14 päivää). Mittauksia tehtiin 2-3 päivän välein. (B) Keskimääräinen kasvaimen paino ohjaus ja PKRA7 käsitellyn hiiren kasvainten poiston jälkeen. (C) IHC värjäys käyttäen CD34 endoteelisolumarkkeri D456MG SC kasvaimia hiirille on ohjattu tai PKRA7. (D) Kumulatiivinen todennäköisyys aluksen suhteellinen tiheys mitattuna CD34 värjäystä. Verisuonten tiheys kasvainten väheni PKRA7 hoitoon. (E) edustaja kuvaa H & E-värjäystä osien valvonnan ja PKRA7 käsiteltyjen SC kasvaimet (F) kvantifiointi nekroottisen alueiden 5 dioja kunkin kasvaimen hoitoryhmää kohti, prosenttiosuudet nekroottisen alueilla mitattiin ImageJ (* p≤0.05 ). (G) 1 x 10

4 D456MG soluja IC ruiskutetaan nude-hiiriin ja hoito aloitettiin 7 päivää kasvaimen istutuksen. Hiiret hallinnassa (n = 8) tai PKRA7 hoitoa (n = 9) ryhmästä lopetettiin, kun he kehittivät vakavia neurologisia fenotyypin osoitus kasvaimen kasvua kallon sisään.

Näiden lupaavia tuloksia tukahduttaminen ihonalaisen kasvaimen muodostumista PKRA7, käytimme kallonsisäisen inokulaation glioomasolujen arvioida kykyä PKRA7 estää kasvaimen kasvua patologisesti asiaan ympäristössä. Tällä kertaa, hoito aloitettiin 7 päivää 1 x 10

4 D456MG gliooma soluinokulaation päivittäin IP injektiot PKRA7 tai ajoneuvon hallinnan. Hiiret tapettiin neurologisia oireita kasvaa kasvaintaakkaa ilmeni, ja päivämäärät kirjattiin generoimaan Kaplan-Meier käyrä (kuvio 1G). Tässä määrityksessä käsittely PKRA7 huomattavasti pitkittynyt puhkeamista neurologisia oireita kasvaimen taakkaa (keskimääräinen eloonjääminen 38,4 päivä vs. 34,1 päivää varten PKRA7 ja ohjaus, vastaavasti, p≤0.05), mikä osoittaa, että PKRA7 oli tehokas inhiboimaan kasvaimen kasvua kallonsisäinen ympäristö. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa glioomasolulinjaa kuin varten D456G soluja (tietoja ei esitetty).

PKRA7 vaimentaa kasvaimen kasvua Nude (nu /nu) Hiiren Vieraslajisiirteen malli haimasyövän kautta inhibitio Macrophage tunkeutuminen

seuraavaksi testasimme onko PKRA7 voisi olla vaikutusta ksenograftissa kasvua ihmisen haimasyövän soluja johtuen vakiintunut asema myelooisen solujen muodostumiseen haimasyövän. 5 x 10

5 AsPc-1-solut ympättiin nude-hiiriin ihon alle, ja käsittely aloitettiin 7 päivää istutuksen jälkeen noudattaen samaa menettelyä kuin kanssa D456MG glioomasoluissa. Kuten kuviossa 2A, kasvuvauhti AsPc-1-soluissa tukahdutettiin PKRA7, mikä vähentää merkittävästi keskimääräinen paino kasvainten (kuvio 2B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun eri ihmisen haimasyövän solulinja, CFPac-1, käytettiin sijasta AsPc-1-soluissa (kuvio S2).

(A) AsPc-1-soluja SC injektoitiin paljaisiin hiiriin ja valvonta (n = 4) tai PKRA7 (n = 5), hoito aloitettiin, kun tuumorit olivat visuaalisesti havaittavissa (9 päivää). Mittauksia tehtiin 2-3 päivän välein. (B) Keskimääräinen kasvaimen paino ohjaus ja PKRA7 käsitellyn hiiren kasvainten poiston jälkeen (* p≤0.05). (C) edustaja H & E-liukuu kontrollista ja PKRA7 käsitelty kasvaimia. (D) kvantifiointi nekroottisen alueita 5 dioja kunkin kasvaimen kohden testiryhmässä prosenttiosuudet nekroottisen alueilla mitattiin ImageJ (p = 0,205719). (E) IHC värjäys käyttäen F4 /80 hiiri makrofagimarkkeri of AsPc-1 SC kasvaimia käsiteltiin kontrolli tai PKRA7. (F) kvantifiointi keskimääräinen makrofagien infiltraatiota AsPc-1 käsitellyt kasvaimet ohjaus (n = 4) tai PKRA7 (n = 5), 5 liukuu kutakin kasvaimen hoitoryhmää kohti (* p≤0.05).

Voit selvittää mahdolliset mekanismia taustalla vähentää merkittävästi kasvaimen kasvua johtuen PKRA7 hoitoon, tutkimme tuumorisektioiden merkkejä muutoksista angiogeneesin ja kuolion. Ei ollut eroa tiheys verisuonten vaikka oli vähemmän aluksia per näkökenttä havaittujen verrattuna glioblastooma osien (tietoja ei esitetty) ja samalla tasolla nekroosia havaittiin kasvainten peräisin käsiteltyjen ja kontrollihiirten (kuvio 2C, D). Sen sijaan, oli merkittävä väheneminen makrofagien tunkeutui kasvaimia eristetty PKRA7-käsiteltyjen hiirten mitata värjäämällä intensiteetti hiiren makrofagimarkkeri F4 /80 (kuvio 2E, F). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että PKRA7 voi estää haiman kasvainten kasvua kautta eri mekanismilla estämällä PKR1- ja PKR2 ilmentäviä makrofagien tunkeutuminen kasvaimeen microenvironment sijaan tukahduttaa angiogeneesiä, havainto sopusoinnussa fenotyyppiset piirteet ihmisen haimasyövän huonosti vascularized mutta näytteille runsas desmoplastic fibroosia ja joka sisältää suuren määrän soluttautunut myeloidisolujen lukien makrofagit [10], [15].

PKRA7 Estää endoteelisolujen Capillary Haarautuvan ja myeloidisolun Migration

tulokset

in vivo

ksenograftin tutkimukset ihmisen gliooma ja haimasyövän soluja tuki voimakkaasti käsitystä, että anti-kasvain aktiivisuuden PKRA7 voisi välittyvän kaksi hyvin eri mekanismeja. Koetin Tämän lisäksi solutasolla, teimme

in vitro

määrityksissä arvioida PKRA7 on angiogeenisen aktiivisuuden endoteelisolujen sekä muuttavia kykyä myeloidisolujen. Sen määrittämiseksi, ovatko PKRA7 vaikuttaa kykyyn endoteelisolujen muodostamiseksi kapillaariputki kaltainen verkon tärkeä indikaattori angiogeneesin [23], käytimme ikuisti ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (IHMVECs). Soluja käsiteltiin 200 ng /ml rekombinanttia PK2 yksin tai PK2 plus 1 ug /ml PKRA7 ja maljattiin ohut kerros Matrigel. Tämä pitoisuus PKRA7 käytettiin meidän

in vitro

kokeita, koska se on lähellä pitoisuus PKRA7 verenkierrossa hiirien meidän

in vivo

kokeita pysyessä myrkyttömiä soluihin kudosviljelmässä (tuloksia ei ole esitetty). Kuten kuviossa 3A on esitetty, PKRA7 esti tehokkaasti PK2 aiheuttama hiussuonten haarautuva mitattuna yhteyksien määrä solujen välillä, mutta sillä ei ollut vaikutusta VEGFA aiheuttaman kapillaari haarautuva (määrällisesti esitetty kuviossa 3B). Identtiset tulokset saatiin käyttämällä kahta ylimääräistä endoteelisolujen rivit: hiiren alkion endoteelisolujen ja primäärisistä ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (tuloksia ei ole esitetty). Spesifisyys anti-PK2 aktiivisuutta tässä määrityksessä vahvistettiin edelleen esittelyn samanlainen vaikutus anti-PK2 polyklonaalista antiseerumia (kuvio S3 ja tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PKRA7 voi spesifisesti estää angiogeenisen vaikutuksen PK2 endoteelisoluissa.

(A) IHMVECs maljattiin Matrigel indikoidun hoitoryhmissä. Edustavia valokuvia otettiin 8 tunnin kuluttua pinnoitus. (B) keskimääräinen lukumäärä yhteyksiä solujen laskettiin ja analysoitiin. Tulokset on normalisoitu data 3 erilliselle kokeelle. Lisäämällä PKRA7 merkittävästi estää PK2 aiheuttaman kapillaari haarautuva (* p≤0.05). (C) 1 x 10

5 THP-1-solujen päälle kammion siirtoaltaat annettiin kulkeutua 4 tuntia. Solut kiinnitettiin, värjättiin ja solujen lukumäärä per näkökentän lasketa. Tulokset ovat normalisoitu keskimäärin 3 riippumattoman kokeen. Lisääminen PKRA7 merkittävästi esti PK2 aiheuttaman monosyyttien muuttoliike (* p≤0.05). (D) 7,5 x 10

4 RAW264.7 solujen päälle kammion siirtoaltaat annettiin kulkeutua 18 tuntia. Solut kiinnitettiin, värjättiin ja solujen lukumäärä per näkökentän lasketa. Tulokset ovat normalisoitu keskimäärin 3 riippumattoman kokeen. Lisääminen PKRA7 merkittävästi esti PK2 aiheuttaman syöjäsolujen (* p≤0.05). (E) Keskimääräinen mitatun luminesenssin kasvaimen jälkeen IP-injektion lusiferaasi-leimatun RAW-solut kontrolli- (n = 4) tai PKRA7 (n = 4) käsitellyillä hiirillä SC AsPc-1 kasvaimia 30 päivää istutuksen jälkeen. Keskimääräinen koko lusiferaasi määrä oli pienempi hiirissä, joita käsiteltiin PKRA7 kontrolliin verrattuna (* p≤0.05). (F) qPCR mittaamiseksi vaikutus PKRA7 ilmenemistä kemokiinien ja kemokiinireseptorien, jotka havaittiin indusoituvan PK2 hoitoon. Tiedot mRNA-tasolla muutoksia esitetty log2 CT arvo muuttuu. PKRA7 estää säätelyä CCL27, CCR10: n, CCR4, CCR5, ja CCR6 (* p≤0.05).

vaikutuksen määrittämiseksi PKRA7 on PK2 aiheuttamaa kulkeutumista myeloidisoluissa käytimme ihmisen monosyytti THP-1 käyttäen transwell migraatiokokeessa. Kuten kuviossa 3C on esitetty, 1 ug /ml PKRA7 tehokkaasti heikensi PK2-indusoidun migraation THP-1-soluissa, mutta ei siirtyminen näiden solujen kohti CCL2 tai monosyytti-chemotatic proteiini 1 (MCP-1), joka on tunnettu kemoattraktantti THP -1 [24] – [25]. Lähes samat tulokset havaittiin hiiren makrofagisolulinjassa, RAW264.7 kanssa PKRA7 nimenomaan estää PK2 muuttoliikkeelle mutta ei muuttoliikkeen aiheuttama CXCL12, tässä kutsutaan SDF-1α (kuvio 3D). Siksi PKRA7 estää spesifisesti PK2 aiheuttamaa kulkeutumista myeloidisolujen sekä ihmisen että hiiren alkuperästä.

arvioida PKRA7 siirtolaisuudesta /tunkeutumisen hiiren makrofagien osaksi mikroympäristöä ksenograftikasvaimissa muodostaman ihmisen haimasyövän soluja mittasimme kertymistä kasvainten lusiferaasin-leimatun RAW264.7-makrofagisolujen 24 tunnin kuluessa niiden IP-injektiona nude-hiiriin 30 päivää sen jälkeen, kun oli implantoitu ihon alle AsPc-1 syöpäsoluja. Kuten kuviossa 3E, merkittävä lasku luminoivaa lähettämän signaalin hiiren makrofagisolujen havaittiin hiirissä, joita hoidettiin PKRA7 verrattuna kontrolliryhmän hiirillä. Nämä tulokset osoittavat, että PKRA7 pystyy estämään syöjäsolujen /tunkeutumisen tuumoripaikkaan käytettäessä

in vivo

ympäristössä, estäen siten kyky makrofagien vaikuttamaan myönteisesti kasvuun ksenograftikasvaimissa.

edelleen tutkia mekanismia, jolla PKRA7 estää PK2 aiheuttamaa syöjäsolujen, suoritimme sytokiini matriisi kvantitatiivista-reaaliaikaista PCR: THP-1-solut, jotka oli indusoitu erilaistumaan makrofagisoluissa. Joukossa joukko 95 ihmisen kemokiini /sytokiini ligandien ja niiden reseptorien, viisi näkyvissä merkittävää induktio ilmaisussaan hoidon jälkeen PK2 lukien CCL27, CCR10: n, CCR4, CCR5, ja CCR6 (kuva S4). Tärkeää on, ainakin neljä näistä indusoidun molekyylien tiedetään olevan osallisena parantaa kulkeutumista myeloidisoluissa ja kaikkien niiden induktion PK2 oli tylppäpäiseksi PKRA7 (kuvio 3F), mikä viittaa vahvasti siihen, että suppressio PK2 indusoiman näiden kemokiinien ja reseptorit taustalla ensisijainen mekanismi antituumorivaikutuksen of PKRA7 yhteydessä haimasyövän.

PKRA7 Parantaa teho standardin Therapies glioblastoma ja haimasyöpä ksenograftimalleissa

Vaikka PKRA7 näkyvissä voimakas anti-kasvain toimintaa yhteyksissä sekä glioblastooma ja haimasyöpä, se ei todennäköisesti kehittynyt terapeuttinen aine yksinään. Sen testaamiseksi PKRA7 voisi lisätä tehoa standardi kemoterapeuttisen hoidon glioblastooma, tutkimme vaikutus tämän yhdisteen yhdistettynä temotsolomidi, jota käyttävät nykyään klinikalla tähän sairauteen [26] – [27]. Seuraavat vakiintunut koemenettely arvioimiseksi Yhdistelmäkäytön vaikutus hoidon vierassiirrekokeissa hiiren malleissa [28] – [29], 1 x 10

4 D456MG soluja istutettiin kallonsisäisesti ja sen jälkeen käsittelemällä 10 mg /kg temotsolomidia viiden päivän ajan, ja sitten tai ilman PKRA7 hallinnon aikana jäljellä päivän kokeissa. Kuten kuvassa 4A on esitetty, hoito sekä temotsolomidia ja PKRA7 pitkäaikainen puhkeamista neurologisia oireita kasvaimen taakkaa verrattuna hiirillä, jotka saivat kontrolli, temotsolomidi tai PKRA7 yksinään, mikä osoittaa, parannettu vaikutus monimuotoiset hoidon aineet inhiboimaan kallonsisäistä gliooma kasvua nude-hiirissä (keskiarvo selviytyminen oli 49,8 päivää PKRA7 plus temotsolomidi vs 44,6 päivää joko temotsolomidia tai PKRA7 yksin vs. 38,6 päivää valvontaa).

(A) Kaplan-Meier käyrä nude-hiirten jälkeen temotsolomidia ja PKRA7 hoitoon seuraavissa IC injektion 1 x 10

4 D456MG soluja. Hoito 10 mg /kg temotsolomidia tai ohjaus aloitettu 3 päivää sen jälkeen IC injektion yhteensä 5 peräkkäistä päivittäin hoitoja. Käsittely PKRA7 tai ohjaus aloitettu 7 päivää IC injektion ja jatkoi ajaksi kokeen. 5 hiirtä per kunnossa. (B) AsPc-1-soluja SC injektoitiin nude-hiiriin, ja ohjaus (n = 10) tai PKRA7 (n = 10), hoito aloitettiin, kun tuumorit olivat näkyvissä (7 päivää). Hoito 100 mg /kg gemsitabiinia (n = 10) tai kontrolli (n = 10) aloitettiin 7 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen, ja annettiin joka 4 päivä kahden viikon ajan, yhteensä 4 käsittelyä (#). Mittauksia tehtiin joka 3 päivä. 5 hiirtä per kunnossa. (C) Keskimääräinen kasvaimen painon valvonta, gemsitabiinin, PKRA7 ja gemsitabiinin sekä PKRA7-käsitellyn hiiren kasvainten poistamisen jälkeen (* p≤0.05).

haimasyöpä, gemsitabiini on yksi tärkeimmistä kemoterapeuttisen huumeita käytetään nykyään klinikalla ja se testattiin aiemmin yhdistelmähoidossa tutkimuksia AsPc-1-soluissa [30]. Meidän kokeissa, 5 x 10

5 AsPc-1-soluja implantoitiin ihon alle nude-hiiriin, joita oli käsitelty PKRA7 ja gemsitabiinin (100 mg /kg) 7 päivää myöhemmin. Kuten on esitetty kuviossa 4B, on selvää, että kasvaimia hiiret saivat sekä gemsitabiini ja PKRA7 olivat merkittävästi pienempiä kuin hiiristä hoidettiin vain gemsitabiinin tai PKRA7. Nämä tulokset viittaavat siihen, että monimuotoiset gemsitabiini- ja PKRA7 voisi olla vahvempi antituumorivaikutuksen kuin tavallinen hoito vähentää haimasyövän ksenograftin kasvaimen kasvua mallissamme.

Keskustelu

tumorigeneesin on monimutkainen prosessi, joka on paljon muutakin kuin lisääntyvien syöpäsoluja. Kasvainsolut tuettu ja tukee ympäröivä kasvain strooman mikroympäristön, joka on täynnä heterogeeninen sekoitus solujen, kuten fibroblastien, endoteelisolut ja immuunijärjestelmän soluihin [31]. Nämä solut reagoivat signaaleihin laajentaa kasvaimen erittämällä tekijät oman jotka voivat ylläpitää kasvua signaalin, uudistaa soluväliaineen, edistää angiogeneesiä ja ohjata rooli immuunijärjestelmän soluja. Angiogeneesi on pitkään ymmärretty olevan tärkeä osa kasvaimen kehittymisen ja monia tutkimuksia on tehty estää tämän prosessin [32]. Vaikka tärkeitä angiogeenisten tekijöiden on tunnistettu, kuten VEGF, terapeuttisina vastaan ​​VEGF signalointireitille ei ole osoitettu olevan yleisesti onnistunut. Monet syövät ovat resistenttejä VEGF-hoidon tai tullut tulenkestävä antamista näiden hoitojen, jolloin uusiutuminen joka on joskus aggressiivisempi kuin primaarikasvaimen [14], [16], [33] – [38].

on tarpeen tunnistaa ja kohdistaa lisäksi signalointireittejä, jotka voivat edistää angiogeneesiä tai muita prosesseja, jotka on osoitettu olevan tärkeitä tuumorin etenemistä, kuten makrofagien tunkeutumista. PK2 ja sen reseptorit ovat osa signalointireitin osallisena myeloidisolun mobilisaatio [8]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että CD11 b

+ Gr1

+ myelooinen prekursorisolut voivat edistää angiogeneesiä ja kasvaimen kehittymisen eri syöpätyyppien [8], [37], [39]. Makrofaagit johdettu näiden esiastesolujen kasvaimen mikroympäristössä voidaan myös erittää sytokiineja, jotka vaikuttavat suoraan tuumorisolun kasvuun. Viimeaikaisissa tutkimuksissa, kasvaimen vastainen teho anti-PK2-vasta-aine on verrattuna hoitoon, jossa anti-VEGF-vasta-aineen ja sen havaittiin olevan lähes yhtä tehokas estämään taudin etenemistä siirtogeenisen hiiren mallia haiman β-solujen kasvainten synnyssä, kun taas yhdistelmä kahden vasta-aineen osoitti vielä voimakkaampi vaikutus estämällä ihon alle kasvun eri ihmisen syöpäsolulinjoissa (paksusuolen syöpä, rabdomyosarkooma) ja hiiren kasvainsoluja (mastosytooma, lymfooma) [8], [39]. Anti-PK2-vasta-aine käsittely vähensi myös määrää verenkierrossa ja kasvaimen läpäisevistä CD11

+ Gr1

+ myeloidisten, myös luuytimestä peräisin olevia makrofageja, joiden on osoitettu välittävän vastareaktioita anti-VEGF-hoidot useita hiiren -ksenografti tuumorimalleissa [8], [37]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, PK2 oikeutetuksi kohteena syövän hoidossa.

Vasta-aineisiin perustuvia hoitoja ovat merkittävä osa syövän hoidossa vaihtoehtoja nykypäivän klinikoilla. Kuitenkin tutkimukset potilaiden ja hiiri malleja glioblastooma ja haimasyövän ovat osoittaneet, että nämä tyypit syöpä voi olla resistenttejä tai tulenkestävä anti-VEGF signalointi hoitojen [14], [16], [33], [35] – [37] . Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä kestävä vaste voi olla yhteisiä ylimääräisiä syöpien, kuten rinta- ja paksusuolen syöpä [34], [40] – [41]. Potilaat voivat siis hyötyvät ylimääräisiä hoitoja, jotka kohdistuvat vuorottelevat reitit yhdistettynä anti-VEGF signalointi hoitoja estää tulenkestävän vastauksia. Siten pienmolekyylisalpaajien tarjota vaihtoehto terapeuttinen lähestymistapa, koska ne voivat silti olla erityinen kohteisiinsa samalla kustannustehokkaampaa valmistaa. Myös jotkut lääkehoitoja vaaditaan ylittämään veri-aivoesteen sairauksien hoitoon, kuten glioblastooma ja pienmolekyylisalpaajien ovat hyviä ehdokkaita tätä tarkoitusta varten. Tässä suhteessa meidän osoitus siitä, että PKRA7 kykenee läpäisemään veri-aivoesteen hiiren ja toimii estämään kallonsisäinen ksenograftin kasvaimen muodostumisen glioomasolut esittää vaihtoehtoisena strategiana estää kasvaimen angiogeneesiä mekanismilla, joka eroaa anti-VEGF, koska PK2 tehostaa angiogeneesiä kautta G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori aktivoituu reittejä [7].

Desmoplastic strooman on piirre haimasyövän ja voivat sisältää korkeita kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM), erityisesti leviämisrintamassa haimasyövän [15], [18]. Tämä tunkeutumisen makrofagien ei katsota vaikuttavan sairauden etenemiseen ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen [18]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoivat, että immunosuppressiivista solut mukaan lukien TAM, myelooinen johdettuja vaimennin soluja (MDSCs) ja säätelijä-T-solujen (T

reg) löydettiin suurina määrinä aikaista loppuvaiheissa etenee syöpään verrattuna normaaliin kudokseen hiirimallissa pre-invasiivisia ja invasiivisia haiman adenokarsinooma [42]. PK2 voi olla ratkaiseva rooli monimutkainen ja dynaaminen suhde haimasyöpäsoluissa ja nämä stroomasolujen sääntelyn ansiosta rekrytointi ja toiminnan myeloidisolujen. Itse asiassa on havaittu, että PK2 indusoi tuotanto kemokiinien ja osallistuvat reseptorit kulkeutumista myeloidisoluissa ja PKRA7 voisi estää tämän induktion (kuvio 3F). Kemokiinireseptorit, CCR10: n ja CCR4, tunnettu vastata Chemo-houkuttimia CCL27, MCP-1, ja CCL22, on osoitettu olevan kriittinen indusoimisessa liikkeelle ja itseohjautuva myeloidisolujen ja leukosyyttien kasvainkohtaan [43]. Kemokiinireseptori CCR6 ja sen ligandin CCL20 on osallisena dendriittisolujen maahanmuuton ja näyttävät olevan tärkeää säilyttää normaalin makrofagin väestöstä, koska CCR6

– /- hiiret osoittivat vähentynyt määrä makrofagisoluissa [44]. Meidän tutkimukset osoittivat, että haiman kasvaimia ovat huonosti vascularized ja sisältää suhteellisen vähän endoteelisolujen käsittelemättömiä hiiriä ja vahvisti, että muutokset verisuonten tiheyden vuoksi PKR inhiboi PKRA7 käsitellyissä hiirissä olisi todennäköisesti hyvin pieni ja sitä on vaikea havaita.