PLoS ONE: EZH2 väheneminen Estää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa
tiivistelmä
Enhancer of Zeste 2 (EZH2) proteiini on raportoitu stimuloivan solujen kasvua joidenkin syöpien ja siksi katsotaan edustavan mielenkiintoinen uusi kohde terapeuttiselle interventiolle. Täällä tutkimme mahdollisesta roolista EZH2 kasvulle valvontaa koolonkarsinoomasoluissa. RNA-interferenssi (RNAi) -välitteisen solunsisäinen EZH2 ehtyminen johti solusyklin pidätyksen koolonkarsinoomasoluja klo G1 /S siirtyminen. Tähän liittyi vähenemiseen solun numerot kun ohimenevän transfektion synteettisen
EZH2
-targeting siRNA: t ja estämällä niiden pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti kun stabiili ilmentyminen vektorivälitteisten siRNA. Olemme lisäksi testataan, onko EZH2 voi tukahduttaa kasvua estävää
p27
geeni, kuten raportoitu haimasyöpä. Kuitenkin ilmaus analyysit koolonsyöpäsolulinjaa ja paksusuolensyöpä koepaloja ei havaittu johdonmukaista korrelaatiota EZH2 ja p27 tasolla. Lisäksi EZH2 ehtyminen ei uudelleen indusoi
p27
ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa, mikä osoittaa, että
p27
tukahduttamisen EZH2 voi olla solu- tai kudosspesifisiä. Koko genomin transcriptome -analyyseissä solun geenit vaikuttavat EZH2 ehtyminen koolonsyöpäsolulinjaa. Ne sisältyvät useat syöpään liittyvien geenien liittyy soluproliferaatioon tai invaasio, kuten
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, ja
Tob1
. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että EZH2 ehtyminen estää kasvun koolonkarsinoomasoluissa. Nämä havainnot saattavat tuoda etuja hoitoon paksusuolen syöpä.
Citation: Fussbroich B, Wagener N, Macher-Goeppinger S, Benner A, Fälth M, Sültmann H, et al. (2011) EZH2 väheneminen Estää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10,1371 /journal.pone.0021651
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat
vastaanotettu: 2. helmikuuta 2011; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2011; Julkaistu: 13 heinäkuu 2011
Copyright: © 2011 Fussbroich et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.
kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Enhancer of Zeste Homologi 2 (EZH2) proteiini on keskeinen osatekijä Polycomb- Sortavat Complex2 (PRC2) ja muuttaa transkription epigeneettisenä tasolla vaikuttamalla histoni ja DNA: n metylaatio [1]. EZH2 on yli-ilmentynyt useissa maligniteettien, mukaan lukien suuria ihmisen syöpien, kuten eturauhas- syöpä, rintasyöpä, haimasyöpä, munuaissyöpä, tai kohdunkaulan syöpä [2] – [6].
On kokeellista näyttöä siitä, että
EZH2
voi suoraan edistää syövän syntymistä toimimalla
bona fide
onkogeeni. Erityisesti, tiettyjen syövän yksiköt, on raportoitu, että EZH2 stimuloi solujen lisääntymistä, lohkot apoptoosia, edistää solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden, aktivoi kasvaimen angiogeneesi, ja indusoi kasvainten hiiren malleissa [2] – [11]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että EZH2 inhibitio voi edustaa houkutteleva uusia strategia epigeneettisiä syövän hoidossa [1], [12].
Viime aikoina on kuitenkin myös tietoja viittaa siihen, että EZH2 voisi toimia tuumorisuppressoriproteiinia vuonna tietyissä kudoksissa [13]. Homotsygoottinen inaktivoivan
EZH2
mutaatioita havaittiin osaan myelooinen maligniteettien [14], [15], nostaa sitä mahdollisuutta, että EZH2 voi joko käyttää pro- tai anti-onkogeeninen toimintaa, solutyypissä-riippuvaisella tavalla [ ,,,0],16]. Toinen taso monimutkaisuus on lisännyt havaitseminen heterotsygoottista
EZH2
mutaatioiden osan lymfoomat siemennestettä-keskus alkuperä [13]. Tässä tapauksessa, mutantti proteiini näyttää nostaa H3K27 metylaation, kriittinen alavirran kohde EZH2, toimimalla yhdessä villityypin proteiinia ilmennetään mutatoimattomia alleelin [17].
peräsuolen syöpä on neljänneksi yleisin syöpä muodossa ihmisillä. Joka vuosi yli 1,2 miljoonaa yksilöt sairastuminen ja yli 600000 kuolee sen [18]. Vaikka korkea biolääketieteen merkitys tämän kasvain, tutkimuksia EZH2 tila ja funktio koolonkarsinoomasoluissa ovat hajanaisia ja osittain ristiriitaisia. Esimerkiksi kun EZH2 johdonmukaisesti raportoitu yliekspressoituvan paksusuolensyövät, EZH2 ekspressiotasot korreloi positiivisesti [19], negatiivisesti [20], [21], tai ei lainkaan [22], jossa selviytymisen paksusuolen syöpäpotilaiden. Lisäksi tietojemme mukaan ainoastaan yhden toiminnallisen tutkimuksessa tutkittiin miten EZH2 kasvulle koolonkarsinoomasoluissa, mutta ei nähdä vaikutus
EZH2
geenien [22]. Tämä havainto on voimakas kontrasti ja kasvua edistävää roolia EZH2 raportoitu useita muita syöpää yksiköt [2] – [6]. Tässä työssä olemme käsitelleet tätä kysymystä analysoimalla EZH2 ilmentyminen koolonkarsinoomasoluissa
in vitro
ja
in vivo
, ja tutkimalla osuus EZH2 kasvua kolorektaalisyövän solulinjojen .
tulokset
ilmentäminen EZH2 paksusuolen syöpäsoluissa
in vitro
ja RNA-interferenssi-välitteisen
EZH2
tukahduttaminen
jotta tutkia ilmentymistä EZH2 paksusuolen syöpäsoluissa
in vitro
, analysoitiin paneeli kaksitoista kasvain- koolonsyöpäsolulinjoissa immunoblottauksella ja qRT-PCR: llä. Kaikki testatut solulinjat ilmensivät helposti havaittavia määriä EZH2-proteiinin (kuvio 1A) ja
EZH2
mRNA: ta (kuvio 1 B). Myöhempinä RNA-interferenssi (RNAi) analysoi, me syntyy kolme synteettisen siRNA kohdistaminen eri alueilla
EZH2
transkriptio. Kaikki kolme siRNA salpasi tehokkaasti EZH2 ilmentymistä (kuvio 1C). Koska mahdollisia off-tavoite vaikutuksia yksittäisten siRNA: iden voidaan vähentää siRNA yhdistämällä [23], [24], testasimme myös altaan koostuu kaikista kolmesta
EZH2
-targeting siRNA. Tämä siRNA-allas myös tehokkaasti estetty EZH2 ilmentymistä (kuvio 1C), ja käytettiin edelleen toiminnallisia analyysejä.
immunoblot-analyysi EZH2 proteiinin ilmentymisen. Tubulin, lastaus valvonta. B qRT-PCR analyysejä
EZH2
mRNA ilmaisun. Tiedot esitetään kertaiseksi eroja geenien ilmentyminen, normalisoidaan taloudenhoito geeni indeksi. Keskihajonnat kaksi käänteistranskriptio toistojen on merkitty. C modulointi EZH2 proteiinin ilmentymisen RNAi. EZH2 ilmentyminen määritettiin immunoblot-analyysillä 48 tuntia transfektion jälkeen, jossa
EZH2
-targeting siRNA: t tai ohjaus siRNA: ita, kuten on osoitettu. siEZH2pool: yhdistetty
EZH2
-targeting siRNA. Tubulin, kuormituksen valvonta.
EZH2
tukahduttaminen johtaa G1 pidätyksen ja kasvun esto koolonkarsinoomasoluissa
Seuraavaksi testasimme vaikutus RNAi-välitteisen
EZH2
tukahduttaminen kasvuun HCT116, LoVo, ja DLD1 peräsuolen syövän soluja. siRNA-hoito johti on vähentää huomattavasti EZH2 tasoilla kaikilla testatuilla paksusuolen syöpäsolulinjoissa ja, kuten aiemmin on raportoitu muille soluille, [7], joka samanaikainen lasku sykliini D1 ilmentymisen (kuvio 2A).
immuunianalyyseilla of HCT116, DLD1, ja LoVo solut osoittavat tehokasta downregulation EZH2 ilmaisun RNAi. Sykliini D1 tasot on merkitty. Tubulin, lastaus valvonta. B Cell kaarianalyysien FACS. Soluja käsiteltiin kaksi ohjaus siRNA: t tai
EZH2
-targeting siRNA. Prosenttiosuudet solujen G1, S tai G2 /M-vaiheisiin solusyklin on merkitty. C kokoaminen solusyklin analyysit kolmesta itsenäisestä kokeesta. Keskihajonnat on merkitty. Tähdellä yhtäläiset p≤0.05, kaksinkertainen tähdellä yhtäläiset p≤0.01, ei riittävä ei merkittävää.
Cell kaarianalyysien fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) suoritettiin rinnakkain. Ne paljastivat tilastollisesti merkittävä kasvu G1 populaatioiden ja samanaikainen väheneminen S-vaiheessa populaatioissa, kun
EZH2
tukahduttaminen. Tyypillisiä FACS käyrät on esitetty kuvassa 2B, kooste tuloksista kolmen erillisen kokeen on esitetty kuviossa 2C. Nämä tulokset osoittavat, että
EZH2
tukahduttaminen aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 /S rajan ja siksi voi toimia antiproliferatiivisia paksusuolen syöpäsoluissa.
Edelleen Tämän kysymyksen, solumäärä analyysit paksusuolisyövän solulinjat tehtiin. RNAi-estoa
EZH2
ilmaus johtanut merkittävään vähentämiseen solujen määrä, mikä näkyi selvästi 48-72 tuntia transfektion synteettisten siRNA: iden (kuvio 3A), mikä osoittaa, että
EZH2
hiljentäminen tulokset kasvun eston koolonkarsinoomasoluissa.
Solulaskennat seuraavan ohimenevän transfektion synteettisillä ohjaus siRNA (sicontr-1) tai
EZH2
-targeting siRNA (siEZH2 pool). Käyrät edustavat suhteellinen solujen määrä, ilmoitettuina ajankohtina kuluttua siRNA transfektion. Cell numerot transfektio (ajankohtana 0) asetettiin 1,0. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, keskihajonnat on merkitty. Tähdellä yhtäläiset p≤0.05, ei riittävä ei merkittävää. B Pesäkkeenmuodostusta määrityksiä. HCT116, LoVo, DLD1, ja RKO-solut transfektoitiin stabiilisti ilmentävien plasmidien kaksi eri shRNAs vastaan
EZH2
(pCEP-shEZH2-1, pCEP-shEZH2-2) tai kaksi ohjaus shRNAs (pCEP-shluc tai pCEP- shcontr-1). Kokeet itsenäisesti toistettiin ainakin kolmesti, jossa yhdenmukaiset tulokset.
validoimiseksi antiproliferatiivinen vaikutus
EZH2
eston koolonkarsinoomasoluissa riippumaton menetelmällä, suoritimme pesäkemuodostusta määrityksiä. Kaksi eri
EZH2
-targeting siRNA: ita saatiin stabiilisti ekspressoitiin valittavissa ekspressointivektoreilla HCT116, LoVo, DLD1, ja RKO soluja, 13 15 päivään. Sekä
EZH2
-targeting siRNA: t johtivat selvästi vähentämistä pesäkemuodostuksen kapasiteetti kaikkien testattujen koolonsyöpäsolulinjoissa verrokkiin siRNA-käsitellyissä soluissa (kuvio 3B). Morfologiset näkökohdat, FACS-profiilit, ja terminaali deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP nick end merkinnät (TUNEL) analyysit eivät toimittaneet todisteita lisääntynyt apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa upon RNAi-välitteinen
EZH2
tukahduttamisen (tuloksia ei ole esitetty).
Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että EZH2 ehtyminen indusoi solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa ja estää niiden kasvun koolonkarsinoomasoluissa.
Tissue Micro Array analyysi EZH2 ilmentymisen paksusuolen adenoomia ja syöpiä
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että EZH2 on yliekspressoituvat merkittävästi paksusuolen syövissä verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksessa [19] – [22]. Kuitenkin data verrataan EZH2 ilmaisun hyvänlaatuisia paksusuolen adenoomia vastaan paksusuolen syöpä on, että tietomme, ei ole vielä saatavilla. Siksi suoritettiin immunohistokemiallinen analyysit käyttäen kudoksen microarray kattaa 24 adenoomia, 25 G1 karsinoomat, 24 G2 karsinoomat, ja 24 G3 karsinoomat. Verrattuna paksusuolen adenoomia, EZH2 ekspressio lisääntyi merkitsevästi paksusuolikarsinoomat (kuviot. 4A ja 4B). Analyysit paksusuolen syöpiä, jotka edustavat eri asteita histologisia erilaistamattomuuden (kasvoi G1-G3) paljasti suuntauksen edelleen lisäystä EZH2 ilmaisun vähemmän eriytetyn syöpien, joka ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4B).
immunohistokemiallinen analyysit paksusuolen adenoomia ja paksusuolen syövän koepaloja edustavat yhä astetta histologiset erilaistamattomuuden (G1-G3). Mustat nuolet: karsinooma; valkoiset nuolet: sidekudosta. Mittaviivat 50 pm. B Laatikko juoni EZH2 proteiinin ilmentymisen. Ekspressiotasot EZH2 lisättiin merkittävästi karsinoomia verrattuna adenoomia (p 0,001). Erot EZH2 ilmaisun välillä G1, G2, ja G3 karsinoomat eivät olleet merkitseviä (p = 0,185).
EZH2 ja p27 ilmaisua eivät korreloi paksusuolensyöpä
sykliiniriippuvainen -inhibiittori p27 (myös nimeltään Kip1) on kasvua inhiboiva proteiini, joka estää solusyklin etenemistä on G1 /S-siirtymä [25]. Paksusuolen syövät, p27 tasot ovat usein alhainen [26], [27]. Mielenkiintoista on, että se oli raportoi äskettäin, että EZH2 ehtyminen johti p27 uudelleen ilmentymisen haiman syöpäsoluissa, mikä osoittaa, että EZH2 voivat edistää kasvainsolujen proliferaation tukahduttamiseen
p27
[4]. Ottaen huomioon havaintomme että EZH2 edistää solujen lisääntymistä ja stimuloi G1 /S solusyklin etenemistä koolonkarsinoomasoluissa, me käsitteli kysymystä siitä,
p27
on tukahdutettu mukaan EZH2 paksusuolen syövän sekä.
immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että paksusuolen syövät esiintyi merkittävästi vähentynyt ydin- P27 ja suuntaus alennettua sytoplasman p27-proteiinin tasot (kuvio 5A), verrattuna paksusuolen adenoomia. Sisällä syöpä ryhmä, lisäämällä astetta syöpäsolun erilaistamattomuuden (G1-G3) havaittiin tilastollisesti ei-merkitsevä suuntaus vielä laskua p27 ilmaisun (kuvio 5A). Yleisesti, nämä tulokset ovat vastakkaiset havainnot saatu EZH2 ilmentymistä (kuvio 4B), nostaa sitä mahdollisuutta, että EZH2 tasot voivat negatiivisesti korreloivat p27 tasoilla. Kuitenkin EZH2 ja p27 tasot eivät merkittävästi korreloi yksilön syövissä (n = 68) on potilasta kohti perusteella, eli kasvaimia, jotka ovat peräisin samasta potilaasta (kuvio 5B). Tämä puute yhdistyksen sovelletaan analysointiin EZH2 määrä suhteessa sekä ydin- tai sytoplasmista p27 ekspressiotasot (Spearmanin rho korrelaatiokertoimet r = 0,187, p = 0,572 ja r = -0,0623, p = 0,613, tässä järjestyksessä).
Box tontit ydin- ja sytoplasmaattinen p27-proteiinin ilmentymistä paksusuolen adenoomien ja karsinoomien (G1-G3). Ekspressiotasot ydin- p27 olivat merkittävästi alhaisemmat karsinoomia kuin adenoomien (p = 0,026), sytoplasman p27 tasot kehittyi samaan tapaan, joka ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,173). Erot p27 ilmaisun välillä G1, G2, ja G3 karsinoomat eivät olleet merkittäviä. B immunohistokemiallinen värjäys pariksi näytteitä koolonsyöpien ei havaittu merkittävää korrelaatiota EZH2 ja p27 ekspressiotasoja. Esimerkkejä 4 eri syöpiä (I-IV) värjättiin EZH2 (ylempi paneeli) ja p27 (alempi paneelit), tässä järjestyksessä. Mittaviivat 50 pm.
Näiden tavoitteiden mukaisesti
in vivo
havaintojen pohjapinta tasot EZH2 proteiinin ilmentymisen ei aina korreloinut p27-proteiinin tai mRNA tasojen paksusuolisyöpäsolulinjassa linjat
in vitro
(kuvio 6A ja 6B). Tutkimme myös, onko p27 ekspressiotasot vaikuttavat EZH2 ehtyminen HCT116, LoVo, ja DLD1 koolonkarsinoomasoluissa. Jos EZH2 lohkot p27 ilmaus, vaimentaminen
EZH2
olisi kytkettävä uudelleen lisäys p27 ilmaisun, kuten on havaittu haiman syöpäsoluissa [4]. Sen sijaan kuitenkin, tehokas inhibitio EZH2 ilmaisua ei liittynyt merkittävää lisäämistä p27 ilmentymistä, eikä proteiini- (kuvio 6C) tai mRNA (kuvio 6D) tasolla, paksusuolen syöpäsoluissa. Cellular fraktiointi tutkimukset osoittivat, että p27 on käytännössä yksinomaan lokalisoitu sytoplasmassa, vuonna HCT116, LoVo, ja DLD1 soluja. Tämä subsellulaariset jakelu ei myöskään havaittavasti muuttaa EZH2 ehtyminen (kuvio S1).
EZH2 ja p27-proteiinin ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjoissa, arvioitiin immunoblot-analyysit. Tubulin, lastaus valvonta. B
p27
mRNA ilmaisun mitattuna qRT-PCR-analyysit. Data esitetään kansi erot geeni-ilmentymisen, normalisoidaan siivous geenin indeksi. Keskihajonnat kaksi käänteistranskriptio toistojen on merkitty. C immuunianalyyseilla jälkeen EZH2 ehtyminen RNAi. EZH2 ja p27 tasot on merkitty. Tubulin, lastaus valvonta. D qRT-PCR-analyysit jälkeen EZH2 ehtyminen RNAi.
P27
ja
EZH2
mRNA ilmaistaan suhteessa sicontr-1-käsiteltyjä soluja (mielivaltaisesti 1,0). Keskihajonnan kolmen erillisen kokeen osoitetaan.
transcriptome analyysit koolonkarsinoomasoluissa upon EZH2 ehtyminen
Jotta voitaisiin tunnistaa mahdolliset kohdegeenien vaikuttaa EZH2 ehtyminen koolonkarsinoomasoluissa, transcriptome analyysit suoritettiin. Tätä varten LoVo ja DLD1 soluja käsiteltiin joko siRNA allas hiljentäminen
EZH2
ilmentymisen tai ohjaus siRNA. Muutokset ekspressiotasot solun geenien arvioitiin käyttämällä genomin laajuinen microarray noin 25000 geenejä. Havaitsimme merkittävät muutokset 2,235 geenien DLD1 (1095 voimistunut, 1140 vaimentua) (taulukko S1) ja 379 geenien LoVo (280 voimistunut, 99 vaimentua) (taulukko S2). Päällekkäisyys koostui 139 geeniä, jotka vaikuttivat EZH2 ehtyminen sekä koolonsyöpäsolulinjaa (100 voimistunut, 39 vaimentua). Lämpökarttana visualisointiin nämä 139 differentiaalisesti geenien annetaan kuviossa 7A, mikä osoittaa korkea välistä yhdenmukaisuutta biologisen toistojen. Yksityiskohtainen luettelo näistä geeneistä annetaan taulukossa S3.
Venn-kaavio ja lämpökarttoja 139 geeniä, jotka vaikuttavat olennaisesti vuoden transkriptin tasolla EZH2 ehtyminen sekä LoVo ja DLD1 soluja. Heatmaps luotiin käyttäen hierarkkinen klusterointi. Soluja joko käsitellään siEZH2pool tai sicontr-2. Neljä biologiset rinnakkaista analysoitiin kullekin näytteelle. Merkittävästi voimistunut geenit on merkitty keltaisella, merkittävästi vaimentua geenejä sinisellä. B qRT-PCR analyysejä arvioidakseen ilmentymistä viisi geeniä, jotka vaikuttivat EZH2 ehtyminen transcriptome analyysi (katso edellä). Indikoitu ovat tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin DLD1 soluissa. mRNA-tasot on esitetty suhteessa sicontr-2-käsitellyissä soluissa (mielivaltaisesti 1,0). Keskihajonnat on merkitty. Tähdellä yhtäläiset p≤0.05, kaksinkertainen tähdellä yhtäläiset p≤0.01.
toiminnallinen merkinnästä 139 geenien Ingenuity Pathway Analyysi paljasti, että 37 geenin tuotteet on yhdistetty syöpään (taulukko 1). Koskien molekyyli- ja solutason toimintoihin, EZH2 ehtyminen havaittiin vaikuttavan useiden geenien säätelyyn osallistuva solujen kehityksen, kasvun ohjaus, solujen liikkumista, ja signalointi (taulukko 1).
validoimiseksi array data, olemme analysoineet ilmentymisen 5 syöpään liittyvien geenien, jotka indusoitiin EZH2 ehtyminen transcriptome analyysit, joita qRT-PCR: (i)
Dag1
(Dystroglycan 1), joka koodaa adheesiomolekyyli, joka usein on ali-ilmentynyt paksusuolen syöpä [28], (ii)
MageD1
(melanooma-liittyvä antigeeni perheen proteiini-D1), joka koodaa proliferaation inhibiittori ja kasvainsolun invaasiota [29], (iii)
SDC1
(syndekaani 1), joka koodaa solun pinnan proteoglykaani, joka estää solun invaasiota [30], (iv)
Timp2
(TIMP metallopeptidaasi estäjä 2), joka koodaa inhibiittoria matriksin metalloproteinaasien, jonka downregulation korreloi invasiivisen potentiaalia LoVo koolonkarsinoomasoluissa [31], ja (v)
Tob1
(Transducer ErbB2), joka koodaa antiproliferatiivinen proteiinia tuumoria tukahduttavan potentiaalia [32]. Kuten havaittiin microarray, kaikki 5 geenit olivat myös merkittävästi indusoi EZH2 ehtyminen qRT-PCR-analyysi (kuvio 7B), edelleen joka vahvistaa transcriptome tiedot.
Keskustelu
Esillä olevassa tutkimuksessa osoitamme, että EZH2 ehtyminen koolonkarsinoomasoluissa (i) vähentää solusyklin etenemisen tällä G1 /S rajan, (ii) pienenee solumäärät lyhyellä aikavälillä kasvun määrityksiä, ja (iii) estää solujen kasvua pitkällä aikavälillä pesäkkeiden muodostumisen määritykset . Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia kasvua edistävä rooli EZH2 paksusuolen syövän ja ovat ristiriidassa tuoreen raportin osoittaa, että kasvua koolonkarsinoomasoluissa ei vaikuta siRNA-välitteisen EZH2 ehtyminen [22].
mahdollinen selitys tälle ero saattaa liittyä määrityksiä käytetään mittaamaan solujen kasvua. Edellisessä tutkimuksessa tukeutui MTT-määritystä, joka mittaa metabolista aktiivisuutta (vähentäminen MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi ja formatsaaniksi) [22]. Tämä määritys voidaan vaikuttaa monet olosuhteet, kuten aineenvaihdunnan muutoksia, ja voi johtaa aliarviointiin kasvua estäviä vaikutuksia [33] – [35]. sen sijaan tässä tutkimuksessa, antiproliferatiivisia vaikutuksia seuraava
EZH2
hiljentäminen havaittiin säännönmukaisesti kolme itsenäinen määrityksissä. Tuloksemme osoittavat siten, että EZH2 stimuloi koolonkarsinoomasoluissa, kuten on raportoitu useita muita syöpää yksiköt [2] – [9], [11].
tarkkaa molekyylitason mekanismeja miten EZH2 stimuloi soluproliferaatiota ovat yhä suurelta osin tuntemattomia. Koska keskeinen osa PRC2 transkription repressori monimutkainen, EZH2 voi johtaa tukahduttaminen antiproliferatiivinen geenien. mielenkiintoinen tutkimus viime aikoina osoittaneet, että EZH2 johtaa tukahduttamisen kasvua estävää
p27
solusyklin säädin geeni haiman syöpäsoluissa [4]. Koska p27 säädösten klo G1 /S siirtymä – jonka löysimme vaikuttavan
EZH2
hiljentäminen paksusuolen syöpäsoluissa – ja koska p27 tasot ovat usein alhaisia koolonsyöpien [26], [27], testasimme mahdollinen korrelaatio EZH2 ja p27 tasot
in vivo
ja
in vitro
.
kuitenkin vertailevia analyysejä EZH2 ja p27 ilmaisua ei esiintynyt tilastollisesti asiaan positiivinen tai negatiivinen sidoksen koolonsyöpien
in vivo
, on per potilaskohtaisesti. Lisäksi EZH2 ehtyminen ei johtanut uudelleen ilmentymistä p27 in koolonsyöpäsolulinjaa
in vitro
, ajankohtina missä se johti erittäin lisääntynyt p27 ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa [4]. Nämä havainnot osoittavat, että – toisin kuin tilanteessa, haiman syöpäsoluissa – p27 tasoja ei kriittisesti säätelee EZH2 paksusuolen syöpäsoluissa. Siten kirjo EZH2 kohdegeenien voi vaihdella kudos- tai solu- spesifisellä tavalla.
Jotta saat käsityksen kirjo geenejä, jotka vaikuttavat EZH2 ehtyminen koolonkarsinoomasoluissa, suoritimme koko genomin transcriptome analyysit DLD1 ja LoVo soluja. Niistä 139 geenit, jotka vaikuttivat merkittävästi molemmissa solulinjoissa, yli neljäsosa tiedetään olevan syöpään liittyvän. Kirjo vaikuttaa geenien on sopusoinnussa hypoteesin, että EZH2 on tärkeä tekijä kehityksen, leviämisen valvonta, signalointi, ja liike /hyökkäys [1], [36]. Lisätyötä tarvitaan analysoida tarkkaa mekanismia, joilla EZH2 voi muuttaa näiden geenien ilmentymistä ja tutkia perusteellisesti niiden vaikutus kasvuun vapauttamisen koolonkarsinoomasoluissa. Me tukevat array data ilmentyminen analysointi 5 geenien qRT-PCR:
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, ja
Tob1
. Mukaisesti transcriptome analyysi,
EZH2
hiljentäminen lisäsi ilmaus kaikki 5 geenien qRT-PCR-analyysit samoin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että EZH2 voi tukahduttaa näiden geenien joko suoraan tai välillisesti koolonkarsinoomasoluissa. Kaikki 5 geenit raportoitu olevan antiproliferatiivisia ja /tai antiinvasive potentiaalia [28] – [32] ja niiden downregulation olisi siten yhteensopiva mahdollisesti kasvaimia synnyttävän vaikutuksen EZH2 paksusuolen syöpä.
Koska kasvua edistäviä roolia EZH2 erilaisissa syövissä, esto EZH2 keskustellaan parhaillaan houkuttelevana uusi strategia syövän hoidossa [1], [12]. Todellakin,
EZH2
inhibitiota siRNA: t, tai ehtyminen PRC2 komponenttien huumeiden 3-deazaneplanocin A (DZNep), aiheutti antioncogenic vaikutuksia estämällä solujen lisääntymisen ja /tai aiheuttamaan apoptoosin [2] – [7], [11], [37], [38], vastustamalla invaasio ja etäpesäkkeiden [9], [10], ja estämällä kasvaimen angiogeneesiä [8].
havainto tutkimuksessamme että EZH2 myötävaikuttaa leviämisen koolonkarsinoomasoluissa laajentaa kirjo kasvain yksiköistä, jotka voivat terapeuttisesti hyötyä EZH2 esto paksusuolen syöpä. Ottaen huomioon EZH2 mahdollisena terapeuttisena kohteena, mutta on otettava huomioon, että EZH2 ilmentyy myös normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien proliferatiivinen solu- kerroksen paksusuolen kryptien [22]. Tärkeää on, EZH2 on todettu aiheuttavan ratkaisevan säätelytoimintoja useissa kudoksissa, kuten valvonta erilaistumista kudosspesifisiä esisolujen ja kantasolujen [39] – [42]. Lisäksi viime havainto, että EZH2 voi toimia tuumorisuppressorina tietyissä hematologinen häiriöt [14], [15], [16] viittaavat siihen, että EZH2 inhibitio voi jopa edistää tuumorigeneesiä, joissakin kudoksissa. Täten häiritsevät EZH2 toimintoa, koska terapeuttinen strategia kantaa riskin aiheuttavan sivuvaikutuksia ja edellyttää todennäköisesti erittäin spesifinen toimittaminen EZH2 estäjien niiden kohdesoluihin.
Materiaalit ja menetelmät
Cells ja transfektiot
HCT116, DLD1, LoVo, WiDr-, SW620, HCT15, RKO, T84, Caco-2, ja Colo205 paksusuolen sinoomasolulinjoja ystävällinen lahjoitus tri M. von Knebel Doeberitz (University of Heidelberg ), SW480 Dr. S. Wiemann (German Cancer Research Center, Heidelberg) ja HT29 solusta ja solukkoviljely core facility Saksan Cancer Research Center, Heidelberg. Soluja ylläpidettiin joko DMEM (pH 7,2), RPMI, tai McCoys väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiinisulfaattia.
Plasmidit transfektoitiin kalsiumfosfaattirinnakkaissaostamisen [43] osaksi HCT116 soluihin tai Fugene HD (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) osaksi DLD1, LoVo, ja RKO soluja. Synteettiset siRNA: t transfektoitiin Dharmafect (Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, solut maljattiin 6 cm: n annoksia 15%: sta 25%: n konfluenssiin. Dharmafect 4 ja siRNA (lopullinen pitoisuus 100 nM) olivat molemmat laimennettiin Opti-MEM I vähensi seerumin väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja sekoitettiin, jonka tilavuus oli 400 ui transfektion liuosta.
Plasmidit ja synteettiset siRNA
siRNA: t olivat joko syntetisoida kemiallisesti (Dharmacon) tai ilmaistuna shRNAs päässä pCEPsh, kuten aiemmin on kuvattu [44]. Seuraavassa
EZH2
-targeting siRNA: ita käytettiin: siEZH2-1 5′-GAAUGGAAACAGCGAAGGA-3 ’(valmiista siRNA päässä Dharmacon), siEZH2-2 5′-GACUCUGAAUGCAGUUGCU-3′ [7], ja siEZH2-3 5’-GCUGAAGCCUCAAUGUUUA-3 ’(predesigned siRNA maasta Dharmacon). SiEZH2pool koostui kaikkien kolmen siRNA: iden sekoittaa ekvimolaariset. Seuraavat ohjaus siRNA: ita käytettiin: sicontr-1 5’-CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ’[45], sicontr-2 5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′ (valmiista siRNA päässä Dharmacon, joka sisältää vähintään neljä epäsuhta kaikkiin tunnettuihin ihmisen geenejä), ja siluc 5’-CAUCACGUACGCGGAAUAC-3 ’(kohdistus
Photinus pyralis
lusiferaasi [46]).
RNA, kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (qRT-PCR), ja proteiini analyysit
-RNA eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla [47], ja suspensoitiin uudelleen RNAasi vapaata vettä. RNA pitoisuudet mitattiin NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE USA), 260 nm. Käänteistranskriptio 1 ug RNA: ta suoritettiin käyttäen oligo-dT-aluketta ja ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR Kit (New England Biolabs, Frankfurt, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Expression-tasot määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä, jossa on 7300 Real-Time PCR System ilmaisin (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), käyttämällä SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems), täydennettynä 500 nM kutakin eteenpäin ja peruutusvaihde pohjamaali.
EZH2
(NM_004456) ilmentyminen määritettiin käyttäen forward-aluketta 5′-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 ’ja reverse-alukkeen 5′-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’ [48]. Havaitsemiseksi
p27
Kip1
(NM_004064) ilmaisu 5′-GCCAGACGGGGTTAGCGGAG-3 ’käytettiin eteenpäin ja 5′-GAGGCCAGGCTTCTTGGGCG-3’ pään alukkeena.
MageD1
(NM_001005333) ilmentyminen määritettiin alukkeilla 5′-GGCTGTCCTCTGGGAGGCACT-3 ’ja 5′-GGGTTGCTGTTGGGCACTCGT-3’,
Timp2
(NM_003255) lauseke alukkeilla 5′-TCTACACGGCCCCCTCCTCG-3 ’ja 5′-TGGGGCAGCGCGTGATCTTG-3’,
SDC1
(NM_001006946) lauseke alukkeilla 5′-CGGCCCTGCCGCAAATTGTG-3 ’ja 5′-CCTCCAGGCCGGTGGGTTCT-3’,
Tob1
(NM_005749) lauseke alukkeilla 5′-TGCAGCCTATGGAGGCCTCAA-3 ’ja 5′-CCCCTTGGGCCCGTGCATTTT-3’, ja
Dag1
(NM_001165928) lauseke alukkeilla 5′-GTCGTCGGGCGCTCATTTCGA-3 ’ja 5′-CCAGCCGTGTAGCGCTCACTG-3’. GAPDH ja HPRT1 alukesekvensseihin ja pyöräily olosuhteet on kuvattu aiemmin [49]. Koot PCR-tuotteiden alun perin varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja sen jälkeen tarkistaa sulamispisteen analyysin jälkeen jokaisen reaktion. Suhteellinen kvantitointi suoritettiin käyttäen vertailevaa Ct (2
-ΔΔCt) menetelmä [50]. Tiedot esitetään taitteen ero geeniekspression normalisoidaan taloudenhoito geeni indeksin (geometrinen keskiarvo
GAPDH
ja
HPRT1
ekspressiotasot), ja suhteessa calibrator näyte. Housekeeping geenit valittiin useiden testattujen taloudenhoito geenejä normalisointia geenien ilmentymisen, koska niillä oli yhtä suuri vahvistus tehokkuutta kuin meidän kiinnostuksen kohteena olevia geenejä. Tilastollinen merkitys eroja mitataan muuttujien välillä valvonnan ja hoidettujen ryhmien määritettiin kaksipuolinen pariksi t-testiä käyttäen Sigma Plot ohjelmisto (Systat Software Inc., San Jose, CA). Erot katsottiin merkitsevä p≤0.05.
Yhteensä proteiinia uutteet valmistettiin 48-96 tuntia transfektion jälkeen, kuten aiemmin on kuvattu [51]. Sillä soluliman ja tumauute valmistamiseksi, solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet® P-40, pH 7,4) ja inkuboitiin jäillä. Ehjä tumat pelletoitiin sentrifugoimalla ja sytosolin uutteen supernatantti siirrettiin. Tumat pestiin kahdesti lyysipuskurilla, joka sisälsi 0,05% Nonidet® P-40 ja ydin- proteiinit uutettiin, kuten on kuvattu proteiinin kokonaismäärän otteita. Western blot-analyysit, 20-30 ug proteiinia uute erotettiin 12,5% SDS-PAGE, siirrettiin Immobilon-P-membraanille (Millipore, Bedford, MA, USA), ja analysoitiin tehostetun kemiluminesenssin (GE Healthcare, Buckinghamshire, Iso-Britannia ). Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-EZH2-vasta-aineen (AC22, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p27-vasta-ainetta (# 610242, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-sykliini D1-vasta-ainetta (DSc6 , Cell Signaling), ja anti-alfa-tubuliinin vasta-aineella (CP06, Calbiochem, Darmstadt, Saksa).
Soluseurantalaitteet ja solusyklin analyysit
solujen määrä analysoidaan, koko solujen lukumäärät määritettiin 48-72 tuntia transfektion jälkeen. Yhteensä solua ml: ssa mitattiin käyttäen Countess Cell Counter (Invitrogen).
solusyklin analyysit, solut trypsinoitiin 48 tuntia transfektion jälkeen, pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja kiinteä 80% kylmää etanolia yön yli -20 ° C: ssa.