Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Runt liittyvä transkriptiotekijä 3 (RUNX3) on tuumorisuppressorina syövän ja näyttää olevan tärkeä osa transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-ß ) aiheuttaman tuumorisuppressiogeeneksi kautta. Yllättäen huomasimme, että RUNX3 ekspressiotaso pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) kudoksiin, joka on yksi yleisimpiä ihmisen syövän, oli korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa, jonka aiemmin julkaistu microarray aineisto meidän esitutkimus. Siksi täällä selvitimme onkogeenisiä roolia RUNX3 vuonna HNSCC.

Keskeiset havainnot

Usein RUNX3 ilmaisun ja sen korrelaatio pahanlaatuinen käyttäytymistä havaittiin HNSCC. Kohdunulkoinen RUNX3 yliekspressio edistää solujen kasvua ja esti seerumistarvaatio aiheuttaman apoptoosin ja kemoterapeuttisen lääkkeen aiheuttama apoptoosin HNSCC soluissa. Nämä havainnot varmistettiin RUNX3 knockdown. Lisäksi RUNX3 yliekspressio parantaa tumorsphere muodostumista. RUNX3 ilmentymistaso oli hyvin korreloi metylaatiostatuksen in HNSCC soluissa. Lisäksi RUNX3 ilme oli alhainen johtuen metyloinnin sen promoottorin normaaleissa suun epiteelisoluissa.

Johtopäätökset /merkitys

havainnot viittaavat siihen, että i) RUNX3 on onkogeenisessä rooli HNSCC, ii) RUNX3 ekspressiotaso havaittiin HNSCC voi johtua osittain demetylaation aikana syövän kehitystä, ja iii) RUNX3 lauseke voi olla käyttökelpoinen markkeri ennustamiseen pahanlaatuinen käyttäytymistä ja vaikutusta kemoterapeuttisen lääkeaineiden HNSCC.

Citation: Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa I, Fujita T, Kurihara H, et al. (2009) RUNX3 Onko onkogeenisessä Rooli pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10,1371 /journal.pone.0005892

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu 4 helmikuuta 2009; Hyväksytty: 15 toukokuu 2009; Julkaistu: 12 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Tsunematsu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustuksia-in-tukea opetus-, tiede- ja Japanin kulttuuri (YK ja TT) sekä Satake koulutuksen ja tutkimuksen avustus (YK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

RUNX3 /AML2 /PEBP2C /CBFA3 on transkriptiotekijä, ja yksi Runt liittyvien (RUNX) perhe. Kolme jäsentä Runx perheen geenejä,

RUNX1

,

RUNX2

ja

RUNX3

, ja niihin liittyvät geeni,

CBFB /Pebpb2

, ovat kaikki tunnetaan kehitykselliset sääntelyviranomaisten ja on osoitettu olevan tärkeitä ihmisen syövissä [1]. RUNX3 alun perin kloonattiin AML2 ja kromosomissa 1p36.1 [2]. RUNX3 on useita toimintoja ja sen aluksi raportoitu korreloivan syntyhistoriasta ja etenemistä ihmisen mahasyövän tuumorisuppressorina [2]. Runx3-null hiiret osoittavat hyperplasiaa mahan limakalvon seurauksena stimuloidun proliferaation ja tukahdutti apoptoosin epiteelisolujen [3]. Itse asiassa, RUNX3 inaktivoidaan yli 80% ihmisen mahalaukun syövän geenien ja proteiinien mislocalization [4]. Sen lisäksi, mahasyöpä, on raportoitu, että alentunut ilmentyminen RUNX3 havaittiin erilaisten syöpien, mukaan lukien virtsarakon, maksan, paksusuolen ja peräsuolen ja keuhkojen syövät [5] – [8]. Näiden kasvainten, vähentää ilmentymistä RUNX3 on usein aiheuttanut CpG-saarekkeen hypermetylaation [9]. Lisäksi pistemutaatioita

RUNX3

havaittiin tietynlainen ihmisen syövissä kuten maha- ja virtsarakon syöpien [3], [5]. Yhdessä RUNX3 toimii tuumorisuppressorina erilaisissa syövissä.

Pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC) on yksi yleisimpiä ihmisen syövän, joiden vuosittainen ilmaantuvuus on yli 500000 tapauksissa maailmanlaajuisesti [ ,,,0],10]. Kuten useimmat epiteelin syövät, HNSCC kehittyy kertymistä useiden geneettisten ja epigeneettiset muutokset on monivaiheinen prosessi [11]. Yllättäen huomasimme, että RUNX3 ekspressiotaso HNSCC kudoksissa oli korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa, jonka aiemmin julkaistu microarray aineisto 41 HNSCC potilaista ja 13 normaalia valvontaa Alustavan tutkimuksen [12] (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että viime aikoina on raportoitu, että RUNX3 yli-ilmentyminen havaittiin tyvisolusyöpä ihon [13]. Siksi ajattelimme, että RUNX3 voisi olla onkogeenisessä rooli HNSCC sekä tyvisolusyöpä ihon. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme ilmaisun ja roolit RUNX3 varten HNSCC kehittämiseen.

V: Total RNA 41 ensisijaisen HNSCC ja 13 normaaleista kudoksista leimattiin ja hybridisoitiin Affymetrix U133A geenilastut kuten aiemmin raportoitu. Kaavio osoittaa keskimääräisen signaalin voimakkuuden RUNX3 41 HNSCC ja 13 normaalia kudosten mikrosiruanalyysillä. RUNX3 ekspressiotaso HNSCC on korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa. B: n ilmentyminen RUNX3 mRNA 14 HNSCC solulinjoissa (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1, Ho-1-U-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313, TSU ja OMI) RT-PCR. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. C: Expression of RUNX3 mRNA: n eri syöpäsolulinjoissa mukaan lukien paksusuolen syöpä (RKO ja HCT116), mahasyöpä (MKN-1 ja MKN-45), leukemia (HL60), lymfooma (U937) ja rintasyöpä (MCF7 ja SK-BR3 ). GAPDH: ta käytettiin kontrollina. D: n ilmentyminen RUNX3 mRNA: 18 HNSCC tapauksissa RT-PCR: llä. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. E: n ilmentäminen RUNX3 proteiinin 6 HNSCC solulinjoissa (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1 ja Ho-1-U-1) tutkittiin Western blot -analyysillä. Cul1 ilmentyminen käytettiin latauskontrollina.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Transforming growth factor SS1 (TGF-ß), emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF ) ja Verihiutalekasvutekijät kasvutekijä-AA (PDGF-AA) saatiin R 5′-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 ’ja käänteisaluke-; 5’-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 ’. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. Alikvootit koko cDNA monistettiin Go Taq® Green Master Mix (Promega), ja monistukset suoritettiin PC701 lämpösyklilaitteessa (Astec, Fukuoka, Japani) 30 syklin jälkeen, kun ensimmäinen 30 sekunnin denaturaatio 94 ° C: ssa, lämpökäsiteltiin 30 s 60 ° C: ssa, ja jatketaan 1 min 72 ° C: ssa kaikissa alukkeita. Monistusreaktio tuotteet erotettiin 1,5% agaroosi /TAE geelit (Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japani), elektroforeesi 100 mV, ja visualisoitiin etidiumbromidivärjätystä.

Western blot-analyysi

Western blottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Anti-RUNX3 monoklonaalinen vasta-aine (R3-5G4, ystävällisesti Dr. Ito, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore), anti-FLAG-vasta-ainetta (M2, Sigma) ja anti-Cul1 polyklonaalista vasta-ainetta (Zymed) käytettiin. Kolmekymmentä ug proteiinia ajettiin 10% polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja sen jälkeen elekt- nitroselluloosasuodattimelle. Havaitsemista varten immuno-kompleksin, ECL Western blotting havaitsemisjärjestelmä (Amersham) käytettiin.

immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen tunnistus RUNX3 on HNSCC tapauksissa suoritettiin 4,5 um: n osat on asennettu piin päällystettyihin lasilevyille käyttäen streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-tekniikalla kuten aiemmin on kuvattu [14]. Immunohistokemiallinen havaitseminen Runx3 ihmisen eri syövistä myös 3 ruokatorven syöpiä, 3 syöpien, 3 paksusuolen syövät, 3 peräsuolen syövät, 3 haima syövät, 3 maksa syövät, 3 keuhkosyövässä, 3 munuaisten syövät, 3 virtsarakon syövät, ja 4 kohtu syöpien suoritettiin käyttäen kudosta mikrosirulla (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japani). Immunohistokemiallista tutkimusta, anti-RUNX3 monoklonaalinen vasta-aine (R3-6E9, ystävällisesti Dr. Ito, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore) käytettiin. Immunohistokemialliseen tutkimuksessa hiiren kudoksissa, anti-Runx3 monoklonaalinen vasta-aine (R3-1E10, MBL Co. Ltd.) käytettiin. Ilmentyminen RUNX3 luokiteltiin positiivisia (yli 5% tuumorisolujen tai epiteelisolujen osoitti immunopositivity) ja negatiivisen (alle 5% tuumorisolujen tai epiteelisolujen osoitti heikkoa tai paikallinen immunopositivity tai ei värjäytymistä). Kolme patologit (Y.K., I.O., ja T.T.) teki kaikki arvioinnit. Mahdolliset korrelaatio muuttujien analysoidun kasvain näytteet testattiin yhdistys, jonka Fisherin testiä.

P

arvo 0,05 vaadittiin merkitys.

5-atsa-2′-deoksisytidiinin hoidon

HSC4 solujen ja normaalien epiteelisolujen käsiteltiin alustassa, joka sisälsi 300 nM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC, Sigma) 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja tutkittiin ilmentymistä RUNX3 mRNA: RT-PCR: llä.

bisulfiittimodifikaatio ja metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (PCR) B

Genominen DNA soluista tai kudoksista uutettiin käyttäen DNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Viisikymmentä mikrolitraa supernatanttia käytettiin suoraan lähteenä DNA natriumbisulfiittia hoitoon. DNA-näytteet käsiteltiin bisulfiitin muuntaa kaikki metyloitumattomat sytosiinit urasiileja jätetään samalla metyloituja sytosiineja ennallaan. DNA denaturoitiin NaOH: lla (lopullinen pitoisuus, 0,2 M) 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Kolmekymmentä ui 10 mM hydrokinonia (Sigma) ja 520 ui 3 M natriumbisulfiittia (Sigma) pH: ssa 5,0 sekä juuri valmistettu, lisättiin ja sekoitettiin, ja näytteitä inkuboitiin 50 ° C: ssa 16 tuntia. Modifioitu DNA puhdistettiin käyttämällä Wizard DNA: n puhdistus hartsia (Promega) ja eluoitiin 50 ul: aan vettä. Muutos saatiin valmiiksi NaOH (lopullinen pitoisuus, 0,3 M) käsittely 5 min huoneen lämpötilassa, jota seurasi etanolisaostus. Modifioitu DNA: t monistettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 2 ui 10 x PCR-puskuria, jossa on 15 mM MgCI 2, 4 ui 5xQ-liuos, kaksikymmentäkaksi kutakin aluketta, 0,2 mM dNTP: itä ja 0,75 U Taq-polymeraasia (Hotstar Taq DNA-polymeraasia; Qiagen, Hilden, Saksa). Sen jälkeen, kun seosta kuumennettiin 95 ° C: ssa 15 minuutin ajan, PCR suoritettiin lämpösyklilaitteessa (GeneAmp 2400; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja 35 sykliä denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 58 ° C 60 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 60 sekunnin ajan, minkä jälkeen lopullinen 10 minuutin pidentäminen 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin 8% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä. RUNX3 CpG-saarekkeen ja analysoitiin alueet (nro 1-10) on esitetty kuviossa 2B. Alukesarjat Tässä tutkimuksessa käytetyt lueteltiin taulukossa S1 (GenBank AL023096) [15].

V: n ilmentyminen RUNX3 tutkittiin ihon epiteelin (× 100 ja x 250, ylempi paneeli), normaali suun limakalvojen (× 100 ja x 250, keskimmäinen paneeli) ja normaali suun limakalvojen kanssa soluttautuminen krooninen tulehduksellinen soluja (x 100 ja x 250, alempi paneeli). Ihon epiteelin, jotkut orvaskeden solut osoittivat RUNX3 ilmentymistä sen ytimeksi. Normaaleissa suun limakalvon kudoksissa, vain muutamia epiteelisoluja tyvikerroksen ilmaistuna RUNX3 niiden ytimet, ja useimmat epiteelisolujen ei ilmaista RUNX3. Normaalissa suun limakalvojen kanssa soluttautuminen krooninen tulehduksellinen soluja, lymfosyyttejä päätymisen suun limakalvon osoitti RUNX3 ilme. B: n ilmentyminen RUNX3 tutkittiin HNSCC tapauksissa (× 100). Useimmat syöpäsolut ilmaistuna RUNX3 niiden ytimet.

Generation of RUNX3 yli-ilmentyvä HNSCC solujen

RUNX3 ekspressioplasmidin pcDNA3 koodaa FLAG-leimattua RUNX3 cDNA, oli ystävällisesti toimittanut Dr. Ito (Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore). RUNX3 /pcDNA3-plasmidin tai pelkällä vektorilla vietiin HSC3 soluihin, ja sitten G418 (500 ug /ml, Gibco) lisättiin elatusaineeseen 48 tunnin kuluttua transfektion. 2 viikon kuluttua G418-valinnan, saimme vakaa altaan klooneja. Cell transfektiot suoritettiin käyttämällä FuGENE 6 (Roche) noudattamalla valmistajan ohjeita.

vaimentaminen mukaan Sirna

logaritmisesti kasvavia Ca9-22-soluja ympättiin tiheydellä 10

5cells /6 cm: n malja ja transfektoitiin oligot kahdesti (24 ja 48 tuntia sen jälkeen jatkomaljausta) käyttäen Oligofectamine (Invitrogen), kuten on kuvattu [16]. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia viimeisen transfektion, lysaatit valmistettiin ja analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus. SiRNA on 19 bp: n duplex-oligoribonukleotidi, jossa on sense-juoste, joka vastaa nukleotideja 275-293 ihmisen RUNX3 mRNA-sekvenssin; 5′-ccuucaaggugguggcauu-3 ’. Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina.

Virtaussytometrinen analyysi

Cell cycle jakautuminen määritettiin DNA-sisällön analyysi jälkeen propidiumjodidin värjäystä. Soluja viljeltiin, kuten edellä on kuvattu, ja kiinnitettiin 70% etanolilla ja varastoitiin 4 ° C: ssa ennen analyysiä. Virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuuden analysoitiin FACS Calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) -virtaussytometriä. Kunkin näytteen, 20.000 tapahtumaa säilytettiin.

anneksiini V ja propidiumjodidia Dual-värjäys Pitoisuus

Kun seerumistarvaatio tai Dox hoito, sitten solut värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidun anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI), käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection kit (Becton-Dickinson) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Apoptoottisia soluja tunnistettiin dual-värjäys yhdistelmä-FITC-konjugoitu anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI). Tietojen hankinta ja analysointi tehtiin FACSCalibur (Becton-Dickinson) virtaussytometria käyttäen CellQuest ohjelmistoa.

Tulokset

Erittäin ilmentymistä RUNX3 vuonna HNSCC

Ensimmäinen, selvitimme ilmentyminen RUNX3 14 HNSCC solulinjoissa (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1, Ho-1-N-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313 , TSU, ja OMI). RUNX3 mRNA havaittiin 9 14 HNSCC solulinjojen (kuvio 1 B). Tietyissä tyyppinen ihmisen syövissä, mukaan lukien mahalaukun ja virtsarakon, on raportoitu, että pistemutaatioita RUNX3 havaittiin [3], [5]. Ei kuitenkaan mutaatioita löydettiin HNSCC solulinjoissa RUNX3 mRNA: n ekspression (Ca9-22, Ho-1-U-1 ja Ho-1-N-1) (tuloksia ei ole esitetty). RUNX3 mRNA ilmentyminen tutkittiin myös erilaisissa syöpäsolulinjoissa lukien paksusuolen syöpä (RKO ja HCT116), mahasyöpä (MKN-1 ja MKN-45), leukemia (HL60), lymfooma (U937) ja rintasyöpä (MCF7 ja SK-BR3 ) (kuvio 1 C). RKO, MCF7 ja SK-BR3-solut eivät ilmaisseet RUNX3 mRNA. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, RUNX3 ilmentyminen oli hyvin korreloi metylaatiostatuksen, lukuun ottamatta SK-BR3-soluja [17] – [20]. SK-BR3-solut, alas-säätely RUNX3 arvellaan johtuvan tuntemattoman mekanismin [20]. Tutkimme myös ilmentymisen RUNX3 mRNA 18 HNSCC kudoksissa. 13: 18 (72,2%) HNSCC kudoksiin, RUNX3 mRNA: n ekspressio havaittiin (kuvio 1 D). Seuraavaksi RUNX3 proteiinin ilmentyminen tutkittiin Western blot-analyysi 6 HNSCC soluissa (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1 ja Ho-1-N-1) (kuvio 1 E). Niistä, Ca9-22, Ho-1-U-1 ja Ho-1-N-1-soluissa ilmaistuna RUNX3 proteiinia, joka vastaa mRNA: n ilmentymisen. Sitten tutkimme RUNX3 ilmentymistä 9 normaalissa suun limakalvon kudoksissa ja 52 HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti. Ensinnäkin, käytimme ihon epiteelin ja paksusuolen limakalvolle reaktiivisuuden RUNX3 ilmaisua. Kuten esitetään tuoreessa raportissa [13], orvaskeden solujen osoitti myös RUNX3 ilmentymistä sen ytimet (kuvio 2A, ylempi paneeli). Tutkimme myös RUNX3 ilmentymisen paksusuolen syöpä. Paksusuolen syöpä, RUNX3 ajatellaan olevan kasvainsuppressorigeenin [18]. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [18], RUNX3 ilmentyminen havaittiin sen ytimet normaalin limakalvon, kun taas koolonkarsinoomasoluissa ei ilmaissut RUNX3 (kuva S1). Normaaleissa suun limakalvon kudoksissa, vain muutamia epiteelisoluja tyvikerroksessa hieman ilmaistuna RUNX3 niiden ytimet, ja useimmat epiteelisolujen ei ilmaista (kuvio 2A, keskimmäinen paneeli). Lymfosyytit soluttautuminen normaaliin suun limakalvon osoitti RUNX3 ilmaisu (kuvio 2A, alempi paneeli). Immunopositivity of RUNX3 lymfosyyteissä käytettiin positiivisena kontrollina värjäystä. Toisaalta useimmat syöpäsolujen ilmaistuna RUNX3 niiden ytimet (kuvio 2B). Meillä on myös vahvistanut, että ydin- ilmentyminen RUNX3 käyttämällä ydin- ja sytoplasminen osa HNSCC solulinjojen, mikä osoittaa ei-proteiini mislocalization (tuloksia ei ole esitetty). RUNX3 ilmentymistä havaitaan usein 50% (26 52) HNSCC tapauksissa (taulukko 1). Lisäksi vertasimme RUNX3 ilmaisutapoja kliinis-patologisia löydöksiä kuten erilaistumista, invasiivisuus ja etäpesäkkeiden. Mielenkiintoista, RUNX3 ilmentyminen oli hyvin korreloi pahanlaatuisia käyttäytymistä, mukaan lukien huonosti erilaistuminen, invasiivisuus ja etäpesäkkeiden (taulukko 1).

metylaatiostatuksen

RUNX3

oli hyvin korreloi sen mRNA: n ekspression HNSCC

Kysyimme miten RUNX3 ilmentyminen aiheutti vuonna HNSCC. Alennettu ilmentyminen RUNX3 on usein aiheuttanut CpG-saarekkeen hypermetylaation eri syöpätyyppien [9]. Itse asiassa, RUNX3 ilmentyminen havaittiin HSC4 soluja ilman RUNX3 ilmentyminen sen jälkeen, kun 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoitoa (kuvio 3A). Homma et ai. tutki metylaatiostatuksen useiden alueiden

RUNX3

promoottori CpG saari (3478 bp) sisällä proksimaalisen promoottorin (nro 1-10) in syöpien ja totesi, että metylaatio alue ulottuu transkription aloituskohdasta (nro . 5-8) on kriittinen menetys RUNX3 ilmaisun (kuvio 3B) [15]. Tutkia

RUNX3

metylaatio asema HNSCC, olemme analysoineet metylointi

RUNX3

lainkaan promoottorialueet (nro 1-10) metylointi-spesifistä PCR: ää paneelin HNSCC solulinjojen (Kuva 3C ja 3D). HNSCC solujen RUNX3 ilme näytti unmethylation tai osittain metylaation nro 5-8 alue (kuvio 3D). HNSCC soluja ilman RUNX3 ilme näytti täysin metylaation nro 5 ja 6 alueella. Siten metylaatiostatus

RUNX3

promoottorialue oli hyvin korreloi RUNX3 mRNA: n ekspression HNSCC solulinjoissa.

V: RUNX3 ilmentyminen tutkittiin jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5 -Aza) hoitoon. HSC4 soluja käsiteltiin elatusaineessa, joka sisälsi 300 nM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja tutkittiin ilmentymistä RUNX3 mRNA: RT-PCR: llä. B:

RUNX3

CpG-saarekkeen ja analysoitiin alueita (nro 1-10) esitetään pystypalkit. Transkription aloituspaikan (TSS) sijaitsee alueella nro 7. C: metylaatiostatuksen RUNX3 vuonna HNSCC solulinjoissa. Genomi-DNA uutettiin HNSCC solulinjojen ja käsiteltiin bisulfiitilla. Metylaatiostatuksen promoottorialue (nro 1-10) tutkittiin metylaatiospesifisen PCR-menetelmällä. D: Yhteenveto metylaation ja ilmaisun asemaa RUNX3 vuonna HNSCC solulinjoissa. E: n ilmentyminen Runx3 hiiren kielen epiteelin alkion (yläpaneeli) ja aikuisten (alempi paneeli) hiiri immunohistokemiallisesti. Kielen kudoksiin hiiren alkioiden alkion päivänä 15,5 ja 10 viikkoa vanhoja BALB /c-hiiriä käytettiin. F: RUNX3 mRNA: n ekspressio tutkittiin RT-PCR: llä 4 ensisijainen viljeltiin normaaleissa suun epiteelisolujen (# 1- # 4). HSC4 solun käytettiin negatiivisena kontrollina ja Ca9-22 solujen käytettiin positiivisena kontrollina RUNX3 ekspressiota. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. G: RUNX3 ilmentyminen tutkittiin jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) hoitoon. Ensisijainen viljeltiin normaaleissa suun epiteelisolujen (# 1 ja # 2) käsiteltiin väliaineella, joka sisälsi 300 nM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja tutkittiin ilmentymistä RUNX3 mRNA: RT-PCR: llä. H: Genominen DNA uutettiin 4 ensisijainen viljellyistä normaalit suun epiteelisolujen (# 1- # 4). Metylointi tila alue nro 5-8 tutkittiin metylaatiospesifisen PCR-menetelmällä. I: Yhteenveto metylaation ja ilmaisun asemaa RUNX3 normaaleissa epiteelisoluissa.

Viime raportin mukaan Runx3 ilmaistaan ​​kielen ja kitalaen epiteelin hiiren alkioiden alkiopäivänä 12,5-16,5, ja että Runx3 ilme vähenee jälkeen alkion päivä 16.5 ja katoaa vastasyntyneillä hiirillä [21]. Tässä meillä on myös vahvistanut, että Runx3 ilmentymistä havaittiin kielen epiteelin hiiren alkioiden (E15.5), mutta ei aikuisen hiiren kielen epiteelin (10 viikkoa vanha) (kuvio 3E). Nämä havainnot saivat meidät oletuksen, että

RUNX3

saattaa vaiennetaan metylaatio aikuisen suun epiteelisolujen. Suun limakalvon kudos sisältää yleensä sidekudoksen ja tunkeutuvia lymfosyyttejä. Kuten on esitetty kuviossa 2A (alempi paneeli), lymfosyyttien infiltroituvat normaaliin suun limakalvon osoitti RUNX3 ilmentymistä. Siksi käytimme ensisijaisesti viljellyt epiteelisoluja on saatu normaalista suun kautta epiteelin tässä tutkimuksessa saastumista välttäen lymfosyyttejä. Samanlaisissa Immunohistokemiallisten tutkimusten (kuvio 2A), 4 ensisijainen viljellyistä epiteelisoluja on saatu normaalista suun kautta epiteelin (# 1- # 4) ei ilmaista RUNX3 mRNA: ta (kuvio 3F), mikä osoittaa, että ilmentymisen taso RUNX3 on vähän tai ei ollenkaan in adult normaalissa suun epiteelin. Tutkimme RUNX3 ilmaisun jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoitoa. RUNX3 ilmentyminen up-säännellään 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoitoa 2 ensisijainen viljellyissä epiteelisoluja (# 1 ja # 3) (kuvio 3G). Sitten me tutki

RUNX3

hiljennettiin metyloitumisella aikuis- suun epiteelisolujen. Suoritimme metylaatiospesifinen PCR: 4 ensisijainen viljellyissä epiteelisoluissa alueella ulottuu transkription aloituskohdasta

RUNX3

(nro 5-8), joka on kriittinen menetys RUNX3 ilmentymisen HNSCC soluissa (kuvio 3C). Mielenkiintoista, 2 ensisijainen viljellyistä epiteelisoluja (# 1 ja # 2) osoitti osittain metylaation nro 6 ja nro 7 alueella, ja toinen 2 ensisijainen viljellyistä epiteelisoluja (# 3 ja # 4) osoitti täysin metylaation nro 7 ja nro . 8 aluetta (kuvio 3H ja 3I).

RUNX3 yliekspressio solujen lisääntymisen tehostuneen ja esti apoptoosin

Jos haluat tietää roolia RUNX3 vuonna HNSCC, me stabiilisti transfektoitu ekspressiovektorilla FLAG-RUNX3 osaksi HSC3 solujen pienempi ilmentyminen RUNX3. Saimme stabiilisti RUNX3 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 4A). Mielenkiintoista on, RUNX3 yliekspressio parantaa solujen kasvua (kuvio 4B). Tällä 6 päivää, määrä RUNX3 yli-ilmentäviä soluja oli huomattavasti korkeampi kuin kontrollisolut. Vaikka me tutkimme muuttoliikkeen ja invaasio, RUNX3 yliekspressio ei edistää muuttoliikettä ja invaasiota (kuva S2). Lisäksi lisääntynyt väestön vastaa osa-G1 after seerumistarvaatio havaittiin vain ohjaus-soluissa, mutta ei RUNX3 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 4C). Osoittamaan, onko tämä lisäys sub-G1 tunnistettiin kontrolli-soluissa sen jälkeen, kun seerumistarvaatio johtuu apoptoosin, apoptoosin taso arvioitiin käyttämällä anneksiini V-FITC /propidium- jodidia määrityksissä (kuvio 4D). Anneksiini V /propidiumjodidi double-positiivisia soluja havaittiin 1,8% RUNX3 yli-ilmentäviä soluja, kun taas 21,7% kontrollisoluja, mikä osoittaa, että RUNX3 yliekspressio inhiboi seerumistarvaatio aiheuttamaa apoptoosia. Vahvista nämä fenotyypit, tutkimme knockdovvn RUNX3 vuonna Ca9-22 soluissa, jotka osoittivat RUNX3 yli-ilmentymisen ja oli resistenttejä seerumistarvaatio indusoiman apoptoosin. Sillä knockdovvn RUNX3 käytimme kolmea eri siRNA (si-RUNX3-1, si-RUNX3-2 ja si-RUNX3-3) ja niiden cocktail. RUNX3 ilmentyminen merkittävästi vaiennetaan si-RUNX3-1 (Kuva S3A). Siksi käytimme si-RUNX3-1 seuraavien tutkimuksissa. RUNX3 siRNA transfektio vähensi ilmentymistä RUNX3 mRNA: ta ja proteiinia Ca9-22 soluissa (kuvio 5A). Tutkimme jos siRNA indusoi epäspesifistä interferoni stressiä vastausta. RUNX3 siRNA hoito ei aiheuttanut klassinen interferoni-reagoiva geenejä, OAS1 ja ISG54 mRNA: iden, mikä osoittaa, että RUNX3 siRNA hoito ei aiheuttanut merkittävää interferonivastetta (kuvio S3B). Kuten odotimme, RUNX3 siRNA inhiboi solun kasvua (kuvio 5B). Tällä 6 päivää, määrä RUNX3 siRNA käsiteltyjä soluja oli huomattavasti pienempi kuin kontrollisolujen. Lisäksi RUNX3 siRNA lisäsi väestöä vastaava osa-G1 jälkeen seerumistarvaatio (kuvio 5C). Anneksiini V /propidiumjodidi double-positiivisia soluja havaittiin 10,5% kontrollisoluja, kun taas 18,1% on RUNX3 knockdown-soluja (kuvio 5D).

: Generation of RUNX3 yli-ilmentäviä soluja. RUNX3 /pcDNA3-plasmidin tai pelkällä vektorilla vietiin HSC3 soluihin ja stabiili allas kloonit saatiin valikoimalla G418 2 viikkoa. Eksogeeninen ekspressio RUNX3 mRNA: ta ja proteiinia tutkittiin RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi (WB). Cul1 käytettiin latauskontrollina. B: Kaavio osoittaa solujen kasvua RUNX3 yli-ilmentävät ja ohjaus HSC3 soluja. Solut maljattiin 24-kuoppalevyille, ja trypsinisoitiin solut laskettiin Cell Counter (Coulter Z1) 0, 2, 4 ja 6 päivää. C: RUNX3 yliekspressio estivät seerumistarvaatio aiheuttamaa apoptoosia. Soluja inkuboitiin 0, 48 ja 96 tunnin kuluttua seerumistarvaatio ja kiinnitettiin 70% etanolilla. Solusyklin jakautuminen määritettiin DNA-sisällön analyysi jälkeen propidiumjodidivärjäys virtaussytometriä käyttämällä. Kunkin näytteen, 20.000 tapahtumaa varastoitiin. Suoritimme kaksi erillistä koetta. D: Virtaussytometrinen analyysi anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys valvonta- ja RUNX3 yli-ilmentää soluissa, sen jälkeen seerumistarvaatio 96 tuntia. Suoritimme kaksi erillistä koetta.

V: RUNX3 hiljentämiseltä Sirna. Logaritmisesti kasvavia Ca9-22 solujen RUNX3 ilmaisu ympättiin tiheydellä 10

5cells /6 cm: n malja ja transfektoitiin oligot kahdesti (24 ja 48 tunnin kuluttua jatkomaljausta). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia viimeisen transfektiosta solut kerättiin ja RUNX3 mRNA: ta ja proteiinin ilmentyminen tutkittiin RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä. B: Kaavio osoittaa, että solujen kasvu RUNX3 siRNA käsiteltyjen ja hallita Ca9-22 soluja. Solut maljattiin 24-kuoppalevyille, ja trypsinisoitiin solut laskettiin Cell Counter 0, 2, 4 ja 6 päivää. C: RUNX3 siRNA tehosti seerumistarvaatio aiheuttamaa apoptoosia. Solusyklin jakautuminen määritettiin DNA-sisällön analyysi jälkeen propidiumjodidivärjäys virtaussytometriä käyttämällä. Kunkin näytteen, 20.000 tapahtumaa varastoitiin. Suoritimme kaksi erillistä koetta. D: virtaussytometrianalyysin anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys hallinnassa ja RUNX3 pudotus solujen jälkeen seerumistarvaatio 96 tuntia. Suoritimme kaksi erillistä koetta.

Lisäksi tutkimme apoptoosin sen jälkeen, kun kemoterapeuttisen lääkeaineen ohjaus ja RUNX3 jotka yliekspressoivat HNSCC (kuvio 6). Ohjaus ja RUNX3 yli-ilmentävät HSC3 solut altistettiin 72 tunnin ajan adriamysiinin (DOX, 0,5 ja 1 ug /ml), joka on kemoterapeuttinen aine, joita käytetään yleisesti hoidettaessa HNSCC. Sub-G1 väestön RUNX3 yli-ilmentävät HSC3 solut oli 7,49%, kun taas kontrolli-soluissa oli 44,76% käsittelyn jälkeen 1 ug /ml DOX (kuvio 6A). Lisäksi käsittelyn jälkeen 1 ug /ml DOX, anneksiini V /propidiumjodidi double-positiivisia soluja havaittiin 25,2% valvonnan solujen, kun taas 8,9% RUNX3 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 6B). Toisaalta, anneksiini V /propidiumjodidia double-positiivisten solujen kasvoi RUNX3 taintumisen (kuvio 6C). Kaiken kaikkiaan nämä viittaavat siihen, että RUNX3 yliekspressio voi olla mukana HNSCC kehitykseen edistämällä solujen kasvun ja apoptoosin.

V: adriamysiini (Dox, 0, 0,5 ja 1 ug /ml) käsiteltiin 72 tunnin ajan hallinnassa ja RUNX3 yli-ilmentävät HSC3 soluja. Solusyklin jakautuminen määritettiin DNA-sisällön analyysi jälkeen propidiumjodidivärjäys virtaussytometriä käyttämällä. Kunkin näytteen, 20.000 tapahtumaa varastoitiin. Prosenttiosuus sub-G1 väestö on osoitettu. Suoritimme kaksi erillistä koetta, joissa kolmen kuopan kohti kunnossa. Edustavat tiedot näytetään. B: Virtaussytometrinen analyysi anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys valvonta- ja RUNX3 yli-ilmentää soluissa, sen jälkeen DOX hoidon 72 tuntia osoitetussa annoksilla. C: Virtaussytometrinen analyysi anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys valvonta- ja RUNX3 knockdown-soluja sen jälkeen, kun DOX-hoidon 72 tuntia osoitetussa annoksilla. Suoritimme kaksi erillistä koetta.

Jos haluat tietää roolia RUNX3 kasvainten synnyssä, selvitimme tumorsphere muodostumista käyttämällä ultra low kiinnityslevyjä. RUNX3 yliekspressio edistänyt tumorsphere muodostumiseen (kuvio S4A ja S4b). Keskimäärin pesäkkeiden oli 535,6 ja 663,3 valvonta ja RUNX3 yliekspressoivia soluja, tässä järjestyksessä (kuva S4b). Lisäksi RUNX3 knockdown esti tumorsphere muodostumiseen (kuvio S4C ja S4d).