Krooninen sairaus

tiivistelmä

Luonnostaan ​​radioherkkyyttä on tärkeä tekijä taustalla sädehoidon vastausta, mutta ei ole mitään menetelmää sen rutiini arviointi ihmisen kasvaimissa. Gene allekirjoitukset parhaillaan johdetaan ja joitakin aiemmin tuottaman ilmaisun profilointi NCI-60 solulinja paneelissa. Se oli arveltu, että keskitytään enemmän homogeeninen kasvaintyypeille olisi parempi lähestymistapa. Kaksi solulinjaa ikäluokat käytettiin peräisin kohdunkaula [n = 16] sekä pään ja kaulan [n = 11] syöpiä. Radioherkkyyttä mitattiin eloonjääntifraktio seuraava säteilytys 2 Gy (SF2) by klonogeeniset määrityksessä. Differential geenien ilmentymisen välillä säteilylle ja säteilyresistenteille solulinjoissa (SF2 / mediaani) tutkittiin käyttäen Affymetrix GeneChip- eksoni 1.0ST (kohdunkaula) tai U133A Plus2 (pään ja kaulan) rakenteet. Oli eroja solulinjassa kohortteja liittyvät kudoksen alkuperän heijastuu ilmaus kerrostunut epiteelin merkki p63. 138 geenejä tunnistaa näiden liittyy SF2, vain 2 (1,4%) olivat yhtenevät välillä kohdunkaula ja pään ja kaulan sinoomasolulinjoja (MGST1 ja TFPI), ja nämä eivät osio julkaistun NCI-60 solulinjoissa perustuu SF2. Siellä oli vaihteleva menestys soveltamisessa kolmesta julkaistusta radioherkkyyttä allekirjoituksia meidän ikäluokat. Yksi geeni allekirjoitus, alun perin koulutettu NCI-60 solulinjoissa, teki osittain erillinen herkkiä ja resistenttejä solulinjoja kaikissa kolmessa solulinjassa aineistoja. Havainnot eivät vahvista meidän hypoteesia, vaan viittaavat siihen, että yhteinen transkription allekirjoitus voi heijastaa radioherkkyyttä kasvainten heterogeenisten alkuperää.

Citation: Hall JS, Iype R, Senra J, Taylor J, Armenoult L, Oguejiofor K, et ai. (2014) tutkiminen radioherkkyyttä Gene Allekirjoitukset Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (1): e86329. doi: 10,1371 /journal.pone.0086329

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 29 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 9. joulukuuta 2013. Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Hall et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Cancer Research UK (C1094 /A9437, C1467 /A7286, ja C147 /A6058), Medical Research Council UK (GO801525), ja ECMC (C1467 /A7286) tuki tätä tutkimusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Mark J O’Connor työskentelee AstraZeneca. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Muut kirjoittajat ilmoittavat, ettei eturistiriitoja. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa.

Johdanto

Luonnostaan ​​radioherkkyyttä on tärkeä tekijä taustalla sädehoidon vastaus [1]. Radioherkkyyttä voidaan mitata osa solujen elossa yhden 2 Gy säteilyannoksen (SF2) korkea arvo osoittaa radioresistance. Vaikka muut menetelmät ovat käytettävissä mitata solujen radioherkkyyttä solulinjoissa, SF2 pidetään kultakantaan ja tukevat vahvaa kliinistä näyttöä.

In vitro

mittauksissa SF2 korreloi

in vivo

radioresponse hiirimalleissa [2]. Mittaus SF2 primaarisissa ihmisen kasvaimissa oli itsenäinen ennustetekijä potilailla, joilla on syöpä kohdunkaula [3] sekä pään ja kaulan [4] Seuraavien mahdollisesti parantava sädehoitoa. Vaikka näyttöä sen merkitys, ei menetelmä on käytettävissä sen rutiini arviointia potilaille, johtuen epäkäytännöllinen mitata kasvaimen radioherkkyyttä. Kyky mitata kasvaimen radioherkkyyttä olisi suuri edistysaskel ja mahdollistaa yksilöllisen hoito vähentää annosta ja /tai jättää kemoterapia potilailla, joilla on herkkä kasvaimia tai päinvastoin tehostaa hoitoa vastaan ​​resistenttejä kasvaimia. Hoito yksilöllistämisen pitäisi lisätä selviytymisen ja vähentää sairastuvuutta. Arvioiden mukaan biologisesti yksilöllinen lähestymistapa hoitoon perustuvan radioherkkyyttä testaus voisi lisätä selviytymisen hinnat 10% [5].

Näin ollen on kiinnostusta johtuvat geeni allekirjoitus, joka heijastaa radioherkkyyttä. Useita menetelmiä on tutkittu: tunnistetaan geenit indusoitu seuraava säteilytys solulinjoissa [6]; tunnistamiseen differentiaalikaavojen välillä aiheuttama säteilyresistenteille ja vanhempien säteilylle syövän solulinjoissa [7] ja profilointi

in vitro

vasteen kohdunkaula kasvaimia säteilylle [8]. Useimmat julkaistut tutkimukset olivat pieniä ja eivät ole itsenäisesti validoitu. Kattavin tutkimuksissa käytettiin NCI- 60 paneeli solulinjoja [9]. Yhdessä tutkimuksessa tunnistettiin 22 geeniä, jotka yhdessä syrji matalan ja korkean SF2 arvot 63 solulinjoissa, joka perustuu kynnyksellä 0,2 (eli solulinjoissa, joissa on alle 20% yhdyskunnan eloonjäämiseen Seuraavat 2 Gy määritellään säteilylle) [10]. Toinen sarja tutkimuksia kehittäneet ennakoivaa luokittelija on radioherkkyyttä perustuu SF2 liittyy geeniekspressioprofiilien NCI-60 linjaa [11], [12], [13], [14]. Päätepistettä Näiden tutkimusten oli regressiomallin 10-napa geenejä, joilla oli ennustetekijöitä merkitystä sovellettuna kolmesta kliinisestä aineistoja (peräsuolen, ruokatorven ja pää kaulasyöpiä) [13] ja oli myös ennustava hyötyä sädehoidon rintasyövässä [15]. Lisäksi meta-analyysi Julkaistujen tietojen neljästä mikrosirujen alustat NCI-60-solujen tunnistettu 31 geeniä radioherkkyyttä allekirjoitusta [16].

NCI-60 paneeli on laajimmin tunnettu siitä asettaa syöpäsolun linjat ja julkinen resurssi, jota käytetään usein seulonta väline lääkeaineiden [9]. Paneeli sisältää solulinjat useista kudoksista peräisin, mutta harvat radiobiologically asiaan kasvaintyypeille kuten kohdunkaulan (n = 0) tai pään ja kaulan (n = 0), eli syövät jossa sädehoito on tärkeä osa hoitoa. On hyvin tunnettua, että tuumorit, jotka ovat peräisin eri kudoksista vaihdella radiosensitivities; joilla oli hematologisia syöpäsairauksia herkkyys, ja glioblastooma ja ihosyövän kaikkein säteilyresistenteille [17]. Tutkimukset osoittavat, että pohjapinta geeniekspressiotasot korreloivat vahvasti kudoksen alkuperän, erityisesti välillä hematologisia ja kiinteitä kasvaimia [10]. Sinänsä huomattavaa vaihtelua ja kohinaa on läsnä NCI-60 ”pohjapinta” geenien ilmentyminen tietojen mahdollisesti vaikeuttaa tunnistamista liittyvien geenien SF2. Transkriptiotekijä P63 on merkkiaine levyepiteelisyöpä alkuperää ja säätelee monia geenejä, jotka liittyvät epi- /levyepiteeliperäinen kohtalon. Loss of p63 liittyy ylössäätöä liittyvien geenien entistä mesenkymaalisten /vaeltavia solukohtalo- [18].

Se hypoteesi, että johtamiseksi radioherkkyyttä allekirjoituksen käyttäen yhtenäisempi ryhmä solulinjojen olisi parempi lähestymistapa. Saimme 16 kohdunkaulan sinoomasolulinjoja, kasvaimen tyypistä, jos sädehoidon on tärkeää, mutta se ei ole edustettuna NCI-60 paneeli. Solut tunnettu tiukasti kontrolloitua pohjapinta olosuhteissa; mitattiin mukana SF2, proteiinin ilmentyminen käänteisfaasi-proteiinin array (ZeptoMARK) ja geenin ilmentymisen Affymetrix eksoni 1.0ST array. Yritimme tunnistaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti korkean ja matalan SF2 solulinjojen yhden homogeenisen kasvaimen tyyppi. Meillä oli pääsy toinen itsenäinen radiobiologically-asiaan pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) solulinja kohortti (n = 11) vahvistaa havaintomme ja ne on johdettu julkisesti saatavilla NCI-60 data.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

Neljätoista kaupallisesti saatavilla kohdunkaulan karsinooman solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC) tai japanilaisen Collection of Research Bioresources (JCRB). Kaksi muuta solulinjat (778 ja 808) saatiin talon [19]. Kaikki kohdunkaula solulinjoja viljeltiin samanlaisissa olosuhteissa: 4,5 g /l glukoosia DMEM plus Glutama- (Life Technologies, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Lot: A04305-0160, PAA Laboratories (Yeovil, Iso-Britannia )) ja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa. Yksitoista pään ja kaulan solulinjoja viljeltiin kuten kuvattu taulukossa S1. Kaikki solulinjat tehtiin STR todennus ja olivat mykoplasma ilmainen.

klonogeeninen Analyysit

Menetelmä on kuvattu muualla [20]. Lyhyesti, eksponentiaalisesti kasvavat solut trypsinoitiin ja säteilytettiin 0-10 Gy huoneenlämpötilassa käyttäen X-ray yksikön annos-nopeudella 1,37 Gy /min. Sen jälkeen pinnoitus ja 2-3 viikkoa kasvu, muodostuneiden pesäkkeiden värjättiin Crystal violetti ja ne, joilla 50 solua sijoitettiin. Kussakin kokeessa mukana on vähintään kolme, mutta yleensä kuusi teknistä rinnakkaisnäytettä ja kokeet toistettiin kaksi (n = 4) tai kolme (n = 21) kertaa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo biologisen toistojen.

HPV-genotyypin

HPV genotyypin Näiden kohdunkaulan karsinooman solulinjoissa kuvattu aiemmin [21]. Pään ja kaulan sinoomasolulinjoja qRT-PCR E2, E6 ja E7 varten HPV16 ja HPV18 suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22].

MTT-määritys

kaksinkertaistaminen aikaa arvioitiin kunkin solun riville CellTiter 96 Aqueous kuin radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison, WI, USA) kohti valmistajan ”yhdessä yössä” protokollaa. Standardi 7 päivän kasvun käyrä suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Kolorimetrinen lukemat otettiin 570 nm ja verrataan, jonka eksponentiaalinen regressio standardikäyrään tunnettujen solutiheyden. Keskimäärin kolme riippumatonta toistoa eri tiheyden avulla laskettiin keskimääräinen kahdentumisaika.

RNA uuttaminen

Solut pestiin PBS: ssä ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä. RNA uutettiin ja DNaasia hoitaa käyttäen Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, UK), kuten valmistajan ohjeiden. RNA eheys (RIN) ja määrällinen mitattiin käyttämällä Bioanalyser (Agilent Technologies Ltd, Santa Clara, CA, USA). 260/230 ja 260/280 suhteet arvioitiin käyttämällä Nanodrop 1000 Spektrofotometri (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Western-blottaus

p63-proteiini asema kohdunkaulan sinoomasolulinjoja oli kuvattu aiemmin [21]. Käyttäen samoja menetelmiä Western blotting suoritettiin pään ja kaulan solulinjoissa, käyttäen seuraavia vasta-aineita: p63 hiiren monoklonaalinen (BC4A4) (Abcam, Cambridge, UK) ja anti-β-Actin hiiren monoklonaalinen (klooni AC-15) (Sigma -Aldrich, Dorset, UK).

ZeptoMARK Käänteisfaasi Protein Arrays

Eksponentiaalisesti kasvavat solut pestiin PBS: llä, hajotettiin 75 ul: CLB1 lyysipuskuria (Zeptosens: Division of Bayer ( Schweiz) AG, Sveitsi), kaavittiin mikrosentrifugiputkiin, vorteksoitiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Näytteet sentrifugoitiin 15000 rpm: llä huoneen lämpötilassa, supernatantit kerättiin ja pitoisuudet määritettiin Bradfordin määrityksellä. Tiputtelua menettely on kuvattu aikaisemmin [23]. Lyhyesti, kohdunkaula syöpä proteiini lysaatit standardoitu 2 mg /ml, josta neljää (0,20, 0,15, 0,10 ja 0,05 mg /ml) nähtiin kahtena päälle ZeptoMARK hydrofobinen sirun (Zeptosens). Kukin solulinja itsenäisesti kasvanut ja korjattu kahteen otteeseen; Näin ollen kahden biologisen rinnakkaista nähtiin päälle jono. Chips blokeerattiin CeLyA puskurilla (Zeptosens), ennen inkubaatiota primaarisilla vasta-aineilla 22 tuntia 20 ° C: ssa. Kaksikymmentäneljä vasta-aineita (Zeptosens) valittiin perustuen niiden rooli syövän tai terapian vastus [24]. Inkuboinnin jälkeen ylimäärä primaarinen vasta-aine poistettiin ja fluoresoivasti leimattua lajien vasta-aineen hybridisoitiin 2,5 tunnin ajan 20 ° C: ssa. Pesun jälkeen taulukot luettiin ZeptoREADER (λ

ex /λ

em = 635/670 nm). Saatu suhteellinen fluoresenssin voimakkuus (RFI) laskettiin standardikäyrästä, joka on rakennettu neljästä pitoisuudet (kahtena kappaleena). Tämä on kvantitatiivinen proteiini mittaus. Arvot näkyvät ovat keskiarvo kahden biologisen näytteitä (eli 4 standardikäyristä).

eksoni Array Hybridisaatio

100 ng RNA: ta monistettiin käyttäen NuGen WT-Ovation FFPE v2 kit (NuGen Technologies, San Carlos , CA, USA). WT-Ovation eksoni moduuli V1.0 käytettiin synnyttämään ST-cDNA: n ja 4 ug hybridisoitiin ihmisen eksoni 1,0 ST paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Lisätietoja ja raakadatan (CEL-tiedostot) ovat saatavilla https://bioinformatics.picr.man.ac.uk/vice (tai GEO: GSE39066 (osa Super sarjassa GSE39067). Raakadata HNSCC solulinjoja ovat saatavilla GEO : GSE51370.

eksoni Array data Analysis

Microarray data normalisoitiin käyttäen RMA [25]. R /Bioconductor paketti

annmap

ja annmap tietokannan [26] käytettiin poistamaan ei-eksoni ja multi-kohdistaminen probesets. Array suorituskykyä mitattiin prosenttiosuutena probesets merkitty ”läsnä” konservatiivinen cut-off (% Detection taustan ylittävänä [% DABG]

P

0,01 ) ja vain ne probesets merkitty ”läsnä” vähintään kolme näytettä säilytetään. Tämä suodatus vähensi probesets pohdittu 1411399 ja 353981 eksoni probesets, joista 243301 läpäisi DABG suodatuksen. Gene taso yhteenvedot laskettiin ottamalla mediaani signaalin suodatettu probesets että kartoitettu ainutlaatuinen geeni symboleja. Kun tiivistää tämä johti 31345 geenejä harkita. Valvomatta hierarkkinen klusterointi suoritettiin 1000 eniten variantin geenejä (paremmuusjärjestykseen variaatiokerroin) näyttää erottaminen näytteistä perustuu kaikkein muuttuja geenien data ja minimoida laskennallinen vaatimukset. Allekirjoitus Generation: Geeni allekirjoitus määritettiin joukko geenejä tai probesets, joita on huomattavasti ilmentyvät differentiaalisesti kahden ryhmän välillä solulinjojen mukaan joko Limma tai Rank Tuotteen analyysi. Cut-off merkitys oli väärä löytö korjattu p-arvo on 0,01. Paketit: R: 3.0.2, Annmap: v1.2.1 käytetään ihmisen tietokantaa rakentaa 66, Limma: 17.03.26, RankProd: 2.32.0, Pheatmap: 0.7.7.

Validation Kohorteissa, Array kartoitus ja Data analyysi

Pään ja kaulan solulinja Affymetrix U133A Plus2 array tiedot olivat RMA normalisoitiin käyttämällä

affy

paketin R. Affymetrix ohjaus probesets ( ’AFFX’ selityksin) poistettiin. Sillä varianssianalyysi, _x_, _a_ ja _s_ selityksin probesets poistettiin myös. NCI-60 – Affymetrix Plus2 cel-tiedostot ladattiin CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/) ja RMA normalisoitu kuin ennen. Normalisoinnin jälkeen, jäljitellä paneelit kunkin solulinjan laskettiin keskiarvo. Vertailun geeniin tason yhteenveto eksonin array data, Plus2 probesets kartoitettiin geenien symboleja

annmap

.

radioherkkyyttä Allekirjoitus Mapping

Kaikki allekirjoitukset levitettiin geeniin tason yhteenvedot kohdunkaula tietoja käyttämällä geeniä symboli kartoitus. Soveltamisen allekirjoitukset HNSCC ja NCI-60 Affymetrix Plus 2 aineistoja, seuraavia protokollia käytettiin:

Probeset tunnukset varten Eschrich

et al

[13] Kymmenen napa geenit otettiin Taulukko 3 ryhmästä ensimmäinen paperi [13]. NCI-60 testijärjestelyä solulinjat olevassa taulukossa 4 ryhmästä toiseksi paperi [12]. Kaksitoista solulinjoja luettelossa, mutta ei ollut vastaavaa Plus2 matriisia rintojen solulinjan MDN.

Neljä parasta sijoitusta geenien Torres-Roca

et al

[14] (

RPIA , RBBP4, RGS19, ZNF208

) on kartoitettu Affymetrix Plus2 probesets käyttämällä

annmap

. Vastaava lauseke tiedot probesets poimittiin ja piirrettiin lineaarisella asteikolla (anti-log).

Gene symboleja Amundson

et al

geeni allekirjoitus otettiin toisesta taulukko alkuperäinen artikkeli [10]. Yksi geeni ei voida sijoittaa (Unigene ID Hs.494347), koska ei ollut vastaavaa geeniä symboli taulukossa. Loput 21 geeni symboleita kartoitettu Plus2 probesets käyttämällä

annmap

. Multi-kartoitus probesets poistettiin.

Tewari

et al

allekirjoitus otettiin toisesta taulukosta alkuperäisen artikkelin [8]. Neljäkymmentäyhdeksän 60 probesets ainutlaatuinen geeni symboli uutettiin ja kartoitetaan Plus2 probesets avulla annmap. Multi-kartoitus probesets poistettiin.

valvomaton analyysejä (klustereiden, PCA) geeniekspression data allekirjoituksen analysointi ja differentiaalikaavojen analyysi (

Limma

[27],

RankProd

) suoritettiin käyttäen R. kynnys ero ilmaisun käyttäen Rank Product Analysis (

RankProd

) oli Prosenttia False Positive (PFP) määrä 0,01.

piirtäminen ja tilastot

tulokset osoittavat keskimääräisen biologisen rinnakkaisnäytteiden ja tarkkoja mittauksia keskivirhe keskiarvon, ellei toisin mainita. R arvot osoittavat Pearsonin tuote hetki kerroin. Boxplots kertyi GraphPad Prism (v6.0): box-viiksi parametrit: rekki osoittaa mediaani ilme, ruudussa osoittaa kvartiiliväli; viikset edustaa alue. Visualisointiin Säteilyn eloonjäämiskäyrien lineaarinen asteen yhtälö on asennettu R, jossa radiobiological parametrien johdettu DRFIT [28]. R paketti

Limma

, käytettiin laskemiseen differentiaalikaavojen arvot proteiinin profilointitiedot. Tarvittaessa

p

-arvot ovat Benjamini ja Hochberg väärien löytö määrä (FDR) korjattu [29]. Pääkomponenttianalyysi (PCA) vähentää moniulotteisen datan (eli tuhansien geenien) dataksi-pistettä 2-D avaruudessa. Mitä lähempänä kahta data-pistettä (näytteet) sitä enemmän samankaltaisia ​​näytteitä. PC1 (x-akseli) osuus useimpien varianssia kokeilu, PC2 (y-akseli) selittää osan edustaa toiseksi korkein varianssi.

Tulokset

Kohdunkaulansyöpä Solulinjat on Range of Radiosensitivities

taulukossa 1 esitetään yhteenveto kohdunkaulan sinoomasolulinjoja. Kaksi solulinjaa eivät muodosta pesäkkeitä ja SF2-arvot jäljellä 14 riviä vaihteli 0,25-0,75 (kuvio 1). SF2 arvot kuusi solulinjoja julkaisema toinen ryhmä [30], ja ranking oli identtinen molemmissa tutkimuksissa. Vuonna 14 solulinjoissa, ei ollut korrelaatiota SF2 kanssa pinnoitus tehokkuus (R

2 = 0,005,

p

= 0,82), kaksinkertaistui aika (R

2 0,0001,

p

= 0,99) tai RNA ilmaus TP63, merkki squamous solujen erilaistumisen (

p

= 0,90).

A) Säteily selviytymisen käyriä eloonjääntifraktio (log10) (y -akseli) säteilytyksen jälkeen 2, 4, 6, 8 ja 10 Gy 14 kohdunkaulan syövän solulinjat. Datapisteet keskiarvo ja keskivirhe 2-3 itsenäisen kokeen (3-6 jäljittelee koetta kohti). Data-pisteet on varustettu lineaarisen asteen yhtälön ja värittää alla (sininen) tai yli (punainen) mediaani SF2.

Molecular ominaispiirteiden Näennäisesti Homogeeninen Kohdunkaulansyöpä Solulinjat Näyttää merkittävä ero

p63 ilmaus (proteiini ja mRNA) mitattiin sillä se asettaa eriarvoiseen levyepiteelikarsinooma (p63 +) ja ei-levyepiteelikarsinooma (p63-) histologinen tyypit kohdunkaulan syövän [21]. Sen jälkeen transkription profilointi, ilman valvontaa ryhmittely eniten variantin 1000 geenejä (paremmuusjärjestykseen variaatiokerroin) erotti rivit kolmeen klustereita (kuva 2A) klusterin 1 (C33A ja HCSC1) ovat poikkeavia havaintoja. Toinen 14 solulinjat osioitu p63- ja p63 + klustereiden lukuun ottamatta SKG1 joka oli alhaisin TP63 transkriptio taso p63 positiivisen linjat. HCS2 ja 778, jotka eivät muodostaneet pesäkkeitä meidän olosuhteissa, eivät klusterin yhdessä viittaa ole yhteistä transkription ilmaisu liittyy kyky muodostaa pesäkkeitä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että suuri pohjapinta transkription eroja solulinjat liittyvät p63 ilmentymistä. Mielenkiintoista, kun taas HeLa-solut olivat ainoat adenokarsinooma (AC) mukaan lähtöpaikan tietojen useita kohdunkaula solulinjoissa oli samanlainen maailmanlaajuinen transkription profiileja. HCSC1 on ”pieni karsinooma” johdettu siten selvitimme onko klusterointi C33A ja HCSC1 johtui yhteinen histologista alkuperää. Pääkomponenttianalyysi (PCA) käyttämällä yhdistettyjä geeniekspression kahden geenin allekirjoitusta, koulutusta (i) AC: n ja SCC [21] ja (ii) pienisoluinen karsinooma [31], osoitti, että HCSC1 ja C33A oli hyvin samanlainen histologinen geenin ilmentymistä ( Kuvio 2B). Kuvio 2C esittää, että C33A ja HCSC1 oli alhainen SCC geenien ja keskimääräistä suuremmat pienisoluisen karsinooman geenejä. On mielenkiintoista huomata, että AC geeniekspressiota oli alhainen kaikissa solulinjoissa, mukaan lukien HeLa, mikä viittaa siihen, että tätä allekirjoitusta, joka saadaan primäärikasvain materiaali voi olla rajallinen soveltuvuus solulinjoissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että C33A on histologisesti pieni karsinooma solulinjaa ja korostetaan transkription erot liittyvät histologinen tyyppi havaittiin suhteellisen homogeeninen yhden kudoksen alkuperän kohortin.

A) valvomaton hierarkkinen klusterointi alkuun 1000 geenit paremmuusjärjestykseen vaihtelukerroin (eksonista array data). Heatmap väritys on log

2 lauseke arvoa. Rivit edustavat geenejä ja pylväät ovat solulinjat. x-akselin dendrogrammi (klusterit) osoittaa samankaltaisuutta solulinjojen ja y-akseli dendrogrammissa samankaltaisuus geenejä. Ryhmä 1 edustaa kahta näytettä, jolla on pienin TP63 arvot (p63 negatiivinen). Cluster 2 esittää ryhmittely muiden p63- solulinjat, mukaan lukien adenokarsinooma HeLa. Klusterin 3 ryhmää p63 + solulinjoja, lukuun ottamatta SKG1, joka on luokiteltu p63 negatiivisia soluja. B) Pääkomponenttianalyysi 16 kohdunkaulan syövän solulinjoissa perustuu SCC (n = 1062), AC (n = 155) ja pienisoluinen karsinooma (n = 77) geenien ilmentyminen. X-akseli osoittaa pääasiallisen komponentin 1 (PC1) osuus 15,5% varianssista. PC2 näkyy y-akselilla osuus 13,7%: n varianssi histologia allekirjoitus geenien ilmentymisen. Väritys edustaa p63-proteiinin ilmentymisen. C) Kaavio keskimääräisestä lauseke (log2) ja SCC, AC ja pienisoluinen karsinooma allekirjoitus. y-akseli on eksoni array peräisin mediaani geenin ilmentymistä, kunkin kolmen allekirjoituksia. X-akseli esittää solulinjassa. Solulinjat on luokiteltu perustuvat TP63 ilme.

Proteiini profilointi ”Cancer Associated Genes” osoittaa Key Pathway Erot solulinjoissa, mutta ei korkean ja matalan SF2 Ryhmät

Paneeli 24 proteiinit on valittu luettelo ennalta vahvistettu vasta proteiinien osallisina syövän, tai resistenssiä hoitoon [24]. Harvat DNA-vaurioita vastaus aineet olivat saatavilla ja niin valinta rajoittui validoitu hyvin proteiinien liittyy syövän, kuten p53, Rb, EGFR jne p63 on välttämätöntä proliferaatiopotentiaali kantasolujen kerrostunut epiteeli [32], me arveltu että p63 + solut ilmentävät korkeampia tasoja epiteelin markkeriproteiinina E-kadheriinin, verrattuna p63- solujen ja tämä vahvistettiin proteiini array (

p

= 0,0001) (kuvio 3A). Vertasimme myös mRNA: n ilmentymisen tasoa E-kadheriinin (eksoni-array johdettu), jossa proteiinin runsauden mitattuna array (suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti [RFI]; kuvio 3B). Siellä oli vahva korrelaatio (R = 0,95,

p

0,001), mikä osoittaa, että proteiini tasot heijastavat transkriptipitoisuuksissa E-kadheriinin. Olemme myös havainneet korkeita p53-proteiinin C33A soluissa verrattuna kaikkiin muihin solulinjoihin (kuvio 3C), johtuen tunnetun mutaation

TP53

geeni [33] tuloksena proteiinia vakauttamiseen. Nämä tiedot antoi meille suuri luottamus proteiinissa profiloinnin tiedot. Valvomaton ryhmittely proteiinin tiedot osoittivat mitään suhteita ominaisuudet tunnetaan (kuvio S1). Sijoitus solulinjat mukaan SF2 ei ollut selvää visuaalista rakennetta datan (kuvio 3C). 14 solulinjat jaettiin korkean ja matalan radioherkkyyttä ryhmiä käyttäen mediaani SF2 arvo, kuten aiemmin käytetty kliinisissä näytteissä [3], [4]. Neljä proteiinit ilmentyvät eri (

p

0,05) ryhmien välillä: mTOR, PTEN, IKB alfa, ja NFKB, mutta yksikään ei ollut merkittävää jälkeen vääriä löytö määrä (FDR) korjaus (kuvio 3D, taulukko S2 ). mTOR oli rajatapaus merkitsevä (FDR

p =

0,09) ja oli suuntaus maltillista korrelaatiota mTOR ja SF2 (R = 0,48,

p

= 0,08, kuvio 3D). Nämä tiedot paljastavat, että vaikka oli merkittäviä eroja solujen suhteen proteiinin ilmentymisen ja reitin aktivaation, yksikään proteiineista /reitit olivat vankasti liittyvän SF2 tässä solulinjassa kohortissa.

A) Histogrammi näyttämällä ZeptoMARK proteiini-array johdettu runsautta varten 16 kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Y-akseli näyttää E-kadheriinin proteiinin tason (suhteellinen fluoresenssin voimakkuus (RFI) kunkin solulinjoista (x-akseli). Solulinjat on luokiteltu perustuvat TP63 ilme. Ryhmittely osaksi p63 negatiivinen ja p63 positiivisia solulinjoja vahvistaa yhdistys E-kadheriinin kanssa p63. p-arvo on T-testi johdettu verrataan ero E-kadheriinin ilmentymisen välillä p63 positiiviset ja negatiiviset ryhmät, virhepylväät näyttää keskihajonta kahden biologisen rinnakkaisnäytettä. B) x-y scatterplot osoittaa E- kadheriinin geenin ilmentymistä (eksoni array) y-akselilla E-kadheriinin proteiinin ekspressiota x-akselilla. Katkoviivana täydellistä korrelaatiota. Eksoni array data-pistettä edustavat keskiarvoa useita eksoni probesets (n = 19), yhdestä eksoni ilmaisun array, jossa proteiini tiedot ovat keskiarvo kahden biologisen rinnakkaisnäytteitä. C) Heatmap osoittaa klusterointi proteiinien vastaava ilmaisu (y-akseli) on ZeptoMARK proteiinin profilointitiedot. Solulinjat paremmuusjärjestykseen SF2. Heatmap väritys perustuu rivillä Z-score. D) xy-sirontakuvaajan osoittaa ilmaus (y-akseli) top 5 proteiineja Limma vastaan ​​SF2 (x-akseli). Taulukossa on yhteenveto tuloksista Limma ero proteiinin ilmentymisen analyysi korkean ja matalan SF2 ryhmien ja Pearsonin korrelaatiota proteiinin ilmentymisen (RFI) vastaan ​​SF2. p-arvot tarkoitetaan sellaisia ​​proteiineja differentiaalikaavojen (* p 0,05 tai ** p 0,01) välillä SF2 matalan ja korkean ryhmiin Limma analyysiin. Kuitenkin nämä eivät läpäise vääriä löytö korjausta.

Head and Neck Cancer Cell Lines Näytä yhtäläisyydet Global Gene Expression

Taulukossa 2 on yhteenveto 11 HNSCC solulinjat, jotka olivat kaikki HPV negatiivinen (Kuva S2). Vaikka raportoitu olevan okasolusyöpä, kolme puuttui p63-proteiinin ilmentymistä Western blotilla (kuvio S3), ja sillä oli alhainen transkriptipitoisuuksissa havaita mikrosirulla. SF2 alue (0,3-0,8) oli samankaltainen kuin kohdunkaulan linjojen (kuvio 4A), mutta HNSCC solulinjat olivat säteilyresistenteille verrattuna kohdunkaula (

p

= 0,003). Mediaani SF2, jota käytetään jakamaan solulinjojen oli 0,36 kohdunkaulan ja 0,61 HNSCC solulinjoja. Kuten kohdunkaula solulinjojen, ei ollut eroa SF2 välillä, jotka ilmentävät korkeita verrattuna alhainen

TP63

(kuva 4B) ja ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi osioitu HNSCC solulinjojen kolmeen ryhmään heijastaa

TP63

lauseke (kuvio 4C). Syrjäisimmät klusteri oli pienin

TP63

ilmaisu, kun taas kaksi klustereiden jaettu solulinjaa ilme / 6,0 (log

2) TP63. Nämä tiedot osoittavat, että sekä kohdunkaulansyövän ja HNSCC solulinjoilla ovat samanlaisia ​​radiosensitivities ja maailmanlaajuinen transkription profiileja, jossa suurin osa eroista liittyvät transkriptiotekijä p63. Sinänsä HNSCC kohortti on kudostyypin eroaa kohdunkaula, mutta pitäisi olla hyvä vertailukohtana SF2 liittyy geenien johdetut kohdunkaulan solulinjoissa ja

päinvastoin

.

A) Kaavio näyttää keskimääräinen SF2 (log10) (y-akseli) kullekin 11 kohdunkaulan syövän solulinjat (x-akseli). Virhe palkit esittävät keskivirhettä 2-3 itsenäisen kokeen. B) Kaavio osoittaa, että ei ole mitään eroa TP63 ilmentymisen välillä SF2 korkean ja matalan ryhmiä. Palkki näyttää mediaani ilmaisua. C) valvomaton hierarkkinen klusterointi alkuun 1000 geenit paremmuusjärjestykseen Variaatiokerroin (peräisin U133 array data). Heatmap väritys on log

2 lauseke arvoa. Rivit edustavat geenejä ja pylväät ovat solulinjat. x-akselin dendrogrammi (klusterit) osoittaa samankaltaisuutta solulinjojen ja y-akseli dendrogrammissa samankaltaisuus geenejä. Ryhmä 1 edustaa kahta näytettä, jolla on pienin TP63 arvot (p63 negatiivinen). Cluster 2 esittää ryhmittely muiden p63- solulinja, yhdessä alhaisen TP63 ilmentävien linjat. Cluster 3 on koottu kaikki HNSCC linjat 6,0 (log2 lauseke) TP63 ilme. D) Kaavio edustaa integroitua SF2 analyysi kohdunkaula ja HNSCC solulinjoissa. Sijoitus tuoteanalyysi (FDR 0,05) tunnistettiin 96 geeniä kohdunkaula kohortin ilmentyvät eri välillä SF2 matalan ja korkean solulinjoissa. Identtinen analyysi HNSCC solulinjoissa tunnistaa 97 probesets (42 geenit) ilmennetty eri välillä SF2 matalan ja korkean solulinjoissa. PCA kohdunkaula geenien osoittaa, että ne pystyvät erottamaan solun riviä SF2. PCA on HNSCC geenien on yhtä kykenee erottamaan näytteiden perustuu SF2. Venn kaavio osoittaa, että vain 4/138 geenit ovat yhteisiä kahden kohortteja ja näistä vain 2/138 ovat ”yhdenmukaisia”, ja liittyy samaan suuntaavuus (korkea SF2 /matala SF2 sekä HNSCC ja kohdunkaula). PCA osoittaa probeset ilmentymistä näiden kahden ”yhteinen” ja ”yhtenevä” geenejä (MGST1 ja TFPI) NCI-60 aineisto. NCI-60 ylempi PCA osoittaa data-pistettä värillinen mediaani SF2 ja alemman PCA värillinen 0,2, käytetään aiemmin osioida säteilylle ja säteilyresistenteille solulinjat tässä kohortissa.

Genes ilmentyvät eri välillä korkea ja matala SF2 ryhmät ovat ensisijaisesti solutyyppispesifisiä ja ei voi osittaa NCI-60 Cell Lines

erot solulinjojen osioitu käyttäen mediaani SF2 tutkittiin käyttäen genominlaajuisten ilmentymisen profilointi. Ei ilmentyvät eri transkriptien löytyivät

Limma

toistettuja-testaus korjauksen. Tämä oli myös lineaarisia malleja joissa HPV ja p63 ilmaisun kovariantteja, tai 3-tie ANOVA. Vaikka geenit tunnistettiin, jotka ilmentyvät eri (raaka p 0,05), ei mitään läpäissyt vääriä löytö korjaus. Vaihtoehtoinen menetelmä, Rank Product Analysis, levitetään kohdunkaula solulinjojen tunnistettu 96 differentiaalisesti ilmentyvien geenien (pfp 0,01) (taulukko S3). Nämä geenit erottaa kohdunkaulan näytteistä ensimmäisen pääkomponentti, osuus 36% vaihtelusta (kuvio 4D), mutta ei voinut erottaa HNSCC solulinjoissa perustuu SF2 (kuva S4A). Vastavuoroisesti analyysi HNSCC linjatuissa vastaava määrä probesets (n = 97, kartoitus 42 ainutlaatuinen geeni symboleja, pfp 0,01) ilmentyvät eri korkean ja matalan SF2 (taulukko S4). Nämä geenit suoriutui hyvin erottamalla HNSCC solulinjoissa (kuvio 4D), mutta ei erota kohdunkaula linjat (kuvio S4b).