Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynekologisia maligniteetti, ja munasarjojen selvä solukarsinooman alatyyppi (Occa) osoittaa erityisen huono vaste tavanomaiseen hoitoon. Parannuksia munasarjasyövän tuloksia, erityisesti Occa, voitaisiin odottaa selkeämpi käsitys molekyyli patologian, jotka saattavat ohjata strategiat aikaisemmin diagnoosin ja tehokkaan hoidon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Cell -SELEX tekniikkaa käytettiin kehittämään uusia molekyylinäytteitä munasarjasyöpä solun pinnan markkereita. Kaikkiaan kolmetoista aptameereillä K

d’s munasarjasyöpään solujen pico- ja nanomoolialueella saatiin. Esitutkinta tavoitteista näiden aptameerit ja niiden sitovien ominaisuuksien suoritettiin myös.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme valinneet joukon Aptameerien jotka sitoutuvat erilaisia ​​munasarjasyöpä, mutta ei kohdunkaulan syöpä. Vaikka sitoutuminen muihin syöpäsolulinjoilla havaittiin, nämä aptameerit voisi johtaa tunnistamiseen biomarkkerit, jotka liittyvät syöpään.

Citation: Van Simaeys D, López-Colón D, Sefah K, Sutphen R, Jimenez E, Tan W (2010) tutkimus Molecular Recognition Aptameerien Selected kautta munasarjasyöpäsolu-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10,1371 /journal.pone.0013770

Editor: Cameron Neylon, University of Southampton, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 03 toukokuu 2010; Hyväksytty: 06 lokakuu 2010; Julkaistu: 01 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Van Simaeys et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos National Institutes of Health (NIH) tukea (R01GM079359, R01 CA133086, R01-CA106414). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi yleisin syöpä naisilla [1], ja on korkein kuolleisuus kaikista gynecologic maligniteetti. Tämä tauti on ominaista muutaman varhain oireita, esitys on edennyt pitkälle useimmissa tapauksissa ja huonosta eloonjäämisasteesta [2] – [8]. Ennuste on erityisen huono potilailla, joilla on munasarjojen selvä adenokarsinooman (Occa), joka on usein resistentti standardi platina-kemoterapian [6] – [10].

Yleisimmin käytetty seerumi biomarkkeri kliinistä diagnoosia ja ennuste on munasarjasyöpä antigeeni 125 (CA-125). CA-125-arvo on kohonnut noin 90% myöhäisen vaiheen tapauksia epiteelin munasarjasyöpä (vaiheet 3 ja 4). Se on kuitenkin vain koholla 50-60%: lla naisista, joilla alkuvaiheen tauti ja myös koholla useita lieviä olosuhteita [2], [5], [7], [11] – [13].

hyödyntäminen aptameerien on runsaasti potentiaalia tunnistaakseen uusia biomarkkereita. Aptameerit, jotka ovat koettimia, jotka kykenevät sitoutumaan spesifisesti solun pinnan markkereita ilmaistaan ​​suunnattu tuumorisoluissa [14] – [21], ovat lyhyitä yksijuosteisia oligonukleotideja noin 100 nt. Ne valitaan suuri kombinatorisista altaat sekvenssien Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen Enrichment (SELEX) niiden kyky sitoutua tavoitteisiin, jotka voivat vaihdella pienistä molekyyleistä proteiineihin tai polysakkarideihin, samoin kuin kasvainsoluja [16] – [19 ], [21] – [23]. Aptameerit on hyvin määritelty tertiäärisiä rakenteita, jotka määräävät selektiivisyyden tavoitteensa.

kohdespesifisyys ja affiniteetti aptameerien ovat samanlaisia ​​kuin vasta-aineet, mutta joissa on useita etuja verrattuna vasta-aineiden kliiniseen käyttöön. Aptameerit voidaan syntetisoida kemiallisesti lyhyessä ajassa suhteellisen alhaisin kustannuksin, mikä mahdollistaa paremmin erä-erien toistettavuus ja helpompi sisällyttäminen kemiallisia muutoksia. Koska aptameerit ja solut valitaan ilman tietoa kohde-molekyylien, jotka on valittu aptameerit voidaan käyttää tunnistamaan uusia solupintamarkkerien syöpäsolujen [14], [16] – [18], [20], [24] – [27] .

tässä työssä yhteensä 13 aptameereillä valittiin kaksi mallia munasarjasyöpäsolu tukijalkaa: Occa linja TOV-21G [28] (10 aptameerit) ja munasarjojen serous adenokarsinoomaa linja CAOV-3 [29 ] (3 aptameerien). Solun pinnan tavoitteita aptameereillä myös lyhyesti tutkittu. Alustava tutkinta aptameerit ”tavoitteet ja sitovat ominaisuudet suoritettiin myös.

Tulokset ja keskustelu

Kaksi mallia munasarjasyövän solulinjoissa valittiin valinnassa munasarjasyöpä aptameerit: Tällä Occa solulinja TOV -21G ja munasarjojen serous adenokarsinoomasolulinjaan CAOV-3. Jotta voidaan tunnistaa aptameerejä, jotka sitoutuvat spesifisesti munasarjasyöpäsoluja, kohdunkaulan syövän solulinja HeLa käytettiin vasta-valintaa. SELEX menettely TOV-21G on kuvattu alla lyhyesti. Yksityiskohtainen kuvaus löytyy kokeellisessa osassa.

Aloita valintaprosessi, 20 pmol naiivi kirjasto rikastettiin peräkkäisellä sitoutumista TOV-21G yksisoluiset kerrokset. Sekvenssit näytetään ei-spesifinen sitoutuminen yleiseen solun pinnan markkereita poistettiin inkuboimalla rikastetun poolin HeLa-solujen kanssa (kierrosta 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). Eluoitu allas jokaisessa kierroksen SELEX monistettiin PCR: llä, minkä jälkeen ssDNA altaat kiinnostava otettiin talteen ja seurattiin rikastamiseen kohti TOV-21G virtaussytometrialla. Koska valittu poolit rikastettu sekvenssejä, jotka tunnistavat ja sitoutuvat kohde-solulinja, joka on fluoresenssin kasvun signaali havaittiin (kuva 1a). Mutta yrittää jättää vasta-valinta kierroksilla 13-19 johti rikastukseen varten HeLa-sitovia sekvenssejä. Sekvenssit sitoutuminen HeLa solut onnistuneesti poistettiin vastavalinta myöhemmissä kehitysvaiheissa, kun taas rikastamisen kohti kohdesolulinjana pidettiin (kuva 1b). Jälkeen 22 kierrosta SELEX, joka on rikastettu allas, joka sitoutuu spesifisesti mallin Occa solulinjassa, mutta hieman HeLa-soluja, saatiin (kuvio 2). Siten allas onnistuneesti rikastettiin sekvenssit sitoutumisen pinnan markkereita ilmaiseman mallin Occa solulinjassa, mutta ei kohdunkaulan syöpäsolut.

EN) rikastaminen TOV-21G solujen B) marginaalinen sitova vastaavien altaat HeLa-solut. Tekemällä vastavalinta, sekvenssit sitoutumisen HeLa poistettiin.

Negatiivinen kontrolli näissä sitoutumisen määrityksissä oli PE /Cy5-leimatun random kirjasto. C) Soluja inkuboitiin vaihtelevilla PE-Cy5-leimatun aptameerin kahtena kappaleena. Fluoresenssin intensiteetin peräisin tausta sitova kullakin pitoisuudella vähennettiin fluoresenssin voimakkuuden keskiarvolla vastaavan Aptameerin.

valmistumisen jälkeen valintaprosessin, kolme allasta valittiin ja jätetään sekvensointi: viimeinen pool (pyöreä 22), edellinen allas (pyöreä 21) ja allas osoittaa minimaalinen rikastus (pyöreä 13). Allas sekvensointi käytettiin auttaa tunnistamaan aptameeriin ehdokkaita tuottamalla suuria määriä sekvenssejä. Tämä määrä sekvenssejä (tässä vähintään 2000 dollaria pool) on riittävän suuri tunnistamisen Aptameerien että vain pieni edustus allas (eli alle 1%). Kuten voidaan nähdä taulukosta 1, valitaan aptameerit olivat todellakin läsnä jo minimaalinen rikastaminen havaittiin. AptTOV1 koon prosenttiosuus laski SELEX edelleen, mikä on huomattava ottaen huomioon korkea affiniteetti tämän aptameerin. Tämä ongelma on havaittu myös muita valintoja [30]. Muut aptameerit osoittavat johdonmukaisesti kasvettua prosenttimäärällä kuin rikastamiseen lisääntynyt. Tulokset AptTOV6 sisältyvät osoittaa, että jopa suhteellisen pienet perheet voivat johtaa Aptameerien.

Sekvenssit linjassa perheisiin mukaan sekvenssihomologia. Määrä homologien verrattiin poikki eri sekvensoitu altaat vahvistaa niiden rikastumista valintamenettelyä käyttäen perus bio- informatiikan. Kymmenen sekvenssit osoittavat parhaiten homologiaa koko allas valittiin aptameerin ehdokkaita, syntetisoitiin ja testattiin sitoutumisen mallin munasarjasyövän solulinjoissa. Kaikki ehdokkaat osoittivat sitoutumisen TOV-21G, joissa Sitoutumisaffiniteetit että pico- nano-molaarinen alue (taulukko 2). Tämä osoittaa mahdollisen seuraavan sukupolven sekvensointi SELEX tulla voimakas ja toistettava menetelmä kehittämiseen aptameerit.

Kuten on esitetty taulukossa 2, aptameerit aptTOV1 (K

d = 0,25 ± 0,08 nM) ja aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) sitoutuvat hyvin tiukasti TOV-21G soluissa. Kuten taulukossa 2 on esitetty, sekä aptameerit voidaan erottaa TOV-21G HeLa-soluista.

sitoutuminen valitun aptameerit testattiin eri adenokarsinooma solulinjojen, sekä muiden syöpien solulinjoissa, kuten on esitetty Taulukko 2. Viisi aptameerit valitun vastaan ​​TOV-21G osoitti sitoutumista CEM-soluja (akuutti lymfaattinen leukemia), kun taas yksikään aptameerien sitoutuneen Ramos-solujen (Burkittin lymfooma) tai HL-60 (akuutti promyelosyyttinen leukemia). Kaikki saadut aptameerien sitoutuvat peräsuolen adenokarsinooma (HCT-116) ja glioblastooma (A172). Aptameerejä saatu TOV-21G eivät sitoudu DLD-1 (Dukes ’C-tyypin peräsuolen adenokarsinooma), kun taas aptameerit peräisin CAOV-3 ei sitoutuvat tässä solulinjassa. Tämä toiminta on samanlainen kuin aiemmissa tehty työ laboratoriossamme.

Koska molemmat valinnat pidettiin 4 ° C: ssa, valitut aptameerit testattiin fysiologisissa olosuhteissa. Aptameerejä inkuboitiin kohdesolulinjana 37 ° C: ssa ja 4 ° C: ssa ja niiden sitoutuminen mitattiin. Kaikki aptameerit osoittivat samanlaisia ​​sitova 4 ° C: ssa ja 37 ° C (esim aptTOV1 kuviossa 2a), mikä viittaa siihen, että niillä on potentiaalia in vivo.

tutkimiseksi luonne kohdemolekyylin kunkin aptameerin, sitovat kunkin aptameerin testattiin sen jälkeen kun kohdesolujen proteaasit trypsiini tai proteinaasi K: Kuten voidaan nähdä kuviosta 3a, aptTOV1 osoittaa selvää sitoutumisen häviötä TOV-21G proteaasikäsittelyn jälkeen. Sama käytös havaittiin myös kaikkien muiden aptTOV Aptameerien. Mielenkiintoista on, että toinen malli solulinja, CAOV-3, DOV3 ja DOV4 säilyttivät sitova proteaasikäsittelyn jälkeen (kuvio 3b), mikä viittaa siihen, että nämä aptameerit ei saa sitoutumista solun pinnan membraaniproteiineja, vaan toiselle solunpintamarkkeri (eli hiilihydraatteja tai lipidejä). Kumpikaan DOV3 eikä DOV4 sitoutuu testattu leukemiasoluja (taulukko 3).

) N: o sitoutuminen havaittiin aptTOV1 ja trypsinoitiin TOV-21G-soluja. B): n sitoutuminen DOV 3 ja 4 CAOV-3-soluja ei vaikuttanut proteaasin hoitoon. Kaikki muut aptameerit oli sama ongelma kuin edustettuina a).

Yhteenvetona olemme valinneet joukon Aptameerien suurella affiniteetti munasarjasyöpäsoluja, kuten Occa (TOV-21G) ja vakavien adenokarsinooma (CAOV-3). By vastavalinta vastaan ​​HeLa-solujen, aptameerit voidaan erottaa munasarjasyöpä kohdunkaulan syöpään valittiin. Erityisesti AptTOV 1 osoitti hyvin korkea affiniteetti TOV-21G, joiden K

d 250 pM.

Koska rajallinen määrä biomarkkereita munasarjasyövän tällä hetkellä saatavilla, aptameerit saada näistä valinnoista on mahdollisuudet parantaa diagnoosia ja hoitoa tätä tappavaa tautia. Koska aptameerit sitovat myös hyvänlaatuisia kystia (taulukko 3) aptameerit ei voida käyttää tunnistamaan munasarjasyöpään

sinänsä

. Koska aptTOV apamers eivät sitoudu syöpä samanlainen etiologiasta (CaOV3) ja jättää HeLa, ne on vielä potentiaalia tuottaa paremman käsityksen patologian munasarjasyöpä. On havaittu, että on olemassa huomattavia eroja proteomiin vakavien ja selkeä solujen munasarjasyöpä [31]. Tavoitteet Näiden aptameerit ovat todennäköisimmin sääteli tai vaiennettu näissä kahdessa solussa mallia. Lisäksi AptTOV aptameerit osoittavat sitoutumista syöpäsolulinjoissa eri ei-liittyviä syöpiä (taulukko 3), ja jotkut AptTOV aptameerit myös sitoutua CEM-soluja. Tämä tulos viittaa siihen, että aptameerit saatu tämän SELEX voidaan käyttää profilointiin ekspression membraaniproteiinien eri syöpiä. Tunnistaminen tavoitteet valitun aptameerien odotetaan valottaa taustalla olevien mekanismien mukana.

Löytö kaksi aptameereillä jotka olivat epäherkkiä proteaasidigestion on kiehtova. Lisäksi, niiden sitoutuminen kaikkien testattujen adenokarsinoomasoluja, mutta ei mitään leukemian solulinjoja, ehdottaa mahdollisia edelleen valaista alla molekyylipainon erot näiden syöpätyyppien. Lisätutkimuksia on perusteltua tunnistaa tavoitteet näiden aptameerit ja arvioida niiden suorituskykyä kliinisissä näytteissä.

Materiaalit ja menetelmät

instrumentointi ja reagenssit

Kaikki oligonukleotidit syntetisoitiin standardin fosforamidiittia kemiaa käyttäen 3400 DNA-syntetisaattorilla (Applied Biosystems) ja puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC: llä (Varian Prostar). Kaikki PCR sisälsivät 50 mM KCl: a, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,0 mM MgCl

2, dNTP: t (kukin 2,5 mM), 0,5 uM kutakin aluketta, ja Hot start Taq DNA-polymeraasia (5units /ul ). PCR suoritettiin Biorad Thermocyclerissä ja kaikki reagenssit hankittiin Takara. Seuranta pool rikastamisen luonnehdinta valitun aptameerejä, ja tunnistaminen kohdeproteiinin määritykset suoritettiin virtaussytometrisellä analyysillä käyttäen FACScan sytometrillä (BD Immunocytometry Systems). Trypsiini ja proteinaasi K ostettiin Fisher Biotech. Kuvantamisen solujen suoritettiin Olympus FV500-IX81 konfokaalimikroskoopilla (Olympus America Inc., Melville, NY). DNA-sekvenssit määritettiin Genome Sequencing Services Laboratory yliopistossa Floridan käyttämällä 454 sekvensointi (Roche).

Soluviljely ja puskureita

CAOV-3, HeLa, Hs832 (C) T ja TOV-21G-solulinjat, joissa on saatu American Type Cell Culture (ATCC). CAOV-3 ja TOV-21G munasarjasyövän solulinjoissa jossa ylläpidetään viljelmässä MCBD 105: Medium 199 (01:01); HeLa-solulinjaa viljeltiin RPMI-1640; ja Hs832 (C) T-solulinjaa viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM). Kaikki media, jossa oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 UI /ml penisilliiniä-streptomysiiniä. Muut solulinjat, joita käytetään selektiivisyyden määrityksissä sisältyvät CEM (T-soluleukemia), Ramos (Burkittin lymfooma), HCT-116, DLD-1, HT-29 (peräsuolen adenokarsinooma), NCI_H23 (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) ja A172 (glioblastooma ), jotka kaikki viljeltiin mukaan ATCC vaatimukset. Kaikkia solulinjoja, joissa inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä.

valinnan aikana, solut pestiin ennen ja jälkeen inkubaation pesupuskurilla (WB), joka sisälsi 4,5 g /l glukoosia ja 5 mM MgCl

2 Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jossa kalsiumkloridia ja magnesiumkloridia (Sigma). Sitomispuskuria (BB), joita käytetään valintaa valmistettiin lisäämällä hiivan tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma) ja BSA: ta (1 mg /ml) (Fisher) pesupuskuriin taustan vähentämiseksi sitovia.

SELEX kirjasto ja alukkeita

HPLC-puhdistettu kirjasto sisälsi satunnaissekvenssisegmentti 40 nukleotidin (nt) reunustavat 20-nt alukehybridisaation sites:

(5′- ATC CAG AGT GAC GCA GCA (N)

40 TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3 ’) ja (5’-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (N)

40 AGA GTT CAG GAG AGG CAG GT-3′). Eteenpäin-alukkeet leimattiin 5′-FITC ja reverse-alukkeet leimattiin 5′-biotiinilla.

In vitro cell-SELEX

Tässä tutkimuksessa, TOV-21G käytettiin kohdesolulinjana ja HeLa käytettiin vasta-valintaa. Ensimmäisen kierroksen, soluja inkuboitiin 20 pmol naiiveja ssDNA kirjaston liuotetaan BB. Sillä myöhemmillä kierroksilla, 50 pmol rikastettua altaan käytettiin inkubaation liukenee myös BB. Ennen inkubaatiota, ssDNA-poolin jääneen denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja jäähdytettiin nopeasti jäillä 5 minuutin ajan, jotta kukin sekvenssin muodostamiseksi vakain sekundaarisen rakenteen.

Solut pestiin kahdesti ( 2 min), jossa WB ja inkuboitiin DNA-poolilla, jäällä tasoravistelijalla 30 min. Myöhemmissä valintakierroksilla solut pestiin lisääntynyt tiukkuuden poistamiseksi heikosti sitoutuvat sekvenssit (suuremman määrän pesee ja lisääntynyt pesuaika, korkeintaan 5 min). Sitoutunut sekvenssit eluoitiin 500 ul: aan BB kuumentamalla 95 ° C: ssa 15 min, jäähdytettiin jäillä 5 min ja sentrifugoitiin 14000 rpm 2 min.

sisältävä supernatantti DNA-sekvenssit inkuboitiin sitten negatiivinen solulinja suorittaa vähentämällä yleisesti sekvenssejä, kuten edellä on kuvattu. Jäljellä olevat sekvenssit monistettiin PCR: llä käyttäen FITC- ja biotiini-leimattuja alukkeita. Monistukset suoritettiin 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s, minkä jälkeen lopullinen laajennus 3 min 72 ° C: ssa. Valittu tunne ssDNA erotettiin biotinyloitu antisense ssDNA by streptavidiinipäällystetyille sefaroosihelmet (Amersham Bioscience). SsDNA eluoitiin sefaroosihelmien sulattamalla 0,2 M NaOH-liuoksella.

rikastuminen spesifiset sekvenssit määritettiin käyttäen virtaussytometriaa, kuten jäljempänä selitetään. Kun taso rikastamiseen saavutti tasanteen, altaat kohteisiin jätettiin sekvensointiin. Aptameeriä valinta varten CaOV3 solulinjan suoritettiin käyttäen samaa protokollaa, mutta 1 minuutin trypsinaation askel käytettiin keskeyttää solujen ennen lisäämistä altaat. Lisätietovarasto S1 ja S2 sisältävät Clustal tietoja linjaukset jokaisen valinnan (lopullinen pool).

Affinity opinnot: Flow fluorometrilaitteen analyysi määrittämiseksi sitoutumisaffiniteetin

määrittämiseksi sitomisaffiniteettien aptameerejä, kohdesolut (5 x 10

5) inkuboitiin eri pitoisuuksien 5′-biotiinileimattua aptameerit jäissä 20 min 100 ul: aan BB. Sitten solut pestiin kahdesti 500 ui BB, ja suspendoitiin 100 ul: aan BB, joka sisälsi streptavidiini-PE-Cy5.5. Sitten solut pestiin kahdesti 500 ui WB, ja suspendoitiin 200 ul: aan BB virtaussytometrianalyysiä, käyttäen 5′-biotiinileimattua satunnaisessa järjestyksessä negatiivisena kontrollina. Kaikki kokeet sitoutumisen määritykset toistettiin vähintään 2 kertaa. Spesifisen sitoutumisen voimakkuus laskettiin vähentämällä keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti taustan sitova keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus aptameerit. Tasapainodissosiaatiovakio (K

d) Fluoresoivan ligandin saatiin sovittamalla käyrä spesifisen sitoutumisen intensiteetti versus (Y) aptameeriä pitoisuus (X) yhtälön Y = B

maxX /(K

d + X) käyttäen SigmaPlot. (Jandel, San Rafael, CA). Lisätietovarasto S3 sisältää virtauksen tiedot kaikista kokeista esitetään tässä artikkelissa.

valikoivuus ja spesifisyys

määrittämiseksi soluspesifisyys valitun aptameerien, solulinjojen HeLa, K562, H23, H69 , A172, HL-60. HT-29, Ramos ja CEM käytettiin sitoutumiskokeissa virtaussytometrialla, kuten on kuvattu edellä.

Lämpötilan vaikutus aptameerin sitova

aptameerin valintaprosessi ja kaikki sitoutumisen määritykset suoritettiin jäätä. On havaittu, että jotkut aptameerit valitun alemmissa lämpötiloissa ei voi sitoutua hyvin 37 ° C: ssa [26], mikä johtaa huonoon suorituskykyyn fysiologisissa olosuhteissa. Sen varmistamiseksi, sitovia vakautta, aptameerit inkuboitiin kohteena 37 ° C: ssa, ja fluoresenssi-intensiteetti määritettiin virtaussytometrialla. Aptameerit inkuboitiin jäillä käytettiin positiivisena kontrollina.

Proteaasidigestio määritys

Target soluja (5 x 10

5) on irrotettu käyttämällä ei-entsymaattista soluhajotusprosessin ratkaisu. Sekoittamisen jälkeen suspension solut pestiin 3 ml: lla PBS: ssä ja inkuboitiin sitten 1 ml: lla 0,05% trypsiiniä /0,53 mM EDTA HBSS tai 0,1 mg /ml proteinaasi K: PBS: ssä 37 ° C: ssa 1, 5, 15, 30 ja 60 minuuttia. Puhdasta FBS lisättiin sammuttamiseksi proteinaaseille. Kun oli pesty 2 ml: lla BB, käsiteltyjen solujen käytettiin sitoutumismääritykset, kuten edellä on kuvattu.

tukeminen Information

Data S1.

Allignment lopullisen TOV allas.

doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s001

(1,13 MB TXT) -iin Data S2.

Allignment lopullisen CaOV3 allas.

doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s002

(0,20 MB TXT) -iin Data S3.

tiedosto sisältää virtatiedot luvut tässä artikkelissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s003

(3,69 MB ZIP) -iin Data S4.

Legend määrään ansioita. Tämä luku oli ohjenuoranamme määrittää määrän ansioita syötäväksi 3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s004

(0,04 MB PDF) B

Kiitokset

Kiitämme Drs. Parag Parekh ja Tahir Bayrac varten monia hyödyllisiä tieteellisiä keskusteluja, jotka vaikuttivat tähän työhön, herra George Ansoaunoor teknistä apua. Kiitämme myös tohtori Kathryn Williams hänen kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen. Kiitämme DNA: n sekvensointi ydin, ICBR, yliopistossa Floridassa.