Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hankitut kemiallis-vastus on yksi tärkeimmistä syy tekijöitä syövän kuolemaan. Kehittyvät todisteita mukaan miRNA ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon kriittisiä rooleja kemiallis-resistenssi syöpiä. Täällä me osoitti yhdistys paklitakselia vastuksen miR-375 over-ilmentyminen ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon houkutin kohdunkaulan syöpä. Erilaisten kohdunkaulan syöpäsolujen malleja, huomasimme, että paklitakseli ohimenevästi aiheuttama säätely ylöspäin miR-375 ilmaisua, leviämisen estäminen, siirtyminen epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppiin, ja mikä estää paklitakselin herkkyys. Pakko yli-ilmentyminen miR-375 voi estää Ecadherin ilmentymisen suoraan suunnattu polku, joka johti paklitakselin vastarintaa. Päinvastoin, uudelleen ilmentäminen Ecadherin osittain päinvastaiseksi epiteelin-mesenkymaalitransitioon fenotyypin ja miR-375 aiheuttama paklitakseli-vastus. Tuloksemme viittaavat siihen, että paklitakseli aiheuttama miR-375 over-ilmentyminen helpottaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon prosessi kautta suoraan kohdistaminen Ecadherin, leviämisen estäminen, ja siten johtaa kemiallis-resistenssin kohdunkaulan syöpäsoluja. Takaisinmutaatiotestissä Mir-375 tai Ecadherin ilmentyminen voi olla uusi terapeuttinen lähestymistapa voittamiseksi kemiallis-resistenssi kohdunkaulan syövän.

Citation: Shen Y, Zhou J, Li Y, Ye F, Wan X, Lu W, et ai. (2014) miR-375 välittämä Hankittu Chemo-Resistance in Kohdunkaulan syöpä helpottamalla EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10,1371 /journal.pone.0109299

Editor: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health – National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty 10 syyskuuta 2014; Julkaistu 16. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluaa kiittää jatkuvaa taloudellista tukea National Natural Science Foundation of China (avustus nro 81172475 ja 81172474), Natural Science Foundation Zhejiangin maakunnassa Kiinassa (myöntää nro Z2110056, LQ13H160005 ja Y2110206). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kehittyvät todisteita ovat paljastaneet, että kemoterapia-resistenssi liittyy epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsoluissa, ja hankinta kemiallis-resistenssi syöpäsoluissa mukana on siirtyminen epiteelin on mesenkymaaliset fenotyyppiin [ ,,,0],1] – [3]. Esimerkiksi, eri lääkeresistenttiä syöpiä, mukaan lukien oksaliplatiini-resistenttejä ja peräsuolen syövän soluja, [4], paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja [5], ja gefitinibi kestävä keuhkosyövän soluja [6], esittää siirtymistä epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyypin pitkin menetyksen kanssa epiteelisolujen adheesiomolekyyli Ecadherin ja voitto mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista, Ncadherin, ja fibronektiini. Uudemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kemoterapia-aineisiin voivat helpottaa epiteelin on mesenkymaaliset fenotyypin muutosta jäljellä elossa olleen syöpäsoluja, jotka voivat olla yksi ratkaisevista vaiheista hankitun lääkeresistenssin syövissä [7], [8]. Siten acquirement EMT tulee keskeinen prosessi myötävaikuttaa pahanlaatuiseen fenotyypit syöpäsolujen vastustuskyky kemoterapiaa. Siksi väliintulo EMT prosessi on ehdotettu terapeuttinen lähestymistapa vastaan ​​hankittu Chemo-vastus.

MikroRNA (miRNA) toimivat tärkeinä geeni sääntelyviranomaiset ihmisgenomeissa ja niiden poikkeava ilmaisu voi edistää paitsi Tumori-genesis ja kasvain aggressiivisuus vaan myös resistenssi kemoterapiaa [9]. Viime aikoina tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA olennainen rooli moduloinnissa EMT, kuten miR-200s joka säätelee EMT estämällä ZEB1 /2, transkription repressori Ecadherin [1], [10], [11]. Me raportoi äskettäin, että ilmaus miR-375 pienennettiin kohdunkaulan syöpäsolut [12] ja määrättiin yli-ilmentyminen miR-375 esti merkittävästi proliferaatiota ja esti G1-S solukierron siirtyminen [13]. Toisessa tutkimuksessa, olemme edelleen havaittu, että miR-375 oli säädelty vahvistavasti paklitakselia saaneilla kohdunkaulan soluja ja kudoksia, ja pakotti yli-ilmentyminen miR-375 laski paklitakselin herkkyys kohdunkaulan syövän [14]. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismin kätyri miR-375 säännelty lääkeresistenssin vielä löytäjäänsä. Vuoteen miRNA kohdistuu geenin ennustaminen, löysimme sitoutumiskohta välillä miR-375 ja Ecadherin 3′-UTR, joka osoitti, että Ecadherin oli mahdollinen välittömänä kohteena miR-375. Siksi oletetaan, että miR-375 voivat osallistua EMT sääntelyn ja hankittu paklitakseli-resistenssin kohdunkaulan syöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa, löysimme ensimmäistä kertaa, että paklitakseli estää proliferaatiota, indusoi EMT, ja ylös -regulates miR-375 ilmentyminen samanaikaisesti kohdunkaulan syöpäsoluja. Ja miR-375 over-ilmentyminen suoraan esti Ecadherin ilmaisun ja helpottanut paklitakseli-vastus. Näin ollen on selvä positiivinen palaute mekanismi keskuudessa paklitakseli, miR-375, ja EMT joka johtaa hankittu Chemo-resistenssin fenotyyppejä kohdunkaulan syöpäsoluja. Tällainen sääntely takaisinkytkentäsilmukan tuloksia miR-375 yliekspressio, epiteelin on mesenkymaaliset fenotyypin muutosta, ja näin ollen acquirement paklitakselin vastus. Joka tapauksessa, se voisi olla sitä mieltä, että tauko tällaisen palautteen silmukka olisi, ainakin osittain, voittaa Chemo -resistance kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

näytteet syövän kudosta kerättiin 23 kohdunkaulan okasolusyöpä potilaalla on FIGO (2009) vaihe IB

2 tai II A

2 joille tehtiin neo-adjuvanttihoitoa seurasi tyypin III radikaali kohdunpoisto välillä 01 marraskuu 2008 ja 30 toukokuu 2010 in Naisten sairaala, School of Medicine, Zhejiangin yliopistossa. Kokoelma Kaikkien näytteiden hyväksynyt eettinen lautakunta Clinical Research päässä naisten sairaala, School of Medicine, Zhejiangin yliopistossa ja kirjoittanut tietoon perustuva suostumus saatiin.

Kaikki potilaat saivat 2 sykliä laskimoon neo-adjuvanttihoitoa ( paklitakselia 135 mg /m

2 ja sisplatiinin 75 mg /m

2, 3 viikon välein) ennen leikkausta. Vaikutus kemoterapiaa arvioitiin mukaisesti Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) [15], kuten aikaisemmin on kuvattu

14. Kaikista 23 potilasta, joiden keski-ikä oli 36,5 vuotta (vaihteluväli 20-65 vuotta), oli ennen ja jälkeen kemoterapiaa kohdunkaulan kasvain näytteissä. Määritetty koostumus jokaisen näytteet määritettiin kokenut patologi.

Soluviljely ja EMT houkutin

Kaksi ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa, SiHa ja CaSki viljeltiin aiemmin kuvatulla

14. Ihmisen rekombinantti TGF-β1: n ja EGF-β saatiin ProSpec-Tany Techno Gene Ltd (Israel), vastaavasti käytetään lopulliseen konsentraatioon 5 ng /ml ja 2 ng /ml. Syöpä solulinjoja siirrostettiin 1 x 10

5 /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa yli yön, ja sitten sitä käsiteltiin TGF-β1 tai EGF-β 72 tuntia vastaavasti, indusoimaan EMT.

RNA ja Real-Time RT-PCR

Yhteensä RNA: t, jotka sisältävät miRNA poimittiin nestetypessä säilynyt kudoksista tai korjattu soluihin käyttäen 1 ml TRIZOL reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seuraten valmistajan ohjeita. cDNA syntetisoitiin kanssa PrimeScript RT-reagenssia (Takara Otsu, Shiga, Japani). Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) ja miRNA ja mRNA suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu

14. Sekvenssit kaikkien alukkeiden on esitetty taulukossa 1.

proliferaatiomääritystä ja MTS-määritys

vaikutuksen määrittämiseksi miR-375 ja paklitakselilla leviämisen kohdunkaulan solulinjojen soluproliferaatiota määritettiin MTT-määrityksellä ja CellTrace CFSE soluproleferaatiomäärityksessä 24, 48, 72, 96 tuntia ja 5 päivää vastaavasti. Elinkelpoisuutta kokeita, kohdunkaulan syöpäsolut tai ilman 10 nM paklitakselihoidolla 72 tuntia levytettiin (SiHa-, 3 x 10

3 /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä ja 2 x 10

5 /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ; CaSki-, 2 x 10

3 /kuoppa 96-kuoppalevylle ja 1 x 10

5 /kuoppa 6-kuoppaisella levyllä) ja viljeltiin yön yli. MTT-määritys näytteiden absorbanssi mitattiin spektrofotometrillä lukijalla 490 nm: ssä. CellTrace CFSE solujen lisääntymisen määritys suoritettiin värjäämällä aktivoitu kohdunkaulan syövän CellTrace CFSE solujen lisääntymistä väriainetta (2,5 uM) (Invitrogen), ja analysoida käyttämällä virtaussytometrialla 488 nm: n virityksellä ja emissiosuodattimia. In vitro paklitakseli kemiallis-herkkyys kohdunkaulan syövän solujen arvioitiin käyttäen MTS-määritystä (Promega, Madison, WI), kuten aiemmin on kuvattu [12]. Neljä jäljitellä kaivoja käytettiin kutakin analyysiä, ja vähintään kolme riippumatonta koetta suoritettiin.

Western Blot analyysi

Kaikkiaan 50 mg proteiinia erotettiin denaturoivalla 8-15% SDS-polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla. Western-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kalvot analysoitiin densitometrisesti kanssa VersaDoc Imaging System; Malli 3000 (BioRad) käyttäen Määrä Yksi ohjelmistoa. Analyysi ristiriidassa Bonferroni korjaus useita testejä käytettiin määrittämään merkitystä. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat anti-Ncadherin (1:5000), anti-Ecadherin (1:2000), anti-fibronektiini (1:1000), anti-vimentiinistä (1:1000) ja anti-aktiini (1:2000), kuten endogeeninen kontrolli, kaikkea Epitomics Biotechnology (Epitomics).

immunohistokemia

pääluokat (6 um) kasvainkudoksen leikattiin paraffinised 23 parit itsensä pariksi pre-ja post-kemoterapian kohdunkaulan syöpä näytteitä, ja immunohistokemia analysointi ja pisteytys kuvattiin aikaisemmin

12. Ensisijainen käytetyt vasta immunohistokemia analyysissä olivat anti-Ecadherin vasta-ainetta (1:1000) ja anti-aktiini-vasta endogeeninen kontrolli (1:2000), niin Epitomics Biotechnology (Epitomics).

lentivirustartunnat rakentaminen ja transfektio

tuottaa miR-375 ja Ecadherin yli-ilmentyminen stabiilit transfektantit, kohdunkaulan syövän soluja transfektoitiin lentiviral ilmentävillä vektoreilla. Plasmidi rakenne ja lentivirukselle paketti olivat täydellisiä GENECHEM Company. Pre-miR-375-sekvenssit monistettiin ja kloonattiin pGCsil-GFP-vektorilla käyttäen seuraavia alukkeita: (Forward) HSA-pre-miR-375-XhoI-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC; (Peruutus) HSA-pre-mi-R-375-MfeI-R, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. HSA-CDH1 (CDS) geeni monistettiin ja kloonattiin PGC-FU-GFP-vektorilla käyttäen seuraavia alukkeita: (Forward) 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 ’, (Reverse) 5′-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3’. Virukset pakkaus suoritettiin HEK 293-T-soluja, kun kotransfektiolla 20 mg pGCsil-GFP-pre-miR-375-vektori tai PGC-GFP-CDH1 vektori, 15 mg pakkauksen plasmidin pHelper 1,0 Vector ja 10 mg kirjekuoren plasmidin pHelper 2.0 vektori käyttäen Lipofectamine 2000 virukset kerättiin 48 h transfektion jälkeen, ja viruksen tiitterit määritettiin. Tiitterit viruksen käytetty tässä tutkimuksessa olivat välillä 5 x 10

8~2 × 10

9 TU /ml.

Jos haluat luoda miR-375 ja Ecadherin yli-ilmentyminen vakaa transfektantit, kohdunkaulan syövän soluja transfektoitiin lentiviral ilmentävillä vektoreilla kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. MOI = 5 käytettiin SiHa ja MOI = 10 käytettiin CaSki. Sen jälkeen 4~7 d transfektion stabiileja kloonit valittiin GFP virtaussytometrialla ja korjataan lisäkokeita. Tyhjä PGC FU-GFP-NC-LV vektoria käytettiin negatiivisena kontrollina.

Luciferase Activity Assay

Sen tutkimiseksi, CDH1 ilmentymistä säätelee miR-375, joka on psicheck-2 dual -luciferase miRNA tavoite ekspressiovektori (psicheck-2 -UTR vektori) käytettiin suorittamaan lusiferaasiaktiivisuuden määritys. Villi ja mutantti-tyypin 3′-UTR CDH1 sisältävät ennustetun miR-375 sitoutumiskohdan syntetisoitiin ja liitettiin 3′-UTR-alueen alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geeni psicheck-2-vektoriin (psicheck-2 -UTR) käyttäen Xho I ja Notl restriktiokohdat. Kaikki rakenteet varmistettiin sekvensoimalla. Sen jälkeen kun oli kotransfektoitu miR-375 jäljittelee (20 uM), ja reportteri vektorit (0,2 ug /ml), Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 24 tuntia käyttäen Dual-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuuden luvut viittaa tulikärpäsen lusiferaasi toiminta normalisoidaan Renilla lusiferaasi. Arvot solut tyhjiä psicheck-2 vektori asetettiin yhtäläisesti 1.

Tilastollinen analyysi

Kokeet toistettiin ainakin kolme kertaa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. Riippumattoman Studentin t-testiä tai ANOVA käytettiin vertaamaan jatkuvia muuttujia. Pearsonin korrelaatiokerroin testiä käytettiin arvioimaan korrelaatio kahden jatkuvia muuttujia. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Paklitakseli indusoi EMT ja esti leviämisen samanaikaisesti kohdunkaulan syöpäsolut

Kun morfologiaa viljellään rutiininomaisesti kohdunkaulan syöpäsolut käsitelty tai ilman paklitakselia tutkittiin mikroskoopilla, havaitsimme, että SiHa solu kasvoi tiiviisti pakattu ”cobblestone” kaltainen epiteelisolujen, kun taas solut, jotka saivat paklitakselia tuntui kara kaltainen muoto litistetty ja menetti suurimman osan solu-solu kontakteja. (Kuvio 1 a) Samalla ilmentymisen Ecadherin proteiinin laski (10,5% ~66.6% ja 43,75% ~67.6% alle 5 nM ja 20 nM paklitakselihoidolla vastaavasti) ja ilmauksia Ncadherin ja fibronektiiniproteiinin lisättiin annoksesta reagoiva tavalla. (Kuva 1b) Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös CaSki soluissa. (Kuva 1b Kuva S1).

(a) Näkyvä morfologiset muuttuu ”mukulakivi” kaltainen ja ”fibroblastien” kaltainen solujen havaittiin SiHa kuluttua 72 h paklitakselihoidolla. Edustaja solut morfologisia muutoksia leimattiin (b) Immunoblottaus mittasi ilmaus Ecadherin ja muut EMT liittyviä proteiineja (vimentiinista, Ncadherin, ja fibronektiini) kohdunkaulan syövän solujen (SiHa ja CaSki) eri määriä (0, 5, 10, 20 nM) paklitakselin hoitoon. Ekspressio Ecadherin proteiinin vähentynyt ja ilmauksia vimentiinin, Ncadherin, ja fibronektiiniproteiinin lisättiin soluissa, jotka saivat paklitakselia 72 tuntia annoksesta reagoiva tavalla. Kaikki ilmaukset proteiinien normalisoitiin ß-aktiini ja tiedot pylväsdiagrammeja esitetään keskiarvo kolmen näytteen kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaikki virhepalkkeja ilmoitettu s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0.05). (C, d) Ohimenevä solujen lisääntymisen inhibition ja morfologisia muutoksia indusoi paklitakselia ei havaittu. Leviämisen muutokset SiHa ja CaSki -soluissa, sen jälkeen paklitakselin annon analysoitiin CellTrace CFSE solujen lisääntymistä (c) ja MTT-määrityksellä (d) 24 h, 72 h, 96 h, päivä 5, päivänä 7, päivänä 14, ja päivänä 21, vastaavasti. Leviämisen nopeus Paklitakselin käsiteltyjen SiHa ja CaSki solujen väheni huomattavasti päivänä 7 ja palauttaa 21. päivänä sen jälkeen, kun Paklitakselihoidon. Säilyneistä CaSki- Solut palautettiin normaaliin morfologiaan 21. päivänä sen jälkeen, kun Paklitakselihoidon.

Lisäksi, ohimenevä soluproliferaatiota esto indusoi paklitakselia virtaussytometrialla ja MTT. SiHa ja CaSki-soluja viljeltiin rutiininomaisesti 10 nM paklitakselia, 72 tunnin jälkeen, paklitakseli poistettiin ja soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa jatkuvasti, sen jälkeen leviämisen muutoksia SiHa ja CaSki-solujen ennen ja jälkeen paklitakselin annon paljasti 24 h, 72 h, 96 h, päivä 5, päivä 7, päivänä 14, ja päivänä 21, vastaavasti. Kuten osoitti kuvassa 1c, 1d, leviämisen nopeus paklitakselin käsiteltyjen SiHa ja CaSki soluja 7. päivänä väheni merkittävästi (SiHa-, p = 0,002 ja p = 2,3 × 10

-5; CaSki-, p = 3,1 x 10

-4 ja p = 1,2 x 10

-5 vastaavasti), verrataan sokeakoekuoppaa, ja palauttaa samalle tasolle kuin ennen lääkehoidon päivänä 21. samaan aikaan, ”cobblestone” kaltainen morfologisia muutoksia aiheuttama paklitakselin säilyneet solut myös normalisoitunut morfologiaan päivänä 21. Nämä seikat osoittavat, että paklitakseli ohimenevästi estää proliferaatiota ja indusoi EMT samanaikaisesti kohdunkaulan syöpäsoluja, mutta kaikki nämä paklitakseli aiheuttamiin muutoksiin päinvastaiseksi jälkeen vieroitusoireista.

paklitakseli up-regulation miR-375 aikana asiakkuutta EMT ja leviämisen esto

oli tutkinut miR-375 ilmentymisen muuttuvassa mukana paklitakselin aiheuttama EMT ja lisääntymistä eston kohdunkaulan syöpäsolujen ja selkeä annoksesta riippuva vaikutus paklitakselin päällä miR-375 over-ilmentyminen havaittiin

14. Lisäksi progressiivinen sääteli ilmentyminen miR-375 saavutti huippunsa 7. päivänä Paklitakselihoidon, laskivat vähitellen paklitakselin jälkeen poistetaan ja palautetaan tasolle ennen lääkehoidon noin päivä 21

14. Lisäksi, oli voimakas negatiivinen korrelaatio ekspression miR-375 ja suhteellinen leviämisen osuus kohdunkaulan syövän soluja (SiHa-, r = -0,472, p = 1,52 x 10

-3, CaSki, r = -0,835 , P = 3,03 x 10

-4). (Kuva S2) Meidän tietojen mukaan paklitakseli sääteli miR-375 ilmaisun ja esti leviämisen samanaikaisesti kohdunkaulan syöpäsolut mutta sekä paclitexel aiheuttamiin muutoksiin päinvastaiseksi jälkeen vieroitusoireista, mikä viittaa siihen, että jotkut kohdunkaulan syöpäsolujen hengissä paklitakseli, luultavasti vaikka ylös- säännellään miR-375 ilmaisun ja hankkimalla pahanlaatuinen mesenkymaalisten fenotyyppejä, sitten kehittää potentiaalia vähentää lisääntymistä ja vastustaa huumeiden myrkyllisyys. Nämä korrelaatio viittaavat siihen, että miR-375 over-ilmentyminen saattaa olla syy rooli kemoterapian aiheuttaman EMT.

MiR-375 välittää EMT suoraan kohdentamalla Ecadherin

miRDB ja TargetScan hakuohjelmia analyysissa löysi ennustettu sitoutumisen miR-375 kanssa CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR, joka osoitti, että Ecadherin oli mahdollinen välittömänä kohteena miR-375 (kuva 2c). Edelleen varmistamiseksi, että Ecadherin on kohdegeenin Mir-375, me ensin analysoida suhdetta Ecadherin ja miR-375 ilmentymistä kohdunkaulan syövän soluja eri määriä paklitakselihoidolla. Kuten kävi ilmi, kuviossa 1b ja kuviossa S2, miR-375 ekspressio soluissa oli merkittävästi säätelemätön annoksesta riippuvalla tavalla aikana paklitakselin aiheuttama EMT prosessi, samoin kuin Ecadherin proteiinin ja miR-375 ilmentyminen käänteisesti korreloi (r = -0,752, P = 2.32 x 10

-4). Sitten vielä käyttäneet Luciferase Activity Assay vahvistaa sitoutuminen miR-375 3′-UTR Ecadherin. (Kuvio 2c).

(a) Faasikontrasti- kuvia kohdunkaulan syövän solujen tartunnan ennalta miR-375 tai negatiivinen lentivirus vector ja nollakoe. (B) Immunoblottaus mittaus Ecadherin ja EMT liittyviä proteiineja kohdunkaulan syövän tercells tartunnan ennalta miR-375 tai negatiivinen lentivirus- vektori. (C) ennustettu duplex muodostuminen ihmisen CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR ja miR-375. Alentunut lusiferaasiaktiivisuus jälkeen havaittiin transfektoimalla Ecadherin 3′-UTR villityypin vektorin miR-375, mutta ei mutatoitunut tai tyhjän vektorin (p = 0,014). Datan-c esitettiin keskiarvona tripletti näytteiden riippumattomassa kokeessa. Kaikki virhepalkkeja ilmoitettu s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0.05).

Sen testaamiseksi, säätely ylöspäin miR-375 vaikuttaneet paklitakselin indusoimaan EMT, vaikutukset miR-375 over-ilme nämä tapahtumat arvioitiin. Ilmaisu Mir-375 analysoitiin Reaaliaikainen PCR toisella viikolla, kolmas viikko ja ensimmäisen kuukauden ennalta miRNA lentiviral vakaa transfektion. Kuten on esitetty kuviossa 2a ja 2b, pakko yliekspressio miR-375 indusoi EMT prosessi kohdunkaulan syövän soluja, tunnettu siitä, että hankinta fibroblastin kaltaisen solujen morfologia, suppression Ecadherin lausekkeen (65% ~69.2%), ja parantaminen vimentiinista, Ncadherin, ja fibronektiinin ilme, samanlainen havaitut vaikutukset paklitakselilla käsitellyissä soluissa.

Näin meidän havainnot osoittavat, että miR-375 over-ilmentyminen edistää paklitakselin aiheuttama EMT osittain suoraan kohdentamalla Ecadherin kohdunkaulan syövän soluja.

EMT säätelee paklitakselin herkkyys mutta ei miR-375 ilmaisu

Voit selvittää EMT voi säädellä miR-375 ilmaisu käänteisesti, seuraava koesarja suoritettiin. Me aiheuttama EMT TGF-β1 tai EGF-β kohdunkaulan syöpäsolujen (SiHa ja CaSki) ja havaittu vaikutus EMT paklitakselia herkkyys ja miR-375 ilme. Stimuloida TGF-β1 tai EGF-β, kohdunkaulan syöpäsolut koki EMT mukana näkyviä morfologisia muutoksia (kuvio 3a), kuten ulkonäkö karan kaltainen muoto soluissa, ja EMT markkeri muuttaminen, mukaan lukien vähentynyt Ecadherin proteiinin ilmentymisen (28,5% ~ 65,8% TGF-β1 ja 47,5% ~67.6% EGF-β), sekä lisääntynyt Ncadherin, vimentiinistä, ja fibronektiiniproteiinin lauseke (kuva 3c). Ilmaisulla Mir-375 ei muuttunut TGF-β1 tai EGF-β aiheuttama EMT prosessi kohdunkaulan syöpäsolut (SiHa-,

p

= 0,538; CaSki-

p

= 0,542) (Kuva 3d).

(a) Näkyvä morfologisia muutoksia SiHa ja CaSki alle TGF-β1 tai EGF-β houkutin. (B) MTS-analyysi paklitakselia herkkyyden kohdunkaulan syöpäsoluja. (C) immuuniblottausanalyysi Ecadherin ja muut EMT liittyviä proteiineja jälkeen TGF-β1 tai EGF-β induktio. (D) miR-375 ilmaisun SiHa- ja CaSki alle TGF-β1 tai EGF-β houkutin. Data in b-d esitettiin keskiarvona kolmoset näytteitä itsenäisestä kokeesta. Kaikki virhepalkkeja ilmoitettu s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0.05).

Lisäksi olemme rajattuja huumeiden solujen herkkyys meneillään EMT käyttäen MTS-määritystä. Paklitakseli herkkyys on merkittävästi vähentynyt SiHa- ja CaSki-soluissa, sen jälkeen TGF-β1 tai EGF-β stimulaation verrattuna seerumittomalla kulttuuri kontrolleihin (kuvio 3b). IC50-arvot kasvoivat SiHa- ja CaSki 5 ng /ml TGF-β1 (95,81 ± 2,53 nM ja 66.66 ± 2,32 nM, SiHa-,

p

= 0,032; CaSki-,

p

= 0,023) tai 2 ng /ml EGF-β stimulaatio (96,74 ± 2,47 nM ja 94,78 ± 1,72 nM, SiHa-,

p

= 0,038; CaSki-

p

= 0,028) verrattuna seerumin vapaata kulttuuri valvonta (24,54 ± 1,37 nM, ja 23,98 ± 2,62 nM).

havainnot osoittavat, että TGF-β1 tai EGF-β indusoi EMT mutta annos ei muuta miR-375 ilmentymistä kohdunkaulan syöpäsoluja, ja mesenkymaalisten solujen kaltaisia ​​kohdunkaulan syöpäsolujen aiheuttama TGF-β1 tai EGF-β ovat tyypillisesti paklitakseli resistenttejä. Huomattavasti voimistunut ilmentyminen miR-375 paklitakselin käsitellään kohdunkaulan syöpäsoluissa on aiheuttamien paklitakselin mutta ei EMT.

Ecadherin yli-ilmentyminen vaimenee kyky miR-375 toimia välittäjänä EMT ja paklitakseli-vastus

Ecadherin ei ole ainoastaan ​​tärkeä molekyylin aloittamisen EMT vaan myös tunnusmerkki EMT ja miR-375 välittää EMT suoraan kohdentamalla Ecadherin.To roolin tutkimiseksi Ecadherin vuonna EMT ja paklitakselin herkkyyttä ja testata onko säätelyä ylöspäin ofEcadherin voi vaimentaa vaikutusta miR-375 on EMT ja paklitakselia resistenssin kohdunkaulan syöpäsolujen; Ecadherin yliekspressoidaan lentviral PGC-flag-CDH1 vektoria käytettiin. Olemme vastaavasti transfektoidut Ecadherin yliekspressoitujen lentviral vektori ja negatiivisen kontrollin osaksi SiHa ja CaSki solujen kanssa ja ilman miR-375 yliekspressio, ja havaittiin, että vaikutus pakotetaan-ilmentyminen Ecadherin EMT ja paklitakselia-vastus. In Ecadherin yli-ilmentävien kloonien kanssa ja ilman miR-375 yli-ilmentyminen, oli voimakas ja merkittävä kasvu ilmentymisen Ecadherin (kuvio 4a). Soluissa ilman miR-375 yliekspressio, mitään merkittäviä eroja morfologia ja mesenkymaalisten markkereita havaittiin SiHa ja CaSki solujen jälkeen Ecadherin yli-ilmentyminen, joka on luultavasti koska heidän vanhempien solut jo näytteillä epiteelin fenotyyppi. Tätä vastoin solut miR-375 yli-ilmentyminen, oli siirtyminen eristetty fibroblastisoluja on ”cobblestone” kaltainen epiteelisolujen. Samaan aikaan ilmauksia Ncadherin, vimentiinin, ja fibronektiiniä oli laskenut huomattavasti Ecadherin yli-ilmentyminen (kuvio 4a, 4c).

Immunoblottaus (a) ja MTS (b) analyysi Ecadherin ja muiden EMT liittyviä proteiineja SiHa ja ilman miR-375 yli-ilmentymisen jälkeen Ecadherin ilmentävien tai negatiivinen lentiviruksen vektorin transfektiolla. Tiedot (a) ja (b) on esitetty keskiarvona tripletti näytteiden riippumattomassa kokeessa. Kaikki virhepalkkeja ilmoitettu s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0:05). (C) Morfologiset muutokset SiHa ja ilman miR-375 yliekspressio jälkeen Ecadherin ilmentävien tai negatiivinen lentiviruksen vektorin transfektiolla. Edustaja solut morfologisia muutoksia oli merkitty.

paklitakseli kemiallis-herkkyys sitten arvioitiin MTS määrityksissä. Kuten odotettua, paklitakselin herkkyys lisääntyi merkitsevästi Ecadherin lentvirus-transfektoitujen solujen kanssa ja ilman miR-375 yliekspressio verrattuna kontrolli soluihin. IC50-arvot pienenivät SiHa- ja CaSki kanssa Ecadherin yliekspressio (12.82 ± 2,54 nM ja 7,62 ± 0,93 nM, SiHa-,

p

= 0,043; CaSki-,

p

= 0,038) verrattuna negatiiviset kontrollit (20,73 ± 1,23 nM ja 11,68 ± 0,62 nM, SiHa-,

p

= 0,028; CaSki-,

p

= 0,021). Lisäksi paklitakselin vastus oli merkittävästi heikennetty jälkeen Ecadherin oli käytännössä yli-ilmentynyt kohdunkaulan soluissa yli-ilmentynyt miR-375 verrattuna negatiiviseen kontrolliin (kuvio 4b). IC50-arvot pienenivät SiHa- ja CaSki kanssa Ecadherin ja miR-375 kotransfektioon (22,82 ± 3,54 nM ja 13,68 ± 0,64 nM, SiHa-,

p

= 0,033; CaSki-,

p

= 0,038) verrattuna SiHa ja CaSki negatiiviseen kontrolliin ja miR-375 kotransfektioon (82,83 ± 2,23 nM ja 20,31 ± 3,01 nM, SiHa-,

p

= 0,032; CaSki-,

p

= 0,025 ). Tuloksemme osoittivat, että Ecadherin yli-ilmentyminen tehostaa merkittävästi paklitakselin herkkyys kohdunkaulan syövän solujen kanssa tai ilman miR-375 yli-ilmentyminen, mikä viittaa siihen, että Ecadherin yli-ilmentyminen parantaa merkittävästi paklitakselin herkkyyden lisäksi, uudelleen ilmentyminen Ecadherin kääntää, ainakin osittain, EMT fenotyyppi ja paklitakseli-vastus välittämä miR-375 kohdunkaulan syöpäsoluja.

miR-375 over-ilmentyminen korreloi Ecadherin ilme jälkeisissä kemoterapiaa ihmisen kohdunkaulansyövän kudosten

luoda kliinistä merkitystä miR-375 välillä Ecadherin ilmaisuja alle kemoterapiaa vaikutuksia, arvioimme miR-375 ja Ecadherin ilmaisun 23 parit itsensä pariksi ennen ja jälkeen kemoterapiaa ihmisen kohdunkaulansyövän kudoksiin. Immunovärjäyksen varten Ecadherin paljasti laajempi ja voimakkaampi ilmentyminen ennalta kemoterapiaa kuin jälkeisen kemoterapiaa tuumorikudoksista (kuva 5). Samaan aikaan, miR-375 oli merkittävästi voimistunut (4,67-kertainen) paklitakselin saaneilla kohdunkaulan näytteissä, Ecadherin ja miR-375 ilmentyminen oli käänteisesti korreloivat kaikissa kudoksissa, kuten ennen ja jälkeen kemoterapian (r = -0,905, p = 1,81 × 10

-3) (taulukko S1).

(a) Ecadherin ja miR-375 ilmentyminen oli käänteisesti korreloivat kaikissa kudoksissa, kuten ennen ja jälkeen kemoterapian (r = -0,905, p = 1,81 × 10

-3). (B) värjäys ihmisen erityisiä Ecadherin ilmentymisen kolme edustajaa (1 PD ja 2 PR) (x 200). Jos on käytetty pienempää Ecadherin ilmentyminen osoitettiin kudoksissa kemoterapian jälkeen (p = 0,0023).

Kaikista 23 potilasta, 19 oli Chemo-herkkiä ja 4 Chemo-vastus, ilmen- tymisen lisääntymisen ilmaus miR-375 on lisää merkittävästi kemiallis-vastuksen potilaista verrattuna jälkeistä kemoterapiaa kudoksiin heidän itsensä pariksi ennalta kemoterapiaa kudoksissa (6,7 ± 2,3 kertaisesti kemoterapian resistenssin ja 4,35 ± 0,63 kertaiseksi chemosensitive potilaista,

p

= 0,033) . Mutta on huomattava, että ei ole tarpeeksi virtaa päätellä, että miR-375 ilmaisu on suurempi kemiallis-vastus potilaat, osittain johtuen pienestä näytteen koon kemiallis-vastus potilailla (N = 4).

keskustelu

Chemo-vastus on yksi tärkeimmistä syy tekijöitä syövän relapses ja etenemiseen. Suurin osa syöpäsolujen vastaa hyvin aluksi kemoterapiaa, mutta lopulta kehittää resistenssin seuraavia lääkealtistuksen. Kehittyvät todisteita ovat paljastaneet, että syöpäsolut läpikäyvät EMT edistää solujen eloonjäämistä ja kestävyys kemoterapiaa [3]. Vaikka se on raportoitu, että miRNA voi olla keskeinen rooli moduloivan EMT [16]; kuitenkin yksityiskohtainen sääntelymenettelyä edelleen tutkimatta. miR-375 oli alun perin havaittiin ilmentyvän haiman saarekesolujen, jossa se säätelee insuliinin eritystä ja aineenvaihduntaa glukoosin [17]. Äskettäin miR-375 tunnistettiin tärkeänä säätelijänä tumorgenesis ja syövän etenemisen; kuitenkin, tarkka tehtävät tämän miRNA edelleen pääosin epäselviä. miR-375 tunnistettiin tuumorisuppressorina useimmissa syöpien, kuten mahasyövän [18], [19], maksasyöpä [20], pään ja kaulan okasolusyöpä [21] ja eturauhasen syövät [22], mutta toistetaan onkogeenisessä rooli ERa rintasyöpä [23], keuhkojen adenokarsinooma potilailla [24] ja HBV positiivinen HCC potilaille [25]. Niinpä nämä ristiriitaisia ​​tietoja koskien yhdistyksen välillä miR-375 tason ja syövän ehdotti monimutkaisempi ja mahdollisesti syövän erityinen suhde. Toisessa tutkimuksessa meidän, havaitsimme yhdistyksen välillä miR-375 over-ilmaisun ja paklitakselin -resistance kohdunkaulan syövän

16. Täällä me linkittää suoraan miR-375 kemoterapian aiheuttaman EMT prosessi kohdunkaulan syöpä. Löysimme ensimmäistä kertaa, että paklitakseli estää proliferaatiota, indusoi EMT, ja ajan säätelee miR-375 ilmentymistä annosriippuvaisesti samanaikaisesti kohdunkaulan syöpäsoluja, mutta kaikki nämä paklitakseli aiheuttamiin muutoksiin päinvastaiseksi jälkeen vieroitusoireista. Mekanistisesti kohdunulkoinen yli-ilmentyminen miR-375 vähensivät Ecadherin ilmaisun ja mukana hankittu mesenkymaalisten ominaisuudet ja kemoterapian resistenssin kohdunkaulan syöpäsoluja. Täten havaintomme ehdotti, että paklitakseli ei poista kaikkia kohdunkaulan syöpäsolut ja jotkut jäljellä solut voivat selviytyä alle lääkealtistuksen. Tämän prosessin aikana, ne jäljellä kohdunkaulan syövän solujen säädelty miR-375 ilmaisu todennäköisesti hallussaan mahdollista hankkia mesenkymaalisten fenotyyppejä, hidastaa lisääntymistä, ja vastustaa huumeiden myrkyllisyys.