Krooninen sairaus

tiivistelmä

Homeobox D10 (HoxD10) näyttelee tärkeä rooli erilaistumista alkion solujen ja etenemisen rintasyöpä. Edellisessä raportti osoitti, että insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini-3: sta (IGFBP3) säädeltiin HoxD10 mahasyövän soluissa; kuitenkin, toiminnalliset roolit ja taustalla mekanismeja IGFBP3 mahasyövän jää epäselväksi. Tässä olemme huomanneet, että ilmentyminen IGFBP3 ilmentyivät jälkeen ektooppinen ilmentyminen HoxD10 mahalaukun syöpäsoluja. Kromatiinin immunosaostus määritys osoitti, että HoxD10 sidottu kolmen mahdollisen alueille IGFBP3 promoottorin. Eksogeeninen HoxD10 merkittävästi parannettu aktiivisuus lusiferaasireportteri sisältävät näitä sitovien alueiden mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi tiedot osoittivat, että kaikki nämä sitoutumiskohdat oli Hox sitova osa ”TTAT”. Immunohistokemiallinen värjäys tulokset paljastivat, että IGFBP3 ilmentyminen merkitsevästi vaimentua 86 mahalaukun adenokarsinooman kudoksissa suhteessa niiden viereiseen ei-syöpä kudoksiin (p 0,001). Lisäksi IGFBP3 ilme oli merkitsevästi pienempi mahakasvaimen kanssa imusolmuke etäpesäke verrattuna ilman imusolmuke etäpesäke (p = 0,045). Potilaat, joilla on korkea ilmentymistaso IGFBP3 suotuisasti 5 vuotta kokonaiselinaikaa (p = 0,011). Knockdown IGFBP3 nopeutetun mahasyövän solumigraatioon ja invaasion ja indusoi ilmentymistä invasiivisen tekijät, kuten MMP14, uPA ja uPAR. Siten meidän tiedot viittaavat siihen HoxD10-kohdegeenin IGFBP3 voi vähentää mahan syöpäsoluinvaasiota ja suosii selviytymisen mahasyöpäpotilaista.

Citation: Xue M, Fang Y, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et ai. (2013) IGFBP3, transkriptionaalisen Tavoite Homeobox D10, korreloi ennuste mahasyövän. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2013 Hyväksytty: 13 lokakuu 2013; Julkaistu: 27 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Xue et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81302070, 81272678, 81071961) (https://www.nsfc.gov.cn), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) ja Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja nykyään on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1]. Lähes puolet mahan Caner potilaat ovat jo edennyt myöhäisessä vaiheessa kanssa imusuonten tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä diagnoosin ja menettää mahdollisuuden leikkaus [2]. Näillä potilailla on huono tulos ja viiden vuoden pysyvyys niille, joilla etäpesäkkeiden on alle 5% [3]. Etenemisen mahalaukun syövän pidetään monivaiheinen prosessi, johon liittyy aktivointi onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressorigeeneille. Olemme aiemmin esitetty, että homeobox D10 (HoxD10) toimi tuumorisuppressorina tukahduttamalla kasvaimen kasvu ja invasiivisuus, jonka epigeneettiseltä vaiennettu mahasyövän [4].

HoxD10 geeni kuuluu homeobox superperheen, jotka koodaavat transkriptiotekijät ja käyttämään toimintoja pääasiassa aktivoinnin tai tukahduttamisen alavirran kohdegeenien [5]. Aminoterminaalinen käsivarsi Hox homeodomeenin on useita keskeisiä yksimielisyys sitovia elementtejä, kuten TTAT, TAAT ja TTAC [6,7]. Esimerkiksi HoxC8 sitoutuu näihin elementtejä promoottorialueita ja moduloi transkriptiota toimintaa pedf, NCAM, Zac1, Opn ja Cdh11, määritettynä korkean koko kromatiinin immunosaostusmäärityksissä ja globaalin HoxC8 DNA-sitoutumiskohdan analyysi [7]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että HoxD10 estää angiogeneesiä ja soluliikkuvuus endometriumin syöpä (EY) [8] ja heikentää kennon invasiivisuus maha- ja rintasyöpiä [4,9]. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismeista, miten HoxD10 kykenee sen toimintoja syövän synnyn ja syövän etenemiseen. Olemme järjestelmällisesti läpi kaikki mahdolliset kohteet HoxD10 cDNA microarray ja tunnistettu useita geenejä, mukaan lukien insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini-3: sta (IGFBP3), joka voi olla vastuussa kasvaimen estävä vaikutus HoxD10 mahasyövän [4].

IGFBP3 on suuri IGFBP laji liikkeessä, sitova yli 75% kiertävän insuliinin kasvutekijän I (IGF-I) [10]. Se voisi estää soluproliferaatiota ja aiheuttaa solujen apoptoosin useiden syöpätyyppien, kuten eturauhas- ja mahasyöpä [11,12]. Useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että IGFBP3 vaimentaa invasiivisuus kohdun limakalvon syövän (EY) soluihin [13], etäpesäke eturauhassyövässä [14], ja angiogeneesiä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [15]. Yleisesti todettiin, että IGFBP3 voivat estää sitovan alueen IGF-I: sen reseptoriin IGF-IR, mikä poistaa vaikutus IGF /IGF-IR-akselilla. Lisäksi riippuvuuden IGF /IGF-IR-akselilla, on olemassa vaihtoehtoisia IGF /IGF-IR riippumaton ja tumaansiirtymiseen tavalla [10]. Monet tekijät on selkeytetty säätelemään IGFBP3, mukaan lukien retinoiinihappo, tuumorinekroositekijä-α, trikostatiini A, caudal tyypin homeobox 2 (CDX2) ja metylaatiostatuksen itsestään [10,16]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että IGFBP3 oli yläreguloituja AGS ja MKN28 solut yli-ilmentävät HoxD10 [4]. Kun otetaan huomioon promoottorialue IGFBP3 on useita mahdollisia sitoutumiskohtia HoxD10, ennustaa PROMO, ohjelma ennustamisessa transkriptiotekijän sitoutumiskohtien [17], HoxD10 saattaa suoraan vuorovaikutus IGFBP3 säätelyyn mahalaukun syöpäsoluinvaasiota. Selvittäminen Tämän verkon antaisi edelleen oivalluksia rooliin IGFBP3 mahasyövän.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet, että HoxD10 voi sitoutua suoraan promoottorialueiden IGFBP3 mahdollisesti kautta TTAT elementti, jolloin transkriptionaalisesti säätelee sen ilmentymistä mahasyövässä. Lisäksi ekspressiotason IGFBP3 usein vaimentua mahasyövän kudosten ja liittyy yleiseen eloonjäämiseen, viittaa siihen, että IGFBP3 on tärkeä rooli mahalaukun syövän etenemisessä. Toiminnallisesti IGFBP3 hillitsevän muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja, ainakin osittain, säätelemällä näiden invasiivisia tekijöistä, kuten metalloproteinaasi-14 (MMP14) ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA).

materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kahdeksan mahasyövän solulinjoissa (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 ja SGC7901) saatiin Riken Gene Bank (Tsukuba, Japani) ja American Type Culture Collection (Manassas, USA). Yksi hyvänlaatuisen mahalaukun solulinja (GES-1) saatiin Beijing Institute for Cancer Research (Peking, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Holly lehtiä, Huzhou, Kiina), ja inkuboitiin 5% CO

2, 37 ° C: ssa ja 95%: n kosteudessa.

rakentaminen IGFBP3 lusiferaasireportteri plasmidit

Kolme eri fragmenttien promoottorialue IGFBP3, mukaan lukien -2282-56 bp (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 sitoutumiskohdan I, HBSI) ja -1727 ~ -943 bp (HBSII), monistettiin PCR: llä käyttäen genomista DNA: ta HEK-293T-villi solujen templaattina. HBSI käsittää HBS1 ja 2, HBSII sisältää sekä HBS3, 4 ja 5, joissa HBS1-5 on ennustettu PROMO (https://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS alukesekvenssit olivat seuraavat: pIGFBP3, 5′-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 ’ja 5′-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3′; HBSI, 5’-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 ’ja 5′-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3′; HBSII, 5’-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 ’ja 5′-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3’. PCR-fragmentit ligoitiin PGM-T-vektoriin (Tiangen, Peking, Kiina), pilkottiin Kpnl /Bglll (Promega, Madison, USA) ja sitten alakloonattiin Kpnl /Bglll sivustoja pGL3-perusvektoriin (Promeg) tuottamiseksi pGL3-pIGFBP3-perus lusiferaasireportteri plasmidit, ja pGL3-promoottori-vektoriin (Promega) pGL3-HBSI (II) -promoottorin lusiferaasireportterilla plasmideja. Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla.

rakentaminen lusiferaasireportteri plasmidit HBSS

syntetisoitiin oligonukleotidit, joissa on ennustettu Hox sitoutumiskohtia (HBSS), että promoottorialueet IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) ja joilla kullakin on yhden pisteen mutantti-sivuston (A → C), oligonukleotidit olivat seuraavat:

HBS3, 5′-CTCTTTTTATTA-3 ’ja 5′-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3’;

mutantti HBS3, 5′-CTCTTTTTCTTA-3 ’ja 5′-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3’;

HBS4, 5′-CATTTGCTATTA-3 ’ja 5′-CATGGTAAACGATAATCTAG-3’;

mutantti HBS4, 5′-CCTTTGCTCTTA-3 ’ja 5′-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3’;

HBS5, 5′-CCTTTATTATTA-3 ’ja 5′-CATGGGAAATAATAATCTAG-3’;

mutantti HBS5, 5′-CCTTTCTTCTTA-3 ’ja 5′-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3’.

kaksijuosteinen HBSS hybridisoitiin ja insertoitiin ylävirtaan pGL3-promoottorin vektori tuottaa lusiferaasireportteri- plasmidit [18]. Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Cell transfektio

Mahalaukun cacner soluja (BGC823 ja SGC7901) transfektoitiin pcDNA3.1-HoxD10 tai pcDNA3.1 tyhjän vektorin käyttämällä Fugene HD (Promega) . Tuottavat vakaita HoxD10 yliekspressio solulinjat, edellä transfektoidut solut valittiin 400 pg /ml G418: aa (Merck, Darmstadt, Saksa) toisen 14 päivää. SiRNA-välitteinen geenin knockdovvn, BGC823 ja SGC7901 solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA tai IGFBP3 kohdistettuja siRNA (Qiagen, Hilden, Saksa), HGC27 solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA tai HoxD10 kohdistettuja siRNA (Genepharma, Shanghai, Kiina) käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen).

Lusiferaasiaktiivisuus määritys

1,0 x 10

5 BGC823 ja SGC7901 solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia, sitten transfektoidaan 0.4μg pcDNA3.1 tyhjällä vektorilla tai pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (promoottori) tyhjän vektorin tai pGL3-pIGFBP3 (HBS) -laimentamaton (promoottori), ja 0.004μg PRL-TK-vektoria (Promega), joka sisälsi viite-ohjaus renilla käyttäen Fugene HD [18]. Lusiferaasiaktiivisuus analysoitiin dual-lusiferaasireportteri- määritysjärjestelmää 48 tunnin kuluttua mukaan valmistajan protokollia (Promega).

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) B

stabiili HoxD10 yli-ilmennetään BGC823 ja SGC7901 solulinjat, kromatiinin immunosaostettiin HoxD10 monoklonaalisella vasta-aineella (Rabbit, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) [19] tai kaniinin normaalilla IgG (negatiivinen kontrolli) mukaan Simple ChIP entsymaattinen kromatiini IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , USA). Saostunut DNA: t tai 2% Input näytteitä genomi-DNA HEK-293T villi solut monistettiin Taq DNA Polymerase (Takara, Otsu, Japani) [20,21]. Neljää aluketta kattaa HBSS eri sivustoja IGFBP3 promoottorin suunniteltiin seuraavasti: A1 (-2251 ~ -2073 bp, ja HBS1 ja 2,), 5′-CATTCGGCACTGAACAAG-3 ’ja 5′-AGCCTGGACTGACCACT-3′; A2 (-1765 ~ -1633 bp, ja HBS3,), 5’-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 ’ja 5′-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3′; A3 (-1470 ~ -1364bp varten HBS4,), 5’-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 ’ja 5′-AGGTGGATAGGTGACTTG-3′; A4 (-1153 ~ -877bp varten HBS5,), 5’-GCCGACAGGAGTTACAG-3 ’ja 5′-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3’.

Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA eristettiin Trizol reagenssia (Cwbiotech, Peking, Kiina). Käänteinen transkriptio (RT) -PCR määritettiin M-MLV käänteistranskriptaasia (Takara) ja Taq DNA Polymerase. Seuraavia alukkeita käytettiin monistamiseen:

GAPDH, 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ’ja 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′; HOXD10, 5’-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 ’ja 5′-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3′; IGFBP3, 5’-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 ’ja 5′-CTTTGGAAGGGCGACACT-3’;

MMP2, 5′-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 ’ja 5′-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3’;

MMP7, 5′-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 ’ja 5′-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3’;

MMP-9, 5′-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 ’ja 5′-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3’;

MMP14, 5′-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 ’ja 5′-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3’;

kudoksen estäjä metalloproteinaasi-1 (TIMP1), 5′-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 ’ja 5’ -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ’;

TIMP2, 5′-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 ’ja 5′-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3’;

uPA, 5′-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 ’ja 5′-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3′; uPAR, 5’-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 ’ja 5′-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3’.

Western blotting

Yhteensä proteiinit uutettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (Beyotime, Haimen, Kiina). Triton X-100 hajotuspuskuria käytetään erottamaan liukoisen E-kadheriinin ja ß-kateniinin, SDS hajotuspuskuria käytetään erottamaan liukenemattomia E-kadheriinin /ß-kateniinin kompleksin [22]. Lysaatit erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, USA). Blotit koetettiin HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-kadheriinin (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), SS-kateniinin ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) tai GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) vasta-aineita. Täplät visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokio, Japani). Suhteelliset tiheydet proteiinit kvantitoitiin Image J. ohjelmiston ja normalisoitiin GAPDH [20].

Haavan paranemista määrityksessä

BGC823 ja SGC7901 solut transfektoitiin IGFBP3 siRNA tai ohjata negatiivinen siRNA kuusi-kuoppalevyille ja sitten raaputettiin p10-pipetin kärjen syntyy aukko. Kuopat huuhdeltiin PBS: lla poistamiseksi joutuneiden solujen ja tuoretta väliainetta (1% FBS BGC823 ja seerumin vapaa SGC7901) lisättiin. Kolme satunnaistettu kuvia naarmuuntunut alueiden otettu (× 40 suurennus) yli 0h, 12h ja 24h [23].

TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Solun muuttoliikettä ja invaasiota arvioitiin muutettu Boyden transwell kammiot (Corning Inc., Corning, USA), päällystetty (for invaasio) tai ilman (Siirrettävissä) matrigeelin (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNA transfektio ja nälkään solut maljattiin ylempään kammioon viljelyväliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää (BGC823) tai ei FBS (SGC7901), alustaa, joka sisälsi 15% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon, solut ylemmässä kammiossa poistettiin huolellisesti inkuboinnin jälkeen 16 tuntia (Siirrettävissä) tai 36h (varten hyökkäys). Siirtyneet solut värjättiin 0,5 ng /ml DAPI Värjäysliuos (Roche, Penzberg, Saksa). Solumäärät satunnaistettiin laskettiin viidellä (x 400 suurennos) [24]. Tunkeutuneet soluja inkuboitiin Cell Stain Solution (Millipore) ja valokuvattiin (x 200). Väriaine Seos pestiin uuttopuskuria ja siirrettiin 96 kuopan kolorimetriseen mittaus 560nm mikrolevylukijalla (Thermo, Boston, USA) [25,26].

Potilaat ja näytteet

86 leikkauspotilas mahalaukun adenokarsinooman otettiin vuodesta toukokuuta 2007 helmikuu 2008 allekirjoittamisen jälkeen tietoista suostumusta. Tutkimus hyväksyi Clinical Research Ethics komitean Sir Run Run Shaw sairaala Zhejiangin yliopistossa. Hyväksytty kasvain kudosten ja viereisen kasvaimettomina kudokset saatiin. Potilaiden kliinis tietoja kuten sukupuoli, ikä, TNM vaiheissa ja patologinen laadut haettiin potilastietoja. Seuranta suoritettiin klo 1 vuoden välein leikkauksen jälkeen, sairaushistoria kirjattiin kun potilas tuli myöhemmin käynnin. Seuranta-sulku aika oli elokuuta 2012, ja mediaani seuranta-aika oli 35 kuukautta (vaihteluväli, 1-63 kuukautta).

Tissue microarray ja immunohistokemiallisella värjäyksellä

Johtimet mittaamalla 1.5mm vuonna suurin mitta lävistettiin ulkopuolisista nekroottinen alueilla Hyväksytty kasvain kudosten ja viereisen kasvaimettomina kudoksiin. Tissue microarray dioja sisältäviä 4 um paksuja mikrosirujen osat rakennettiin käyttäen standardimenetelmiä (yhteistyössä Shanghai Superchip Company, Ltd., Shanghai, Kiina). Objektilasit inkuboitiin IGFBP3 vasta-aineella (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) yön yli 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen inkuboitiin Envision-plus tunnistusjärjestelmä (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Kööpenhamina, Tanska). Leikkeitä kehitettiin 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia ratkaisu mikroskoopin avulla seuraten ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä [27]. Kudokset Pitkälle edenneen rintasyövän värjättiin positiivinen kontrolli [28]. Osuus positiivisten solujen kunkin yksilön kvantitoitiin mikroskoopilla ja luokiteltu neljään ryhmään. 0: 0-5% positiivisia soluja; 1: 6%: sta 50% positiivisia soluja; 2: 51%: sta 75% positiivisia soluja ja 3: 76-100% positiivisia soluja. Intensiteetti IGFBP3 värjäys luokiteltiin seuraavasti: ei värjäytymistä = 0; heikkoa värjäytymistä = 1; kohtalainen värjäytyminen = 2; tiheä värjäystä = 3. pisteet intensiteetin plus osuutta positiivista värjäytymistä määriteltiin IGFBP3 värjäystä pisteet. Pistemäärä 0-3 pidettiin heikkoa ilmentymistä ja 4-9 high ilme.

Tilastollinen

ero ilmaus IGFBP3 välillä kasvainkudos ja ei-kasvainkudoksessa määritettiin Mann-Whitneyn U-testiä. Chi-square testillä analysoida suhteita kliinis ja IGFBP3 värjäys tulokset. Todennäköisyys kokonaiselossaoloaikaa laskettiin Kaplan-Meier menetelmä ja ero käyrien arvioitiin kanssa Log-rank-testiä. Sulku p 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

HoxD10 ylössäätelee ilmentymisen IGFBP3

Genominlaajuiset analyysi paljasti, että useita geenejä, mukaan lukien IGFBP3 säädeltiin by HoxD10 mahasyövän soluissa edellisessä tutkimuksessa (4). Sen määrittämiseksi, onko HoxD10 voisi transkriptionaalisesti säätelemään IGFBP3 mahasyövän soluissa, havaitsimme ekspressiotaso IGFBP3 jälkeen stabiilisti käyttöön HoxD10 geeni BGC823 ja SGC7901 soluja, tai ohimenevästi kaatamalla of HoxD10 on HGC27 soluissa. RT-PCR: llä ja Western blot tulokset osoittivat johdonmukaisesti, että ilmentyminen IGFBP3 oli merkittävästi yläreguloituja HoxD10 yli-ilmennetään soluissa (kuvio 1A ja 1 B), kun taas vaimentua jälkeen hiljentäminen on HoxD10 in HGC27 soluissa (kuvio 1C ja 1D).

ilmaisu IGFBP3 havaittiin tavanomaisilla RT-PCR (A, C) ja Western-blottauksella (B, D) sen jälkeen kun oli transfektoitu pcDNA3.1 tyhjän vektorin tai pcDNA3.1-HoxD10 in BGC823 ja SGC7901 soluja, ja negatiivinen kontrolli siRNA (Ne -Si) tai kaksi HoxD10 siRNA (H-Si1 ja H-Si2) in HGC27 soluissa. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna pCDNA3.1 vektori tai negatiivinen kontrolli siRNA-arvot normalisoitu 1. (E) BGC823 ja SGC7901 kotransfektoitiin kanssa pcDNA3.1 tyhjällä vektorilla tai pcDNA3.1-HoxD10, pGL3-basic-vektori tai pGL3- (pIGFBP3) -laimentamaton ja PRL-TK vektori. Suhteellinen firefly aktiivisuus ilmaistiin normalisoitu renilla aktiivisuutta PRL-TK vektori. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. ** Osoittaa p 0,01.

2,3 kiloemäksen sekvenssi (-2282-56 bp) ylävirran alue IGFBP3 kloonattiin pGL3-perusvektoriin ja käytetään arvioimaan lusiferaasiaktiivisuutta dual-lusiferaasireportterilla määrityksissä. Tulokset osoittivat, että IGFBP3 promoottorin aktiivisuus BGC823 ja SGC7901 solujen parannettu 4,2 ja 3,8 taittuu vastaavasti sen jälkeen, kun ko-transfektoitiin pcDNA3.1-HoxD10 suhteessa pcDNA3.1 vektori transfektanttien (p 0,01, kuvio 1E). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että HoxD10 voisi transkriptionaalisesti upregulate ilmentymisen IGFBP3 mahalaukun syöpäsoluja.

tunnistaminen uusien säätelyalueille IGFBP3 promoottori vastaa HoxD10

vieressä analysoitiin mahdolliset HoxD10 sitoutumiskohdat IGFBP3 promoottori. 2,3 kb ylävirtaan sekvenssin IGFBP3 geeni syötetty PROMO (https://alggen.lsi.upc.es/), ohjelma ennustamisessa transkriptiotekijän sitoutumiskohtia yhtäjaksoista tai ryhmässä liittyvien sekvenssien (17 ), ja 5 mahdolliset HoxD10 sitoutumiskohtia (HBS1 ~ 5) ennustettiin (taulukko S1). Kuten kuviossa 2A on esitetty, nämä viisi HBSS oli paikallistaa -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) ja -953 ~ -944bp (HBS5), vastaavasti. Vuonna vakaa HoxD10 yliekspressoidaan BGC823 ja SGC7901 solujen, sitovan alueita IGFBP3 promoottori tutkittiin Chip määrityksiä. Olemme havainneet, että kromatiinin saostetaan HoxD10 spesifistä vasta-ainetta monistettiin käyttäen A2, A3 ja A4 alukkeita, jotka käsittävät HBS3, HBS4 ja HBS5 vastaavasti, kun taas mitään monistusta ei havaittu A1 alukkeita kattaa HBS1 ja 2 (kuvio 2B).

(A) Kaavamainen esitys IGFBP3 promoottorin kanssa mahdollisia sitoutumiskohtia HoxD10 (HBS1-5) ja neljä fragmenttia (A1-A4) ulottuu viiden HBSS IGFBP3 promoottorialue oli suunniteltu PCR-analyysi ChIP määrityksissä (A1-A4). (B) HoxD10 yli-ilmennetään BGC823 ja SGC7901 soluja silloitettu formaldehydillä ja hajotettiin. Solulysaatit altistettiin immunosaostukselle joko kanin vasta-aine HoxD10 tai kaniinin normaalilla lgG: llä. Genomi-DNA: ta ja 2% panos-DNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina.

saada syvemmälle säätelysegmentit IGFBP3 promoottorin HoxD10, kloonasimme 2 eri DNA-fragmentit, jotka kattavat HBSI (HBS1 ja 2) ja HBSII (HBS3, 4 ja 5), ​​tässä järjestyksessä, osaksi SV40-promoottorin lusiferaasi toimittajille. Tulokset osoittivat, että ko-transfektoitiin HoxD10, HBSII parannettu SV40-promoottorin aktiivisuus 4,0-kertaiseksi verrattuna niihin tyhjällä vektorilla transfektanttien in BGC823 soluissa (P 0,01, kuvio 3A). Sen sijaan, HBSI ei ollut merkittävää vaikutusta SV40-promoottorin aktiivisuutta (kuvio 3A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin näkyville toinen riippumaton SGC7901 solut, SV40-promoottorin aktiivisuuden muutokset olivat 3,3 ja 0,9 kertainen HBSII ja HBSI, vastaavasti (kuva S1A File S1).

(A) BGC823 solut transfektoitiin pcDNA3.1 tyhjällä vektorilla tai pcDNA3.1-HoxD10, pGL3-promoottori vektorissa tai pGL3-HBSI (II) -promoottorin ja PRL-TK-vektoria. (B) Eri oligonukleotidit, jotka sisältävät villi tai pisteen mutanttisekvensseistä of HBS3, HBS4 ja HBS5 kloonattiin pGL3-HBS-promoottori. Suhteellinen firefly aktiivisuus ilmaistiin normalisoitu renilla aktiivisuutta PRL-TK vektori. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. ** Osoittaa p 0,01.

HBS3, 4 ja 5 yhteisiin sitovat tekijä ”TTAT”, kun taas HBS1 tai HBS2 olla mikään näistä elementeistä. Olemme hypoteesin, että HoxD10 sitoutuu suoraan promoottorin IGFBP3 on ”TTAT” sivustoja. Tämän vahvistaa, syntetisoimme 10bp oligonukleotideja, jotka sisältävät sekvenssit HBS3, HBS4 ja HBS5 vastaavasti. Kuten kuviossa 3B on esitetty, SV40-promoottori toimintaa tehostettiin 1,8, 2,0, ja 2,7 taittuu vastaavasti, kun ko-transfektoitiin HoxD10 plasmidin BGC823 soluissa, kun taas kohdan mutantteja HBS3, HBS4 ja HBS5 ei todettu merkittäviä muutoksia. Me jäljentää samankaltaisia ​​tuloksia SGC7901 soluissa (kuvio S1B File S1).

Yhdessä edellä tulokset osoittavat, että IGFBP3 on välittömänä kohteena HoxD10 mahalaukun syöpäsoluja. Havaitsimme kolme toiminnallista siteet sivustojen välillä -1727 ~ -943bp ylävirran IGFBP3 vastaavan geenin HoxD10. HoxD10 voisi suoraan sitoa promoottori IGFBP3 mahdollisesti kautta Hox sitova elementti ”TTAT”.

IGFBP3 on vaimentua mahasyövän ja liittyvät potilaiden ennusteeseen

määrittämiseksi ekspressiokuviota IGFBP3 mahasyövän, 86 paria kirurgisista näytteistä ihmisen mahasyövän ja mukaan viereisen noncancerous maha- kudokset tutkittiin. Intensiteetti IGFBP3 värjäytyminen pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen), tai 3 (tiheä), määritettynä itsenäisesti kaksi patologit (kuva S2 File S1). Tulokset osoittivat, että ekspressiotaso IGFBP3 tuumorikudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin viereisillä kasvaimen-free kudoksissa (p 0,001, kuvio 4A ja 4B). Lisäksi IGFBP3 ilmentyminen arvioitiin, mitä tulee kliinis potilaiden ominaisuuksiin. IGFBP3 ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi mahakasvaimen kanssa imusolmuke etäpesäke (p = 0,045). Lisäksi korkea IGFBP3 ilmentyminen pienikokoisiin kasvaimet (T1 + T2, 8/12) havaittiin useammin suhteessa, että suuret (T3 + T4, 36/74), mutta joilla ei ole merkittävää eroa (p = 0,062) . Myös merkittävää korrelaatiota ilmentymisen IGFBP3 ja kliinis ominaisuuksia, kuten sukupuoli, ikä ja patologinen arvosana (taulukko 1).

(A) ilmentyminen tasot IGFBP3 havaittiin immunokemia analyysi 86 paria mahakasvaimen ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa. Edustavia kuvia näytettiin 3 pariksi kasvain (T) ja normaalin (N) kudoksiin. (B) vertailu värjäytymisen tulokset IGFBP3 välillä mahakasvaimen ja viereisten kasvainta kudoksiin. (C) Eloonjäämiskäyrät piirrettiin perustuvat Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Ilmentymistaso IGFBP3 käytettiin variate erottaa kaksi riviä.

IGFBP3 immunovärjäyty- intensiteetti

Kliininen luokitus

kokonaismäärä

Low (numero) B Korkea (numero) B p value

Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644 60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. sukupuoli, ikä ja kliinis ominaisuudet ja immunohistokemia tulokset mahakasvaimen kudosnäytteitä.

CSV Lataa CSV

analysoitava tarkemmin korrelaatiota ilmentymisen IGFBP3 ja eloonjäämisaste mahasyövän potilailla. Korkeampi ilmentymä IGFBP3 liittyi pidempi elinaika on 5 vuoden seurannassa (p = 0,011, Kaplan-Meier selviytymisen Log-rank test) (kuvio 4C).

knockdovvn IGFBP3 geenin edistää mahalaukun syöpäsolun muuttoliike ja invaasio

arvioimiseksi toiminnallista roolia IGFBP3 mahasyövän, tutkimme solumigraatioon ja invaasion jälkeen knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 selektiivisesti knockdowned RNA häiriöitä BGC823 ja SGC7901 soluja (kuvio 5A ja 5B), mikä oli suhteellisen korkea endogeenisen IGFBP3 paneelissa mahalaukun solulinjojen (kuva S3 File S1). Tulokset osoittivat, että hiljentäminen ilmentymistä IGFBP3 tehostaa merkittävästi solujen vaeltamiseen sekä transwell muuttoliikkeen määrityksissä (kuvio 5C ja 5D) sekä raaputuskokeen (kuva S4 File S1), kun verrattuna negatiivisen kontrollin siRNA. Lisäksi knockdowning IGFBP3 näkyy huomattavasti suurempi aktiivisuus solujen hyökkäyksen Transvvell- määrityksissä (kuvio 5E ja 5F).

ilmentymisen IGFBP3 BGC823 ja SGC7901 solut havaita tavanomaisilla RT-PCR: llä (A) ja Western-blottauksella (B) sen jälkeen kun on transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (Ne-si) tai IGFBP3 siRNA (I3-si) . Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA arvot normalisoitu 1. (C) Cell muuttoliikettä arvioitiin muutettu Boyden TranswellTM kammioita määrityksiä. Kun oli inkuboitu 16 tuntia, solut, jotka vaelsivat pohjaan kalvon värjättiin DAPI. (D) keskimääräinen lukumäärä näkyvissä vaeltavien solujen laskettiin viisi satunnaisessa HPF. Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. ** Osoittaa p 0,01. (E) BD Matrigel päällystetyt kammiot arviointiin käytettiin soluinvaasiota. Tunkeutuneet solut pohjassa kalvon värjättiin solun väriliuos. (F) tunkeutuneet solut pestiin uuttopuskuria ja havaitaan mikrolevylukijalla (560 nm). ** Osoittaa p 0,01.

IGFBP3 moduloi ilmauksia MMP14, uPA ja uPAR

selvittää mahdollisia mekanismeja miten IGFBP3 säädellä invasiivisuus mahalaukun syövän solujen, tutkimme mRNA tasot MMP2 /MMP7 /MMP-9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA ja sen reseptorin uPAR, jotka kaikki ovat hyökkäyksen liittyvät tekijät, erityisesti syöpään. Sen jälkeen, kun oli transfektoitu tilapäisesti IGFBP3 siRNA varten 72h BGC823 ja SGC7901 solujen mRNA ekspressiotasot MMP14, uPA ja uPAR lisääntynyt, kun taas mitään merkittävää muutosta MMP2, MMP7, MMP-9 tai TIMP1 /TIMP2 havaittiin (kuvio 6A). E-kadheriinin, ß-kateniinin ja E-kadheriinin /SS-kateniinin kompleksi uutettiin käyttäen erilaisia ​​lysaatit, niiden tasot ei ollut merkittävää muutosta, kun hiljentäminen IGFBP3 BGC823 soluissa (kuvio S5 File S1). Nämä tulokset osoittivat, että IGFBP3 estää hyökkäys mahasyövän solujen läpi, ainakin osittain, moduloimalla ilmauksia MMP14, uPA ja uPAR (kuvio 6B).

(A) MMP (2,7,9, 14), TIMP (1,2), uPA ja uPAR vuonna BGC823 ja SGC7901 solut havaita tavanomaisilla RT-PCR jälkeen transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (Ne-si) tai IGFBP3 siRNA (I3-si). (B) systeeminen ymmärtäminen väyliä HoxD10-IGFBP3 säätely mahasyövän solumigraation ja invaasiota.

Keskustelu

Hox superperheen ovat ryhmä tärkeitä transkription tekijöitä, jotka voivat säädellä leviämisen ja erilaistumista embronic solujen [29,30]. Lisäksi poikkeava ekspressio HOX soittaa myös kriittisiä rooleja etenemistä useita erilaisia ​​syöpiä [31]. HOX proteiinit on suuri loppupään sääntelyverkon ja käyttää niiden toiminnot pääasiassa näiden kohdegeenien [5]. Genominlaajuisia analyysi on tehty seuloa loppupään geenejä HoxD10 aikana selkäytimen kehitys ja mahasyövän soluissa [4,32]. Me ja muut ovat osoittaneet, yksi yhteinen kohdegeenin IGFBP3, joka on raportoitu palvelemaan tuumorisuppressorina [10].

Tutkimuksemme tarjotaan ensimmäistä näyttöä siitä, että HoxD10 suoraan sitoo IGFBP3 promoottori aktivoida ilmentymistä IGFBP3 mahalaukun syöpäsoluja. HoxD10 proteiini voitiin palkata tiettyyn promoottorialueen IGFBP3 geenin, mikä osoittaa, että HoxD10 voisi sitoutua suoraan IGFBP3 geeniä. Lusiferaasiaktiivisuus villi, mutta ei mutantti, HBS3, HBS4 tai HBS5 merkittävästi parantaa yli-ilmentymisen HoxD10, viittaa siihen, että HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) ja HBS5 (CTTTATTATT) oli kolme toiminnallista HoxD10 sitoutumiskohtien promoottorialueen IGFBP3. Kuten odotettua, ilmentymisen taso IGFBP3 mRNA: ta ja proteiinia voimistuvan pakko ilmentymisen HoxD10 eri mahasyövän solulinjoissa [4]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Hox proteiineilla on joitakin keskeisiä yksimielisyys sitovia elementtejä, kuten TTAT, TAAT, ja TTAC [7]. Point-mutaation ”TTAT” ja ”TTCT” tai ”TCTT” ja ”tatt” in promoottorialueen IGFBP3 esillä olevassa tutkimuksessa osoittavat, että ”TTAT” tai ”tatt” ovat tärkeitä sitoutumiskohtia HoxD10. HOX proteiinit voivat suoraan säädellä transkription prosessin loppupäässä kohdegeenien monomeereinä tai homodimeerejä [33]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.