Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anti-invasiivisia ja antiproliferatiivisia vaikutuksia betulins ja abietane johdannaiset systemaattisesti testattu käyttäen organotypic mallia järjestelmä kehittyneiden, kastraatio kestävä eturauhasen syöpiä. Alustava näyttö alkuperäisen joukon 93 yhdisteiden suoritettiin kaksiulotteinen (2D) kasvuolosuhteet käyttämällä ei-transformoidut eturauhasen epiteelisolujen (EP156T), androgeeni herkkä eturauhassyöpäsolulinja (LNCaP), ja kastraatio kestävä, erittäin invasiivisia solulinja PC-3. 25 Lupaavin yhdisteet olivat kaikki betuliiniin johdannaisia. Nämä valittiin keskittynyt toisiolajitin kolmiulotteisessa (3D) kasvuolosuhteet, jonka tavoitteena on määritellä tehokkaimmat ja erityinen anti-invasiivisen yhdisteitä. Lisäherkkyysanalyysit ja sytotoksisuutta tehtiin tämän jälkeen käyttämällä laajennettua solulinjaa paneeli. Vaikutukset näiden yhdisteiden solusyklin etenemisen, mitoosia, leviämisen ja yleisluontoinen sytotoksisuutta, vs. niiden kykyä nimenomaan häiritä soluliikkuvuus ja kasvainsolujen invaasio oli osoitettu. Tunnistaa mahdolliset vaikutusmekanismit ja todennäköisesti yhdiste tavoitteet, multiplex profilointi yhdisteen vaikutukset paneelin 43 ihmisen proteiinikinaasien suoritettiin. Nämä tavoitearvot de-konvoluutio tutkimukset yhdistettynä fenotyyppinen analyysit monisoluisten organoids 3D-mallit, paljasti spesifinen esto AKT signalointi liittyvät vaikutukset järjestämisestä aktiinisytoskeletonin todennäköisimpänä kuljettaja muuttuneen solumorfologian ja liikkuvuuteen.

Citation: Härmä V, Haavikko R, Virtanen J, Ahonen I Schukovin HP, Alakurtti S, et al. (2015) optimointi Invasion-Specific Effects of Betuliini johdannaisten syöpäsolujen kautta Lead Development. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10,1371 /journal.pone.0126111

Academic Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, AUSTRALIA

vastaanotettu: 03 helmikuu 2015; Hyväksytty: 23 maaliskuu 2015; Julkaistu: toukokuu 12, 2015

Copyright: © 2015 Härmä ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: kirjoittajat ystävällisesti tunnustavat taloudellisen tuen (Projektinumero 252308; BARC – Betulins, abietans ja hartsit uusina lyijy yhdisteitä syövän) alkaen Suomen Akatemian ( ja KMOC), ja kasvain mikroympäristölle Etäpesäke Kastrointi hylkivät Eturauhassyöpä (hanke numero 267326) ja MN. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lukuun ottamatta ihosyöpä, eturauhasen syöpä (PRCA) on yleisin syöpä miehillä, erityisesti Euroopassa. Punasoluaplasia tyypillisesti hormoniriippuvaisen ja rooli androgeenien etenemistä androgeeniriippuvaisen hormoni tulenkestävät punasoluaplasia vakiintunut [1]. Varhaisen vaiheen punasoluaplasiassa voidaan menestyksellisesti hallinnoi toimintaa yksin ja toistuva kasvaimia hoidetaan ablaatio kiertävän androgeenien jonka kemiallinen kastraatio. Sen sijaan myöhäisvaiheen kastraation kestävä punasoluaplasiassa (CRPC) ominaisella metastaattinen levittäminen primaarikasvaimen, yleensä luun, on edelleen merkittävä syy syöpään liittyvien kuolemaan. Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut hoidossa ensisijaisen ja androgeenista herkkä eturauhasen kasvaimia, hoitavia hoitoja, jotka kohdistuvat erityisesti metastaattisen leviämisen kehittyneitä ja aggressiivinen CRPC hetkellä ei ole olemassa. Osittain tämä liittyy puute kokeellisen mallin järjestelmien uskollisesti edustavat piirteet invasiivisuus ja soluliikkuvuus

in vitro

tai

in vivo

.

Kumpikaan vakio kaksi- ulotteinen (2D) soluviljelymalleissa (solulinjojen) eikä eläinmalleissa (hiiri ksenografteissa) oikein edustaa täyttäminen kliinisen kasvaimia. 2D malleja erityisesti puuttuu kasvain microenvironment (TME), soluväliaineen (ECM), ja tukikudosten solutyyppejä. Tällaiset mallit huonosti vastaavat lääkeaineen herkkyys havaita

in vivo

[2]. Nämä toiminnalliset puutteet prekliinisen lääkekehityksen heijastuvat korkean poistuman hinnat syöpälääkkeet ( 95%) [3] myöhemmissä kliinisissä tutkimuksissa. Siten biologisesti osuvampia

in vitro

kasvainmuodoista on kehitetty parantamaan tuottavuutta lääkekehityksen ja vähentää tarvittavien eläinten määrää lääkekehityksessä [4]. ECM valmisteita eri alkuperää ovat osoittautuneet erityisen kriittinen tutkia solu-vuorovaikutuksiin ja erilaistumista 3D kulttuuri [5]. Integroitu, vankka ja standardoitu 3D alustat ovat yhteensopivia sekä suurikapasiteettisten (HTS) ja korkea-pitoisuus seulonta (HCS) asetuksia [2], ja tehokas kääntäminen 3D soluviljelymenetelmillä perustutkimuksesta teollisiin sovelluksiin on käynnissä [6 ]. Biologisesti relevantti ECM kuten kollageenien tai laminiinin-rikas tyvikalvon otteita kuten matrigeelin käytetään nykyään laajasti tutkia solun mekanismeja, kuten solun liikkuvuus ja invaasiota. Kirjo monisoluisten morfologioi- muodostaman eturauhasen epiteelin ja syöpäsolujen 3D kulttuureissa vaihtelee täysin toimiva rauhas acini, toimimattomia kasvain pallosia; invasiivisia stellate rakenteisiin [7,8], että puuttuu eniten eriytetty ominaisuuksia. Siten eri morfologia ilmenee 3D lrECM kulttuuri on vankka osoitus siitä, että korreloi eri vaiheissa pahanlaatuinen etenemisen. Tällaiset Biomimeettinen 3D solumalleja tarjota tehokas keino määrällisesti syöpään liittyvien biologisten prosessien. Invasion ja etäpesäke ovat kriittisimmät tunnusmerkkejä syöpä, joka voi muuttaa lokalisoidut syövän osaksi hengenvaarallinen sairaus [9]. 3D kulttuuri, tuumorisolun invaasiota ilmenee joko yksittäisten solujen tai solujen aggregaatteja että aktiivisesti hyökätä ympäröivä ECM käyttäen eri liikennemuotojen liikkuvuutta (esim amoeboid tai kollektiivinen hyökkäys) [10]. PC-3 on yksi harvoista PRCA solulinjoja joka näyttää kollektiivinen hyökkäys piirteitä sekä

in vitro

ja

in vivo

[7,11]. Tällaiset monimutkaiset monisoluisten prosesseja ei voida jäljentää kiinnittymisestä riippumaton tarttumattomat 3D järjestelmiä, joista puuttuu biologisesti funktionaalinen ECM, kuten poly-HEMA [12], pehmeä agar [13] tai ”roikkuu-drop” viljelmistä eristetty pallosia [14] . Tuore tutkimus osoitti, että geeniekspressioprofiilien rintasyövän soluja viljeltiin 3D lrECM olivat paljon lähempänä

in vivo

kuin yksikerroksisen tai poly-HEMA kulttuureissa [15]. Korkea pitoisuus näytöt (HCS) käyttäen lrECM-pohjaisia ​​alustoja on raportoitu eturauhasen [16], rintojen [15], haiman [17], ja munasarjojen syöpien [18]. Tällaiset perusteellisesti standardoitu ja pienennetyt kudoksen kaltaisia ​​malleja tarvitaan systemaattisesti kaapata vaikutukset pienimolekyylisten yhdisteiden /huumeet, siRNA: t, biologiset (esim. Vasta-aineita ja peptidien), kasvutekijöitä tai toksiinien kasvaimen biologiaan. Nämä monimutkaiset Biomimeettinen lähestymistavat ovat käyttökelpoisia uskollinen prekliinisen työkaluja tutkimiseen lyhyen ja pitkän aikavälin lääke vastauksia, hoidon epäonnistuminen tai lääkeresistenssin kehittymisen [19]. Yhdistettynä korkean sisällön mikroskooppinen kuvantaminen ja kuva-analyysimenetelmiä, 3D fenotyyppinen malleja voi myös olla erittäin informatiivinen lyijyn löytämisen ja lyijy optimointi tutkimuksia (LD tai LO, vastaavasti), etenkin jos molekyyli lääkkeen kohde on tuntematon, ja monimutkaisten mekanismien, kuten kudosspesifisiä erilaistumista ja solu-solu-vuorovaikutuksia voidaan arvioida perustuu puolueeton, moniparametrisissä luetun. Kanavointi kuvantamisen-pohjainen lukema mahdollistaa myös samanaikainen arviointi sytotoksisuuden, apoptoosin, ja vaikutukset solusyklin, esim. käyttämällä sopivia fluoresoivia koettimia [2,20], mikä vähentää tarvetta liiallista validointitutkimuksissa. Lisäksi reaaliaikainen ja elävien solujen 3D määritykset, jotka perustuvat korkea-pitoisuus kuva-analyysi voidaan yhdistää päätepisteen tutkimuksilla esiin ilmaisun biomarkkerit, kuten on kuvattu edellisessä julkaisuissa [7,11].

Luontaistuotteet ( NP) ovat olleet korvaamattomia välineinä selvittämisessä logiikkaa biosynteesin ja lähtöaineina kehittää etulinjan lääkkeitä [21]. Itse asiassa suurin osa uusien molekyylien hyväksytty huumeiden US Food and Drug Administration (FDA) ovat johdonmukaisesti olleet joko NP tai NP peräisin olevat yhdisteet [22]. Pentasyklinen triterpenoids, toissijainen kasvi aineenvaihduntatuotteiden runsaasti hedelmissä kuori, lehdet ja varsi kuori, ovat herättäneet suurta kiinnostusta terapeuttisina aineina ja ravintolisiä [23,24]. Lisäksi puolisynteettisiä johdannaisia ​​luonnollisesti esiintyvän triterpenoids on tutkittu aktiivisesti etsimään uusia syöpälääkkeiden, keskittyen erityisesti anti-invasiivisuus ominaisuudet [24-29]. Betuliinia ja betuliinihappoa ovat lupane-tyyppinen pentasyklisestä triterpeenejä runsaasti koivun kuori suvun lajien

Betula

L. [30]. Betuliinihapon ja muiden betuliinin johdannaisia ​​on antiviraalinen, anti-inflammatorisia, anti-malaria, ja syövän vaikutukset [31]. Lisäksi betuliinihappoa tunnistettiin selektiivinen indusoija apoptoosin melanoomasolujen [32], synnyttää vahvaa kiinnostusta triterpenes kuin syöpälääkkeiden. Lisäksi betuliiniin havaittiin estää invasiivisia ominaisuuksia aivojen ja keuhkojen syöpäsoluja, selvästi alle sen sytotoksiseen pitoisuuteen, mikä viittaa lupaava chemopreventive vaikutus vastaan ​​etäpesäkkeitä [33]. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet yhdistelmä 2D- ja 3D PRCA solumalleja ja HCS perustuvat menetelmät kuvantaminen ja automatisoitu kuva-analyysi, arvioida ja validoida antineoplastinen ja anti-invasiivisen ominaisuuksia kirjaston 93 yhdisteitä. Tässä kirjastossa, olemme sisällyttäneet vanhempien yhdisteet betuliiniin, betuliinihappo (2) ja niiden puolisynteettisiä johdannaisia, ja yhdisteet toisesta luokasta terpenoids vähemmän tutkittujen biologisia vaikutuksia, abietanes. Kaiken kaikkiaan kirjasto koostui 78 betulins ja 15 abietanes.

Tulokset ja keskustelu

synteesi kirjaston betuliiniin ja abietane johdannaiset

Joukko 76 betuliiniin johdannaisia ​​valmistettiin lähtö- alkaen betuliiniin ja betuliinihappoa (1), kun taas 13 johdannaiset valmistettiin dehydroabietiinihaposta ja dehydroabietylamide (kuviot 1-3, katso myös S1 File), käyttämällä asiantuntemusta luonnontuotteita kemia ja seuraava joko meidän aiemmin raportoitu menettelyjä tai toisten [ ,,,0],34-37]. Betulonic happo (2) saatiin betuliinin Jones hapetus, ja käytetään monikäyttöistä välituotetta kemiallisia synteesejä. Erilaisella substituentilla, insertoitiin asemissa 3 ja 28 lupane ydin. Jotkin johdannaiset valmistettiin myös fuusioimalla heterosykleistä rengas A, asemissa 2 ja 3. Muut yhdisteet sisältyvät yksi ylimääräinen rengas on fuusioitunut rengasta C, D ja E. vähentäminen isoproprenyl sivuketjun terpeenisten ydin on tehty joidenkin johdannaisten . Sivuketjun uudelleenjärjestely johti myös germanicane-tyyppiset yhdisteet. Vuonna abietanes asettaa valmistettujen yhdisteiden koostui lähinnä urean ja amidijohdannaisia.

tehoseulonnan (HTS) bioaktiivisuuden

Nämä yhdisteet koottiin kuin kirjasto ja biologinen aktiivisuus testattiin käyttämällä 2D-soluviljelmissä 384-kuoppalevyille tehoseulonnan (HTS) muodon (S1 Kuva). Käytetyt solulinjat olivat EP156T (ei-transformoituja eturauhasen epiteelin), LNCaP (androgeeni herkkä PRCA), ja PC3 (kastraatio kestävä, invasiivisia PRCA). Kokeet suoritettiin kolmella eri yhdistettä pitoisuuksina (0,1, 1 ja 10 uM) kolmena kappaleena, käyttäen CellTiterGlo kuin päätepisteenä lukema solujen lisääntymistä. Paneeli 25 betuliiniin johdannaisten syntetisoitiin tehokkain ja syöpää erityisiä yhdisteitä mainittiin alustavissa 2D-näyttö, ja valittiin lisätutkimuksia varten.

Korkea Sisällön Screening (HCS) varten invasion salpaavan vaikutuksensa

Seuraavaksi nämä 25 tehokkain yhdisteitä testattiin 3D-asetukset tiettyjen anti-invasiivisia ominaisuuksia. Kolme tavanomaista hoitoa yhdisteitä käytetään laajasti vastaan ​​PRCA lisättiin kontrolleina; nimittäin androgeenireseptoriantagonistin enzalutamide (MDV3100), The C17α-hydroksylaasin /C

17,20-lyaasin estäjä abirateronin (Zytiga), ja klassinen mitoosi estäjä paklitakseli. Hoidot aloitettiin päivänä 4, jolloin hyvin erilaistunut kierroksen acini perustettiin. Yhdiste altistus jatkettiin sitten kuusi päivää, jolloin suurin osa käsittelemättömän monisoluisten rakenteet oli muuttunut erittäin invasiivisia fenotyypin.

Automatisoitu morfometrisiin kuva-analyysi (AMIDA) ja tilastollisen arvioinnin

Live 3D solu sitten viljelmät värjättiin reaktiovärejä Calcein AM havaita elävä, ja etidiumhomodimeeriä havaita kuolleita soluja. Kuvat (kuvio 4A) hankittiin -konfokaalimikroskoopilla ja kuvadatan analysoitiin AMIDA ohjelmiston [38]. Periaatteet morfometrisiin kuva-analyysin lyhyesti kuvattaviin S2 kuvassa.

PC-3-soluja viljeltiin 3D Matrigel ECM 4 päivää ja käsiteltiin 6 päivää 25 betuliiniin johdannaiset (2D tehokkaiden seulontojen), DMSO /ajoneuvon hallinnan, ja kolme viite yhdisteitä. A) edustaja enimmäisintensiteetillä ennusteet -konfokaalimikroskoopilla pinon kuvia valittuun yhdisteen hoidoista 300 nM konsentraatio (5 x tavoite, laajuus 100 pm). B) Kolme kaavioita suhteellinen vaikutus kolme morfometrisiin parametrit 7 betuliiniin johdannaisia, DMSO-kontrollin, ja yksi kontrolli yhdiste (paklitakseli). Data skaalaus: näyttää suhteellinen ero mediaani Area /Complexity /Area suhde, DMSO valvontaa. Paklitakseli hoidot ja DMSO valvonta on osoitettu arvojen -100 ja 0, tässä järjestyksessä. C) Hierarkkinen klusterointi tehtiin käyttäen kolmea morfologisia parametreja johdettu PC3 organoids: sferoidiviljelmiä koko (alue), monimutkaisuus ja kuolleiden solujen. D) Haavojen parantumisen käyrät kahden betuliiniin johdannaiset 4 ja 20, korostaa 50% raja-tason (oranssi katkoviiva).

Kuvio 4A esitetään edustavat -konfokaalimikroskoopilla kuvia joidenkin betuliini- johdannaisten . Erittäin tehokas, mitoosia valvonta huumeiden paklitakseli erottui jo hyvin pieninä pitoisuuksina (30 ja 100 nM), joka osoittaa voimakas vaikutus kaikkiin morfometrisiin toimenpiteistä (Kuva 4B): tämä johti pienempiin (alennettu alue), vähemmän invasiivisia organoids (yksinkertaisempi ), lisääntynyt määrä kuolleita soluja. Ohjaus- yhdisteet abirateronin ja enzalutamide ollut havaittavaa vaikutusta PC-3-solut. Mielenkiintoista on, että betuliinihappo (1) ja betulonic happo (2) eivät osoittaneet merkittäviä anti-invasiivisen vaikutuksia, kun taas yhdiste 3, joissa on isopropyyliryhmä substituentti C19, oli yksi voimakas anti-invasiivisen, kasvua estävät aineet. Samoin isoksatsolijohdannaisia ​​4 ja 5 näkyy voimakas kasvu inhiboivaa ja anti-invasiivisen vaikutuksia pienemmillä pitoisuuksilla (niinkin alhainen kuin 100 nM 4 ja 300 nM 5). Kaikki nämä tehokkaat yhdisteet eroavat toisistaan ​​ainoastaan ​​asemassa C19: yhdiste 4 on isopropyyli sivuketju, kun taas yhdisteellä 5 on alkuperäinen isopropenyyli sivuketjun. Lisäksi, kun isoksatsolirengas 5 korvattiin pyratsolirenkaan, saatu yhdiste 6 oli vielä voimakkaampi, ja se osoittautui olevan erityisen anti-invasiivisen. Sen sijaan, isoksatsolijohdannaisen, jolla on formyyli (7) tai asetoksiryhmä (8), joka on ensisijainen amidi (9) tai hydroksi (10), ryhmä asemassa C28 näkyy vähäinen vaikutuksia invasiivisen fenotyypin. Merkityksellisyys alkuperäisen karboksyyliryhmän asemassa C28 (betulonic happo, 2) anti-invasiivisia tai sytotoksista aktiivisuutta tutkittiin korvaamalla tämän ryhmän eri amidiryhmiä. Mikään näistä yhdisteistä osoittivat merkittävää anti-invasiivisen vaikutukset (11, 12, 13, ja 14) (ei esitetty). Myös yhdiste 15 osoitti voimakas anti-invasiivisia vaikutuksia 1,0pM ilman kasvun estäminen. Kuitenkin, kun sen karboksyyliryhmä C17 muutettiin ensisijainen amidiryhmä, tuloksena yhdiste 16 oli sama korkea anti-invasiivisen vaikutuksia yhdiste 15. Sen sijaan johdannaisia ​​tertiäärisen amidin (17) tai nitriili ryhmät (18) at C17 olivat inaktiivisia (ei kuvassa). Kaksi pyridiinijohdannaiset testattiin myös. Ei menetys anti-invasiivisen aktiivisuuden havaittiin onko pyridiinin typen oli vieressä C3 paikkaan kuin alkuperäinen lupane luuranko (19), tai vieressä C2 asennon lupane luuranko (20). Mielenkiintoista, molemmat yhdisteet 19 ja 20 oli voimakkaasti anti-invasiivisia merkittävästi pienemmillä pitoisuuksilla, kuin yhdiste 15.

Seuraavaksi tilastolliset analyysit suoritettiin tulkitsemaan monimutkaisia ​​kuvadatan (kuvio 4B ja 4C). Yksinkertaisuuden vuoksi olemme keskittyneet vain kolme, perus morfologinen parametrit moniparametrisissä AMIDA lukemaksi (Kuva 4B): 1) Pinta-ala (joka osoittaa kasvua organoids), 2) rakenteelliset kompleksisuus (mittana intensiteetti hyökkäyksen), ja 3) suhteellinen alue kuolleiden solujen organoids (punainen signaali mittana sytotoksisuusmekanismin tai apoptoosin). Area (koko organoids, kuvion 4B, ylempi paneeli) mitattiin määrä pikseleitä sisällä segmentoitu rakenne. Logaritminen muutos Area /Koko tietoja käytettiin, joka osoitti lähes Gaussin (normaali) jakauma kuvia. Muoto Monimutkaisuus (kuvio 4B, keskimmäinen paneeli) saatiin käyttämällä rakenteen koko (alue) ja kehä (lukumäärä raja pikseliä). Mitä enemmän säännöllisen muotoiseksi organoidikappaleen, sitä lähempänä se on täydellinen ympyrä, joka vähentää kehä suhteessa vastustaa koon. Havaitsimme lähellä lineaarista riippuvuutta välillä log (Area) ja log (Perimeter), mikä osoittaa luonnollisen (toiminnallinen) suhde näiden kahden ominaisuuksia. Asennus regressiosuora tietojen johti hyödyllinen arvio keskimääräisestä kehä tahansa organoidikappaleen rakennetta. Poikkeamat tästä keskiarvo (jäännösten) tulkittiin mittana muodon monimutkaisuuden organoids. Kuten looginen alaraja tämän toimenpiteen (edustaja täydellinen ympyrä), sopeutimme leikkauspiste (korkeus taso) regressiosuoran tehdä kaikki palasi jäämät positiivisina lukuina. Tämä yksinkertaistettu, nopea mitta monisoluisten monimutkaisuus osoitti, että logaritmi jäännösten tuloksena on lähes symmetrinen jakauma arvoja. Hierarkkinen klusterointi, käyttäen näitä kolmea perus toimenpiteiden PC3 kulttuureissa tuotti yksinkertainen dendrogrammissa kaksi päähaaraan: ensimmäinen klusterin mukana tehokkain antiproliferatiivisia ja anti-invasiivisen yhdisteiden (Kuva 4C: keltainen). Toinen ryhmä edustaa heikko (Kuva 4C: punainen) ja ei-tehokas (kuva 4C: harmaa) yhdisteitä.

Validation anti-invasiivisen ominaisuuksia

Perustuu primaariseulonta, me valinnut kuusi betuliiniliuoksen johdannaiset edelleen validointi anti-invasiivisen vaikutuksia ylimääräisillä menetelmillä. Tavallisessa haavan paranemista määritys suoritettiin yksikerroksisessa 2D kulttuurin tehoa joidenkin yhdisteiden oli silmiinpistävän erilainen kuin 3D-asetukset. Esimerkiksi yhdisteet 4 ja 20 täysin vähensi hyökkäyksen 3D jo 300 nM (kuvio 4A), mutta osoitti vain 50% vähennys haavan jälkeen 64 tuntia (kuvio 4D) samana pitoisuutena. Myös yhdiste 5 esti invasiivisia transformaatio PC-3 pallosia jo 300 nM 3D (S3A kuvio), mitattuna ”% pyöreys” säilytetään 10 päivän jälkeen), mutta suurempina pitoisuuksina 1 uM tarvittiin 2D kulttuurin vastaavia vaikutuksia (S3B kuvio). Myös kaikkein voimakas anti-invasiivisen aineet 6, 16 ja 19 (aktiivinen 100 nM 3D olosuhteissa) vähensi haavansulkemiseen 2D vain 50%: iin 3 uM ja 1 uM (S3B kuvio). Yhdiste 21 on sisällytetty tässä esimerkkinä aktiivinen johdannaisia. Se, että monet yhdisteet puuttui sama teho perinteisessä 2D yksikerrosviljelmään viittaa siihen, että biologinen tavoitteet kulkeutumisväylät osallistuvat solun liikkuvuus eivät ole yhtä aktiivisia solujen vaeltamiseen muovipinnoille. On myös todennäköistä, että solun liikkuvuus 2D yksikerrosviljelmässä ohjataan muilla mekanismeilla kuin kollektiivinen hyökkäys 3D-telineen.

Toissijainen 3D-näytöt.

Seuraavaksi 25 valitun betuliiniin johdannaiset kuvissa 1-3 lukien valvonta yhdisteitä jälleen testattu yli sama paneeli eturauhasen solulinjat jo käytetty alustavassa, 2D suuren suoritustehon näyttö. Saatu dendrogrammissa oli joko tuotettu erikseen kustakin solulinjasta (S4 kuvassa), yhdistetään yhdeksi dendrogrammi (kuva 5A), tai jotka on esitetty vähentää organoidikappaleen kokoisia (pinta-ala; kuvio 5B). Ei-invasiivisia, mutta hormoni-herkkä LNCaP organoids, useimmat yhdisteen vaikutukset olivat suhteellisen lieviä. Non-tehokkaita hoitoja muodostavat valtaosa kuvaajan (S4 Kuva: harmaa), kun taas harvat tehokkaita yhdisteitä voidaan jakaa kahteen kytketty oksat (keltainen ja punainen). Kuten odotettua, androgeeniantagonistin enzalutamide mutta ei abirateronin olivat tehokkaita hoitoja. Paklitakseli klusterit yhdessä betuliiniin johdannaisia ​​korkeilla pitoisuuksilla-nämä yhdisteet olivat tehokkaita myös hormoni vastustuskykyisten, invasiivisia PC-3-solut. Dendrogrammi hormoneja riippuvaisten, ei-invasiivisia LAPC-4 (S4b kuvio) osoittaa jälleen tehoa kaikkien positiiviset kontrollit (abirateronin, enzalutamide ja paklitakseli, sisällä keltainen ja punainen klustereita). Aktiivisimmat betuliiniliuoksen johdannaiset jälleen pudota sisällä nämä samat klusterit (3, 4, 6, 16, 19 ja 20) vieressä positiiviset kontrollit. Toisin kuin punasoluaplasia solulinjoja, ei-transformoituja, normaali-like Ep156T solulinja (S4C kuvio) vastasi myös betulonic happo (2), ainakin suurin pitoisuus. Yleensä, kuten LNCaP ja LAPC4 soluja, vaikutukset Ep156T kasvuun olivat lieviä (kuvio 5B).

Kokeellinen betuliiniin johdannaisia ​​ja ohjaus yhdisteet testattiin yli paneeli eturauhassyövän linjat (LNCaP, LAPC-4) ja ei-transformoituja, eturauhasen epiteelisolujen (EP156T) 3D kulttuuriin. A) Dendrogrammi perustuu kolmeen morfologiset parametrit ja yhdistää kaikki tiedot ensimmäisen ja toisen asteen 3D näytöt. Tehokas yhdiste hoidot on merkitty punaisella ja keltaisella, keltainen on kaikkein hyökkäyksen erityisiä. B) Boxplots osoittaa vaikutusta valittujen yhdisteiden sferoidiviljelmiä koko (Area). Data skaalaus: kuvatulla kuviossa 4 C) Vaikutukset kaikista betuliiniin johdannaisten ja valvontaa yhdisteiden solukuolemaa (kuolleiden solujen).

Tukeakseen toiminnallinen luokittelun meidän betuliiniin johdannaisten, yhdistimme kaikki tiedot yhdeksi dendrogrammi, joka on esitetty kuviossa 5A. Lisäksi moniparametrisissä edustus kaikista kokeelliset tiedot yhtenä heatmap on erittäin informatiivinen (S5 kuvio) ja voimakas tapa havainnollistaa vaikutuksia yhdisteiden kasvuun, rakenteellinen monimutkaisuus ja solukuolemaa useiden solulinjojen. Jaoimme yhdisteet ja valvonnan kolmeen klusterit: 1) kasvua estävien yhdisteiden, 2) vahva ja heikko anti-invasiivisia yhdisteitä, ja 3) aktiivinen yhdisteitä. Morfologiset vaikutukset 3D-kulttuuri on koottu S6 kuviossa Voimakkaimmat anti-invasiivisen vaikutukset (PC-3-soluja) on esitetty yhdisteitä, 3, 4, 6, 15, 19 ja 20, joiden pitoisuudet ovat 300 nM tai pienempi (ja lukuun ottamatta yhdistettä 15), jossa ei ole havaittavia vaikutuksia muita solulinjoja. Useimmat näistä yhdisteistä, kuitenkin osoitti kasvua estäviä vaikutuksia kaikissa solulinjoissa pitoisuuksina 1 uM tai enemmän. Lopuksi monet betuliiniin johdannaiset ovat sytotoksisia ja estävät solujen kasvua suurilla pitoisuuksilla ( 1 uM). Kuitenkin pienemmillä pitoisuuksilla, nämä yhdisteet voivat toimia voimakkaita ja spesifisiä inhibiittoreita soluinvaasion ja liikkuvuuteen.

Arviointi anti-invasiivisen vs sytotoksista aktiivisuutta.

sulkea pois, että sytotoksisia ja antimitoottisia vaikutuksia oli virheellisesti tulkittu anti-invasiivisia, testasimme yhdisteet 4, 5, 6, 19 ja 20 proliferaation esto ja solukuoleman induktioon 2D yksikerrosviljelmään (yhteenveto kuviossa 6). Laaja valikoima yhdisteen pitoisuuksien (1 nM 30 uM) käytettiin PC-3, LNCaP ja Ep156T solulinjoissa, ja analysoitiin PerkinElmerin Operetti korkea-pitoisuus lämpökamera. PC3-soluissa, useimmat yhdisteet eivät osoittaneet havaittavia vaikutuksia proliferaatioon pitoisuuksilla alle 10 uM (kuvio 6A). LNCaP-solut olivat herkempiä, jossa kasvun estäminen /sytotoksisuutta alkaen 3 uM. Vaikutukset ei-transformoitu, apoptoosin herkkä Ep156T solut vahvimpia. Täällä sytotoksisia vaikutuksia havaitaan tyypillisesti jo 0,3-1 uM. Mikään yhdisteistä ei indusoi spesifisesti solukuoleman PC-3 tai LNCaP-solujen pitoisuuksina alle 30 uM (kuvio 6B ja 6C, lukuun ottamatta yhdistettä 19). Olemme edelleen laskennallinen EY

50-arvot lisääntymistä, apoptoosin ja solukuoleman kullekin yhdisteen, käyttäen PerkinElmer Harmony ohjelmisto (validointitulosten esitetty S7 kuvassa). Ainoa määritys, joka tuotti tulosta yhdenmukaisia ​​betuliini- johdannaisten testattiin 2D soluviljelymalli oli proliferaatiomäärityksellä (taulukko 1).

A) Solujen lisääntyminen /solujen määrä, B) ohjelmoitua solukuolemaa (apoptoosia ), ja C) kuolleiden solujen arvioitiin tavanomaisissa määrityksissä, yhdistettynä korkean pitoisuus mikroskopia (Operetti). Soluja käsiteltiin viiden tehokkain betuliiniin johdannaiset, mukaan lukien paklitakseli ohjaus 72h. Proliferaatio mitattiin kokonaismäärä ytimien (= solut), apoptoosin suhde kaspaasi-3-positiivisia verrattuna kaikkiin soluihin, ja solujen kuoleman etidiumhomodimeeri-2 positiivisia tumien verrattuna kaikkiin soluihin.

vaikutukset solusyklin etenemisen ja mitoosin

seuraavaksi testasimme jos betuliiniin johdannaiset ollut erityisiä vaikutuksia solusyklin etenemisen ja mitoosin pitoisuuksissa 300 nM (ei kuvassa) ja 1 uM 2D kulttuuri (kuvio 6D ja S8 kuvio). Ei ollut havaittavissa eroja solusyklin etenemistä vasteena tahansa testatuista yhdisteistä. Olemme myös arvioinut soluproliferaatiota ja mitoosin mittaamalla PCNA ja sykliini B1-proteiinin tasot (S8B kuvio). Kuten odotettua, betuliinin johdannaisia ​​ei havaittu vaikutusta ekspression joko proteiinin testatulla pitoisuudella. Nämä havainnot tukevat taas että betuliiniin johdannaiset ovat vain sytotoksisia tai aiheuttaa DNA-vaurioita suurilla pitoisuuksilla (PRCA EY

50 arvot vaihtelevat 1-90 uM), kun taas ne edistävät merkittävästi anti-invasiivisuus vaikutukset alhaisilla nanomolaarisina pitoisuuksina.

mahdollinen mekanismi (t) toiminnan betuliiniin johdannaisten.

jotta selvittämiseksi mahdollisia vaikutusmekanismia meidän betuliiniin johdannaisia, käytimme fosfo-kinaasi array että määrällisesti havaitsee fosforylaation tasoja 43 kinaasien solulysaateista (kuvio 7). Lysaatit uutettu 3D soluviljelmissä PC-3-solut, ja altistettiin betuliiniin peräisin olevat yhdisteet lyhyitä (4 tuntia) tai pitkäaikaista (6 päivää) aikoja. Näitä tutkimuksia varten valitsimme kaksi edustavaa johdannaiset 5 ja 20, koska tarkin, vähiten sytotoksiset inhibiittorit soluinvaasiota. Lyhyen aikavälin (4 h) altistuksen suoritettiin suhteellisen korkea pitoisuus 1 uM, kun taas pitkän aikavälin (6 d) altistumisen, jonka pitoisuus on vain 300 nM on käytetty; molemmat selvästi alle sytotoksisia EY

50-arvot (10 uM yhdistettä 5 ja 67 uM yhdisteen 20). Kinaasi paneelit myös kvantifioitiin kuva densitometria (kuvio 7A). Fosforylaation tasoja neljä kinaasien, sekä lyhyellä että pitkällä aikavälillä vastuut olivat selvästi vähentyneet STAT3 (Y727), c-Jun (S63), Enos (S1177) ja PLC-γ1 (Y783) (kuvio 7A ylä- ja alapaneeli) . Molemmat yhdisteet vähensi myös p53 (S15) fosforylaation lyhytaikainen altistuminen ja p70 S6-kinaasi (T389), p53 (S392) ja PYK2 (Y402) fosforylaatio 6-d valotus ja suurempi AMPKα1 (T174) fosforylaatio. Yhdiste-erityisiä vaikutuksia ainetta 20 sisältyi ero fosforylaatioon Hck (Y411), pan-JNK, GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) ja WNK1 (T60) sivustoja. Akt (S473) fosforylaatio inhiboitui vain 6-d altistuminen. Yhdiste 20 lisäsi myös fosforylaatiota mTOR (S2448), Fyn (Y420) ja Src (Y419). Sen sijaan, yhdiste 5 ei aiheuttanut mitään erityisiä muutoksia kinaasiaktiivisuuden lyhyellä aikavälillä altistuminen, ja osoitti vain muutamia erillisiä muutoksia pitkäaikaishoidossa. Selkeimmin Akt (T308) fosforylaatio Lisäksi poistettiin lähes kokonaan vastauksena altistus yhdisteen 5, kun taas fosforylaatiota p53 sivustoja S46 ja S392 olivat jatkuvasti vähentynyt (kuvio 7A). Vähentäminen AKT-vaikutusta sekä yhdisteiden vahvistanut western blottauksella käyttäen itsenäinen, p-AKT spesifistä vasta-ainetta (kuvio 7B). Lyhyen hoidot aiheuttivat vain vähäisiä muutoksia, joiden suurin vähennys proteiinifosforylaation 2-kertaiseksi (20: GSK-3α /β S21 /S9 ja STST3 Y705). Fosforylaation tasoa vain kolme kinaasien muutettiin yli 2-kertainen pitkällä aikavälillä vastuut, nimittäin AKT (T308), p53 (S46) ja eNOS (S1177), aiheuttama nanomolaarisina pitoisuuksina yhdiste 5. Yhdiste 20 oli paljon vähemmän dramaattista vaikutukset kinaasin fosforylaation verrattuna yhdiste 5, vaikka sen yleensä voimakkaampi anti-invasiivisen vaikutuksia. Yhteenvetona havaittujen alennettu AKT ja p53 toiminnan sekä muuttuneen fosforylaation tasoja useita proteiineja kuten Enos, pan-JNK ja GSK-3α /β, ehdottavat hidastui solujen aineenvaihduntaa tai vähentynyt solujen elinkykyä.

PC -3 sferoidit altistettiin kahden edustavan betuliiniin johdannaisia, 5 ja 20, 4 h (1 uM) ja 6 päivää (0,3 uM). A) Computational määrällinen signaalin intensiteetit kinaasin paneelit, linjassa kertaiseksi havaitut muutokset (vasemmalta oikealle). B) Western blot koko ja fosfo-Akt (S473) näkyy sekä lyhyen ja pitkän aikavälin altistuminen 20 ja 5.

tutki myös 3D-monisoluisten morfologioita PC-3, LNCaP ja Ep156T sferoidit altistuvat 5 valitun betuliiniliuoksen johdannaisia ​​sekä lyhyitä ja pitkiä 4 tuntia ja 6 päivää. Vuodesta yksityiskohtainen analyysi F-aktiinitukiranka (phalloidin värjäys), kävi ilmi, että yhdisteet 5, 6, 15 ja 20 tehokkaasti häiritsi järjestämisestä aktiinitukirangan kuluttua 48 tunnin altistus (kuvio 8A). Kiinnostavaa, lähes identtinen aktiini ”korkkiruuvi” fenotyyppi nähtiin normaalin Ep156T acini ja PC-3 pallosia (Kuva 8A: suurennus paneeli oikealla), kun taas tyypillinen aivokuoren aktiini organisaatio LNCaP pallosia säilyi ennallaan. Tämä viittaa siihen, että nämä betuliiniin johdannaiset voivat kohdistaa asiaan reittejä acinar morfogeneesissä ja dynaamisia prosesseja solun liikkuvuus (myös EP156T solut muodostavat dynaamisen ”haarautuva” rakenteita, jotka tunkeutuvat ECM). Fenotyyppinen vertailuja, testasimme paneeli viite tarkoitettua yhdistettä Akt, Rac, ROCK, Src, ja muut reitit, liittyy laajasti aktiinitukirankaan. Yksikään testatuista valvonnan yhdisteet vaikuttavat solun tukirangan vertailukelpoisessa tavalla, lukuun ottamatta ei-erityinen, pan-estäjät staurosporiinille. Nämä vaikutukset eivät olleet yhteneväiset paneelin solulinjojen (kuvio 8B, suurennus oikealla).

Aktiinisytoskeletonin (rihmamaisia ​​tai F-aktiini) värjätään vihreä (phalloidin) ytimet punaista väriainetta (