Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavaa RNA-molekyylit 20 22 nukleotidin, jotka säätelevät geenien ilmentymistä sitoutumalla niiden 3’alue (3’UTR). Lisääntyvä data sotkea muuteta miRNA osallistuminen etenemistä syöpä. Raportoimme aikaisemmin, että CYP2J2 epoxygenase edistää ihmisen syövän fenotyyppejä. Mutta onko ja miten CYP2J2 säätelee miRNA ei ymmärretä.

Menetelmät ja tulokset

Käyttäen bioinformatiikan analyysi, huomasimme potentiaali kohdesivustoissa miRNA päästää-7b 3’UTR ihmisen CYP2J2. Lusiferaasi ja western blot analyysit paljastivat, että CYP2J2 säädeltiin let-7b. Lisäksi, anna-7b vähensivät entsymaattista aktiivisuutta endogeenisen CYP2J2. Lisäksi let-7b voi vähentää solujen lisääntymistä ja edistää solujen kasvainsolujen apoptoosin kautta posttranskriptionaalisella tukahduttamisesta CYP2J2. Tuumoriksenografteja indusoitiin nude-hiirissä ihonalaisella MDA-MB-435-soluja. Let-7b ekspressiovektorin, pSilencer-let-7b, injektoitiin kautta häntälaskimoon 3 viikon välein. Anna-7b estivät merkitsevästi kasvaimen fenotyypin kohdistamalla CYP2J2. Lisäksi kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio ja western blotting käytettiin määrittämään ekspressiotasoja let-7b ja

CYP2J2

proteiinia 18 täsmäsi keuhkojen okasolusyöpä ja viereisten normaalin keuhkojen kudoksia; ilmentymisen taso CYP2J2 oli kääntäen verrannollinen kuin päästää-7b.

Johtopäätökset

tulokset osoittivat, että vähentynyt ilmentyminen let-7b voisi johtaa korkean ilmentymisen CYP2J2 proteiinin syöpä kudoksiin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miRNA let-7b vähentää CYP2J2 ilmaisu, jotka voivat vaikuttaa estämällä kasvaimen fenotyypit.

Citation: Chen F, Chen C, Yang S, Gong W, Wang Y, Cianflone ​​K, et al. (2012) Anna-7b Estää Human Cancer fenotyyppi Targeting Sytokromi P450 Epoxygenase 2J2. PLoS ONE 7 (6): e39197. doi: 10,1371 /journal.pone.0039197

Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 joulukuu 2011; Hyväksytty: 16 toukokuu 2012; Julkaistu: 25 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program = ”973 =” (nro 2012CB517801) ja NSFC (nro 30930039 ja 81070236). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen sytokromi P450 (CYP) epoxygenase, CYP2J2, katalysoi kaksoissidoksen arakidonihapon neljään regioisomeerien cis-epoxyeicosatrienoic happo (5,6-EET, 8,9-EET; 11,12-EET; ja 14,15-EET) [1]. Tämä entsyymi vaikuttaa ensisijaisesti ilmaistaan ​​sydämessä ja alusten endoteelisoluihin [2], ja se on myös todettu erilaisissa kudoksissa, mukaan lukien maksa, keuhkot, munuaiset, ja maha-suolikanavan kudokset [3]. Koska erot katalyyttinen tehokkuus yksittäisten P450-isoformien tuloksia eri EET profiilit kaikille [4], 11,12- ja 14,15-EETS ovat ensisijaisesti arakidonihappometaboliittien tuotettu eri soluissa ja kudoksissa [5], [6] .

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että EETS on monipuolinen biologisiin vaikutuksiin sydän-järjestelmään. Eets vapautuu endoteelin aktivoitu kalsium-herkkiä kaliumkanavia ja johti hyperpolarisaatioon sileän lihaksen solujen ja verisuonten rentoutumista [7]. Lisäksi fysiologiset pitoisuudet Eets tai yliekspressio

CYP2J2

vähentää verisuonten adheesiomolekyyli-1 (VCAM-1) ilmentymisen ja estää leukosyyttien adheesiota verisuonen seinämään [8]. Estovaikutukset EETS osoittavat, että niillä on tulehdusta vaikutuksia verisuonistossa riippumattomia kalvo-hyperpolarisaatio vaikutukset [8]. Lisäksi Eets edistänyt myös endoteelisolujen proliferaatiota, migraatiota, ja angiogeneesi aktivoimalla molemmat mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) ja fosfatidyyli-3 (PI3) -kinase /Akt reittejä [9].

Toisaalta käsi, muut todisteet osoittavat, että epoxygenase yliekspressio tai Eets hoito on potentiaalisesti haitallisia vaikutuksia. Viime julkaisuissa, CYP2J2 johdettu Eets havaittiin tärkeitä rooleja monia prosesseja, jotka liittyvät syöpäsolujen käyttäytymistä ja kasvaimen synnyssä. Löysimme korkeat ekspressio CYP2J2 ihmisen kasvaimissa, sekä kahdeksan ihmisestä peräisin sinoomasolulinjoja, mutta ei vieressä normaaleissa kudoksissa ja nontumoral ihmisen solulinjoissa [10]. Yliekspressio CYP2J2 tai lisäämättä eksogeenistä Eets selvästi nopeutettu lisääntymistä ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen in vitro ja in vivo [10], [11]. CYP2J2 yliekspressio tai lisäämättä eksogeenistä Eets suojattu ihmisen karsinooman soluja apoptoosin säätelemällä antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L, ja vähen- tämisessä proapoptoottiset proteiini, Bax [10]. Sen sijaan, selektiivisiä CYP2J2 oli merkittäviä antituumorivaikutuksia in vitro ja in vivo, ja ne, joihin liittyy heikentynyt EET biosynteesin [12]. Yhdessä kaikki havainnot osoitti tärkeä ja aikaisemmin tuntemattomia roolit CYP2J2 ja sen EET tuotteita karsinogeneesissä.

Lisääntyvä todisteet osoittavat, että miRNA tärkeä rooli erilaisten biologisten prosessien, kuten proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia kehityksen aikana [13], [14], [15]. Useat tutkimukset ovat todellakin kuvattu poikkeava ekspressio ihmisen kasvaimissa miRNA ja niiden toiminnan ohjaamiseksi tiettyjen syöpägeenien ilmentymistä, ja tuumorisuppressorigeeneille [16], [17], [18]. Esimerkiksi, miR-15a ja miR-16 ovat usein poistettu tai vaimentua in okasolusyöpää ja adenokarsinoomat keuhkojen [19]. MicroRNA-101 on vaimentua virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) kudoksiin ja estää soluproliferaatiota ja pesäkkeenmuodostusta TCC solulinjoissa suoraan tukahduttaa onkogeenin EZH2 [20]. Tuore tutkimus osoitti, että miRNA-let-7a estää ilmentymistä MYC ja kumoaa MYC aiheuttama kasvu Burkittin lymfooman soluissa [21]. Edellinen raportit osoittavat, että let-7 on huonosti ilmaistu erilaisissa ihmisen kasvaimissa ja vähentää anna-7 tasolla johtaa yli-ilmentyminen (cyclinD, RAS, MYC) let-7-reagoiva geenien kasvaimia [22], [23] , [24], [25]. Kuitenkin tarkka rooli let-7 syövän ei ole vielä täysin ymmärretty. Alustavien tietojen mukaan päästää 7b on alassäädetty ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma kasvaimia, kun taas tasojen CYP2J2 proteiini on säädelty, mikä viittaa siihen, että ihmisen CYP2J2 ehkä transkription jälkeen säätelee let-7b. Siten käsiteltävänä olevan oli tutkia tätä hypoteesia, että let-7b saattaa toimia tuumorisuppressorina johon pyritään CYP2J2.

Tulokset

Anna-7b tavoitteet 3’UTR on

CYP2J2

Sen tutkimiseksi, mikäli CYP2J2 säädellään suoraan anna-7b, rakensimme lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää 3’UTR CYP2J2 kloonattu alavirtaan lusiferaasireportterigeenin (kuvio 1A). Transfektoimme lusiferaasi rakentaa osaksi HepG2-soluissa yhdessä let-7b tai satunnainen let-7b. Huomasimme, että transfektointi pMIR /CYP2J2-3’UTR yhdessä let-7b johti merkittävään vähenemiseen reportteriaktiivisuutta kuin teki ne valvonta- ja satunnainen transfektioiden. Toisaalta, mitään merkittävää vaimennussäätely pMIR reportteri aktiivisuus voidaan määrittää, kun transfektoitiin pMIR toimittaja (tyhjä vektori) yhdessä let-7b tai satunnainen let-7b osaksi HepG2-soluissa (kuvio 1 B). Edelleen vahvistaa, että CYP2J2 on tavoite let-7b, rakensimme seitsemän mutantteja (pMIR /CYP2J2-3? UTR mutantti, mutantti-1, mutantti-2 … ja mutantti-6, vastaavasti), joka perustuu pMIR /CYP2J2-3? UTR. Sitten me transfektoitiin nämä konstruktit soluihin (MDA-MB-435 ja SK-MES-1) ja analysoitiin lusiferaasireportterilla toimintaa. Analyysit osoittivat, että lusiferaasiaktiivisuus pMIR /CYP2J2-3? UTR-mutantti ei tukahdutettu anna-7b, verrattuna villityypin pMIR /CYP2J2-3? UTR (kuvio 1C ja D). Jäljellä olevista kuudesta mutantit (mutantti-1, mutantti-2 … mutantti-6), lusiferaasiaktiivisuus mutantti-3 tukahdutettu anna-7b, vertaamalla satunnaisia ​​ja ohjaus (

P

0,05) ( Kuva 1 E). Lisäksi sitoutumiskohta III täysin Hyväksytty siemenen sekvenssin let-7b jos huojunta emäspariutumisessa sallittiin. Nämä tiedot osoittavat, että CYP2J2 on yksi tavoitteista on antaa-7b.

A kaavamaisesti ennustetun kohdesivustoluetteloon let-7b 3’UTR CYP2J2. 3’UTR on CYP2J2 kloonattiin lusiferaasireportteriplasmidi, kutsutaan pMIR /CYP2J2-3’UTR. Sarja mutanttien suorittaa mutatoidun nukleotidin kuusi mahdollista sitoutumiskohtaa varten anna-7b siemenet alue tuotettiin perustuen villityyppisen pMIR /CYP2J2-3’UTR. Mutantteja pMIR /CYP2J2-3’UTR ovat mutatoimalla täydentävä sivusto (merkitty alleviivauksella) in let-7b siemenen alueen toisiaan täydentävät emäksiä. B, lusiferaasiaktiivisuus analysoitiin HepG2-soluissa 24 h transfektion jälkeen reportteriplasmidilla pMIR /CYP2J2-3’UTR tai pMIR (tyhjä vektori). C-D, täysipitkä sekvenssi CYP2J2-3’UTR sisältävät mutantin sitoutumiskohtia let-7b siementen alue luotiin perustuen villityyppisen pMIR /CYP2J2-3’UTR. Transfektoimme nämä konstruktit soluihin (MDA-MB-435 ja SK-MES-1) ja analysoitiin lusiferaasireportterilla toimintaa. Kuten odotimme, anna-7b ei vaikuttanut lusiferaasiaktiivisuus mutanttien verrattuna villin tyypin. E, kuusi mutantit transfektoitiin SK-MES-1-soluja, lisäksi antaa-7b tai satunnainen anna-7b. Lusiferaasiaktiivisuutta kuuden mutanttien ei tukahdutettu let-7b. Renilla Lusiferaasiaktiivisuudet käytettiin normalisoimaan tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05.

Anna-7b Antimikrobiainetta eksressoitumistasojen Endogeenisen CYP2J2 ja sen entsymaattisen aktiivisuuden in vitro

tutkimiseksi ulkosyntyisten let -7b proteiinin tason ja entsymaattinen aktiivisuus endogeenisen CYP2J2 proteiinien, tutkimme proteiinin tasot CYP2J2 HeLa, TCA-8113, SK-MES-1 ja MDA-MB-435-solujen käsittelyn jälkeen anna-7b: ssa 48 tuntia (100 nM). Western blot-analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen let-7b merkittävästi vaimentua ilmentymistä CYP2J2 neljä syöpäsolulinjoissa (kuvio 2A). Suhteellinen CYP2J2 ilmentyminen kvantifioitiin densitometrialla (kuvio 2B). Kuten kuviossa S1A ja B, western blotit osoittivat annoksesta riippuvaa vaikutusta let-7b ja anna-7b estäjä on CYP2J2 proteiinin ilmentymiseen. Ottaen huomioon epävakaus Eets, määritimme pitoisuus n stabiili metaboliitti 14,15-DHET soluviljelmässä media vahvistaa inhibition let-7b on entsymaattinen aktiivisuus CYP2J2. Tulokset osoittivat, että 14,15-DHET tasot vähenivät merkittävästi transfektio let-7b (kuvio 2C). Nämä tulokset osoittivat, että ihmisen CYP2J2 suoraan vaimentua by let-7b.

, proteiini taso CYP2J2. HeLa, TCA-8113, MDA-MB-435, ja SK-MES-1-soluja käsiteltiin let-7b tai satunnainen let-7b (100 nM) 48 tuntia. Proteiini taso CYP2J2 tutkittiin Western blot -analyysillä. B, proteiini taso CYP2J2 kvantifioitiin densitometrialla. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. C, n stabiili metaboliitti 14, 15-DHET HeLa, TCA-8113, ja MDA-MB-435-soluja määritettiin, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Solut käsiteltiin eksogeenisen HSA-let-7b tuotetun vähemmän Eets kuin niillä, joita hoidettiin random let-7b. Points, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05.

Anna-7b Vähentää syöpäsolujen kasvua ja indusoi apoptoosia suoraan downregulating CYP2J2

Olemme aiemmin raportoitu, että CYP2J2 stimuloi proliferaatiota karsinoomasolujen solut ja suojaa ihmisen karsinooman soluja apoptoosin [10]; niin se oli kiinnostavaa vaikutusten arvioimiseksi yli-ilmentymisen avulla, 7b soluproliferaatioon ja apoptoosiin, kun endogeenisen CYP2J2 estyi anna-7b. Käsittelimme HeLa, TCA-8113, SK-MES-1 ja MDA-MB-435-solujen eksogeenisen let-7b tai satunnainen anna-7b 48 tuntia. Lisääntyminen korko määritettiin kautta Cell-Light ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit (Ribobio, Kiina). Tulokset osoittivat merkittävää inhibitiota soluproliferaation let-7b. Esimerkiksi MDA-MB-435 ja SK-MES-1-solut, anna-7b vähensi solujen lisääntymistä 50% verrattuna negatiiviseen kontrolliin ja satunnainen anna-7b (kuvio 3A). Apoptosis, mitattuna anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys, lisääntyi merkittävästi soluissa, jotka on transfektoitu let-7b (kuvio 3B). Lisäksi eksogeeninen let-7b pieneni prosenttiosuus EDU-positiivisten solujen ja lisäsi apoptoottisten solujen HeLa ja TCA-8113-soluja (kuvio 3C ja D). Antaa lisää todisteita siitä, että vaikutukset let-7b ilme soluproliferaatioon ja apoptoosiin liittyi CYP2J2, transfektoitujen solujen let-7b hoidettiin C26 (10 uM) (erityiset CYP2J2 estäjä [12]) ja 14,15-EET (250 nM) 48 tuntia. Minimoida vähentämättä 14,15-EET takia itsehapettumisen, soluja stimuloitiin 14,15-EET tai vastaavan tilavuuden ajoneuvon (DMSO) 6 tunnin välein. Kuten odotettua, vaikutukset let-7b ilme soluproliferaatioon ja apoptoosiin tehostettiin C26 kumotaan 14,15-EET (kuvio 3E ja F). Lisäksi onko let-7b hoito vaikuttaa solujen kasvuun H9c2 (H9c2 solut eivät ole

CYP2J2

), käytimme Cell-Light ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit ja anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys mitata solujen lisääntymistä ja apoptoosia H9c2 soluja. Kuten kuviossa S2A ja B, paitsi soluproliferaatiota vaan myös solujen apoptoosin H9c2 soluja ei vaikuttanut anna-7b tai anna-7b estäjä hoitoa. Nämä tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen let-7b johti vähentynyt proliferaatio ja aktivoitua apoptoosia sinoomasolulinjoja.

, runsaudenmäärityksessä kautta Cell-Light ™ edu DNA Cell Proliferation Kit osoittaa vähentynyt proliferaatio nopeudella MDA-MB- 435 ja SK-MES-1-soluissa, joita käsiteltiin let-7b verrattuna käsiteltyjen solujen satunnainen let-7b tai valvontaa. Sininen-värjätyt solut värjättiin Hoechst, ja punainen olivat Edu lisätä-soluissa. Edu-positiiviset solut laskettiin (EDU-apuohjelman solua /Hoechst-värjättyjen solujen) x 100%. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. B, prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt MDA-MB-435 ja SK-MES-1-soluissa, joita käsiteltiin anna-7b. Apoptoosi mitattiin anneksiini V-FITC: tä (x-akseli) ja propidiumjodidivärjäys (y-akseli). Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen (prosentuaalinen solujen oikeassa yläkulmassa neljännekseen (anneksiini V-positiivisia, PI-negatiivinen) plus solujen alhaisen oikeassa neljänneksessä (anneksiini V-positiivisia, PI-positiivisia) yhteensä solujen määrä) annetaan alla asiaa kuvaaja. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. C-D, prosenttiosuudet Edu-positiivisten solujen ja apoptoottisten solujen analysoitiin HeLa ja TCA-8113 transfektoitujen solujen let-7b tai satunnainen anna-7b. E-F, MDA-MB-435 ja SK-MES-1-solut transfektoitiin let-7b käsiteltiin C26 (erityisiä CYP2J2 estäjä, 10 uM) tai 14,15-EET (250 nM). 48 tuntia myöhemmin, prosenttiosuudet Edu-positiivisten solujen ja apoptoottisten solujen analysoitiin. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. G, anna-7b yliekspressio vaikuttaa ilmentyminen kasvaimeen liittyvien geenien MDA-MB-35-soluissa. Anna-7b yliekspressio MDA-MB-435-solujen merkittävästi vaimentua PI3K, Pakt, ja Perk mutta kasvoi Bax ja nm-23 ilme. Esitetyt tiedot toistettiin kolme kertaa.

Tutkimme myös vaikutteita let-7b ilmentymistä koskevat proapoptoottiset proteiinin Bax ja etäpesäkkeiden proteiini nm-23 ja aktivoinnista PI3K /Akt ja MAPK signalointi reittejä, mikä tärkeitä rooleja P450 epoxygenase- ja EET välittämä kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden [10], [11], [12]. Huomasimme, että let-7b yliekspressio MDA-MB-435-solujen merkittävästi vaimentua PI3K, Pakt, Perk polkuja mutta kasvoi Bax ja nm-23 ilmentyminen (kuvio 3G). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös MDA-MB-435-solu, joka on käsitelty let-7b AGOMIR (kuvio S1C ja D). Emme kuitenkaan-7b ei vaikuttanut PI3K, Pakt, ja Bax of H9c2 soluja (kuvio S2C). Olemme arvelleet, että tämä johtuu H9c2 solut eivät ole

CYP2J2

. Nämä tulokset osoittivat, että tehostajavaikutuksen CYP2J2 kasvaimen muodostumiseen voitaisiin vaimentaa let-7b.

Expression taso CYP2J2 Proteiini ja anna-7b in Human Lung Cancer ja viereisissä Normaali Kudokset ne ovat käänteisesti verrannollisia

tutkia yhdistyksen välillä let-7b tason ja ilmaus CYP2J2 ihmisen karsinoomat, ilmaus CYP2J2 proteiinin ja anna-7b 18 pariksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä kudoksia ja viereisten nontumor kudoksissa tutkittiin western blot analyysi ja todellisen -Time RT-PCR, vastaavasti. Tulokset osoittivat, että CYP2J2 oli hyvin ilmaistu suurin syövän kudosnäytteiden verrattuna viereisen normaalien kudosten (kuvio 4A). Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään kypsän let-7b tasot 18 pariksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä kudoksia ja viereisten nontumor kudoksiin. Vaikka muutokset -ΔΔCT arvojen [- (ACt

ei-kasvainkudoksessa-ACt

syöpäkudoksessa)] olivat suhteellisen lieviä (-1,85-+5,4, 2,6 ± 1,27), kansi muutos (2

– ΔΔCT) let-7b ilmaisun välillä 18 pariksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä kudoksia ja viereisten nontumor kudokset oli merkittävä (,277-+42,22, 6,06 ± 2,43). Näin ollen tulokset osoittivat, että tasot kypsän let-7b merkittävästi vähentynyt 14 keuhkokasvaimia verrattuna niiden verrokkiin joukossa 18 tutkitusta näytteestä (kuvio 4B). Me tutkimme seuraavaksi korrelaatio let-7b ekspressiotason ja CYP2J2 proteiinin taso ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä kudoksiin. Ja on tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio let-7b ekspressiotason ja CYP2J2 proteiinin taso 18 sarjaa keuhkojen squamous kasvainten syöpä ja pariksi viereisen nontumor kudoksiin (kuvio 4C). Lisäksi olemme havainneet, että CYP2J2 oli käänteinen ekspressiotasot päästää-7b neljän pariksi ihmisen rintasyövän ja viereisten nontumor kudoksissa (kuvio 4D ja E). Ja anna-7b ilmentymistä SK-MES-1 ja MDA-MB-435-soluissa on esitetty kuviossa S3.

, ekspressiotasojen CYP2J2 keuhko- syöpä (C) ja viereisen nontumor kudosten (N) oli mitattuna Western blot-analyysi. B, vertailu ekspressiotasot let-7b keuhkojen syöpä- ja viereisten nontumor kudoksissa (n = 18). Vaikka muutokset -ΔΔCT arvojen [- (ACt

ei-kasvainkudoksessa-ACt

syöpäkudoksessa)] ovat suhteellisen lieviä (-1,85-+5,4, 2,6 ± 1,27), kansi muutokset let-7b ilmentymisen välillä 18 pariksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä ja viereisten nontumor kudokset ovat merkittäviä (+0,277-+42,22, 6,06 ± 2,43). C, suhde CYP2J2 proteiinia ja anna-7b ilmentymistä keuhkosyövässä ja pariksi viereisen nontumor kudoksiin. Ekspressiotaso CYP2J2 proteiinin lisääntynyt 13 18 sarjaa keuhkosyöpään verrattuna viereisiin normaalien kudosten (taitteen muutos 1). Kuten odotettua, anna-7b tasot olivat yleisesti vähennetty näissä kasvaimissa verrattuna viereisiin normaalien kudosten (taitteen muutos 1). D-E, ekspressiotasot CYP2J2 ja anna-7b rinta- syöpä- ja viereisten nontumor kudoksissa (n = 4). Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään kypsän let-7b tasolle. U6 snRNA ekspressiotaso käytettiin normalisoimaan suhteellinen let-7b tason. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05.

Anna-7b-välitteisen knockdovvn CYP2J2 kasvaimen kasvu estyy ja metastaasin

Lisäksi olemme tutkineet vaikutus kirjain- 7b kasvaimen kasvuun in vivo -mallissa. Voit luoda -tuumoriksenografti malli, 2 x 10

6 MDA-MB-435-soluja ihon alle oikeaan kylkeen nude-hiirten. Kaksi viikkoa injektion jälkeen, kun kasvaimet olivat kasvaneet noin 40 mm

3 let-7b ekspressiovektori pSilencer-let-7b injektoitiin hiirille annoksella 4 mg /kg: n häntälaskimoon joka 3 viikko. Kuten odotettua, hiirillä, joihin injektoitiin pSilencer-let-7b häntälaskimon kautta osoittivat merkittävää vähenemistä kasvaimen tilavuuden verrattuna kontrolleihin (kuvio 5A). Hoitojakson aikana, määritimme 14,15-DHET tason virtsassa nude-hiirten ja löytänyt vähentää merkittävästi 14,15-DHET in let-7b hoitoryhmässä kontrolleihin verrattuna (kuvio 5B). Lopussa Hoitojakson, anna-7b johti merkittävästi vähentynyt kasvaimen painoa, mutta kehon paino ei ole muuttunut (kuvio 5C). Olemme myös käsitelty MDA-MB-435 solun let-7b AGOMIR (150 nM) tai AGOMIR ohjaus 48 tuntia, ja sitten ruiskutettiin nämä solut oikeaan kylkeen nude-hiirten. Sen jälkeen, kun 4 viikkoa, ruumiinavaus tehtiin, ja kaikki kasvaimet per hiiri punnittiin. Anna-7b AGOMIR johti merkittävästi vähentynyt kasvaimen paino (kuva S4). Lisäksi taso kypsän let-7b validoitiin reaaliaikaisella RT-PCR; Tulokset osoittivat, että pSilencer-let-7b hoito johti merkittävään kasvuun sekä kasvaimen ja elinten (kuvio 5D ja E). Western blot-analyysi osoitti selvästi vähentynyt ekspressiotason CYP2J2 proteiinia ja merkittävästi lisääntynyt ekspressiotaso proapoptoottiset proteiinin Bax ja etäpesäkkeiden proteiini nm-23, anna-7b-käsiteltyjen hiirten verrattuna kontrolleihin (Kuva 5F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että let-7b voi estää ilmentymisen ja kasvaimen edistämiseksi toimintoja CYP2J2.

MDA-MB-435-solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen nude-hiirten tuottamiseksi hiirimallissa rintasyöpä. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiret saivat Let-7b hoito satunnaisesti. Let-7b ekspressiovektoriin (pSilencer-let-7b-plasmidi), injektoitiin hiiriin kautta häntälaskimoon annoksena 4 mg /painokilo joka 3 viikko. A, x-akselin on merkitty päivät pSilencer-let-7b hoitoa. Kasvaimen tilavuus mitattiin viikoittain ja laskettiin TV (mm

3) = pituus x leveys

2 x 0,5236. B, mittaus 14,15-DHET tason nude-hiirissä virtsassa suoritettiin ELISA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Points, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. C, keskimääräinen kasvaimen paino ja painon valvontaa ja anna-7b hoitoryhmissä kasvatuksen jälkeen 8 viikon ajan. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. *,

P

0,05 vs. kontrolli. D-E, ilmaus kypsän let-7b kasvaimissa ja ala elinten validoitiin reaaliaikaisella RT-PCR. Pylväät, keskiarvo kolmesta kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05. F, Western blot-analyysi osoitti muuttaminen ilmentymisen tason CYP2J2 proteiinin ja kasvaimen liittyvät geenit kasvaimen näytteestä.

Lisäksi arvioimme onko yli-ilmentymisen avulla, 7b vaikuttaa etäpesäke. Lopussa kokeen, pernat poistettiin ja viilto pystysuorassa laskea metastaattisen kasvaimen pesäkkeitä. Etäpesäkkeitä pitkittäisleikkaus perna oli nähtävissä paljaalla silmällä kuin kyhmyt. Havaitsimme merkittävä lasku keskimäärin pernan etäpesäkkeiden hiirillä ruiskutetaan pSilencer-let-7b verrattuna kontrolleihin (kuvio 6A). Olemme myös päättäneet, missä määrin imusolmukkeiden etäpesäkkeiden mittaamalla painon imusolmukkeet. Huomasimme, että injektio pSilencer-let-7b kautta häntälaskimoon vähensi keskipaino kainalon imusolmukkeisiin (kuvio 6B). Lisäksi histologista analyysiä jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys parafiinileikkeet osoittivat merkittävää eroa kateenkorvattomissa hiirissä, käsiteltiin let-7b ja hallintalaitteet (kuvio 6C ja D): let-7b hoito aiheutti merkittävän lisääntymistä nekroottisten alueiden kasvain ja perna. Verrattuna verrokkiryhmään, etäpesäkkeet focis olivat pienempiä ja vähemmän osissa pernan let-7b hoitoryhmässä. Lisäksi TUNEL värjäys kohdat osoittivat, että let-7b hoito johti merkittävään kasvuun TUNEL-positiivisten solujen kasvaimia ja hiirillä pernan (kuvio 6E ja F). Nämä tiedot osoittavat, että let-7b hoito voi estää kasvaimen etäpesäkkeitä.

A, keskimääräinen pernan etäpesäkkeiden kunkin ryhmän (n = 6). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. *,

P

0,05 vs. kontrolli. B, keskipaino kainalon imusolmukkeisiin kullekin ryhmälle. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. *,

P

0,05 vs. kontrolli. C-D, hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytymisen kasvain (C1, C2) ja pernassa (D1, D2). E-F, TUNEL värjäys kasvain (E1, E2) ja pernassa (F1, F2) kohdat.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet uuden mekanismin ohjaamalla kasvainta edistäminen funktio CYP2J2. Bioinformatiikan analyysi ennusti, että let-7b on potentiaalinen säätelijä

CYP2J2

geeni. Käyttämällä CYP2J2-ilmaisun syöpäsolun linjat ja kasvaimen xenografs malli, olemme osoittaneet, että ihmisen

CYP2J2

on posttranscriptionally säätelee let-7b ja että posttranskriptionaalisella asetus vastaa kasvaimen edistämisen funktio CYP2J2. Lisäksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä ja viereisten nontumor kudoksiin, havaitsimme käänteinen suhde anna-7b ja CYP2J2 ekspressiotasoja.

On käynyt ilmi, että MikroRNA säätelemään kohdegeenien sitoutumalla komplementaaristen alueiden n 3’UTR niiden kohdegeenien [26], mutta onko HSA-let-7b säätelee ihmisen CYP2J2 ilmaisua ei tunneta. Aiempi tutkimus on osoittanut, että let-7 säätelee RAS kautta 3’UTR [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa, Lusiferaasimäärityksiä osoitti, että let-7b tukahdutettu aktiivisuus reportteri-konstrukti, joka sisältää 3′-UTR-alueen CYP2J2 mRNA. Transfektio sinoomasolulinjoja kanssa let-7b ja injektio pSilencer-let-7b tuottamaan kypsiä let-7b in vivo laski CYP2J2 proteiinin ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että

CYP2J2

on posttranscriptionally säätelee negatiivisesti let-7b.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että let-7 saattaa toimia tuumorisuppressorina ja että alennettu anna-7 tasolla johtaa let-7-reagoiva geenin (cyclinD, RAS, MYC, jne.) yli-ilmentyminen kasvaimissa [22 ], [23], [24], [25]. Kanssa Western blot analyysissä ja reaaliaikainen RT-PCR: llä, osoitimme korkeampi ekspressio CYP2J2 proteiinin ja alempi ilmentyminen let-7b 18 pariksi ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpäkudoksiin verrattuna viereisen nontumor kudoksiin. Näin ollen, korkea ekspressio CYP2J2 proteiinin syövän kudoksissa voi johtua vähentynyt ilmentyminen anna-7b, ainakin osittain. Tietenkin, on todennäköistä, että toinen mekanismi (t) on mukana säätelyssä CYP2J2 ilmaisua. Edellisessä tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen CYP2J2 tai additing eksogeenisen Eets vähentynyttä apoptoosia ja lisäsi solujen proliferaatiota syöpäsolulinjoissa ja lisääntynyt kasvaimen kasvu ja keuhkojen etäpesäkkeiden hiiren ksenograftimallia [10]. Lisäksi olemme hiljattain havaittu, että yhdiste 26, selektiivinen estäjä CYP2J2 merkittävästi tukahdutettu kasvaimeen edistäminen funktio CYP2J2 [12].

Tässä tutkimuksessa olemme kuvattu uusi mekanismi tukahduttamista CYP2J2. Käsittelimme sinoomasolulinjoja kanssa let-7b ja totesi, että yli-ilmentyminen let-7b johti vähentynyt proliferaatio ja aktivoitua apoptoosia syöpäsolujen. Olemme myös havainneet, että pSilencer-let-7b hoito esti merkittävästi tuumorin kasvua -tuumoriksenografti malli. Vaikka downregulation CYP2J2 by ​​pSilencer-anna-7b ei häviämistä kasvainten, käänteinen korrelaatio ekspressiotaso CYP2J2 ja anna-7b ihmisen syöpäkudoksessa ja tehokkuutta estämään kasvaimen edistämiseksi toimintoja CYP2J2 paljasti mahdollista terapeuttista hyötyä päästää-7b ihmisen syövissä.

meidän edellisessä tutkimuksessa raportoimme että Eets suojaavat endoteelisolujen apoptoosin aktivoimalla fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt ja MAPK signalointireitteihin [25] . Esillä olevassa tutkimuksessa, yliekspressio let-7b tukahdutti ilmentymistä CYP2J2 proteiinin ja sen EET tuotteiden in vitro ja in vivo. Olemme myös havainneet, että let-7b voi estää proliferaatiota ja parantaa apoptoosin, ihmisen kasvainsolujen estämällä PI3K /Akt ja MAPK signalointireitteihin ja aktivoimalla proapoptoottiset proteiinin Bax ja etäpesäkkeiden proteiini nm-23, jotka molemmat ovat mukana in P450 epoxygenase- ja EET välittämä kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden [10]. Tuloksemme viittaavat siihen, että vaikutus CYP2J2 johdettujen EETS kasvaimen muodostumista välittämä let-7b. 11 jäsentä anna-7 perhe ovat samanlaisia ​​kohdegeenien ja toimintoja soluproliferaatioon koska korkea samankaltaisuus niiden sekvenssit [23], [28]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet vaikutusta let-7b ilmentymistä koskevat CYP2J2. Vaikutukset muiden jäsenten let-7 perhe CYP2J2 ilmaisun ja syöpäsolujen lisääntymistä on vielä tutkittava.

Yhteenvetona tietomme vahvisti, että let-7b ilmentyminen on usein pienentynyt keuhkojen levyepiteelisyövän syöpiä. Työmme myös, että ihmisen CYP2J2 on posttranscriptionally säätelee let-7b, joka johtaa korkean ilmentymisen CYP2J2 proteiinin ihmisen karsinoomia. Tutkimuksemme osoitti uuden mekanismin, jonka avulla CYP2J2- ja EET välittämä kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden liittyvät let-7b. Paitsi MYC ja RAS, anna-7b voi toimia tuumorisuppressorina estämällä CYP2J2.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi Review Board of Tongji Hospital ja Tongji Medical College. Palvelukseen aiheet säädetty kirjallinen lupa. Tutkimus noudattaa esitettyjä periaatteita Helsingin julistus. Kaikki eläin koemenettelyn noudattanut ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals” julkaiseman Yhdysvaltain National Institutes of Health.

Solulinjat

Ihmisen kohdunkaula adenokarsinoomasolulinja HeLa, ihmisen hepatoma maksan HepG2, ihmisen kielen okasolusyöpä TCA-8113, ja ihmisen keuhkojen squamous syöpäsolu SK-MES-1 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2 vakio kosteus. MDA-MB-435 ihmisen rinsyöpäsolulinja saatiin myös American Type Culture Collection, ja kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja pidettiin 37 ° C: ssa 95% ilma /5% CO

2 .

MicroRNA Target Prediction

RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/rnahybrid_submit) käytettiin miRNA tavoite ennustus. Löysimme neljä mahdollinen kohde sivustoja (site I, site III sivuston IV, ja sivusto VI) 3’UTR ihmisen CYP2J2 varten let-7b. Lisäksi vertasimme myös let-7b sekvenssin täyspitkän sekvenssin CYP2J2-3’UTR kanssa DNAMAN ohjelmisto (LynnonBiosoft, Quebec, Kanada).