Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

molekyyliperustan ja ominaisuudet familiaalinen ei- medullary kilpirauhassyövän ovat huonosti tunnettuja. Tässä tutkimuksessa, suoritimme microRNA (miRNA) profilointi familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän kasvain näytteissä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Genome laaja miRNA profilointia Satunnaista ja perinnöllistä papillaarinen kilpirauhassyövän suoritettiin . Ilmentyvät eri miRNA todensi kvantitatiivisen RT-PCR. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-886-3p kilpirauhassyövän hoitoon linjat suoritettiin tunnistaa polkuja kohteina miRNA sekä, määrittää sen vaikutukset kasvaimen solubiologian. Löysimme neljä ilmentyvät eri miRNA välillä familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän kasvainnäytteestä. MiR-886-3p ja miR-20a validoituja differentiaalisesti ilmaistaan ​​3- ja 4-kertaiseksi. Pathway analyysi genominlaajuisten ekspressiotietojen soluissa yli-ilmentävät miR-886-3p ja tavoite ennustus analyysi osoitti geenien DNA: n replikaatioon ja polttovälin tarttuvuus reittejä säädeltiin miR-886-3p. Yli-ilmentymisen miR-886-3p kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa esti merkitsevästi solujen lisääntymistä, määrä ja koko pallosia ja solumigraatiota. Lisäksi, yliekspressio miR-886-3p lisääntynyt solujen määrä S-vaiheessa.

Johtopäätökset /merkitys

havainnot ensimmäisen kerran viittaa siihen, että miR-886-3p on tärkeä rooli kilpirauhassyövän syöpäkasvain solubiologian ja säätelee geenien DNA: n replikaatioon ja polttovälin tarttuvuus. Siten miR-886-3p voi olla rooli aloittamisen ja tai etenemisen papillaarisen kilpirauhassyöpä.

Citation: Xiong Y, Zhang L, Holloway AK, Wu X, Su L, Kebebew E (2011) MiR-886-3p Säätelee Cell Proliferation ja siirrosta, ja säädeltyyn in familiaalinen Non-Medullary kilpirauhassyöpä. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10,1371 /journal.pone.0024717

Editor: Marian Ludgate, Cardiff University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 17 elokuu 2011; Julkaistu: 05 lokakuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Intramural tutkimusohjelma National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kilpirauhasen syöpä on yksi nopeimmin kasvavista syövän diagnoosit Yhdysvalloissa yli 44000 uutta tapausta arvioidaan esiintyvän vuonna 2011 [1]. Familiaalinen ei-medullaarinen kilpirauhassyöpä (FNMTC) voi esiintyä vähäinen osa familiaalinen syövän oireyhtymien (Gardnerin, Cowden tauti, Carney monimutkainen tyypin 1, Wernerin oireyhtymä, McCune-Albright oireyhtymä) tai kun hallitsevia ominaisuus [2]. Useimmat FNMTC ovat papillaarinen kilpirauhassyövän ja on autosomaalinen hallitseva kuvio perintö puutteellisilla penetranssi. FNMTC tilit jopa 8% kaikista kilpirauhassyöpä tapauksissa [2], [3], [4], [5], [6]. Vuonna familiaalinen syöpä oireyhtymät edellä mainittiin, potilailla esiintyy erillisiä ekstratyroidaalisen vaurioita ja altistavia geenejä vastaava nämä oireyhtymät tunnetaan. Kuitenkin suurin osa ( 95%) FNMTC tapauksissa esiintyä yksittäisiä familiaalinen nonmedullary kilpirauhassyöpä tapauksista, joiden alttius geeni (t) ei tunneta.

FNMTC määritellään, kun kaksi tai useampia ensimmäisen asteen sukulaisia vaikuttaa ei-medullaarinen kilpirauhassyöpä. Geneettisen perustan FNMTC tunnetaan huonosti. Vuonna sidos tutkimuksissa, useat ryhmät ovat tunnistaneet kromosomi loci liittyvät FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-P22, ja 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Mutaatio analyysi on osoittanut, että sukujen kanssa FNMTC ei ole ituratamutaatiot

BRAF

,

RAS

, ja

RET /PTC

geenit, jotka ovat yleisesti mutatoitunut somaattisesti in kilpirauhassyövän follikkelien solujen alkuperä [2]. Lisäksi analyysi somaattisista mutaatioista (

BRAF

,

RAS

, ja

RET /PTC

) satunnaista ja perinnölliset papillaarinen kilpirauhassyövän kasvain ei ollut havaittavaa eroa hintaan ja tyyppi mutaatiot näissä histologialtaan [2], [6], [14]. Näin ollen, ei tiedetä, jos molekyyli profiilia satunnaista versus familiaalinen kilpirauhassyöpä on erilainen. Lisäksi se on myös tuntematon, jos on olemassa molekyylitason perustan varhaisempi aloittaminen ja aggressiivinen tauti käyttäytymistä havaittiin FNMTC verrattuna satunnaisesti taudin [6], [15], [16].

MikroRNA ( miRNA) ovat pieniä (~21 nukleotidin mittainen) ei-koodaavan RNA: ita, jotka säätelevät geenien ilmentymistä ja on merkittävä rooli monissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien kasvaimen kehittymisen [1] – [2]. Erityinen miRNA voi toimia joko onkogeenin tai tuumorisuppressorina säätelemällä ilmentymistä kohde- onkogeenin (t) ja tuumorisuppressorigeenin (t), vastaavasti. Useimmissa tapauksissa, miRNA sitoutuvat 3′-alueet (3′-UTR) ja kohde-mRNA: iden, jotka johtavat mRNA: n hajoamisen tai tukahduttamisen käännös. Vuonna kilpirauhassyöpä, yhteinen yhden emäksen monimuotoisuus pre-miR-146a on raportoitu estävän kypsä miRNA ilmaisun ja lisäävät riskiä sairastua papillaarinen kilpirauhassyövän [17]. Tietääksemme ei ole tehty vertaamalla miRNA profiilit familiaalinen ja satunnaista syöpiä yleensä ja erityisesti kilpirauhassyöpä.

Tässä tutkimuksessa, suoritimme miRNA profilointiin familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän kasvainnäytteestä. Huomasimme, että miR-886-3p säädeltiin vähentävästi vuonna papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna normaaliin ja differentiaalisesti ilmaistut familiaalinen papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän. Pathway analyysi genominlaajuisten ilmentymisen tiedot yliekspressoiviin soluihin miR-886-3p ja kohde-ennustus analyysi osoitti, geeneistä, jotka liittyvät DNA: n replikaatioon ja fokaalisen adheesion reitin säädeltiin miR-886-3p. Todellakin, yli-ilmentyminen miR-886-3p kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa esti merkitsevästi solujen lisääntymistä, määrä ja koko pallosia ja muuttoliike.

Materiaalit ja menetelmät

Kilpirauhasen kudosnäytteiden

Kilpirauhasen kudosnäytteet jäädytettiin nestetypessä aikaan kilpirauhanen. National Cancer Institute Review Board hyväksyi tämän tutkimuspöytäkirja jälkeen ilmoitti kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Kaikki kudosnäytteet kävivät ylimääräisiä histologisia tarkistettavaksi hormonitoimintaa patologi diagnoosin varmistamiseksi ja tunnistaa näytteitä yli 80% kasvainsoluja. Käytimme 28 tavanomainen papillaarinen kilpirauhassyövän kasvain näytteet (21 satunnaista, 7 familiaalinen) ja 10 normaalia kilpirauhasen kudosnäytteitä varten miRNA array profilointia. Suvussa kyselylomakkeen avulla selvittää, onko kasvain, tulee luokitella satunnaista tai familiaalinen. FNMTC määriteltiin, kun 2 tai useamman ensimmäisen asteen sukulaiset kärsivät kilpirauhassyöpä on follikulaarisolujen alkuperää. Tapaukset kilpirauhassyövän varmistettiin vaikutti perheenjäseniä. Kaikki FNMTC kasvaimen näytteet olivat eri perheitä. 5 7 kasvaimen näytteitä FNMTC oli kolme ensimmäisen asteen sukulaiset vaikuttaa ja 2 7 oli kaksi ensimmäisen asteen sukulaiset vaikuttaa. Kasvain Näytteet sovitettu iän (+/- 2 vuotta), sukupuoli ja TNM syövän (klo 03:01 suhteessa satunnaista-to-familiaalinen tapauksissa).

Mirna mikrosirujen

yhteensä 28 mikrosiruja (Exiqon ™) ajettiin verrattiin sekä familiaalinen ja satunnaisia ​​papillaarinen kilpirauhassyövän on altaan normaalin kilpirauhaskudoksen. Tukin

2 suhde Cy5 Cy3 intensiteettiä signaalit laskettiin jokaiselle miRNA joka array (ilman taustaa vähennyslasku) ja data normalisoitiin print kärki lössi normalisointi [18], [19]. Koska yksittäiset miRNA edusti neljä koettimista array, mediaani normalisoitu log

2 suhde rinnakkaisten koettimien (joissa on enemmän kuin yksi merkinnän poistaminen anturi) käytettiin arvoa miRNA. Kootut log

2 suhde kullekin kokeelle käytettiin sitten moderoitu t-tilastot ja p-arvon laskennassa käytetään Limma paketin R /Bioconductor [20], [21] korjattuna väärien löytö korko käyttämällä Benjamini-Hochberg menetelmä [22]. Mirna microarray data, joka on MIAME mukainen, on talletettu GEO tietokannassa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen kilpirauhassyöpä solulinjat FTC-133 (follikulaarinen kilpirauhassyöpä) ja TPC-1 (papillaarinen kilpirauhassyövän) ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jossa 4500 mg /l D-glukoosia, L-glutamiinia, ja 110 mg /L natriumpyruvaattia), johon oli lisätty 10% seerumia, kilpirauhasta stimuloiva hormoni (TSH) (10 mU /ml), penisilliiniä (10000 U /ml), streptomysiiniä (10000 U /ml), Fungizonea (250 mg /ml) ja insuliinia ( 10 (ig /ml) standardin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ja 95% O

2 ilmakehässä. Molemmat solulinjat luodaan ja todennetaan kilpirauhassyöpä solulinjoissa [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. TPC-1 solulinja saatiin tohtori Nabuo Satoh (Japani) ja FTC-133-solulinja saatiin tri Peter Goretzki (Saksa). Seerumin vapaan median (DMEM- F12), jota oli täydennetty 4 hormonien (insuliini [10 ug /ml], somatostatiini [10 ng /ml], transferriini [5 ug /ml], ja hydrokortisoni [0,36 ng /ml]) käytettiin toiminnallisen tutkimuksissa.

miRNA transfektio

Kypsät miRNA esiaste (pre-miR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden . Satunnainen sekvenssin ennalta miR (pre-miR-negatiivinen kontrolli) (Applied Biosystems) käytettiin negatiivisena kontrollina (miR-NC).

RNA: n eristäminen ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. TaqMan miRNA Analyysit (Applied Biosystems) käytettiin mittaamaan miRNA ekspressiotason. Kokonais-RNA käänteistranskriptio miRNA-spesifistä aluketta, mitä seuraa reaaliaikaisella PCR: llä, jossa TaqMan-koettimia. U6 käytettiin endogeenisen ohjaus. Suhteellinen määrä mRNA määritettiin käyttäen TaqMan-määritys (Applied Biosystems) ABI 7900 HT-järjestelmä, käyttäen ihmisen GAPDH kuin endogeeninen kontrolli. ΔΔ Ct menetelmää käytettiin laskettaessa ekspressiotasoja.

Proliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen CyQuant Cell Proliferation Assay (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Fluoresenssin intensiteetin mitattiin fluoresenssi mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

migraatiokokeessa

leviämiskyky kilpirauhasen syöpäsoluja arvioitiin naarmu haava määritystä soluissa kasvatettu yhtenä kerroksena. Noin 150000 solut transfektoitiin pre-miR-886-3p (25 nM) tai miR-NC (25 nM), sitten maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja kasvaa 44 tuntia. Sen jälkeen, kolme pystysuoraa haavat tehtiin steriili 10 ui pipetin kärjen ja vaakasuora viiva tehtiin yli kolme riviä, jotta havainnointi solujen samassa pisteessä. Solut tarkastettiin 6 tunnin välein ja mittaukset jopa 22 tuntia alkuperäisestä haava.

Genominlaajuiset mRNA: n ekspression microarray

TPC-1-solut transfektoitiin ennalta miR-886- 3p ja pre-miR-NC. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen, solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. Kokonais-RNA valmistettiin kolmena kappaleena soluviljelmistä käyttäen RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) mukainen pakkaus valmistajan ohjeita. RNA laatu varmistettiin, ennen merkintöjä käyttäen Agilent RNA 6000 Nano Kit ja Bioanalyzer 2100 Sataviisikymmentä ng kokonais-RNA: ta käytetään suorittamaan cDNA Käänteistransskription synteesi, vahvistus, pirstoutuminen ja terminaali merkintöjen kanssa GeneChip- WT Sense Target Labeling ja kontrollireagensseja (Affymetrix, Santa Clara, CA). Noin 25 ng /ul: n cDNA hybridisoitui Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. Taulukot pestiin ja värjättiin käyttäen fluidistori- protokollaa FS450_0007 menettelynä Affymetrix Fluidics Station 450. koetin voimakkuudet skannataan GeneChip- Scanner 3000. raakadataa normalisoitui ja analysoitiin Partek Genomic Suite (Partek Inc., St. Louis, MO , USA). Varianssianalyysi käytettiin määrittämään ne koetin asetetaan huomattavasti eri ryhmien välillä. Geeni lista suodatettiin taitettavalla muutos cutoff 2. Tämä johti lähtö geenin luettelon geenejä, joilla on merkittävä ero ilmentymisen P≤0.001 ja 2-kertaisesti tai enemmän eroja. Pathway analyysi suoritettiin käyttäen DAVID bioinformatiikan resursseja.

Cell cycle virtaussytometria-analyysi

vaikutuksia miR-886-3p ilmentymisen vaikutus solusyklin etenemistä arvioitiin käyttäen propidiumjodidia virtaussytometriaa. Lyhyesti, TPC-1: n ja FTC-133-solut transfektoitiin pre-miR-886-3p tai pre-miR-NC 72 tuntia 120 tuntia. Solut pestiin PBS: llä, kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla. Sitten soluja käsiteltiin (500 U /ml), DNaasi-vapaata RNaasi ja värjättiin propidiumjodidilla. Solujen näytteet analysoitiin FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), ja G

0G

1, S, ja G

2M vaihe jakeet määritettiin käyttäen ModFitLT ohjelmistoa (Topsham, ME).

Apoptosis virtaussytometria analyysi

The effects of miR-886-3p ilmentymisen vaikutus solukuolemaan arvioitiin anneksiini V- FITC ja propidiumjodidilla virtaussytometrialla käyttäen ApoAlert anneksiini V (Clontech, Mountain View, CA). TPC-1: n ja FTC-133-solut transfektoitiin pre-miR-886-3p tai pre-miR-NC 72 tuntia 120 tuntia. Solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V- FITC ja propidiumjodidilla mukaan valmistajan protokollaa. Cell näytteet analysoitiin FACSCalibur, ja apoptoottisten fraktiot määritettiin.

Luciferase Reporter Assay

1160 emäsparin 3′-UTR

Cdc6

kloonattiin tyhjään lusiferaasireportteri- vektori pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), muodostetaan villityyppisen

Cdc6

UTR lusiferaasireportteri- konstruktilla (pEZX-WT-UTR). Mutaatiot 3′-UTR

Cdc6

suunniteltiin neljän ensimmäisen nukleotidin (CACC on GTGG) tai kolmen viimeisen nukleotidin (CGC on GCG) 7-mer siemenen alueen oletetun sitoutumiskohta miR-886-3p tuottaen kaksi mutantteja kutsutaan kuin pEZX-Mut-UTR-01 ja pEZX-Mut-UTR-02, tässä järjestyksessä. Kaikki konstruktit sekvenssi-varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Sillä kaksi lusiferaasianalyysissä, TPC-1-solut maljattiin kolmena rinnakkaisena osaksi 12-kuoppalevyille ja ko-transfektoitiin 0,25 ug reportteri-konstrukti ja 15 pmol pre-miR-886-3p tai pre-miR-NC käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua solut lyysattiin ja analysoitiin sekä tulikärpäsen ja renilla lusiferaasi käyttämällä Luc-Pair ™ miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD), SpectraMax M5e mikrolevynlukijaa (Molecular Device, Sunnyvale, CA) valmistajan ”ohjeet.

Data Analysis

tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Määrittämään tilastollista merkittävyyttä, Mann-Whitneyn U-testi, t-testiä ja varianssianalyysi käytettiin tarvittaessa. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

miRNA profilointia Satunnaista ja perinnöllistä papillaarinen kilpirauhassyövän

Vertasimme miRNA ilmaus profiilia familiaalinen ja satunnaista papillaarisen kilpirauhassyöpä kasvain näytteitä koko genomin miRNA mikrosiruanalyysillä. Näytteet Hyväksytty perustuu iän ja sukupuolen potilaista, ja TNM kasvain vaiheessa. MiRNA ilmentyminen Tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin kilpirauhasen kudosnäytteistä. Oli 232 miRNA satunnaista ja 135 miRNA familiaalisen papillaarinen kilpirauhassyövän jotka väärin säädellystä verrattuna normaaliin kilpirauhasen kudosnäytteet (kuvio 1A) (p 0,05). Sata yhdeksän säädeltyyn miRNA olivat ainutlaatuisia satunnaisten 13 oli ainutlaatuinen familiaalinen, ja neljä miRNA merkittävästi ilmentyvät eri välillä satunnaista ja perinnölliset papillaarinen kilpirauhassyövän (kuvio 1A ja 1B). Kaksi neljästä miRNA validoituja merkittävästi ilmentyvät eri välillä familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän kvantitatiivisen reaaliaikaisen RT-PCR (kuva 2). Sekä miR-20a ja miR-886-3p myös merkittävästi vaimentua satunnaisissa papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna normaaliin kilpirauhaskudokseen (p = 0,032 ja p = 0,0032, vastaavasti) (kuvio 1 B).

A) vertailu ilmennetty eri miRNA satunnaista ja perinnölliset papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna normaaliin kilpirauhaskudokseen. Satunnaista ympyrä ilmaisee tämän ryhmän verrattuna normaaleihin kilpirauhaskudokseen, familiaalinen ympyrä osoittaa tämän ryhmän verrattuna normaaleihin kilpirauhaskudokseen ja familiaalinen-satunnaista ympyrä ilmaisee vertailun familiaalinen ja satunnaista kasvaimia. B) Suhteellinen prosenttia miRNA ilmaisun ero familiaalinen ja satunnaista kasvaimet normalisoitu normaaliin kudosnäytteitä. * P-arvo 0,05.

MiR-20a oli 4-kertainen ja miR-886-3p oli 3-kertainen familiaalinen papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna satunnaista (p = 0,025 Mir-20a , p = 0,028 mir-886-3p, p = 0,37 mir-195, p = 0,46 miR-29c). Arvot ovat keskiarvo ilme plus ja miinus keskivirhettä. Y-akseli edustaa suhdetta miRNA ja U6-RNA 2

-ΔΔCt menetelmällä, ja alin arvo näytteen asetettiin 1,0.

Target geenien ja reitit MiR-886- 3p kilpirauhassyövän syöpäsoluissa

Koska toiminta miR-886-3p tuumorisolun biologiassa on tuntematon, olimme ensimmäinen kiinnostuneita määritettäessä kohdegeenin (t) ja polku (t), jotka voidaan säännellä miR -886-3p. Käytimme kaksi lähestymistapaa määrittämiseksi miR-886-3p tavoitteet: miRNA tavoite ennustaminen ja genominlaajuisten mRNA: n ekspressio analyysi yliekspressoiviin soluihin miR-886-3p (kuvio 3). Löysimme 730 ennakoi maalin geenit miR-866-3p käyttäen tavoite ennustus tietokantoja (Miranda miRBase, Target skannaa). Suorittamalla Kegg polku analyysi mRNA: t väärin säädellystä in miR-886-3p vähemmän alle ilmaistuna soluja, löydettiin geeneistä, jotka liittyvät DNA: n replikaatioon ja fokaalisen adheesion reitit olivat misexpressed kun miR-886-3p yli-ilmentymisen kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Integraatio näistä bioinformatiikka tunnistettu kuusi geeniä yhteistä välillä analyysejä. Nämä geenit ovat siis ennustetaan olevan miR-886-3p tavoitteita.

Edelleen käsitellä tätä hypoteesia, valitsimme neljä näistä geeneistä validointi upon miR-886-3p yli-ilmentymisen. Löydettiin merkittävä downregulation kaikista neljästä geenistä, kun miR-886-3p yliekspressio kvantitatiivisen RT-PCR: llä (kuvio 4). Näistä geeneistä, olimme erityisen kiinnostuneita

Cdc6

koska tämä geeni koodaa voimakas säätelijä DNA: n replikaation ja oncogenesis [27]. Mielenkiintoista, western blot-analyysi osoitti downregulation

Cdc6

proteiinin ilmentymisen 72 tunnin kuluessa miR-886-3p yliekspressio (kuva 5). Arvioidaan tarkemmin, jos

Cdc6

on välittömänä kohteena miR-886-3p sääntely, transfektoimalla 3’UTR

Cdc6

villityypin vektorin kilpirauhassyöpä solujen miR-886-3p yliekspressio osoitti merkittävää downregulation lusiferaasiaktiivisuuden viittaa siihen, että

Cdc6

oli välittömänä kohteena miR-886-3p (kuvio 6). Mutaatiot ennustettu siemenen alueen miR-886-3p 3’UTR on

Cdc6

kumottu em edelleen viittaa siihen, että miR-886-3p suoraan säätelee

Cdc6

lauseke (kuva 6 ).

transfektio ennalta miR-886-3p vähensi mRNA-tasoja neljän kohdegeenien (

Cdc6

,

PIP5K1C

,

PXN

ZYX

) A) TPC-1 solulinja ja B) FTC-133-solulinja (* p 0,05; ** p 0,01). Y-akseli edustaa suhdetta erityisten kohdegeenin ja GAPDH käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä, ja arvo miR-NC ryhmä asetettiin 1,0 sallimaan vertailun kertainen eroja eri solulinjoissa ja geenejä.

A) tyypillisen western blot kuva

Cdc6

proteiinin ekspression 72 tuntia transfektion jälkeen ennalta miR-886-3p verrattuna negatiiviseen kontrolliin (miR-NC). B) Band densitometria määrällistä

Cdc6

proteiinin ilmentymisen. Ohjelmisto ImageJ (Maryland, USA) käytettiin densitometrisen analyysiin Western blot.

A) pEZX-WT-UTR vektori sekä Renilla lusiferaasin (hRLuc) käytettiin sisäisenä kontrollina ja tulikärpäsen lusiferaasi (hLuc) oli ylävirtaan 3′-UTR-konstrukti. B) Oletettu sitomiskohta miR-886-3p on

Cdc6

3 ’UTR yhdessä mutaatiot ennustettu siemenen alueelle. C) Vasen kuva esittää lusiferaasin aktiivisuus pEZX-WT-UTR TPC-1-soluissa, kun ko-transfektoitiin pre-miR-886-3p tai pre-miR-NC, p 0,05. Keskimmäinen ja oikeanpuoleinen luvut showluciferase aktiivisuus pEZX-Mut-UTR-01 ja pEZX-Mut-UTR-02 TPC-1-soluissa, kun ko-transfektoitiin pre-miR-886-3p tai pre-miR-NC, vastaavasti. Kaikki lusiferaasi mittaukset tehtiin kolmena rinnakkaisena ja lukemat suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen.

MiR-886-3p säätelee solusyklin ja lisääntymistä, ja pallojakaantuminen muodostumista ja muuttoliike

Koska löysimme miR-886-3p säätelee geenien DNA: n replikaatioon ja fokaalisen adheesion polkuja, olimme kiinnostuneita määritettäessä roolin miR-886-3p solusyklin ja solujen lisääntymistä sekä, pallojakaantuminen muodostumista ja muuttoliike. Ensin määrittivät perusilmennystä miR-886-3p neljässä hyvin tunnettu ja todennettu kilpirauhassyöpä solulinjojen ja totesi, että FTC-133 ja TPC-1 oli korkein ja alin taso miR-886-3p ilmaisu, vastaavasti (kuvio 7A ). Käytimme näitä solulinjoja analysoida vaikutusta miR-886-3p soluproliferaatioon. Yliekspressio miR-886-3p esti merkittävästi solujen lisääntymistä 79%: in FTC-133 solujen 144 tuntia (p 0,001) ja 77% TPC-1 solujen 120 tuntia (p 0,001) verrattuna pre-asennuspalveli- NC (kuvio 7B).

) Lähtötilanne ilmentymä miR-886-3p neljässä kilpirauhassyöpä riviä. B) vaikutus miR-886-3p ilmentymisen vaikutus kilpirauhassyöpä soluproliferaatioon. Pre-miR-886-3p ehkäisi merkittävästi kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota. Virhepylväät edustavat keskivirhettä. * P≤0.001.

Koska syvällinen vaikutus miR-886-3p ilmentymisen vaikutus soluproliferaatioon halusimme seuraavaksi tutkia mekanismi miR-886-3p välittämän kasvun estäminen. Olemme siis suorittaa virtaussytometrillä ja anneksiini V Määrityksissä vaikutus miR-886-3p solusyklin etenemisen ja apoptoosin, vastaavasti. Yli-ilmentymisen miR-886-3p lisäsi merkittävästi solujen määrä S-vaiheessa (12-16%) ja vähentää solujen määrä G

0 /G

1 (11-22%) (p 0,001 ). Olemme kuitenkin, ei havaittu huomattavia lisääntyminen solujen apoptoosin ja ilman miR-886-3p yliekspressio. Nämä tiedot osoittavat, että miR-886-3p säätelee solusyklin ja lisääntymistä vastaa meidän miR-886-3p polku ja kohde ennustaminen analyysejä.

Koska miR-886-3p polku ja kohde-analyysit osoittivat säätelevien geenien polttovälin tarttuvuus olivat misexpressed, myös määritti miR-886-3p ilmentymisen vaikutus kilpirauhassyöpä solulinjassa sferoidiviljelmiä muodostumista ja solujen muuttoliike. FTC-133 solulinja muodostaa sferoideja kun viljelty ultralow tarttuu dosviljelypulloihin 72 tunnin kuluessa. Yhdenmukainen vaikutus miR-886-3p yliekspressio yksikerrossoluissa, havaitsimme määrän vähenemiseen ja koon rakeita FTC-133 kilpirauhassyöpä solulinja, joka säilyi jopa 2 viikon viljelyn (kuvio 8). Lisäksi, miR-886-3p yli-ilmentyminen väheni useita solun haara-rakenteita havaittiin negatiivisen kontrollin soluissa. Me seuraavaksi määritti miR-886-3p ilmentymisen vaikutus solumigraatiota käyttäen naarmu haava määrityksessä. Yli-ilmentymisen miR-886-3p esti merkittävästi migraation TPC-1-solulinja (p 0,001) (Kuva 9).

Pre-miR-886-3p pienensi koko ja lukumäärä rakeita FTC -133 solulinjassa. A) edustaja kuvaa rakeita kulttuuri miR-886-3p yli-ilmentymisen. B) kvantifiointi sferoidiviljelmiä ero miR-886-3p yli-ilmentymisen. Yhteenlaskettu pinta-ala pallosia kuvan sisällä mitattiin ympäröimällä kehä kunkin sferoidi, merkintä koko alueella, ja laskemalla pikseli numerot käyttämällä ImageJ ohjelmisto (Maryland, USA). Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja samanlaiset tulokset havaittiin. (*** Osoittaa p 0,001).

Pre-miR-886-3p vähentynyt merkittävästi solujen vaeltamiseen 22 tuntia (p 0,001). A) edustaja kuva haavan määrityksen hetkellä 0 ja 22 tunnin kuluttua alusta. B) kvantifiointi haavan leveyden sulkeminen miR-886-3p yli-ilmentymisen. Kuusi eri paikoissa visualisoitiin ja valokuvattiin vaiheittain kontrastin käänteismikroskooppi (10-kertainen suurennus) kuhunkin maljaan eri ajankohtina, ja kolme levyä käytettiin kussakin ryhmässä. Haava leveys 10 × kuvat mitattiin tavallisella paksuus. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja samanlaiset tulokset havaittiin. (*** Osoittaa p 0,001).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, suoritimme miRNA profilointiin familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän kasvainnäytteestä. Löydettiin neljä miRNA ilmentyvät differentiaalisesti näiden ryhmien välillä, joista kaksi, miR-886-3p ja miR-20a, validoituja differentiaalisesti ilmaistaan ​​3- ja 4-kertaiseksi. Molemmat miRNA oli vaimentua vuonna papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna normaaliin kilpirauhaskudokseen by 3,5-4-kertaiseksi. Genominlaajuisten geenin ilmentymisen koulutusjakson ja tavoite ennustus analyysit osoittivat geenien DNA: n replikaatioon ja polttovälin tarttuvuus reitit olivat kohteena miR-886-3p. Yli-ilmentymisen miR-886-3p kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa esti merkitsevästi solujen lisääntymistä, määrä ja koko pallosia, ja solumigraatiota. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-886-3p lisäsi solujen S-vaiheessa ja vähensi solujen G

0G

1 vaihe ilman vaikutusta apoptoosiin.

Emme ole tietoisia muita tutkimuksia, jotka ovat verranneet miRNA profiilia kasvainten liittyy perinnöllinen syöpien hoitamiseksi niiden yksittäisesti esiintyvä kollegansa. Tällainen analyysi on tärkeitä oivalluksia geneettisen polkuja, jotka voivat olla erilaisia ​​histologisesti samankaltainen kasvaimia, tärkeitä tavoitteita altistavia geneettisiä muutoksia, ja, kun kyseessä on FNMTC, molekyylitasolla. Vaikka useimmat tutkijat ovat ehdottaneet, että FNMTC on selvä perinnöllinen oireyhtymä, argumentteja tästä ovat, että 1) sama alttius geeni (t) ja tai lokusten ei ole todettu useilla sidos tutkimuksissa, 2) ei-pahanlaatuisten kilpirauhasen kasvaimet ovat yleisiä ja siten kilpirauhassyöpä diagnoosi voi olla perustajana vaikutusta tai muuten löydetty, ja 3) expressivity on vaihteleva [2]. Toisaalta useat tutkimukset tukevat FNMTC olevan selvä perinnöllinen oireyhtymä, koska 1) useiden sukujen on raportoitu olevan monen sukupolven esiintyminen FNMTC, 2) on korkeampi kilpirauhasen syöpä miehillä ja lapset FNMTC sukutaulujen, 3 ) on olemassa aikaisempi ikä esitys, ja 4) on uros-uros siirto. Lopuksi epidemiologiset tutkimukset osoittavat, että riski kilpirauhassyövän on ensimmäisen asteen sukulainen potilaan diagnosoitu kilpirauhasen syöpä on 5-kertaa korkeampi [28]. Koska tämä kiista, ryhdyimme onko ilmaisua profiilit familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän olivat erilaiset. Suuri määrä miRNA oli väärin säädellystä sekä familiaalinen ja satunnaisia ​​papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna normaaliin kilpirauhaskudokseen. Suoritimme miRNA profiloinnin Tuumorinäytteissä potilailta, jotka oli sovitettu iän, sukupuolen ja TNM syövän vaiheessa. Tällainen lähestymistapa on ollut käyttää minimoimaan häiritsevien tekijöiden, jotka voivat johtaa erilaisiin miRNA ilmentymisen profiili koska eri sairauden laajuudesta, histologinen alatyyppien kasvain, ja erilaistumisen tilasta kasvaimen [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Siksi uskomme huolellista tutkimista suunnittelu ja analyysi antaa tiedoista, jotka ensimmäistä kertaa, tukee molekyyli- ero familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän.

Niistä ilmentyvät eri miRNA välillä familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyöpä, kaksi miRNA validoituja ekspressoitua eri kvantitatiivisella RT-PCR. Sekä miR-20a (13q31.3) ja miR-886-3p (5q31.2) eivät sijaitse kromosomi loci aiemmin tunnistettu alttiuslokukset kytkemällä tutkimukset suvuissa kanssa FNMTC. Koska vain pieni nukleotidin pituisia miRNA, ei ole yllättävää, että geneettisten muutosten kromosomi loci koodaus miR-20a ja miR-886-3p on ehkä jäänyt näissä tutkimuksissa, vaikka käytetään korkean resoluution SNP paneelit [13]. Tulevaisuudessa iturataan sekvenssianalyysi voidaan käyttää määrittämään, jos nämä miRNA ovat ehdokas alttiusgeenit varten FNMTC. Lisäksi on tärkeää määrittää tulevissa tutkimuksissa mekanismi yleisen MiR-886-3p downregulation in kilpirauhassyöpä johtuu kopioluvun vaihtelu, inaktivoivat mutaatiot tai poistamista.

Olimme kiinnostuneita tutkimuksiin, Mir-886-3p kilpirauhasen syövän synnyn useista syistä. Pääasiassa toiminta miR-886-3p on tuntematon, miR-886 geenin kromosomaalisen sijainti 5q31 jaetaan transformoiva kasvutekijä β1, tärkeä säätelijä epiteelin syövän synnyn, ja taso miR-886-3p ilmentymisen ero familiaalinen ja satunnaista papillaarinen kilpirauhassyövän oli suuri (3-kertainen). Vastaa meidän havaintojen tuore tutkimus osoitti miR-886-3p säädeltiin vähentävästi vuonna okasolusyöpä keuhkosyöpä verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa, mikä viittaa mahdolliseen tuumorisuppressoriproteiinia rooli tämän miRNA [5]. Käyttämällä kaksi hyvin tunnettu kilpirauhassyövän solulinjat eriasteisesti pohjapinta miR-866-3p ilme, osoitimme, että miR-886-3p on kriittinen rooli solujen proliferaatio ja migraatio, ja säätelee geenien mukana DNA: n replikaatioon ja fokaalisen adheesion reittejä. Valitsimme

Cdc6

, voimakas säätelijä DNA: n replikaation ja oncogenesis [27], tarkempaa analysointia ja totesi, että

Cdc6

oli välittömänä kohteena miR-886-3p. Vaikka toiminnallinen tutkimukset tehtiin vuonna kilpirauhassyöpä linjat, meidän tietojen mukaan miR-886-3p on tärkeä säätelijä kasvaimen solubiologian kilpirauhassyövän hoitoon [26].

yli-ilmentyminen miR-886-3p aiheutti dramaattisen muutoksia geenien ilmentymisessä, jotka säätelevät DNA: n replikaatiota ja polttovälin tarttuvuus. Neljä geenit (

Cdc6

,

PIP5K1C

,

PXN

,

ZYX

) oli 4-kertainen Knockdown lisääntynyt miR-886-3p ilme .