Krooninen sairaus

tiivistelmä

myosin IC on yksi otsikoiden jäsen myosiinin superperheen. Olemme äskettäin tunnistaneet uuden isoformin ja osoitti, että

MYOIC

geenin nisäkässoluissa koodaa kolme isoformeja (isoformeja A, B, ja C). Lisäksi osoitimme, että myosiinin IC isoformin A, mutta ei isoformin B osoittaa kudosspesifisiä ilme kuvio. Tässä tutkimuksessa laajensimme analyysi myosiinin IC isoformin ilmentyminen kuvioita analysoimalla proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen eri nisäkässolulinjoissa ja erilaisissa eturauhasnäytteissä ja kasvaimen kudokset siirtogeenisen hiiren eturauhas- (TRAMP) malli immunoblottauksella, qRT-PCR, ja epäsuorilla immunohistokemiallisella värjäyksellä parafiiniin eturauhasen yksilö. Analyysi paneelin nisäkässolulinjojen osoitti lisääntynyttä mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä erityisesti myosiinin IC isoformin A paneeli ihmisen ja hiiren eturauhassyöpäsolulinjoissa, mutta ei ei-syöpä eturauhasen tai muiden (ei-prostate-) syöpäsolulinjoissa . Lisäksi osoitamme, että myosiinin IC isoformin A: n eks- lisääntyy merkittävästi TRAMP hiiren eturauhasessa eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) vaurioita ja kaukaisissa sivuston etäpesäkkeitä keuhkoissa ja maksassa verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Meidän havainnot osoittavat erityisiä muutoksia ilmaus myosiinin IC isoformin A, joka on samanaikainen kanssa esiintyminen eturauhasen syövän TRAMP hiiren eturauhassyövän malli, joka jäljittelee läheisesti kliinistä eturauhassyöpää. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kohonnut myosiinin IC isoformin A voi olla mahdollinen merkki havaitsemiseksi eturauhassyöpä.

Citation: Ihnatovych I, Sielski NL, Hofmann WA (2014) Selective Expression of myosiinin IC isoformiseosten A hiiren ja ihmisen solulinjoissa ja hiiri eturauhassyöpäkudoksille. PLoS ONE 9 (9): e108609. doi: 10,1371 /journal.pone.0108609

Editor: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2014; Julkaistu: 26 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Ihnatovych et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä Tutkimuksen rahoittivat puolustusministeriön, congressionally Directed Medical Research Programs (https://cdmrp.army.mil/default.shtml) (avustus # W81XWH -12-1-0234) ja WAH ja jonka Buffalon yliopistossa käynnistyksen avustuksen WAH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä diagnosoidaan miehillä maailmassa ja toiseksi yleisin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1], [2]. Eturauhassyöpä voi olla usein veltto, mutta se voi myös olla erittäin aggressiivinen ja tappava joillakin potilailla. Tällä hetkellä ei ole olemassa luotettavaa markkeri saatavilla varhaiseen havaitsemiseen, diagnostinen vahvistus tai sairauden ennusteen käytettävissä [3]. Näin ollen, tunnistaminen uusien biomarkkereiden, että on kyky täsmällisesti ja erottamiseksi eturauhasen syöpä on tärkeä tarkan hallinnan tauti.

myosiinin IC on jäsen myosiinin superperheen [4], että paikantuu sytoplasmassa ja tumassa, ja on osallisena eri prosesseissa molemmissa osastoissa. Sytoplasmassa, myosiinin IC on mukana muodostumista lipidilauttojen [5], kuljetukseen rakkulat, jotka sisältävät membraanin proteiinien [6], ja ionikanavan asetuksen karvasolujen sisäkorvan [7] – [9]. Tumassa, myosiinin IC on mukana eri osa transkription [10] – [13], kromatiinin remontin [14], [15] ja dynaaminen organisaatio kromosomi rakenteita [16]. Olemme äskettäin tunnistaneet aiemmin tuntemattoman isoformi myosiinin IC ja osoitti, että

MYOIC

geenin nisäkässoluissa koodaa kolme isoformeja, joita kutsutaan myosiinin IC-isoformit A, B, ja C [17].

aiemmat analyysi myosiinin IC isoformin ilmentyminen hiiren kudoksissa paljasti kudosspesifisen ekspressiokuviota nimenomaan myosiinin IC isoformin A korkeat ekspressiotasot munuaisissa, lisämunuaisissa, haimassa ja lisäkivesten retroperitoneaalisia rasvakudoksen varikot [18]. Sen sijaan, myosiinin IC-isoformi B on esitetty kaikkialla ekspressiota kaikissa analysoitiin kudoksissa ja solulinjoissa [17] – [19].

kudosspesifisen ilmentymisen myosiinin IC isoformin LED meidät tutkimaan ilmentymisen profiilit myosiinin IC isoformit edelleen. Me raportoimme tässä arvioinnissa myosiinin IC-isoformeja A ja B ilmentymisen erilaisia ​​nisäkkään kudosviljelmäsolulinjoissa. Osoitamme, että ilmentyminen myosiinin IC isoformin A on merkittävästi lisääntynyt eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna muihin (ei-eturauhasen) syöpä solulinjoja tai ei-syöpä eturauhasen solulinja. Myöhempää analyysiä eturauhassyövän kasvaimen kudokset hiiren TRAMP malli, joka myötäilevän patogeneesi ihmisen eturauhassyövän [20] – [23] osoittaa merkittävää kasvua isoformin A: n eks- verrattuna normaaleihin kudoksiin. Yhdessä meidän data sotkea erityisiä muutoksia myosiinin IC isoformin A: n eks- jotka ovat samanaikaisia ​​ulkonäkö eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

Vasta-aineita, jotka tunnistavat tiettyjä isoformia myosiinin IC: 1. anti-NMI aine on kanin polyklonaalinen vasta-aine, joka nostettiin vastaan ​​16 aminohappoa pitkän N-terminaalista peptidi NMI, tässä nimeltään isoformi B [5], [24] (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); 2. myosiinin IC-isoformin vasta-aineen on hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka oli nostatettu myosiinin IC isoformin erityinen N-terminaalinen peptidi ja tunnustaa yksinomaan myosiinin IC isoformin [17] (kuvio 1A). Monoklonaalisia vasta-aineita P-aktiinin ja SV40: n suuren T-antigeenin (SV40-TAg) saatiin Sigma (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ja EMD Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA), vastaavasti. Peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-aineita saatiin Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA).

havaitseminen myosiinin IC-isoformeja A ja B proteiinin eri nisäkässolulinjoissa immunoblot-analyysillä käyttäen vasta-aineita ominaisia ​​myosiinin IC isoformit A, isoformi B, SV40: n suuren T-antigeenin (tag) ja aktiini (kontrolli). A) Kaavio myosiinin IC isoformispesifisiä sekvenssit ja tunnistuskohdan vasta-aineita. Kuvattu on 5 ’alueen nisäkkään

MYOIC

geenin eksonit, jotka koodaavat isoformispesifisiä N-terminaaliset peptidit. Translaation aloituspaikat varten isoformit on merkitty ovat N-terminaaliset aminohapposekvenssit. Alleviivatut ovat peptidisekvenssejä käytetään immunogeeninä luomaan isoformin spesifisiä vasta-aineita. B) edustaja immunoblottaus solu-uutteet, jotka analysoitiin käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Merkitykselliset Molekyylipainomarkkerciden merkitty vasemmalle kD. C) Histogrammi esittää keskimääräistä densitometristä intensiteetti myosiinin IC isoformin A: n eks- normalisoitu aktiini. D) Histogrammi esittää keskimääräistä densitometristä intensiteetti isoformin B ilmaisun normalisoitu aktiini. Myosiinin IC isoformin Proteiini on erittäin ekspressoitiin COS-7-soluissa ja ihmisen ja hiiren eturauhassyöpäsolulinjoissa PC-3 ja TRAMP-C2. Sen sijaan, myosiinin IC isoformi B ilmennetään samalla tasolla kaikissa analysoitiin solulinjoissa. Tulokset on esitetty keskiarvo ± keskihajonta; n = 3 itsenäistä koetta.

Solulinjat ja kudosviljelmässä

COS-7, A-431, MCF-7, TRAMP-C1, DU 145, 22Rv1, RWPE-1 ja PC-3-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). OVCAR-3 soluja, alun perin saatu ATCC, oli jalomielinen lahjoitus tohtori Arthur M. Edelman (Dept. farmakologian ja toksikologian, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA). As4.1 soluihin [25] olivat ystävällinen lahja Dr. Kenneth W. Gross [Dept. of Molecular and Cellular Biology, Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY, USA]. TRAMP-C2-solujen [26] oli eräänlainen tri Barbara Foster (Dept. of Pharmacology and Therapeutics, RPCI, Buffalo, NY, USA). COS-7, A431, ja As4.1. -soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). MCF-7 ja DU 145 soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 0,01 mg /ml insuliinia (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). PC-3 ja 22Rv1-soluja kasvatettiin RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. OVCAR-3-soluja kasvatettiin RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 20% FBS: ää ja 0,01 mg /ml insuliinia. TRAMP-C1 ja TRAMP-C2-soluja kasvatettiin DMEM korkea glukoosi oli täydennetty 5% FBS: ää, 5% Nu seerumi IV (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 5 mg /ml insuliinia ja 10 nmol /l dihydrotestosteroni (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). RWPE-1-soluja kasvatettiin Keratinosyyttien Serum Free Medium (Invitrogen Carlsbad, CA, USA; Kit Catalog # 17005-042), johon oli lisätty 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF ). Lisäksi kaikki solut oli täydennetty 1% penisilliini /streptomysiiniä ja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

kudosnäytteitä

Jäädytetyt kudosnäytteet 22 viikon iässä TRAMP hiiret sekä ikään Hyväksytty villityypin hiiriä ostettiin hiiren Kasvainmalli Resource at RPCI (Buffalo, NY, USA). Kudokset kerättiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health alle RPCI n 890M kasvain pankki- protokolla Hiiren kasvainmuodoista Resource. Protokolla hyväksyi Roswell Park Cancer Instituten IACUC (Institutional Animal Care ja käyttö komitea). Eläimet lopetettiin anestesiassa yliannostuksen sen jälkeen taittamalla niskasta. Kaikki eturauhasen ja kasvaimen kudokset oli microdissected ruumiinavauksessa, flash-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Viisi mikronin paksuinen parafiiniin täsmäsi kudosleikkeiden ostettiin samasta lähteestä.

Immunohistrochemistry

Parafiini kudosleikkeet poistui-paraffinized ksyleenillä, nesteytyksestä on alkoholi, ja sijoitetaan dH

2O ennen leikkausta kalibrointiantigeenilla hakuun (sitraattipuskuria, pH 6). Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin käyttämällä 3% H

2O

2 ennen inkubointia joko myosiinin IC isoformin A tai SV40-leima vasta immunohistokemiaan standardimenetelmien mukaisesti. Kuvat saatiin Zeiss Axio Imager Z1 (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY, USA) ja käsiteltiin käyttäen Adobe Photoshop ohjelmistoa.

immunoblot-analyysi

valmistamiseksi raakaöljyn solu-uute, joka on yhtä suuri kuin solujen lukumäärä hajotettiin SDS näyte-puskuria. Kutakin solulinjaa analyysi, kolmen erillisen kokeen tehtiin. Tissue uute valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kunkin kudoksen analyysi, kudosten kolmesta kuuteen hiiret analysoitiin. Yhtä suuret tilavuudet raakaa solu-uutteen tai yhtä suuret määrät kudosproteiinia uutteet (40 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE (natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Siirron jälkeen kalvo leikattiin sopivaan kokoon ja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin. Densitometrinen analyysi suoritettiin taajuusalueet perustuen niiden suhteelliset intensiteetit käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin soluista tai kudosnäytteistä käyttämällä Trizol -reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin solulinjasta käytettiin kääntää puhtaaksi cDNA käyttäen Superscript III käänteistranskriptaasia ja oligo-dT-aluketta mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Carlsbad, CA). qRT-PCR suoritettiin käyttäen iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja pohjamaali, jotka tunnistavat spesifisesti hiiren ja ihmisen myosiinin IC isoformin A (

homo sapiens:

NM_033375. 4;

mus musculus

: XM_006532429.1) ja hiiren ja ihmisen myosiinin IC isoformin B (

homo sapiens:

NM_001080950.1;

mus musculus:

NM_001080775). Kvantifiointiin, kolmena rinnakkaisena normalisoitiin keskimääräiseen GAPDH taloudenhoito geeni. Aluke, jota käytetään qRT-PCR on kuvattu [18].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot on annettu keskiarvoina ± standardipoikkeamat. Normaalisuus tietojen testattiin Kolmogorov-Smirnov testi. Ero aineistoja testattiin Studentin t-testillä. Poikkeamat pidettiin merkittävinä tasolla

p

0.01.

Tulokset

aiemmin analysoitu ilmaisua malleja myosiinin IC isomuotojen 33 hiiren elimiin ja kudoksiin ja totesi, että myosiinin IC isoformin A, mutta ei isoformin B ilmentyy kudosspesifisellä tavalla [ ,,,0],18]. Olemme nyt laajennettu analyysimme proteiinin ja mRNA: n ilmentyminen myosiinin IC-isomuotojen paneeliin nisäkkään solulinjoissa. Analysoida proteiinin ilmentyminen, teimme immunoblot-analyysi koko solu-uutteita käytetään myosiini IC-isoformin spesifisiä vasta-aineita (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B on esitetty ja C, paitsi että Afrikkalainen vihreän apinan munuaissolulinja COS-7 (jos se on alun perin havaittu ja tunnettu siitä, [18]), myosiinin IC isoformin proteiini ilmentyy voimakkaasti ihmisen ja hiiren eturauhassyöpäsolulinjoissa TRAMP -C1, TRAMP-C2, DU 145, 22Rv1, ja PC-3, mutta ei ei-syöpä eturauhasen solulinja RWPE-1. Lisäksi myosiinin IC-isoformin A esittää vain matalia ekspressiotasoja muissa syöpäsolulinjoissa mukaan lukien ihmisen ihon (A-431), rinta (MCF-7), ja munasarjojen (OVCAR-3) syöpäsolulinjoissa. Koska COS-7-solulinja saatiin transformoimalla alkuperä viallisen mutantin SV40, että vielä koodaa SV40: n suurta T-antigeeniä (SV40-TAg) [27], testasimme myös As4.1 solulinja, joka on perustettu soluista siirtogeenisen hiiren kanssa parenkyymin sisäisten munuaisen kasvain, joka aiheutettiin kohdistettuja tuumorigeneesiä kanssa SV40-tag -fuusiorakenteen ja ilmaisee myös SV40-tag [25]. Kuten kuviossa 1A on esitetty, molemmat solulinjat, COS-7 ja As4.1, express SV40-TAg mutta vain COS-7-soluissa osoittavat korkeaa ilmentymistasoa myosiinin IC isoformin A. Toisin kuin tässä solulinjassa ilmentäminen myosiinin IC isoformin A, myosiinin IC isoformi B ilmentyy kaikkialla samalla tasolla kaikissa analysoitiin solulinjoissa (kuvio 1A B).

Voit selvittää proteiinin ilmentyminen korreloi mRNA ilme, me seuraavaksi analysoitu mRNA ilmaus isomuotojen käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR: llä (qRT-PCR), jossa isoformi-spesifistä aluketta (kuvio 2A). Kuten kuviossa 2 on esitetty, olemme huomanneet, että mRNA: n ilmentymisen profiilit myosiinin IC-isoformeja A ja B korreloi proteiinin ilmentymisen profiilit. Vertailukelpoinen proteiiniin tietoja, mRNA: n ilmentyminen myosiinin IC isoformin A on korkea vain COS-7, TRAMP-C1, TRAMP-C2, DU 145, 22Rv1, ja PC-3-soluja, kun taas myosiinin IC-isoformin B-mRNA: ta ilmentyy kaikkialla kaikissa analysoitiin solulinjoja.

Detection of myosiinin IC-isoformeja A ja B mRNA-tasoja erilaisissa nisäkässolulinjoissa by qRT-PCR käyttäen isoformi aluketta. A) Kaavamainen kuvaa 5 ’alueella

MYOIC

geenin ja tuloksena isoformin A ja B-mRNA: iden. Kohdesekvenssi sijainti käytetty aluke qRT-PCR havaita myosiinin IC-isoformien on osoitettu nuolilla. B) Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi mRNA: iden ekspressiotasoja myosiinin IC isoformin normalisoitu GAPDH. C) Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi mRNA: iden ekspressiotasoja myosiinin IC-isoformin B normalisoitiin GAPDH. Myosiinin IC isoformin mRNA-ilmentyminen on korkea COS-7-soluissa ja ihmisen ja hiiren eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja TRAMP-C2. Sen sijaan, myosiinin IC isoformi B-mRNA ilmentyy samalla tasolla kaikissa analysoitiin ell linjat. Tulokset esitetään keinona

±

keskihajonta; n = 3 itsenäistä koetta.

silmiinpistävä havainto analyysimme myosiinin IC-isoformin ilmentyminen näissä solulinjoissa ovat korkeat ekspressiotasot myosiinin IC isoformin A, hiiren ja ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, kun tavanomaiset (ei-syöpä) eturauhasen solulinja RWPE-1 ja muiden (ei-eturauhasen) syöpäsolulinjoissa yhteenveto taulukossa 1. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska edellisessä analyysi hiiren kudosta ja elimiä oli hyvin alhainen ilmaisu of myosiinin IC isoformin A normaalin hiiren eturauhasessa [18]. Yhdessä alhaisen ilmentymisen tasot isoformin A ihmisen normaalissa eturauhasessa solulinja RWPE-1, nämä tiedot viittaavat siihen, että muutokset myosiinin IC-isoformin A: n eks- voitaisiin kehittämiseen liittyvät eturauhasen syöpään.

tutkia tätä mahdollisuutta, analysoimme myosiinin IC isoformin A: n eks- eri kudoksissa päässä TRAMP hiiri. TRAMP on siirtogeeninen linja C57BL /6-hiirten, jotka ilmentävät konstrukti, joka sisältää minimaalisen -426 /+ 28 säätelyelementti rotan probasiinipromoottorin kohdistaa ekspression SV40: n suurta T-antigeeniä eturauhasen epiteeli [21]. Kulkuri malli on laajalti käytetty eturauhassyövän mallia kuin se jäljittelee läheisesti ihmisen eturauhassyöpää. Spontaani syövän etenemisen TRAMP eturauhanen alkaa 8-12 viikkoa iässä, ja 100% hiiristä kehittää eturauhassyövän vuotiaana 20 viikkoa. Sen jälkeen, etäpesäkkeitä voi tapahtua kaukaisiin kohtiin, kuten kasvainten edistymistä [20], [28], [29].

Kuvio 3 esittää immunohistokemiallista analyysiä edustavia villityypin ja TRAMP hiiren eturauhasen hiiristä 22 viikkoa ikä. Kulkuri kudokset omaavat tyypillisiä morfologisia piirteitä, jotka liittyvät PIN vaurioita ja värjää positiivinen ydin- SV40-Tag [23] (kuvio 3A B). Meidän analyysi myosiinin IC-isoformin ilmentyminen näissä kudoksissa paljasti selvästi lisääntynyt läsnäolo myosiinin IC-isoformin A liittyvät solut ominaista PIN vaurioita TRAMP-hiirissä verrattuna soluihin, joita villityypin eturauhasen kudosta, jossa myosiinin IC-isoformin A on tuskin havaittavissa (kuvio 3C F).

edustaja kuva immunohistokemiallinen analyysi SV40-Tag (A B), myosiinin IC-isoformin A (C D), ja isoformin B (E F) ilmentyminen eturauhasessa rauhaset 22 viikon iässä villin tyypin (vasen sarake) ja TRAMP (oikea sarake) hiirillä. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kuvat otettiin 20x suurennuksella. Histologinen muutokset TRAMP hiiren eturauhasen, jotka liittyvät PIN vauriot ovat ilmeisiä (vasen sarake, B, D, F). Kuten odotettua, SV40-Tag immunovärjäys on negatiivinen villityypin eturauhasen (A) ja voimakkaasti ydinvoiman TRAMP eturauhasen (B). Myosiinin IC isoformin A näyttää hyvin heikko immunovärjääminen villityypin eturauhasen kudoksen (C), mutta vahva, pääasiassa sytoplasmista värjäytymistä TRAMP eturauhasen PIN leesioita (D). Myosiinin IC isoformi B osoittaa vahvaa värjäytymistä molemmissa, villityypin ja TRAMP, eturauhasessa (E F).

Vahvista läsnäolon myosiinin IC isoformin A kudoksissa liittyy eturauhassyöpään, analysoimme eri TRAMP eturauhasen kasvain kudoksia, jotka koostuvat joko sivusuunnassa ja ventral (LV) tai selkä, myöhemmin, ja vatsanpuoleinen eturauhanen (DLV). Kuten kuviossa 4 on esitetty, myosiinin IC isoformin proteiini-tasot olivat merkitsevästi korkeammat eturauhassyövän kudoksissa TRAMP-hiirissä verrattuna villityypin eturauhasen kudoksia, jotka osoittavat, vain hädin tuskin havaittavissa myosiinin IC-isoformin A: n eks- tasoja (kuvio 4A B ja [18] ). Lisäksi olemme analysoineet tuumorikudokset kaukaisista sivusto etäpesäke, eli keuhko- ja maksakasvaimia. Samanlainen eturauhaskudoksiin, maksan ja keuhkojen kasvaimet osoittivat merkittävää kasvua myosiinin IC isoformin proteiini ilmentymistä verrattuna ilmentymistasoihin villityypin normaalin keuhkojen ja maksan kudoksissa [kuvio 4A B ja [18]]. Tarkempi tarkastelu myosiinin IC isoformin ilmentymisen qRT-PCR vahvisti, että lisääntynyt proteiinin ilmentymistä TRAMP eturauhasessa ja kaukainen sivuston etäpesäkkeitä korreloi merkittävästi lisäämään myosiinin IC isoformin mRNA-ilmentyminen näissä kudoksissa (kuvio 4C).

eturauhasen kudosuutenäytteitä koostuvat selkä, sivusuunnassa, ja ventral (DLV) tai sivusuunnassa ja ventral (LV) eturauhasen 22 viikon iässä TRAMP tai iältään vastaaviin villityypin hiiriä analysoitiin proteiini- ja mRNA: n ilmentymisen, jotka olivat kudosta otteita keuhkojen ja maksan etäpesäkkeet TRAMP ja Hyväksytty kudoksissa villityypin hiirillä. A) edustaja immunobloteista hiirikudoksessa uutteita, jotka analysoitiin käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Merkitykselliset Molekyylipainomarkkerciden merkitty vasemmalle kD. B) Histogrammi esittää keskimääräistä densitometristä intensiteetti isoformin A: n eks- normalisoitu aktiini. C) Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi mRNA: iden ekspressiotasoja myosiinin IC isoformin normalisoitu GAPDH. Tulokset on esitetty keskiarvo ± keskihajonta; n = 3-6 (lukumäärä testatuissa kudoksissa kukin eri eläin). * P 0,01 verrattuna normaaliin kudokseen.

Keskustelu

analyysi myosiinin IC isoformin ilmentyminen eturauhasessa ja kaukainen sivuston etäpesäkkeitä TRAMP hiirillä tai iältään vastaaviin villityypin hiiret osoittivat että myosiinin IC isoformin A merkittävästi suurempi ilmaistaan ​​eturauhaskasvaimissa suhteessa normaaliin hiiren eturauhas-, keuhko-, tai maksan kudoksissa. Tämä on tietääksemme ensimmäinen raportti dokumentoi muutosta myosiinin IC isoformi ilmaisun yhteydessä syöpään. Mahdolliset biologiset ja fysiologiset seuraukset yliekspressio myosiinin IC isoformin A tuumorikudoksissa tutkii parhaillaan laboratoriossamme.

Lisäksi välisen yhteyden myosiinin IC isoformin A: n eks- ja syöpä, meidän tiedot viittaavat siihen, että poikkeava myosiinin IC isoformin A: n eks- muutoksia voidaan liityttävä transkription muutoksiin liittyy esiintyminen eturauhassyöpää. Tätä hypoteesia tukee useita huomautuksia. Aiemmat analyysi myosiinin IC isoformin A: n eks- hiiren kudosnäytteistä [18] osoitti, että tämä erityinen isoformi osoittaa korkea ekspressio vain munuainen, lisämunuainen, haima, ja osajoukko rasvakudoksesta. Nyt näyttää merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen eturauhasessa, keuhkoissa ja maksassa eturauhassyöpä kasvaimen kudokset TRAMP hiiren verrattuna villityypin kudoksissa.

TRAMP eturauhassyövän malli perustuu eturauhasen-erityinen ilmaisu SV40-tag onkoproteiinin [21]. Suuri T-antigeeni SV40 toimii useiden reittien, mukaan lukien inaktivaatio tuumorisuppressorin proteiinien p53 ja Rb sekä transkription aktivointi useita proteiineja, jotka liittyvät kasvaimen synnyssä [22]. Koska SV40-Tag on universaali sijaan eturauhassyöpä-erityinen onkogeeni, jota on käytetty laajasti mallina monien muiden syöpätyyppeihin [30], se olisi voinut olla mahdollista, että muutokset myosiinin IC isoformin A: n eks- aiheutettiin läpi toimien SV40-tag riippumatta syövän tyypistä. Kuitenkin meidän analyysi osoitti, että isoformin A: n eks- ei muuttunut vuonna As4.1 solulinjassa, joka perustettiin askitesnesteestä on kuuden kuukauden ikäisten siirtogeeninen hiiri, jossa on parenkyymin sisäisten munuaisen kasvain, joka on saatu aikaan siirtogeenin kohdistettuja tumorigeneesin kautta SV40-Tag sulatettu että reniini-promoottori [25]. Lisäksi löysimme myosiinin IC isoformin A: n eks- muuttunut TRAMP-C1 ja TRAMP-C2 solulinjoissa että vaikka peräisin TRAMP hiiristä, eivät ilmaise SV40-Tag [26]. Lisäksi olemme myös havaittu lisääntynyt isoformin A: n eks- SV40-TAg riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3, DU 145, ja 22Rv1 mutta ei ei-syöpä ihmisen eturauhasen solulinja RWPE-1 tai jollekin muulle ei -prostate syöpäsolulinjoilla. Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että myosiinin IC isoformin A: n eks- muutokset ovat samanaikaisia ​​eturauhassyövän ellei muutos solujen ekspressioprofiileja sijaan SV40-Tag-ekspressiota muutoksia.

Vaikka ekspressiokuviota myosiinin IA isoformin ihmisen ja hiiren eturauhasen syöpä on analysoitava tarkemmin, tuloksemme tässä, jotka osoittavat yli-ihmisen ja hiiren eturauhasen syöpäsolujen linjat ja eturauhassyövän liittyy hiiren kudoksissa, viittaavat vahvasti siihen, että nimenomaan myosiinin IC isoformin voisi olla mahdollinen diagnostinen markkeri toteamiseen eturauhassyöpää.

Kiitokset

Kiitämme Ms Ellen Karasik hänen erinomaisesta tekninen tuki immunohistokemiallinen analyysi. Haluamme kiittää tohtori Wade Sigurdson ja tohtori Joan Baizer apua mikroskooppisen kuvantaminen.