Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä on aluksi riippuvainen androgeenien selviytymisen ja kasvun, joten hormonihoito kulmakivi hoito myöhäisvaiheen kasvaimia. Vaikka aluksi peruuttamista, syöpä väistämättä toistu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten androgeeniriippuvaisissa syöpäsolujen lopulta hengissä ja jatkaa kasvua alle androgen riistää ja antiandrogeeni täydennetty olosuhteissa. Kuten malli järjestelmä, käytimme androgen reagoiva PC346C solulinjaa ja sen hoito kestävä alalinjoja: PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2.

Menetelmät /Principal Havainnot

sirutekniikalla käytettiin erojen analysoimiseksi geenien ilmentymisen välillä androgen reagoiva ja terapia-resistenttejä PC346 solulinjoissa. Microarray-analyysi paljasti 487 selostukset differentiaalisesti ilmaisi välillä androgen-reagoiva ja hoito-resistenttejä solulinjoja. Useimmat näistä geeneistä oli yhteinen kaikille kolmelle terapia-resistenttejä alalinjoja ja vain vähemmistö (-5%) oli androgeenisäädellyn. Pathway analyysi osoitti rikastumista liittyviä toimintoja solujen liikkumista, solujen kasvuun ja solukuolema, sekä yhdessä syövän ja sukuelimiin sairaus. PC346DCC ilmaistaan ​​jäljellä tasoja androgeenireseptorin (AR) ja osoitti merkittävää alas-säätely androgeenin geenien (p-arvo = 10

-7). Säätely ylöspäin VAV3 ja TWIST1 onkogeenien ja tukahduttaminen DKK3 kasvaimeen vaimennin havaittiin PC346DCC, mikä viittaa mahdolliseen AR ohitus mekanismi. Myöhemmin validoivat näiden kolmen geenien potilasnäytteistä vahvistivat, että ilmaisu vapautui aikana eturauhassyövän etenemisen.

Johtopäätökset /merkitys

Therapy kestävä kasvu voi johtua mukautuksia AR koulutusjakson, mutta androgeenin riippumattomuus voidaan saavuttaa myös vaihtoehtoisilla selviytymistä mekanismeja. Täällä tunnistettu TWIST1, VAV3 ja DKK3 mahdollisina toimijoiden ohittamisesta AR koulutusjakson, mikä tekee niistä hyviä ehdokkaita biomarkkereina ja uusia terapeuttisia tavoitteita.

Citation: Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van Weerden WM, Jenster G (2010) ohitus mekanismit androgeenireseptorin Pathway in Therapy hylkivät Eturauhassyöpä Cell mallit. PLoS ONE 5 (10): e13500. doi: 10,1371 /journal.pone.0013500

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 29 syyskuu 2010; Julkaistu: 19 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Marques et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ esitetään tässä käsikirjoitus tukee taloudellisesti Alankomaiden Organization for Scientific Research (NWO), kautta ZonMW avustus 903-46-187, ja Alankomaiden Cancer Society (KWF), avustuksina NKB97-1479 ja DDHK 2001-2455. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy miesten syöpäkuolemista länsimaissa ja kasvava ongelma niille hyväksymällä länsimaisen elämäntavan ja ruokavalio. Edistysaskeleet seulonta ja diagnoosi ovat sallineet havaitseminen kasvaimia aiemmissa vaiheissa, kun parantavaa hoitoa ei vielä toteutettavissa. Myöhään vaiheessa levitetään tauti kuitenkin, nykyiset hoidot ovat vain lievittävä eikä parantavaa hoitoa ole. Koska kasvua eturauhasen kasvaimia on alunperin androgeeni-riippuvaisia, metastaattinen syöpä hoidetaan yleensä androgeeniablaatio hoidon kanssa tai ilman antiandrogeeni täydentämistä [1], [2]. Suurin osa näistä potilaista osoittavat merkittävää kliinistä regressio, mutta syöpä lopulta toistuu 12-18 kuukautta. Nämä toistuvat kasvaimet karannut androgeenireseptorin tukahduttaminen ja tuli vastustuskykyisiä hormonihoidon, kutsutaan hormoni-tulenkestävien tai kastraatio kestävä PCa. Selviytyäkseen ja jatkaa kasvua androgeenista riistää ympäristö PCa solujen on joko mukautettava androgeenireseptorin (AR) polku androgeenisäädellyn köyhdytettyä olosuhteissa tai turvautua vaihtoehtoisiin selviytymistä ja kasvua polkuja [3]. Paljon kokeellista näyttöä on tukea sekä mekanismeja, jotka eivät välttämättä ole toisiaan poissulkevia. AR ilmentyminen osoitettiin säilytetään suurin osa potilaista, jotka tehtiin hormonihoidon ja osoitti taudin uusiutumisesta, mikä viittaa rooli AR myös myöhäisessä vaiheessa tauti [4], [5]. Lisäksi AR-geeni monistetaan ja /tai yli-ilmentynyt noin 30%: n hormoni-hoidon tulenkestävät kasvaimia, ja sen on ehdotettu tämä voi herkistää reseptorin jäljellä androgen pitoisuuksia ja antiandrogeenit parhaillaan hormonihoitojen [6], [7 ], [8]. Lisäksi useat AR mutaatioita, mikä johtaa lisääntyneeseen aktiivisuuteen tai laajennettava ligandin spesifisyys vaihtoehtoisiin steroideja ja antiandrogeenit, on liittynyt taudin etenemiseen [9], [10]. Muita muunnoksia AR polku, joka voi aiheuttaa hormoni tulenkestävät kasvu sisältävät kasvaimensisäisiä steroidogeneesiä, ligandista riippumatonta aktivaatiota ylikuulumista muiden signalointireittejä, muutoksia tasapaino AR yhteistyössä sääntelyviranomaisten tai ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen typistetyn AR isoformeja [3] , [11], [12]. Mielenkiintoista, viimeaikainen työ muilta ja meidän on paljastanut, että AR polku voidaan valikoivasti heikennetty kehittynyt /etäpesäkkeitä [13], [14], [15]. Koska AR reitin on myös mukana prosesseissa solujen erilaistumisen ja eturauhasen kypsyminen on houkuttelevaa ehdottaa, että PCa solut voivat lopulta saavuttaa kasvua etu estämällä AR aiheuttama erilaistumista. Taustalla Tästä syystä olemme keskittyneet tässä tutkimuksessa vaihtoehtoisista selviytymisen ja kasvun polkuja, jotka ovat riippumattomia AR aktivointia. Tehokkaasti ohittaa AR koulutusjakson, syöpä epiteelisolujen on pystyttävä selviytymään apoptoottisten signaalien laukaisee hormonivalmisteiden ja vetoavat vaihtoehtoisia kasvun polkuja. Autokriinisen kasvutekijöiden tai sen reseptorien aktivaatio onkogeenien ja tuumorin-synnyssä ovat mahdollisia mekanismeja, ohittaen AR kautta. Sopusoinnussa tämän hypoteesin, parakriinistä kasvutekijöitä, jotka tavallisesti erittää eturauhasen strooman soluja, kuten orvaskeden kasvutekijä (EGF), insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF1), hepatosyyttikasvutekijä (HGF), keratinosyyttikasvutekijän (KGF), tai interleukiini 6 (IL6), on todettu olevan yli-ilmentymisen hormoni tulenkestävät syövän yhdessä siirtyminen autokriiniseen tuotantoon syövän epiteelisolujen [16]. Sen lisäksi, että mahdollisten mitogeenien, yhä enemmän todisteita siitä, että näillä kasvuhormonien pystyvät myös cross-talk AR signalointireitin, joka johtaa ekspressio AR kohdegeenien puuttuessa androgeenien [17]. Siksi on vielä selvitettävä, onko autokriinistä tuotantoa näiden kasvutekijöiden edustaa muuntamista tai todellinen ohitus AR signalointireitin. Muutokset antiapoptoottinen

BCL2

onkogeeni ja pro-apoptoottinen

P53

ja

PTEN

kasvaimen synnyssä on löydetty myös eturauhassyövässä [18], [19]. Nämä tapahtumat ilmenevät useimmiten ennen myöhäisessä vaiheessa etenemistä, mikä tekee niistä vähemmän todennäköisesti ehdokkaita kytkin hormoni tulenkestävät kasvun myöhäisessä vaiheessa tauti. Kuitenkin estämällä PCa solukuoleman ja uuden tasapainon kohti soluproliferaatioon liittyvien geenien säätelyyn apoptoosin voi myös olla rooli hormoni tulenkestävät kasvua.

tutkia mekanismi (t), jolla androgeeni- riippuvainen PCa solut tulevat vastustuskykyisiksi hormonihoidon, käytimme sirutekniikalla kuulustella eroja geenien ilmentymisen välillä androgen-reagoiva ja terapia-resistenttejä solulinjoja. Kuten mallijärjestelmä käytimme androgen-reagoiva PC346C solulinjaa ja sen hoito-resistenttejä alalinjoja PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2. Nämä alalinjoja olivat peräisin vanhempien PC346C pitkäaikainen androgeeniablaatio (PC346DCC), johon oli lisätty antiandrogeeni hydroksiflutamidi (PC346Flu1 ja PC346Flu2) [20], [21]. Aiemmat tutkimukset paljastivat erillisiä AR muutoksia kaikissa kolmessa hoidossa kestävä alalinjoja, jotka vastasivat erilaisia ​​mekanismi hormoni-tulenkestävien kasvua. Katsovat PC346DCC, ilmentävät hyvin alhainen AR ja PSA, ilmeni merkkejä ohittamisen AR koulutusjakson, PC346Flu1 näytteillä 4-kertainen AR ylössäätöä ja PC346Flu2 osoitettiin kuljettamaan T877A AR mutaatio. Sekä PC346Flu1 ja PC346Flu2 alilinjat toistavat etenemisen hormoni-hoidon tulenkestävät tauti kautta muutoksia AR kautta. Siksi olemme keskittyneet PC346DCC alalinjan valitsemaan geenejä erityisesti mukana ohitus AR kautta. Sen lisäksi, että uusia oivalluksia mekanismeja Eturauhassyövän eteneminen, tunnistettujen geenien tässä voi osoittautua käyttökelpoisia ennustetekijöitä markkereita ja potentiaalisia uusia terapeuttisia lähestymistapoja.

Methods

Reagenssit ja solulinjoissa

PC346C solulinja oli peräisin eturauhassyövän potilaan ei-progressiivinen eturauhasen adenokarsinooma (T4N0M0) [20], [21]. PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2 alilinjat olivat peräisin PC346C upon pitkäaikainen kulttuurin hiilellä erotettua välineellä ilman tai antiandrogeeni hydroksiflutamidi täydentämistä, vastaavasti. Kehittäminen ja karakterisointi näistä solulinjoista on julkaistu aiemmin [20], [21]. Perus käytetty viljelyneste ylläpito PC346 solulinjojen koostui DMEM-F12 -alustassa (Cambrex BioWhitaker, Belgia), jota oli täydennetty 2% naudan sikiön seerumia (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Saksa), 1% insuliinin-transferriini-seleeni (Gibco BRL), 0,01% naudan seerumin albumiinia (Boehringer Mannheim, Saksa), 10 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Sigma-Aldrich), penisilliiniä /streptomysiiniä antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä, BioWhitaker, Belgia ); ja seuraavien lisäysten: 100 ng /ml fibronektiiniä (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Alankomaat), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicalsin, Alankomaat), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM fosfoetanoliamiiniin, 0,6 ng /ml trijodityroniinin ja 500 ng /ml dexametason (kaikki Sigmalta). PC346C soluja ylläpidettiin viljelmässä täydellisessä väliaineessa edellä kuvattu, täydennettynä 0,1 nM 17-metyylitrienolonia (R1881, NEN, Boston MA, USA). PC346DCC valinta alustaan ​​lisättiin edellä kuvatulla tavalla, mutta köyhdytettyä päässä androgeenien käyttämällä dekstraani-päällystetyllä puuhiilellä (DCC) käsiteltiin FCS. PC346Flu1 ja PC346Flu2 viljelyväliaine myös androgeenin köyhdytettyä käyttämällä 2% DCC-FCS, ja johon oli lisätty 1 uM hydroksiflutamidi (OH-flutamidi, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA).

Soluja kasvatettiin T25 Primaria ™ kudosviljelypulloon (BD Biosciences Benelux NV, Hollanti) 37 ° C: ssa 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä.

Expression mikrosiruanalyysi

Solut ympättiin niiden valinta keskipitkän tavoittaa -50% konfluenssiin ja annettiin kasvaa 2 päivän ajan. Sitten solut huuhdeltiin kahdesti PBS: lla ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. Kokonais-RNA eristettiin RNAzol B reagenssilla (Campro Scientific, Veenendaal, Alankomaat) ja puhdistettiin edelleen RNeasy pylväät (Qiagen) ja on-sarakkeen DNA ruoansulatusta, mukaan valmistajan protokollaa. RNA laatu tarkistettiin 1% agaroosigeelillä.

Cy3- tai Cy5-leimatun RNA-koettimet tuotettiin sisällyttämällä amino-allyyli UTP aikana RNA-monistuksen, ja sen jälkeen kytkemällä N-hydroksisukkinimidiä modifioitu väriainetta. Lyhyesti, 3 ug RNA: ta käytettiin T7-lineaariset mRNA vahvistus protokollaa, joka on kuvattu aiemmin [22]. Amino-allyyli UTP, plus yhtä suuri määrä modifioimatonta rUTP, sisällytettiin arna T7 Megascript Kit (kaikki Ambion) mukaisesti valmistajan protokollaa. Amplified RNA puhdistettiin ja konsentroitiin käyttämällä Microcon-YM 30 saraketta (Amicon) huuhtomaan kolme kertaa 300 ul RNAasi-vapaaseen veteen. Lopuksi, 2 ug aminoallyl-modifioitua RNA: ta, on enintään 3,33 ui RNAasi-vapaata vettä, inkuboitiin 1,66 ui natriumbikarbonaattipuskuria (0,3 M, pH 9) ja 5 ui Cy3- tai Cy5 väriaine (CyScribe Post-Labeling Kit, Amersham, NJ, USA), 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin 5 ui 4 M hydroksyyliamiinia HCI: ää (Sigma), vasta-leimatut koettimet yhdistettiin ja puhdistettiin /konsentroitiin käyttäen Microcon-YM 30. Probe kerättiin 5-15 ul: n lopullisessa tilavuudessa ja suspendoitiin uudelleen 80 ul: Ambion hybridisaatiopuskuria numero 1 .

mikromatriisi käytimme double-väriaine oligoarrays eli noin 15000 ihmisen geenejä, joihin leimattu RNA kunkin terapia-resistentti alalinja oli cohybridized vastakkaisiin leimatun PC346C. Neljä mikrosirut tehtiin per ehto, käyttäen kahteen erilliseen solun kohtia väriaine-swap. Tämä tehtiin tilille biologisen vaihtelevuuden ja jättää väriaine-etuoikeutetut sitoutuminen oligonukleotidien microarray. Oligoarrays Tässä tutkimuksessa käytetyt tuotettiin Erasmus Center for Biomics. Lyhyesti, ihmisen 18584 oligonukleotideja kirjaston (Compugen, Sigma-Genosys) bongattiin päälle aminosilaanil- dioja käyttäen Virtek Chipwriter Professional ryhmittäjällä (Virtek Vision International, Waterloo, Kanada). Ohjaus paikkoja mukana maamerkkejä, tiputtelua puskuri, ulkomaalainen oligonukleotidit (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly d [A] 40-60, lohen sperman DNA: ta ja ihmisen COT-1 DNA. Ennen hybridisaatiota mikrosiru liukuu esihybridisoitiin 5 x SSC, 0,05% SDS: ää, 4% BSA-liuoksella 30 minuutin ajan 45 ° C: ssa, pestiin kahdesti RNAasi-vapaata vettä 2 minuutin ajan, huuhdeltiin isopropanolin ja spin-kuivattiin 3 minuuttia 1500 g. Microarray hybridisaatiot suoritettiin yön yli 45 ° C: ssa, jatkuvasti sekoittaen, joka HS4800 Hybridization Station (Tecan Benelux BV). Lopuksi paneelit pestiin automaattisesti Hybridisaatio Station käyttäen: 2 x SSC /0,05% SDS (45 ° C), 1 x SSC ja 0,2 x SSC (huoneenlämmössä), ja kuivattiin N2- virrassa, ennen skannausta.

Data louhinta ja analysointi

Array skannattiin on ScanArray Express HT skanneri (Perkin Elmer, Nederland BV) ja spot intensiteetit kvantitoitiin käyttäen Imagene ohjelmistoa (Bio Discovery Inc, El Sequndo, CA, USA ). Tasapainottamiseksi Cy3 ja Cy5 paikalla intensiteettiä, Loewess normalisointi per alaryhmä suoritettiin käyttäen Limma-paketti (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) peräisin Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [23] , [24]. Mittakaavassa välillä paneelit, globaalin mediaani intensiteetti ryhmää kohti asetettiin 1000. Dye intensiteettiä alle 200 sitten kynnysarvo 200, minimoimaan melun ja tehdä kertamuutosta matalan intensiteetin alue vankempi vastaan ​​poikkeavia havaintoja. Täplien intensiteetti kynnyksen alapuolella (200) sekä Cy3 ja Cy5-kanavien yli 2 4 paneelit suoritetaan kohti alilinja suljettiin pois analyysistä. Näyte viitata suhteet laskettiin sitten ja 2log muuttunut. Paikkoja, jotka osoittivat vastapäätä vaikutuksia väriaine-swap /biologinen rinnakkaista jätettiin lisäanalyysiä; vaikutuksia kutsuttiin vastapäätä jos keskiarvo 2log suhdelukua kohden alalinja oli ≥0.5 yhden väriaineen ja alle ≤-0.5 väriaine-swap. Sen jälkeen normalisointi ja kaikki edellä mainitut laadun valvonta, 2log intensiteettisuhteet laskettiin keskiarvo kopiot kunkin alalinjan. Nämä tiedot tallennettiin SRS7 (Sequence Retrieval System versio 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Saksa), joka oli myös käytetty vertailuja muihin aiemmin julkaistu /julkiset tietokannat [25]. Microarray aineisto talletetaan Gene Expression Omnibus arkistoon (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/alle GEO hakunumerolla GSE21596). Hierarkkinen klusterointi ja visualisointiin suoritettiin käyttämällä Cluster ja TreeView ohjelmat (Eisen Labs: https://rama.lbl.gov). Merkitys analyysi mikrosirut (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) käytettiin sen määrittämiseksi, mitkä geenit olivat tilastollisesti erilaiset stimuloitujen näytteiden ja ei-stimuloiduissa viittauksia. Gene ontologia klustereiden tehtiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [26], [27]. Reitti ja toiminnalliset analyysit luotu käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

cDNA-synteesi ja RT-PCR-analyysi

Normaali ja kasvaimen yksilöitä potilaat käytetään kvantitatiivista tosiaikaista RT-PCR-analyysi saatiin jäädytetty kudospankille Erasmus Medical Center (Rotterdam, Alankomaat). Näytteet kerättiin vuosina 1984 ja 2001. koemenettelyn hyväksyi Erasmus MC Medical eettisen komitean mukaan Medical Research ihmiseen kohdistuvan Act. Lisätietoja näistä näytteistä annettiin aiemmin. [28] Kokonais-RNA eristettiin edellä kuvatulla tavalla, ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä MMLV-käänteistranskriptaasia kit ja Oligo (dT)

12-18-aluketta (Invitrogen), mukaan valmistajan protokollaa. cDNA näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa. TaqMan reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems), mukaan valmistajan ohjeiden. Validoitu alukkeet ja koettimet TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) käytettiin kvantifiointia VAV3 (Hs00916821_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1), DKK3 (Hs00951307_m1) ja GAPDH (Hs99999905_m1), mukaisesti PCR-antamat asetukset Applied Biosystems. PBGD kvantifioitiin käyttäen 0,33 uM alukkeita eteenpäin: CATGTCTGGTAACGGCAATG ja reverse: GTACGAGGCTTTCAATGTTG alukkeet, Power SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), mukaan lämpöjaksotukselle protokollan valmistajan suosittelemia. Transcript määrä jokaisen näytteen normalisoitiin vastaan ​​keskimäärin kaksi endogeenisen viittauksia ja suhteessa kalibraattori. Kaksi siivous geenejä käytettiin endogeenista viitteet olivat

PBGD

ja

GAPDH

; seos cDNA eturauhasen ksenografteja käytettiin kalibraattori. Kaaviot ja tilastot suoritettiin GraphPad Prism (versio 3.0). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Differential geeniekspressioprofiili välillä androgeenisäädellyn reagoiva PC346C ja sen hoito kestävä alalinjoja

Expression erilaisia ​​analyysi suoritettiin tutkia, onko AR-reitti on edelleen aktiivinen hormoni-hoidon tulenkestävä soluilla androgen riistää olosuhteet ja tunnistaa otaksuttu vaihtoehtoisia kasvu /eloonjäämisreittejä. Kukin hoito-resistenttejä alalinjoja viljeltiin niiden selektioelatusaineessa (steroidi-riisuttu väliaineessa PC346DCC, johon oli lisätty 1 uM OH-FLUTAMIDE varten PC346Flu1 ja Flu2) ja hybridisoitiin on mikrosiruja, yhdessä vanhempien androgen reagoiva PC346C (viljellyt täydellisessä väliaineessa täydennettynä 0,1 nM R1881). Huomioimaan biologisen vaihtelevuuden ja väriaine-preferentiaalisesta sitoutumisesta oligonukleotidien microarray, neljä taulukot tehtiin per ehto, käyttäen kahta itsenäistä solua kohtia väriaine-swap. Vaihtelu ilmentymiskuvio analysoitiin per hoito kestävät alalinja, ja täplät katsottiin ekspressoitua eri jos absoluuttinen 2log suhde ≥ 0,5 (suhde ≥ 1,42 tai ≤0.71) vähintään kolme 4 paneelit ja keskiarvo kaikkien 4 taulukot. Niiden mukaan oli yhteensä 487 säädellään eri tavalla transkriptien terapiassa kestävä alalinjoja verrattuna androgeenista herkkä PC346C, joista suurin osa päällekkäisten kaikki kolme tulenkestävä alilinjat (Fig. 1). 276 säädellään eri tavalla selostukset, PC346DCC voimakkaimmin poikkeamista vanhempien linjan, kun taas PC346Flu2 paljasti vähiten muutoksia (127 selostukset). Merkitys Analyysi mikrosirujen (SAM) käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä valitun geenien ja kello 5% vääriä löytö korko, 392 ja 487 (80%) on valittu olivat tilastollisesti merkitseviä. Top 100 ilmentyvät eri geenien välillä hoidon kestävä ja androgeenin reagoivien solulinjojen, kunkin ilmaisu suhteet ja tilastollinen analyysi on esitetty taulukoissa 1 ja 2. Kattava luettelo kaikista säänneltyjen geenit kohti alilinja annetaan taulukoissa S1-S3 . Mielenkiintoista on, että huomattava osa (64/487) differentiaalisesti geenien ryhmittyneet erillisissä genomisen paikkoihin kromosomeissa 4, 5, 6, 8, 11 ja 18 (p-arvo 0,05; taulukko 3).

PC346C viljeltiin täydellisessä väliaineessa 0,1 nM R1881, kun taas hormoni tulenkestävät alalinjoja olivat kulttuurin dekstraanipäällysteisellä puuhiilellä puhdistettua väliaineessa (PC346DCC), jota on täydennetty 1 uM antiandrogen hydroksiflutamidi (PC346Flu1 ja PC346Flu2). A) Heat-kartta edustus: punainen ja vihreä väri edustaa ylössäätöä ja alassäätöä, vastaavasti, kun taas musta ei osoita eroa alilinjat ja vanhempien PC234C soluja. Harmaa neliöt ilmoittavat tiedon puuttumisen, joko alhaisen ekspressiotasoja, huono tietojen laatua tai puuttuminen koettimien vastaavan transkriptin array alusta käytetään tutkimukseen. B) Venn-kaavio Säänneltyjen geenien eri alilinjat.

AR polku on säädellä vähentävästi PC346DCC

tutkimiseksi aktivoinnin tila AR väylän PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2, SRS tietokantaa käytetään linkittämään ja vertailla esillä tietoa, joka aiemmin määritettyihin androgen-vaste geeni allekirjoitus (Fig. 2A). Tämä androgeeni-vaste allekirjoituksen määritettiin ilmentämällä mikrosiruanalyysillä stimulaation jälkeen eri PC346 solulinjat synteettisen androgeenin R1881 tai antiandrogeeni hydroksiflutamidi (taulukko S4). Niistä 487 differentiaalisesti säädelty transkriptien terapiassa kestävä alalinjoja, vain 27 oli AR-kohdegeenien ( 6%), mikä osoittaa, että muita geenejä ja reitit ovat mukana myös hormoni-terapiassa tulenkestävä leviämisen näiden alilinjat. Lisäksi AR-kohdegeenien oli säädellä vähentävästi PC346DCC (p-arvo = 10

-7), kun taas niiden ilmaisun PC346Flu1 ja PC346Flu2 ei vaikuttanut merkittävästi (Fig. 2B). Vaikka ei ollut tilastollisesti merkitsevä AR reitin koko, PC346Flu1 ja PC346Flu2 teki heikompi induktion noin androgen reagoiva geenejä, kuten KLK2, STEAP1, STEAP2 ja EHF.

differentiaalisesti ekspressoidun geenin PC346 hormonin -refractory alalinjoja vs. vanhempien PC346C liittyivät aiemmin perustettu androgen-vaste geeni allekirjoitus (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa). (A) Heat-kartta esitys androgen reagoiva geenien vapautettiin tahansa PC346 hormonin tulenkestävä alalinjoja. Väriteema kuvatulla kuvassa. 1. (B) Venn-kaavio ja tällaisiin tilastoihin.

Gene ontologian ja koulutusjakson analyysi jakautuu syöpä allekirjoitus

Valitut 487-geenin allekirjoitusta luokiteltu Gene ontologia (GO) biologiset prosessit käyttävät Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) [26], [27]. Lisäykset klustereiden analyysi osoitti rikastumista luokkiin mukana elimessä kehittämiseen, sukuelimiin erilaistumista, solujen kasvua, erilaistumista ja apoptoosia (taulukko 4). Kekseliäisyyttä Pathway Analyysi käytettiin tunnistamaan rikastamisen ”sairaudet ja häiriöt”, ”molekyyli- ja solutason toimintoihin”, ja hakea luontaisia ​​reittejä /-verkkojen valitun geenin sarjaa (www.ingenuity.com). Syöpä ja sukuelimiin taudista sijoittuu alkuun 3 ”sairauksien ja häiriöiden”, joka loogisesti vahvisti rikastamiseen liittyvien geenien PCA kuten hepsiinin, klusteriinin, D-vitamiinin reseptorin, apilatekijän 3, tuumoriproteiinia D52, AR itse ja useat sen kohdegeenien (Fig. 3A ja 3B, vastaavasti). Lisäksi käytimme Verkostoanalyysi seulomaan 276-geenin allekirjoitus PC346DCC mahdollisten vaihtoehtoisia kasvun polkuja, jotka voisivat olla mukana ohi AR signalointi. Mielenkiintoista, signalointi kautta kasvu-hormonin reseptori (GHR), insuliinin reseptori (INSR) ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori oli kärjessä 10 Networks (pistemäärä = 20) osoittavat sääntelyn purkamisen PC346DCC (Fig. 3C).

Top 5 biologisia toimintoja rikastettu hoito-resistenttejä alalinjoja: (A) sairaudet ja häiriöt, (B), molekyyli- ja solutason toimintoihin. (C) Esimerkki Network analyysin PC346DCC osoittaa vapauttamiseen hormoni ja kasvutekijää reseptorin signalointi: up-geenien ovat edustettuina punaisella ja tukahdutettu geenejä vihreänä. Analyysi tehtiin käyttämällä Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto (www.ingenuity.com).

Integratiiviset analyysi paljastaa geenejä vapautettiin eturauhassyövän etenemiseen

geenien tunnistamiseen moduloidaan PCa että selittäisi hormoni-hoidon tulenkestävä kasvuun ohitus AR koulutusjakson, me liittyy 276-geeni allekirjoituksensa PC346DCC käsittävissä seitsemän PCa microarray tutkimuksia julkaistu aiemmin (taulukko 5) [14], [29], [30], [31 ], [32], [33], [34]. Vain geenejä läsnä vähintään 5/7 tietokantoja (209 geenit) ja vapautettiin vähintään 3/7 (111 geenit) olivat mukana lisäanalyysiä. Hierarkkinen ryhmittely suoritetaan allekirjoituksen geenit (ensimmäinen sarake), vieressä ensisijainen syöpä vs. normaalissa eturauhasessa (toinen sarake), metastaattinen syöpä vs. ensisijainen syöpä (kolmas sarake), ja lopuksi hormoni tulenkestävät vs. hormoni-naiivi tauti (neljäs sarake ), on esitetty kuviossa. 4. Noin 30% geeneistä differentiaalisesti ilmaistut PC346DCC havaittiin johdonmukaisesti vapautettiin metastaattisessa PCa verrattuna elimeen rajoittunut tauti.

276-geeni allekirjoituksensa PC346DCC liittyi tietoja 7 eturauhassyöpään microarray tietokannat ensisijainen (Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu), metastaattinen (Chandran, Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu) ja hormoni-hoidon tulenkestävä kasvaimet (Tamura, Tomlins ja paras). Vain geenejä läsnä vähintään 5/7 tietokantoja (209 geenit) ja vapautettiin vähintään 3/7 (111 geenit) sisällytettiin analyysiin. Heat-kartta edustus (A) 72 ilmentynyt ja (B) 39 tukahdutettu geenejä PC346DCC. (C) vapautettiin geenit valitaan edelleen qPCR analyysiä. Väriteema kuvatulla kuvassa. 1. Grey neliöt ilmoittavat tiedon puuttumisen, joko alhaisen ekspressiotasoja, huono tietojen laatua tai puuttuminen koettimien vastaavan transkriptin array alusta käytetään tutkimukseen. PC-NAP: eturauhassyöpä miinus normaali viereinen eturauhasen; MET-PC: etäpesäke miinus ensisijainen eturauhasen kasvaimia; HR-HN: hormoni-hoidon tulenkestävät miinus hormonia naiivi kasvaimia.

TWIST1, DKK3 ja VAV3 markkereina taudin diagnosointiin ja ennusteen

Perustuen niiden tunnustettujen patologinen tehtävät ja johdonmukainen sääntelyn useita PCa tietokantoihin, twist-homologi 1 (TWIST1), VAV 3 guaniininukleotidiä vaihto tekijä (VAV3) ja dickkopf homologin 3 (DKK3) valittiin niiden mahdollisen roolin ohituksen AR kautta. Tällä tavalla TWIST1 ja VAV3 ovat otaksuttu onkogeenien mukana kasvuhormonin signalointi, joka käy ilmi Ingenuity Pathway Analysis (Fig. 3C). Toisaalta, DKK3 on tuumorisuppressori osoittaen alassäätöä että aineistot alkaen Chandran

et al.

, Lapointe

et al.

Ja Varambally

et al.

(Fig. 4C). Kun taas TWIST1 osoittivat johdonmukaisesti ylössäätöä perus- ja metastasoituneen PCa aineistoja alkaen Varambally

et al.

, Yu

et al.

, Lapointe

et al.

Ja Chandran

et al.

, VAV3 oli säädellä vähentävästi primaarikasvainten seurasi ylössäätöä in etäpesäkkeitä (Fig. 4C).

kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin riippumaton sarja eturauhasessa saatu by eturauhasen tai höyläysleikkaus eturauhasen potilaiden toimiessa Erasmus MC klinikalla. Tämä paneeli sisälsi 21 hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä ja 74 adenokarsinoomista eri tauti vaiheissa. Kvantitatiivinen PCR-analyysi osoitti säätely ylöspäin TWIST1 perusterveydenhuollossa PCa näytteiden ja imusolmuke etäpesäke (P-arvo = 0,0001 ja 0,002, tässä järjestyksessä). Eroa ei havaittu hormonin tulenkestävä (HRPC) ja hormoni-naiivi kasvaimet (HNPC) (Kuva. 5A). DKK3 ilmentyminen oli merkitsevästi vähentynyt PCA ja imusolmuke etäpesäke (P-arvo ≤0.0001), vaikka mitään eroa ei havaittu etenemistä elimeen rajoittunut metastaattinen tai hormonia tulenkestävä tauti (Fig. 5B). VAV3 ilme laski asteittain vuoden PCa etenemistä, joilla on vähiten havaittu metastaattisessa eturauhaskasvaimissa (P-arvo = 0,0001 Post lineaarisen trendin testi) ja hormoni tulenkestävät näytteet (P-arvo = 0,005 HNPC vs. HRPC; Fig. 5C ). Imusolmuke näytteet poistettiin VAV3 analyysi on esitetty. 5C, koska VAV3 oli hyvin ilmentyy normaaleissa imusolmuke verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksia (tietoja ei esitetä). Näissä asetuksia, läsnäolo jäänteitä normaali imusolmukekudoksesta voi johtaa yli-arvio todellisesta VAV3 määrä imusolmuke etäpesäke. Kaplan-Meier-analyysi osoitti suoraa korrelaatiota VAV3 ilmaisun ja etäpesäkkeiden elinaika (P-arvo = 0,004 varten logrank suuntaus testin Fig. 5D).

eturauhaskasvainnäytteissä saatiin eturauhasen tai höyläysleikkaus eturauhasen potilaiden toimiessa Erasmus MC klinikalla. Tämä paneeli sisältää 21 hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä ja 74 adenokarsinoomista eri tauti vaiheissa. (A) TWIST1; (B) DKK3; (C) VAV3 ilmentyminen eturauhasessa; (D) VAV3 etäpesäke elinaikaa analyysi. NAP: normaali viereinen eturauhanen; PC: ensisijainen eturauhassyöpä; LNmet: imusolmuke etäpesäke; PC-Met: ei-progressiivinen elin-Confine eturauhassyöpä; PC + Met: primaarikasvaimen progressiivisesta eturauhassyöpään, että joko oli tai kehittänyt etäpesäkkeitä myöhemmissä seurannan; HN: hormoni-naiivi; HR: hormoni-terapia tulenkestävä; (*) P-arvo ≤0.0001 ja (**) p-arvo ≤0.005 käyttäen Mann-Whitneyn kaksisuuntaisia ​​testi. (***) P-arvo ≤0.0001 Post lineaarisen trendin testi.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme mikrosiruanalyysi tunnistaa eroja geenin ekspressiokuviota androgeenin reagoiva PC346C solulinjaa ja sen hoito-resistenttejä alalinjoja: PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2. Tämä analyysi havaittu 487 selostukset säädellään eri tavalla hormoneja hoito tulenkestävä soluihin verrattuna vanhempien PC346C. Monet näistä olivat yhteisiä kaikille terapia-resistenttejä alalinjoja huolimatta eri AR koulutusjakson muutoksia, mikä viittaa samanlainen kasvua edistäviä muutoksia (Fig. 1). Nämä yhteiset geenit voidaan jakaa neljään pääryhmään: säätely solusyklin etenemisen ja lisääntymistä (ex. HPN, NDN, ATR, ABL2, DHRS2), kehitys ja solujen erilaistumista (CLEC3B, KCNJ8, ADAM29, DNMT3A), rasvahappojen ja steroidi