Krooninen sairaus

tiivistelmä

koostumus ihmisen suoliston mikrobiston liittyy terveydentilaan. Tarkoituksena oli analysoida mikrobiston normaalin ja paksusuolen syöpäpotilaiden luomiseksi syöpään liittyvien dysbiosis.

Potilaat ja menetelmät

jakkara bakteerin DNA uutettiin ennen kolonoskopia 179 potilasta: 60 kolorektaalisyöpään, ja 119 normaali kolonoskopia. Bakteerien geenit saadaan pyrosekvensointi 12 ulostenäytteitä (6 normaali ja 6 Cancer) alistettiin validoitu Principal Component Analysis (PCA) koe. Hallitseva ja alidominantteja bakteerikantojen (

C. Leptum

,

C. Coccoides

,

Bacteroides /Prevotella

,

Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus ryhmiä

,

Bifidobacterium-suvun

, ja

E. coli,

ja

Faecalibacterium prausnitzii

lajilla) määrällisesti kaikkien yksilöiden käyttävät qPCR ja erityisiä IL17 tuottaja solujen suolen limakalvolla karakterisoitiin käyttäen immunohistokemia.

havainnot

pyrosekvensointi (Minimal sekvenssi 200 nukleotidin lukee) paljasti 80% kaikista sekvensseistä voitaisiin antaa yhteensä 819 eliösystematiikan perustuu oletus parametri luokitin ohjelmistoja. Fylogeneettiseen core in Cancer yksilöitä oli erilainen kuin Normaalien henkilöiden mukaan PCA-analyysi, jossa suuntaukset eroja ja aladominantista perheitä bakteerien. Näin ollen All-bakteerit [log

10 (bakteerit /g uloste)] Normal, ja Cancer yksilöt olivat samankaltaisia ​​[11,88 ± 0,35, ja 11,80 ± 0,56, vastaavasti, (P = 0,16)], mukaan qPCR arvojen kun taas kaikkien ja aladominantista lajien vain ne

Bacteroides /Prevotella

oli korkeampi (kaikki bakteerit-erityinen bakteeri; P = 0,009) in Cancer (-1,04 ± 0,55) kuin Normal (-1,40 ± 0,83) yksilöiden . IL17 immunoreaktiivisia solut huomattavasti ilmentää normaalissa limakalvon syöpäpotilaiden kuin ne, joilla on normaali kolonoskopia.

Johtopäätös

Tämä on ensimmäinen suuri sarja osoittaa koostumuksen muutos mikrobiston paksusuolen syöpäpotilaat mahdollisesta vaikutuksesta limakalvon immuunivasteen. Nämä tiedot avaavat uusia hakeutui joukkoseulonnan ja patofysiologia tutkimuksia.

Citation: Sobhani I, Tap J, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Langella P, et al. (2011) Microbial dysbiosis kolorektaalisyövässä (CRC) Potilaat. PLoS ONE 6 (1): e16393. doi: 10,1371 /journal.pone.0016393

Editor: Sylviane Pied, Lille 2 yliopisto, Ranska

vastaanotettu: 12 syyskuu 2010; Hyväksytty: 14 joulukuu 2010; Julkaistu: 27 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Sobhani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Cancéropole Ile de France, CoMiCa 2007-2010 projekti, (Charles Debray yhdistys-ACD); LNCC (French National League syöpää vastaan), CCR INSERM Promotion (2004-2006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen paksusuolen sisältää korkeintaan 10

14 bakteerit [1]. Niillä on tärkeä rooli käymisestä jäljellä ruokaa, modulaatio suolen immuunijärjestelmän toimintaa ja suojaa taudinaiheuttajia ja sairauksia [2] – [5]. Vaikka suolistomikrobistoon on pääosin myönteinen, muutoksia bakteereilla populaatioissa tai tuotteiden bakteeriaineenvaihdunnan voivat myötävaikuttaa sairauden.

Vuonna 1971, tutkimuksen tarkoituksena on tunnistaa assosiaatioita ihmisen mikrobiston koostumus ja peräsuolen syövän syntymistä, mutta se oli hylättävä, koska teknisiä ongelmia. Myöhemmin, Moore ja työtoverit kertoi, että 13 bakteerilajit merkittävästi liittyy suuri riski paksusuolen syövän ja Länsi ruokavalio [1]. Kuitenkin niiden tulokset olivat jonkin verran vakuuttavia, koska ne tutkitaan pieni määrä aiheita eikä suoliston tutkinta eli radiologian tai kolonoskopia suoritettiin. Kuitenkin, koska tämä tutkimus tehtiin, ihmisen paksusuolen mikrobiston on tullut merkittävä ympäristötekijä, joka näyttää moduloida riskiä paksusuolen syöpä, ja dysbiosis että suoliston mikrobiston on nyt uskotaan olevan taustavoima kehittämistä taudin geneettisesti -predisposed yksilöitä. Ei ole kuitenkaan mitään todisteita siitä dysbiosis todellakin esiintyy paksusuolen syöpä.

Only rajoitetuille bakteeripopulaatioita luonnossa on tunnistettu ihmiskehossa ja noin 80% ihmisen bakteerit tunnistetaan molekyyli työkalut eli metagenomic sekvensointi, katsotaan uncultivable [6]. Vaikka jotkut esiintyy bakteerilajien normaaleilla yksilöillä on nyt tunnistaa käyttämällä koko genomin sekvensointi [7], yli 60% lajeista ei vielä tunneta, ja ei ole mitään tietoa siitä, miten dysbiosis, jos sellainen on, voi esiintyä paksusuolen syövän potilaille. Täten DNA: n sekvensointi, joka kohdistuu hypervariaabelialueet pienissä ribosomaalisen alayksikön RNA geenit, erityisesti 16S rRNA geenit on mahdollistanut luonnehtia monimuotoisuuden pieneliöstöstä, mikä saattaa johtaa sairauksiin (katsaus, katso viite [8]). 16S rRNA on ribosomaalisen komponentti, joka on konservoitunut kaikissa bakteerit, ja se sisältää vaihtelevia sekvenssejä, jotka antavat Lajispesifisyyden. Tämän tekniikan hallitseva taksonien ihmisen suoliston mikrobiston ilmoitetaan olevan

Clostridium leptum,

C

lostridium coccoides

Bacteroides /Prevotella

ryhmien ja

Bifidobacterium

suvun [9]. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) lähestymistapa on mukautettu arvioimaan näiden bakteerien populaatiot suuria määriä näytteitä [10] – [11], ja muutokset mikrobiston komponentteja voidaan tutkia suhteessa terveys /taudin tilasta. Lajista riippuen vaikuttaa kokeellisia ja metabolisia tutkimuksia uusien patofysiologiaan lähestymistapoja. Esimerkiksi

Bacteroides

väestön ja erityisesti niille

Bacteroides fragilis

, on viime aikoina osoitettu tuottavan metalloproteaasiksi paksusuolen syöpäpotilaiden mutta ei valvontaa [12]. Tämä bakteerit on osoitettu indusoivan limakalvon säätelijä-T-solujen vasteita suolistossa, johon TH17 solurekrytoitumiseen eläimillä [13] – [14] viittaa vahvasti ne voivat muuttaa homeostaasiin efektori auttaja-T-solupopulaatioiden suoleen [14] – [15].

käyttämällä pyrosekvensointi tekniikkaa, me raportoimme todisteita siitä, että paksusuolen syöpä tauti liittyy dysbiosis lähinnä muutoksesta ja aladominantista lajeja. Käyttämällä qPCR vertasimme suoliston bakteerien yhteisöjä kuin terveillä henkilöillä ja niissä paksusuolen syövän suurin sarjassa tähän mennessä raportoitu ja esittävät tason dysbiosis vakiintuneisiin mikrobiston lajeihin. Laitamme nämä tulokset näkökulmasta limakalvon immuunijärjestelmän homeostaasiin ja uloste merkkiaine massaseulontaohjelmien.

Tulokset

Ominaisuudet yksilöiden

Ne luokitellaan seuraavasti: Normaali (n = 119 ), joilla oli normaali kolonoskopia; joilla paksusuoli (n = 44) tai peräsuolen (n = 16) syöpä (yhteensä n = 60). Syöpäpotilaiden olivat sukupuolijakauman (ilmeisesti kaksi normaalia yhden syövän), mutta oli 10 vuotta vanhempia kuin normaalin kolonoskopiaan (taulukko 1), kuten meidän kohortin (taulukko S1 Täydentävä File S1) in koska peräkkäisten yksilöt olivat mukana. Normaalien henkilöiden harvemmin raportoitu aiemman henkilökohtainen historia polyyppien tai aiemmin paksusuolen syövän perheensä ja ei osoittanut eroa koskevan BMI. Siten lukuun ottamatta tuotteita ikä, ne sovitettu keskeisille muita ominaisuuksia, myös BMI ja ruokaa tai lääkkeitä oton kanssa syöpäpotilaan ryhmä (taulukko 1, taulukko S1 ja kuvio S1 Täydentävä File S1).

Phylogeny kysymys perustuu luokitusjärjestelmän mukaan jakeluun

kaikista aineisto, 1210781 lohkottu sekvenssit saatiin ja 978710 näistä voitaisiin valita yhteensä 819 taksonien (taulukko S2 täydentävä File S1). Ohenemiseen tietojen tehtiin ja antoi riittävä edustus monimuotoisuuden suoliston mikrobien (taulukot S1, taulukko S2 ja kuva S3 Täydentävä File S1). Havaitsimme 18 bakteerisukuja runsaasti yli 1%, ja nämä suvut sisältyi 75% sekvensseistä. Kolmetoista ulos 18 sukuihin (

Alistipes, Collinsella, Bacteroides, Lachnospira, Prevotella, Subdoligranulum, Dorea, Faecalibacterium, Roseburia, Coprococcus, Streptococcus, Bifidobacterium

ja

Ruminococcus) B vastasi ihmisen suoliston mikrobiston phylogenetic ydin [16]. PCAIV analyysi osoitti myös, että noin 5%: n vaihtelu voisi johtua taudin tilan kunkin näytteen (normaali versus Cancer; p 0,05), ja eliösystematiikan osoitus mikrobiston normaalien ja syövän yksilöt olivat selvästi erotettavissa (kuvio 1 ja Kuva S2 täydentävän File S1). Lisäksi 55 ulos 66 bakteerilajien kuuluvat aikaisemmin kuvatut phylogenetic core havaittiin näistä näytteistä. Monte Carlo testi osoitti, että yli 7%: n vaihtelu vaikutti terveydentila (normaali versus Cancer; p 0,05). Vaihtelu sisällä henkilö oli alhainen ja merkityksetön verrattuna välillä henkilö-vaihtelu (kuvio 1 ja taulukko S4 täydentävän File S1).

Pääkomponenttianalyysi, joka perustuu 16S rRNA geenisekvenssiä runsaasti 7 syrjii sukuihin jotka edustivat vähintään 1%: mikrobiston runsaus, suoritettiin 6 terveillä henkilöillä (N) ja 6 syöpä * potilasta (Ca), jossa on kaksi rinnakkaista (huomattava, koska MiD1 ja MID2). Kaksi ensimmäiset osat (PC1 ja PC2) piirrettiin ja edusti 70,83% kokonaisten inertia. Yksilöt (edustavat niiden näyte id) ryhmittyivät ja painopiste lasketaan kunkin luokan. * Ne kaikki on valittu vaiheen I-II TNM luokittelu (katso myös taulukot S2 ja S3 ja kuviot S2 S3 täydentävässä File S1).

vertailu bakteeripopulaatioita ulosteessa

All-bakteerit tasot eivät eronneet Normaali ja Cancer ryhmissä (taulukko 2), kun taas merkittävä ero havaittiin

Bacteroides /Prevotella

ryhmä. Tämä ero liittyi kohonnut näiden bakteerien Cancer verrattuna Normal ryhmiin (taulukko 2). Kun kaikki yksilöt yhdessä

Bacteroides /Prevotella

ryhmä tummuusasteen ei liity ikään tai BMI (r = 0,05; p = 0,46; katso myös kuva S1 täydentävän File S1). Kun kaikki henkilöt, joilla on syöpä bakteeri- tasot eivät liity kasvaimen koon tai tuumorin luokitus viitataan kansainväliseen TNM luokituksen (Kuva S1 täydentävän File S1) ja pienet invasiivisia karsinoomia voisi liittyä korkea bakteerien tiheys. Tasot

Bacteroides /Prevotella

ryhmä ei vaikuttanut muiden potilasryhmät, kuten ikä, painoindeksi, syy kolonoskopia, sen aiempi polyyppien tai syövän perheensä (taulukko S1 täydentävän File S1), jossa koko tai sijainti (vasemmalle vai oikealle puolinen, tai peräsuolen vs. paksusuolen) syöpää (taulukko 2). Muiden hallitseva tai alidominantteja bakteerit eli

C. leptum

ryhmä,

C. coccoides

ryhmä,

Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus

ryhmiä,

Bifidobacterium

sukuun,

E. coli,

ja

Faecalibacterium prausnitzii

lajeja, emme löytäneet mitään eroa potilaiden vs. normaali colonoscopy yksilöitä.

IL17 immuunisolujen ja

Bacteroides

vuonna limakalvon

Nämä solut havaittiin soluttautua enemmistö kasvaimen näytteistä (pisteet ++ ja +++) ja

lamina propria

homologisten normaalin limakalvon (pisteet + symboliin ++) syövän potilaiden kudosnäytteistä, kun he olivat vain harvoin tai ei havaittu normaalissa limakalvon (0 +/-) terveillä henkilöillä (kuvio 2). Ei parametrinen tilastollinen testi osoitti merkittäviä korkeampi IL17 immunovärjättiin solu pisteet normaalissa limakalvon paksusuolen syövän potilailla kuin Normal kolonoskopiaan yksilöiden (mediaani +/- vs. ++; p 0,5). Sen jälkeen kun kahden (CD3 ja IL17) värjäys kudoksen sarjaleikkeissä, suurin osa IL17 immunoreaktiivisten solujen havaittiin olevan CD3 markkeri sekä (normaali limakalvo tai homologinen syövän normaalia limakalvon) tapauksissa, vaikka kaikki CD3 soluja ei immunovärjättiin IL17-vasta-ainetta. Kuitenkin IL17 /CD3 suhdelukuja normaalissa paksusuolen limakalvo näytti mitään merkitsevää eroa Normaali ja Cancer kolonoskopia yksilöitä (kuvio 2C, D). Nämä osittain kvantitatiivinen immuunisolujen löydöksiä sidoksissa tiettyyn kudokseen kiinnittyvä

Bacteroides

tiheys (kuva 3).

Bacteroides

geenin monistaminen tuotteen havaittiin 1000-kertaisesti enemmän ilmaistuna ulosteessa kuin paksusuolen kudosnäytteet paljasti qPCR (kuvio 3B). Lisäksi

Bacteroides

monistustuotteen oli merkitsevästi suurempi paksusuolensyöpä potilaiden kudoksiin (normaali sekä kasvainten) kuin terveillä henkilöillä ’kudoksista arvioimana qPCR ja paljasti geelianalyysin (kuva 3 ja kuva S4 täydentävä File S1). Kolorektaalisyövässä potilailla,

Bacteroides

geenimonistuman tuote oli merkittävästi suurempi kasvainkudoksessa kuin normaalissa homologinen kudoksessa (kuva S5 täydentävän File S1).

näytteet samoilta henkilöiltä ja paksusuolen sivustot olivat toimitettiin DNA: n eristys ja PCR. Interleukiini 17 (IL17) -immunoreactive solut paksusuolen kudokset sijaitsevat pääasiassa

lamina propriasta

että normaaleissa kudoksissa [A: paksusuolen normaali limakalvo normaalista yksittäisistä (korkea suurennus x40 alareunassa), B: paksusuolen normaali limakalvo potilaalta, jolla paksusuolensyöpä (korkea suurennus x40 alareunassa)] ja tunkeutunut kasvain kudoksen samassa yksilössä kuin B [C: IL17 imlmunoreactive solujen tunkeutuminen kasvain korkea suurennus x40 alareunassa D: Tässä kaksinkertainen värjäys IL17 ja CD3, vuohen anti-humaani IL-17-vasta-ainetta lisättiin ennen värjäystä Naphthol /Fast (punainen), jota seuraa kanin anti-humaani CD3-vasta-ainetta, joka oli paljastanut, jossa DAB-substraatti (ruskea); Tämä osoitti, että CD3 ollut ainoa, joka tuottaa IL-17.

Normaalissa yksilön kudoksessa (A) geeli muuttoliikejärjestelmää osoittaa

Bacteroides Twitter /Albumiini suhdeluvut lähellä 1 taas ne esiintyi korkeampi homologisen normaalin (n) tai kasvaimen (Ca) limakalvon paksusuolen syövän potilaan kudoksissa (B). Huomaa, että

Bacteroides

geenimonistukseen tuote ulosteessa on merkittävästi suurempi kuin havaittu limakalvon DNA; vahvistus kutsutaan ihmisen albumiini-geenin.

Keskustelu

Me raportoimme eroja paksusuolen mikrobiston yksilöiden paksusuolen syöpä verrattuna niihin, joilla on normaali kolonoskopia. Osoitimme, että jakelu bakteerien suvuista mikrobiston vaihteli riippuen niiden tautitilannetta, ja qPCR paljasti merkittävän kohoamisen

Bacteroides /Prevotella

väestö syöpäpotilailla, jotka näyttivät olevan yhteydessä kohonnut IL17 tuottavien solujen limakalvon yksilöiden syöpä.

Tässä tutkimuksessa verrataan yksilöitä, joilla oli normaali tai sairaan kolonoskopia. Vaikka ne, joilla on normaali kolonoskopia eivät olleet terveitä vapaaehtoisia, niiden voidaan katsoa muodostavan mielekäs kontrolliryhmään. Tämä johtuu siitä, valittiin satunnaisesti joukosta peräkkäisen henkilöitä, jotka oli lähetetty varten kolonoskopia joka todettiin olevan normaali. Vähentääkseen bias valitsimme 2 terveillä henkilöillä 1 syövän tapauksessa. Niiden ominaisuudet Hyväksytty ne potilaista syöpä ryhmässä, lukuun ottamatta heidän ikänsä ja tapaukset polyyppien tai syövän sukulaisia. Ikäerot kuvastavat epidemiologista tietoa kirjallisuudessa. Bakteerien dysbiosis löytyy meidän tutkimuksessa oli selvästi riippumaton iästä. Mikään mikrobien eroja havaittu tässä tutkimuksessa liittyy iän. Toinen ero tapausten ja kontrollien välillä koskee muita yleisemmin kasvaimien paksusuolensyöpä potilaiden sukulaisia. Tämä saattaa heijastaa rooli ympäristötekijät sijaan siemennestettä geneettisiä muutoksia, koska yksikään potilaista oli Stigmata Lynchin tai polypoosin adenomatoottisen familiaalinen PAF oireyhtymä sairauksia.

Korkea läpimeno sekvensointitekniikoilla ihmisille mikrobiston on merkittävästi edistänyt paljastaa eron bakteerin fylogeneettiseen ydin kuin terveillä henkilöillä jotka kärsivät erilaisista sairauksista [7]. Kuitenkin tämä lähestymistapa ei kuulunut syöpäsairaus. Sen tarkistamiseksi, onko fylogeneettiseen ydin oli erilainen terveillä henkilöillä ja syöpäpotilailla, 16S rRNA geenit on kohdistettu pyrosekvensointi vaihtoehtona kaikki bakteerit Genomikartoituksen. Todellakin, V3 V4 vaihtelevan alueen 16S rRNA voidaan käyttää saamaan aikaan bakteerien luokittelu ihmisen mikrobiston [17] perusteella pyrosekvensointi. Käyttämällä tätä tekniikkaa, olemme selvästi yli 40000 informatiivinen sekvenssit V3-V4 16S rRNA alueen kustakin ulostenäytteestä, esillä olevassa tutkimuksessa ja tämä johti rakentamisen fylogeneettiseen ydin mikrobiston [16]. Tämä fylogeneettinen ydin havaittiin olevan erilaisia ​​syöpäpotilailla verrattuna normaalien yksilöiden. Erot koski erityisesti hallitseva ja osa hallitseva bakteeripopulaatioita. On erittäin epätodennäköistä, että erot me saapuvat pyrosekvensointi voisi olla epiphenomenal, koska kaikki potilaat olivat mukana läpi vakiomenettely (sukupuoli ja ikä-haun, olosuhteet ulosteen näytteenotto- ja DNA: n eristämiseksi) ja järjestyksessä yhtäläisyyksiä kaksoiskappaleet (sisällä henkilö-vaihtelu ) oli erittäin korkea. Niinpä pääryhmää, suku ja laji pois hallitseva ja sub hallitseva bakteeripopulaatioita, on määrä mitataan qPCR joka käytetään rutiininomaisesti määrittämään bakteerien koostumus mikrobiston terveistä tai sairaista ihmisiä tai eläimiä [9], [18]. Tiheys ”all-bakteerit” ulostenäytteissä ei kuvastanut kolonoskopia havaintoja, vaikka yksi (so .;

Bacteroides

) ulos seitsemän lajia tässä tutkituista havaittiin olevan suurempi syövän ryhmään yksilöitä. Kaikki nämä menetelmät on validoitu, ja yleisesti käytettyjen [6]. Vaikka pyrosekvensointi tekniikka, jota on pidettävä osittain kvantitatiivinen työkalu osoitti monia muita bakteerilajit muutos, vain tärkeimmät ja aladominantista lajien määrä määritettiin tässä tutkimuksessa, jonka qPCR. Lisäksi molekyyli- analyysejä kuuluvat laji liittyviä eroja koetin läpäisevyys, ja vahvistus ominaisuuksia, ja siksi, että suhteellisen pieni määrä antureita voidaan analysoida monia tuntemattomia suolen lajit [19], emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että meillä voi olla menetetty muita merkittäviä erot mikrobien tiheys. Joten, tämä ei pitäisi sulkea pois mahdollisuutta eroista potilasryhmiä suhteen bakteerien taksonien tai lajit, jotka nyt vaativat lisätutkimuksia perusteella suurikapasiteettisten sekvensointi tulokset syöpä- ja valvontaa mikrobiston. RRNA geenipohjaisten sekvensointi voi havaita hallitseva yhteisön jäseniä, mutta nämä lähestymistavat eivät välttämättä tunnista harvinainen yhteisön jäsenet toisistaan ​​poikkeavia kohdesekvenssien. Rajoitusten voittamiseksi yhden geenipohjaisten amplikoni yhdistelmätila pyrosekvensointi, koko genomin shotgun sekvensointi on tullut houkutteleva strategia arvioimiseksi monimutkainen mikrobien monimuotoisuutta sekapopulaatioissa [7]. Siitä huolimatta tämä on suurin mikrobiologinen tutkimus on raportoitu tähän mennessä, ja suuri määrä mukaan otetuista joilla tiedetään kolonoskopia ja histopatologia ominaisuudet tekevät siitä erittäin vankka ja se voi avata tietä uusille patofysiologisia kenttiä ja uusia seulontamarkkereina.

syy yhdistyksen välillä

Bacteroides /Prevotella

ryhmä tiheys korkeus arvioimana qPCR ja pahanlaatuisten koolontuumoreissa ei ole selvä. Kaikki käytetyt alukkeet qPCR tässä tutkimuksessa oli suunniteltu määrällisesti hallitseva ja sub valtalajina ehdottamalla pyrosekvensointi lähestymistapaa. Onko tällainen mikrobiologinen eroja löytyy tässä tutkimuksessa ovat syy tai seuraus kasvaimen toteamuksen kolonoskopia koskee mekaaninen lähestymistapa, jota ei ole suunniteltu analysoida täällä ja vaatii tulevaisuudentutkimuksista. Voisimme kuitenkin spekuloida, että

Bacteroides /Prevotella

ryhmä tiheys ei todennäköisesti ole seurausta kasvaimen esiintymisen koska niiden tasot eivät korreloi kasvaimen koon tai sairauden lavastus ja

Bacteroides

suvun lajeja voitiin havaita pestyistä limakalvon viittaa se kuuluu limakalvon tarttujabakteeriseosta ryhmiä. Primers Suunnittelimme kohdistettu

Bacteroides

ja

Prevotella

suvun populaatioiden. Muutokset

Prevotella

on vasta raportoitu suun ja mahalaukun kolot [20] ilman mitään yhteyttä kasvaimen kasvua. Sen sijaan,

Bacteroides

suvun populaatioiden ja niistä erityisesti

Bacteroides fragilis

, on viime aikoina osoitettu tuottavan metalloproteaasi paksusuolen syövän potilaille, mutta ei kontrollien [12] viittaa tämän lajin sub väestöstä saattaa suosia syövän synnyn. On huomattava, että monista mekanismeja saattaa välittää assosiaatioita mikrobiston ja ihmisten terveyteen [21] – [22], proinflammatoristen ja immuunijärjestelmän solujen aktivaatio paksusuolen limakalvolla on suuri merkitys suhteessa maligniteetti. Jotkut jäsenet suoliston mikrobiston voi ohjata isäntä T-soluvasteita [13], [15] muut voivat ylläpitää homeostaasiin efektori auttaja-T-solujen populaatioita suolistossa [14].

B. fragilis

on osoitettu indusoivan limakalvon säätelijä-T-solujen vasteita suolistossa, johon TH17 solurekrytoitumiseen kokeellisissa malleissa [13] – [14]. Kiinnostava limakalvon tarttumista

Bacteroides

lajien tutkimuksessamme näkyy suurempi paksusuolen syöpäpotilaiden kuin normaaleissa kolonoskopia yksilöiden osuutena liittyy limakalvon IL17 immunoreaktiivisia solutiheyden. Tämä on yhdenmukaista aiempien tutkimuksessa ihmisen että raportoitu TH17 solut yli-ilmentyminen yli 80% satunnaista paksusuolensyöpä mikro ympäristöön [23]. IL17 immunoreaktiivisten solujen tunkeutua enemmän homologinen normaalin paksusuolen limakalvon paksusuolen syövän potilaiden kuin normaaleissa kudoksissa normaaleissa kolonoskopia yksilöiden arvioitiin immunohistokemiallisesti tai mRNA qPCR määrän limakal- (tuloksia ei ole esitetty). Nämä voivat ehdottaa T-solujen aktivaation voi liittyä limakalvojen IL17 johtuva muutos

Bacteroides

raportoitu eläinmalleissa [13] – [14], [21] – [22]. Lyhyesti, nämä tiedot kannattivat häiriintynyt immuunivasteen paksusuolen syövän kudoksissa IL-17 ylituotanto pahentaa [24] – [25] tauti todennäköisesti johtuu

Bacteroides

.

Muita mielenkiintoisia näkökohta mikrobiston on sen mahdollinen arvo markkerina paksusuolen syöpä, koska suurin osa potilaista voitiin tunnistaa korkeus

Bacteroides /Prevotella

väestön mahdollisuus kvantitatiivisen testin cut-off perustuu spesifisyys korko. Verrattuna kolonoskopia toistaiseksi kohoamista

Bacteroides

ulosteessa ja /tai IL17 immunoreaktiivisten solujen normaalin limakalvon näyttävät lupaavilta herkkiä markkereita.

Methods

syyskuun 2004 ja syyskuun 2006 648 yksilöiden keskimääräinen tai keskimääräistä korkeampi riski CRC (esim historia syövän sukulaisten tai henkilökohtainen historiaa polyyppien, tai vatsan tai suoliston liittyviä oireita tai anemiaa, joka tarvitaan kolonoskopia), olivat otokseen pankin kokoelma tutkimus. Voidakseen saada osallisuutta potilailla oli oltava ole aiempaa paksusuolen tai peräsuolen leikkauksen, sairauksien kuten syövän tai tulehduksellisten tai tarttuvan vammat suolistossa, eikä tarvitse hätätilanteessa kolonoskopia. Kaksi viikkoa ennen kolonoskopia, potilaat olivat mukana annettuaan tietoisen suostumuksen ja pyydettiin antamaan raikas ulostenäytteestä 2 viikon sisällä jopa kolme päivää ennen kolonoskopia. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Val de Marne Paris-EST alue, joka lupa ilmoittautumalla potilaita kaikissa liittyvät keskuksissa. Kaikki potilaat saivat tietoa tutkimuksesta, sen tavoitteita, ja näytteitä niiden pitäisi antaa. Kaikki tiedot antamaa kirjoitettu kirje kirjoitettu ranskaksi ja muodollinen suostumus on saatu kolminkertaisessa kopio muodossa; yksi näistä säilytettiin potilaan, pidämme yksi kappale osastolla kliinisen tutkimuksen (CIC) ja viimeinen kappale on säilytetty promoottori (National Institute of tieteelliselle tutkimukselle-INSERM). Joten, muodollinen suostumus on saatavilla kullekin potilaalle. Kaikissa tapauksissa ulostenäytteitä kerättiin ennen suoliston puhdistamiseen varten kolonoskopia. Mitään erityistä ruokavalion (diabeetikot, kasvissyöjät) ja lääkkeet (diabeteksen lääkkeet, veren kolesterolia, ja laksatiiveja) tänä aikana kirjattiin. Nukutuslääkäri kävi osallistujille vähintään kolme päivää ennen suunniteltua kolonoskopia. Tutkimuksen aikana jatketaan kunnes kolonoskopia ja patologian tiedot oli tarkistettu, ja lopullinen asema voitaisiin antaa ”normaaliksi kolonoskopia”, ”Kasvain at kolonoskopia” tai ”muita poikkeavuuksia at kolonoskopia”. Ne pidettiin kokoelma bio-pankki patofysiologian tai testin seulonta tutkimuksissa mukaan lukien yksi raportoitu täällä. Sen jälkeen sukupuoli yhteensovittamista yksilöiden kasvainten ja normaali colonoscopies näytteet 180 potilasta (yksi syöpäpotilaan 2 yksilön normaali kolonoskopia), jotka on tarkastettu ole antibioottien kanssa joko ”normaalin” tai ”syöpä” havainnot tehtiin bakteerien DNA analyysi nykyinen sarja.

ulostenäytteet ja bakteeri-DNA: n eristämiseksi

Kokonaiset tuoreet ulosteet kerättiin steriiliin laatikot, ja 4 tunnin kuluessa 10 g pakastettiin -20 ° C: ssa analyysiin. Bakteeri-DNA uutettiin eriä ulostetta, ja sen jälkeen lopullinen saostuminen, DNA suspendoitiin uudelleen 150 ul: aan TE-puskuria ja säilytettiin -20 ° C: ssa lisäanalyysiä, kuten aiemmin on kuvattu [26].

pyrosekvensointi analyysi ulosteet

Bakteeri DNA-näytteet 6 henkilöä (3 urosta ja 3 narttua ollessa satunnaisesti valittu) normaalilla kolonoskopia, ja 6 ikä- ja sukupuolijakauman potilaalla on invasiivisia CCR vaiheen I tai II TNM luokittelu , oli käytetty 12 DNA-kirjastoja. Seuraavat universal 16SrRNA alukkeita käytettiin PCR-reaktiossa: V3F (TACGGRAGGCAGCAG) [27] ja V4R (GGACTACCAGGGTATCTAAT) [28] kohdistaa V3-V4 alue, joka antaa alhaisimman virhemäärien [29].

Viivakoodi sekvenssit (GsFLX avain) TCAG ja MIDGsFLX (12 nukleotidia) on kiinnitetty välillä 454 GsFLX ADAPTATOR järjestyksessä ja forward-aluketta V3F. GsFLX avain ja 454 GsFLX ADAPTATOR oli liitetty käänteisaluketta. Pitoisuus ja laatu PCR-tuotteet arvioitiin kanssa Picogreen saadakseen saman verran kunkin näytteistä (10

8 molekyyliä /pl), ja sitten 16S rRNA amplikoneihin sekvensoitiin Rochen GS FLX 454 sekvensseri ( Genoscreen, Lille, Ranska) ja käsitellään vakioprotokolla valmistajalta (https://genoscreen.fr/). Validoida spesifisten bakteerien taksonien vuonna 2 potilasryhmissä vaikka vaihtelu johtuu teknisistä menetelmistä, kukin DNA-näytettä sekvensoitiin kahtena kappaleena. Niinpä 12 ulosteesta bakteerin DNA uutteet toimitettiin pyrosekvensointi analyysin, jossa on kaksi rinnakkaista kustakin. Nämä 24 erilaista sekvenssit toimitettiin sisäistä yksilön ja muun yksittäisten analyysien ja klassisen monimuotoisuus indeksit laskettiin. Yhteiset sekvenssit kahdessa kaksoiskappaleita katsottiin kunkin; Sitten muun yksilön ja muun ryhmän analyysit suoritettiin ”Normaali” versus ”Cancer” status.

Kvantitatiivinen PCR-analyysi

käytetään reaaliaikaisen qPCR tekniikka tutkia eroa bakteeri tiheydet sisällä mikrobiston välillä normaalin ja syöpäpotilaiden ulosteesta (N = 179) ja limakalvojen DNA (N = 44). Alukkeet ja koettimet, joita käytetään tässä tutkimuksessa on kuvattu muualla [26], ja on esitetty taulukossa S1 täydentävän File S1. Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttäen ABI 7000 Sequence Detection System ohjelmistoversio 1.2.3 (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA), ja kokonaismäärä bakteerityyppiä päätellä keskiarvostandardi käyriä ja ilmaistiin log 10 arvoa, sillä aikaisemmin kuvatulla tavalla [26]. Arvot qPCR saatiin potilasta kohden ja kunkin osan suoliston mikrobiston (yhteensä n = 180 potilasta, 60 syöpä ja 119 normaalilla kolonoskopia, yksi puuttuva näyte). Voittamiseksi, että ulostenäytteissä voi sisältää enemmän tai vähemmän vettä, tiedot kunkin ulosteen näyte oli normalisoitu kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Havaittu taso kullekin erityiselle hallitseva ja osa-määräävän bakteerien vähennettiin kaikista-bakteerien pitoisuus, ja tulokset ilmaistaan ​​log määrän bakteereja grammassa ulosteesta. Nämä määritykset käytettiin vertaamaan koostumuksen suoliston mikrobiston 179 yksilöiden ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD normaalissa, ja syövän potilasryhmiä. Lisäksi tyypillinen paksusuoli (N = 32) tai peräsuolen kautta (N = 12) normaalin kudoksen näytteissä 22 henkilöä, joilla oli normaali paksusuolen ja 22 potilasta, joilla paksusuoli (N = 16) tai peräsuolen kautta (N = 6) syövän toimitettiin DNA: n uutto ja qPCR kvantifiointi mukaan samaa menettelyä analysoida limakalvon tarttujabakteeriseosta komponentti. Paksusuolen tai peräsuolen kudoksista saatiin leikkauksen jälkeen; palaset pestiin ja edustavat näytteet säilytetty joko formaliiniin histokemia tai pakastettuna, kunnes DNA: n eristämiseksi ihmisen albumiini ja

Bacteroides

PCR prosessi.

immunohistokemia

kudosnäytteitä valittiin kussakin tapauksessa (normaali ja syövän yksilöä), ja parafinoidut 4-um: n leikkeitä käytettiin ja immunovärjäyksellä suoritettiin menetelmien mukaisesti, on kuvattu muualla [23], [30]. Lyhyesti, vuohen anti-humaani IL-17-vasta-ainetta (laimennettu 1:40) lisättiin 2 h, ja sitten värjäämällä tehtiin käyttäen (Vectastain AP kitti Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), ja paljastui Naphtol /Fast Red (Sigma-Aldrich). Kvantifioimiseksi immunovärjättiin soluja, viisi hyvin suuntautunut dia näytettä /yksittäisiä normaaleista kudoksista joko ohjaus tai paksusuolensyöpä potilasta tutkittiin suurennoksella 400 x (varten 3 mm pitkä epiteelin näyte kussakin tapauksessa). Merkityt solut millimetrillä määritettiin käyttäen silmän verkkoon. Immunovärjättiin solut laskettiin 10 peräkkäistä kenttää ja puolittain määrällisesti teki (kuten +/-, +, ++ tai +++) ja luokiteltu. For IL17 /CD3 kaksinkertainen värjäys, vuohen anti-humaani IL-17-vasta-ainetta (laimennettu 01:40) lisättiin 2 h, ja sitten värjäämällä tehtiin käyttäen Vectastain AP kit Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), ja paljastui by Naphtol /Fast Red (Sigma-Aldrich).