Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehitys dendriittisolujen rokotteiden on lupaava lähestymistapa syövän immunoterapiassa. Niiden onnistuneelle käyttöön klinikoilla, leviämistä ja toimivuus DC on ratkaiseva. Olemme aiemmin perustaneet kaksivaiheinen menetelmä suuren mittakaavan sukupolven DC napanuoran verestä saatuja MNC /CD34 + soluja. Tämä työ pyritään parantamaan niiden toiminnallisuutta perustuu seuraaviin havaintoihin:

in vitro

syntyy DC voi olla tehottomampi maahanmuutto- ja muiden toiminnallisten toimien ansiosta alentaa eikosanoidituotannon tasolle. Tuotanto eikosanoidien peräisin arakidonihappo (AA), voivat vaikeuttaa heikkenemisestä johtuen entsyymin fosfolipaasi A2 IL-4, joka on välttämätön sytokiini tarvitaan erilaistumiseen DC. Oletimme, että eksogeeninen AA elatusaineet aikana DC sukupolven voi johtaa DC: iden, joilla on parantunut toiminnallisuus. DC synnytettiin ja ilman AA. Kaksi DC sarjaa verrattiin fenotyyppianalyysillä, morfologia ja toiminnalliset analyysit kuten antigeenin oton, MLR, CTL-määritys ja

in vitro

ja

in vivo

muuttoliikettä. Vaikka ei ollut eroja kahden DC kannalta morfologia, fenotyypin ja antigeenin oton, AA

+ DC osoitti parannetun

in vitro

ja

in vivo

muuttoliike, T solu stimulointikyvyn, CTL-aktiivisuus ja huomattavasti korkeampi transkriptipitoisuuksissa COX-2. AA

+ DC osoittavat myös suotuisa Th1 sytokiiniprofiilia kuin AA

– DC. Näin ollen lisäämällä AA elatusaineet on vinouttaa DC kohti eritystä enemmän IL-12 ja vähemmän IL-10 yhdessä palauttaminen eikosanoidien tasojen COX-2-välitteisten reitin ja siten parantaa toiminnallisuutta näiden solujen, joita käytetään niin voimakas solujen rokotteen. Yhdessä nämä havainnot on hyödyksi parempi contriving DC rokotteiden syövän immunoterapiassa.

Citation: Kumar J, Gurav R, Kale V, Limaye L (2014) Ulkoisia arakidonihapon lisäämistä Kulttuuri Media Parantaa toiminnallisuus dendriittisolujen niiden mahdollista käyttöä syövän immunoterapiassa. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10,1371 /journal.pone.0111759

Editor: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Alankomaat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 30 syyskuu 2014; Julkaistu 4 marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asianmukaiset tiedot ovat sisällä olevat tiedot tiedostoja.

Rahoitus: Hanke sai varoja Department of Biotechnology (DBT), Intian hallitus kautta avustusta ei. BT /PR13565 /MED /31/89/2010. JK sai apurahan alkaen neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR) Intiassa ja DBT (PR 4930/31). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Dendriittisolut (DC) ovat tehokkaimmat antigeeniä esittelevät solut (APC: t), jotka tunnistavat maailmankaikkeuden antigeenien ja ohjata erilaisia ​​vasteita [1], [2]. DC on voitava kerätä antigeenejä, käsitellä niitä ja esittää niille asianmukaista Kostimuloinnin molekyylejä ja aloittaa immuunivastetta [3], [4]. DC: t ovat ei vain kriittinen induktio sekä ensimmäisen että toisen T-ja B-soluvälitteinen immuunivaste, vaan ne ovat myös tärkeitä immunologisen toleranssin induktiosta. DC: t ovat keskellä immuunijärjestelmän ja modulaatio immuunivasteen on tärkeä terapeuttinen immuniteetin syöpää [5]. Ainutlaatuinen kyky DC: iden in antigeenin esittelyä ja immuunivasteen säätelyssä on tehnyt niitä houkutteleva adjuvantti syövän immunoterapiassa [6]. Edistysaskeleet

in vitro

DC sukupolven protokollia ja ymmärtämään paremmin DC biologian ovat johtaneet niiden käyttö DC rokotteiden klinikoilla. Koska ensimmäisen raporttinsa vuonna 1995, suuri määrä kliinisiä kokeita on tehty arvioida DC-pohjainen rokotteita yli tusina erilaisia ​​kasvaimia [7], [8], [9]. Kliiniseen käyttöön DC vaatii toistuvaa rokotus aiheuttaa suhteellisen korkeat taajuudet kasvaimen antigeenispesifisen sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) ja täydellinen vaste. Tämä puolestaan ​​edellyttää useita DC, syntyy

ex vivo

[10].

DC voidaan tuottaa CD34

+ -soluista käyttämällä yksi askel tai kaksivaiheisen viljelyjärjestelmiä . Ensimmäisen viljelyjärjestelmän tyyppi CD34

+ soluja kasvatetaan yhdistelmä kasvutekijöiden, missä ne ovat suoraan eriytetty esimerkiksi dendriittisolujen [11], [12], [13]. Toisaalta, kahdessa vaiheessa kulttuuri järjestelmä CD34

+ solut ensin laajennetaan laajamittaisesti kuin DC esiasteita. Nämä laajeni solut edelleen eriytetty kuin DC [14], [15], [16], [17]. Huolimatta täyttä ymmärrystä monimutkaisia ​​DC-säätelyyn isäntä valkosolujen vastauksia,

in vitro

syntyy DC ei voi edustaa vastaavaa muuttavien DC

in vivo

, mikä rajoittaa niiden käyttöä magic luodit parantaa tarkkuutta ja tehokkuutta syövän immunoterapiassa. Viimeaikaiset kokeellista näyttöä osoittavat, että ihmisen monosyyteistä peräisin DC (MoDC) voivat heikentää niiden kykyä siirtyä vastauksena tulehduksellisia sekä homeostatic chemotaxins [18]. Edellinen raportit osoittavat, että IL-4, joka on tärkeä sytokiini

in vitro

DC sukupolven, estää monien alavirran polkuja arakidonihappo (AA) aineenvaihdunnan tuloksena alentunut tuotanto eikosanoidien ja verihiutaleita aktivoivan tekijän ( PAF). Prostaglandiini E

2 (PGE

2) on jäsen eikosanoidituotannon perheen happipitoista AA johdannaisia. Ensimmäinen askel PGE

2 biosynteesi on vapauttaa AA kalvon fosfolipideistä phospholipases kuten fosfolipaasi A2 (PLA

2). Koska eikosanoidien ja PAF tiedetään olevan tärkeä rooli prosesseissa kuten leukosyyttimigraatio, luonnollinen tappaja solujen aktivaation, ja tyypin 2 T-auttajasolujen eriyttämiset puutetta biosynteesiin nämä tekijät voivat olla vastuussa havaittu haittoja MoDCs [19] .

aiemmin perustettu kaksivaiheista muoviinkiinnitysvaiheiden menetelmä suuren mittakaavan sukupolven DC johdettu molempien napanuoran CD34 + [17] ja ylikansallisten yhtiöiden (Mononukleaarisolut) [20]. DC: eitä tuottamat menetelmämme on kypsä fenotyyppi ja ovat toiminnallisesti aktiivisia. Kuitenkin yksi sytokiinien käytetään tuottamaan DC meidän menetelmä on IL-4, ja kuten edellä on mainittu IL-4 voi vaikuttaa arakidonihapon siitä membrane.We arveltu, että eksogeeninen AA meidän viljelmiä erilaistumisen aikana vaihe voi auttaa edelleen parantaa toimintoja DC. Perusteet lisätään ulkoisten AA oli se, että se voi saada muunnetaan prostaglandiinien syklo-1 (COX-1) ja syklo-2 (COX-2) riippuvalla tavalla. Tarkistaa tämän hypoteesin, esillä olevassa tutkimuksessa testasimme vaikutus AA lisäys on

in vitro

DC sukupolvi. Tuloksemme osoittivat, että todellakin AA

+ DC: t ovat ylivoimaisia ​​toimintoja, kuten tehostettu

in vitro

ja

in vivo

muuttoliike, T-solujen stimulointikyvyn, antigeeni otto, CTL-aktiivisuus, huomattavasti korkeampi transkriptipitoisuuksissa COX-2 ja suotuisan Th1 sytokiinien kuin AA

– DC. Niinpä meidän havainnot vie meitä askeleen lähemmäs kohti tuottavan lievittävät muodossa DC syöpäsairauksien rokote.

Materiaalit ja menetelmät

Sytokiinit

rekombinantti ihmisen sytokiineja käytettiin tutkimuksessa oli fms kuten tyrosiinikinaasin 3-ligandin (Flt-3L), Trombopoietiini (TPO), Stem Cell Factor (SCF), interleukiini-4 (IL-4), granulosyyttikasvutekijä monosyyttien -colony stimuloiva tekijä (GM-CSF), tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), CD40-ligandi ja Chemokine ligandi-19 (CCL-19). Kaikki rekombinantti ihmisen sytokiinien hankittiin Peprotech Aasiasta, Revohot Israel.

Vasta

käytetyt vasta virtaussytometrialla oli hiiren anti ihmisen mAb: t: CD1a, CD34, CD11 c, CD40, CD8 -APC koodattu ; CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, CD45RA -PE merkitty; CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC -FITC merkitty, anti hiiri CD 45.1 -PB merkitty ja CCR-7 (puhdistettu ihmisen vastaisesta rotta-mAb). Kaikki monoklonaalisia vasta-aineita ja vastaavia isotyyppikontrolleja käytetään tutkimuksessa hankittiin BD Pharmingen (San Diego, CA).

Muut käytettävien reagenssien

Arakidonihapot Happo- (Cat. No. on A3555) peräisin Sigma Aldrich, kudosviljelmässä testattu tuote on peräisin sian maksa. Puhtaus tuote oli ≥99% analysoituna kapillaarikaasukromatografisesti.

Ficoll Hypaque-Histopaque (tiheys 1,007 g /ml); Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla dekstraania (40 kDa); Wright Stain, Giemsa Stain, Lipopolysakkaridi, DMEM (Dulbeccon Modified Eagle Medium) ja IMDM (Iscoven muokattu Dulbeccon Medium) kaikki olivat yhtiöltä Sigma Aldrich; ELISA-kittiä (BD OptEIA); Hepariinin SRL Pvt. Limited, Mumbai; Hydroksi-etyylitärkkelyksen (HES), Rosette syyskuu T-solujen eristäminen (Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada); [

3H] tymidiiniä (240 GBq /milli mol, BRIT, Navi Mumbai, Intia); Dimetyylisulfoksidi (MP biolääketieteen, Ohio, USA); Dynal sarja mRNA eristäminen (Dynal ASA, Oslo, Norja).

kerääminen ja käsittely napanuoraverestä Näytteitä

Napanuoraveri (CB) näytteet saatiin paikallisissa sairaaloissa mukaan Institutional Review Board [institutionaalisten eettisen komitean (IEC) ja institutionaalisten komitea kantasolututkimuksen (IC-SCRT)] -hyväksytty eettiset ohjeet, jotka ovat sopusoinnussa Helsingin julistuksen. Etukäteen ilmoitettu kirjallisen suostumuksen äidin saatiin. Lupamenettely on hyväksynyt IC-SCRT. Kova kopioita allekirjoitetun suostumuksen lomakkeet on numeroitu ja toimitettu meille. Näytteet kerättiin steriileihin säiliöihin, jotka sisältävät säilöntäaineeton hepariinia (40 IU hepariinia /ml verta) selväkielisenä IMDM. Näytteet tuotiin laboratorioon jäissä pakkauksissa ja käsiteltiin eristämään mononukleaariset solut (MNC).

eristäminen MNC

napanuoraverestä MNC erotettiin Ficoll- Hypaque tisentrifugaatiolla. Solut interphase kerättiin ja pestiin poistamiseksi Ficoll-hypaque. Tumalliset solujen määrä (Kristalliviolettiliuos värjäys) otettiin ja MNC käytettiin DC sukupolven.

eristäminen T-soluja ääreisveren

Oheislaitteet verta kerättiin terveiltä luovuttajilta mukaan Institutional Review aluksella. [Institutionaalisten eettisen komitean (IEC) ja institutionaalisten komitea kantasolututkimuksen (IC-SCRT)] -hyväksytty eettiset ohjeet, jotka ovat sopusoinnussa Helsingin julistuksen. Tunnetun ilmoitti kirjallista suostumusta terveen luovuttajan saatiin. Lupamenettely on hyväksynyt IC-SCRT. Kova kopioita allekirjoitetun suostumuksen lomakkeet on numeroitu ja toimitettu meille. T-solut eristettiin verestä käyttämällä negatiivista valintaa Kit (Rosette syyskuu) kohti valmistajan ohjeen (Stem Cell Technologies). Sen jälkeen Ficoll- Hypaque tisentrifugaatiolla solujen interphase Ficoll ja keskisuurten kerättiin, pestiin sitten käytettiin kokeissa.

In vitro

Generation ja kulttuuri DC: iden

Expansion kulttuureissa ja Plastic noudattamista.

MNCs (tuore tai jäädytetty) laajennettiin 3 viikon ajan, sitten rikastettiin CD14 + solujen muoviinkiinnitysvaiheiden ja myöhemmin eriytetty kuten aiemmin on kuvattu [17], [20]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun 21 päivää laajennus solut pestiin ja ympättiin tiheydellä 3 x 10

5 solua /kuoppa kuuteen-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi 2 ml IMDM lisätty 1% autologista plasmaa. Soluja pidettiin 1,5 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO

2 yrityshautomo ja tarttumaton ja löysästi kiinnittyneet solut poistettiin pesemällä IMDM. Kiinnittyneet solut käytettiin DC sukupolven.

erilaistuminen DC esiasteista läsnä AA (AA

+ DC) ja puuttuessa AA (AA

– DC).

prekursorisolun populaatiot jaettiin kaksi. Solut indusoitiin erilaistumaan kuten DC viljelemällä niitä GM-CSF: ää (50 ng /ml) ja IL-4 (30 ng /ml) 3 päivää, päivänä 3

rd GM-CSF: ää (50 ng /ml) plus TNF-α (30 ng /ml) lisättiin viljelmiin ja edelleen ylläpidetään 4 päivää IMDM: ssä, jota oli täydennetty 5% autologista plasmaa. Sen arvioimiseksi vaikutus AA, yhdet viljelmää pidettiin 100 uM AA lisäksi edellä mainitut edellytykset. Päivänä 7, solut altistettiin kypsymisen yhdistelmä TNF-α, lipopolysakkaridi, ja CD40L, pitoisuutena 100 ng /ml kutakin, 48 tuntia. Kokeellinen suunnittelu on kuvattu muodossa vuokaavio kuvion. S1. Kaikissa kokeissa DC tuottaa ilman AA pidettiin ohjaus asettaa ja AA pidettiin Koepakettia.

morfologinen analyysi: Wrightin ja Giemsa värjäys.

noudatetaan soluviljelytutkimuksista levyjä kiinteät metanolissa 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja värjättiin Wrightin ja Giemsa Stain. Havaintoja tehtiin alle käänteismikroskooppi ja kuvat on otettu (Olympus IX70).

fenotyyppianalyysillä: virtaussytometrialla.

Kypsät AA

+ ja AA

– DC pestiin ja keskeytettiin 2 x 10

5 solua 100 ui kylmää fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja värjäys suoritettiin kuten per kuvatun menetelmän [17], [20]. CCR-7 värjäys, soluja inkuboitiin ensisijaisen seuraa toisen ja kolmannen asteen vasta-aineita 25 min. Solut pestiin kahdesti, kun vasta-aineen kukin inkuboinnit ja suspendoitiin lopuksi uudelleen 1% paraformaldehydiä. Solut analysoitiin virtaussytometrillä (FACS Canto II BD Pharmingen-, San Jose, Kalifornia). Soluroskat eliminoitu analyysin avulla portin eteenpäin ja sivulle siroaa, ja koko soluja analysoitiin. Tiedot analysoitiin ja histogrammin peitot valmistettiin käyttämällä tietokoneohjelmistoja FACS Diva ja Cell Quest Pro (Beckon Dickinson San Jose Kalifornia), tässä järjestyksessä.

Functional Characterization

Endocytosis määrityksessä FITC-dekstraania.

epäkypsiä DC korjattu päivänä 5 inkuboitiin FITC-dekstraania (20 ug /ml), joko + 4 ° C: ssa (sisäistämisen kontrolli) tai + 37 ° C, 30 ja 60 minuuttia. Sitten solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä, joka sisälsi 0,01% natriumatsidia ja 1% BSA. Solut uudelleen suspendoitiin 1% paraformaldehydiä ja hankittiin virtaussytometrillä (Canto II, BD).

Kemotaksia.

kemotaksista

in vitro

syntyy DC: kohti CCL-19 arvioitiin 24-syvennyksen soluviljelmälevyihin BD Falcon

™ soluviljely 0,8 um inserttejä. 500 ui IMDM kanssa tai ilman rhCCL-19 (lopullinen konsentraatio 500 ng /ml) lisättiin alempaan kammioon kohti kuvatun menetelmän [17], [20]. Voit tarkistaa spesifisyys Kemokiinireseptorin (CCR) vuorovaikutus, joissakin kokeissa DC esikäsiteltiin CCR-7 esto vasta-aineella 1 h 1 x PBS: ssä ja sitten niiden siirtymistä CCL -19 tutkittiin edellä kuvatulla tavalla. Siirrettyjä solut värjättiin trypaanisinivärin ja elävät solut laskettiin käyttämällä hemasytometriä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona määrä vaeltavia solujen ± keskihajonta (SD).

Mixed Leukosyyttien (MLR).

Allogeenisia T-soluja jaettiin 10

5 solua kohti pitkälle pyöreäpohjaisessa 96-mikro- (Greiner Bio-One) ja viljeltiin yhdessä läsnä ollessa porrastettu numerot säteilytettyjen DC (2500 rad, Co lähde) 200 ui alustaa, joka sisälsi 10% yhdistettiin napanuoraverestä AB + plasma. Tymidiinin mitattiin Päivä 3 jälkeen 18 tunnin pulssi [

3H] tymidiiniä (1 uCi /kuoppa) käyttäen standardimenetelmiä [17], [20].

Sytokiinimääritys mittaus.

supernatantit

in vitro

syntyy DC viljelmät kerättiin 48 tunnin kuluttua lisäämällä kypsymisen ärsykkeiden ja pidettiin pakastettuna -20 ° C: ssa. Supernatantit jälkeen analysoitiin sytokiinin sisältöä (IL-10 ja IL-12 p70) ELISA: lla ELISA-kittiä kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrä interleukiinien läsnä supernatantit laskettiin standardikäyrän menetelmää.

In vitro

CTL (sytotoksiset T-lymfosyytit) määrityksessä

valmistaminen solulysaattia.

MCF-7 on HLA-A2 rajattu solulinjan ja sitä käytettiin kohdesolulinjana CTL-kokeessa. Lysis of MCF-7-soluissa suoritettiin toistuvia jäätymis- sulatuksen jälkeen seuraa sonikoimalla. Sen jälkeen kun suodatin sterilointi-proteiinin arviointi tehtiin ja lysaatti varastoitiin -80 ° C: ssa antigeenin sykkivä DC: ille.

Generation efektorisolujen ja CTL-määritys.

HLA-A2-positiivinen johto veren MNC käytettiin tuottamaan DC. Epäkypsiä DC inkuboitiin lysaatin MCF-7-lopulliseen konsentraatioon 100 ug /ml proteiinia yhdessä KLH (keyhole limpet hemocyanin) 25 ug /ml 48 tunnin ajan, kuten kypsymisen ärsykkeiden viljelyalustaan ​​rajat esittämistä kasvaimen antigeenin autologisia naiivi T-solut. Valvontaa joukko DC, kypsymisen ärsykkeitä, joka koostuu 100 ng /ml kutakin LPS, CD40L: n ja TNF-α. Autologisiin naiivi T-solut saatiin lajittelemalla CD3, CD8, ja CD45RA positiivisten solujen FACS ARIA (BD). Naiivi T-solut samanaikaisesti viljeltiin MCF-7-lysaattia pulssitettu DC, joka muodostettiin samalla UCB näytteen kanssa tai ilman AA. DC-T-solujen yhteistyö viljelmää pidettiin 3 viikkoa lisäämällä sytokiinien IL-2 (0,1 ug /ml) ja IL-7 (5 ug /ml) ja viikoittain uudelleen stimulaation tuoreen antigeenin pulssitettu DC: iden tuottamiseksi efektori Sytotoksinen Killer Cells . CTL: t näin syntyvät LPS pulssi ja lysaatin pulssi AA

+ DC /AA

– DC: itä yhteistyössä viljeltiin kohdesolujen MCF-7 18 tuntia. Sitten solut pestiin tavallinen median ja sitten pulssitettiin [3H] tymidiinillä 8 tuntia. Prosenttia tappaminen MCF-7 on laskettu P-JAM määritys [21], [22] käyttämällä kaavaa-% tappaminen = CPM [Target yksin – Target + Killer] X 100 /CPM Target yksin.

RT PCR-analyysi

mRNA eristettiin AA

+ DC ja AA

– DC käyttäen Dynabeadsilla mRNA DIRECT kit kohti valmistajan ohjeiden. Eluoitu mRNA käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttämällä käänteistranskriptaasia (Sigma Aldrich) ja oligo-dT-alukkeita (Invitrogen) annettujen ohjeiden ja PCR suoritettiin spesifisillä alukkeilla. Lämpösykli käytettiin (95 ° C 2 min, 95 ° C 45 sekuntia, pariutuminen (per eri geenejä) 45 sekuntia, pidennys 72 ° C 2 min) ja 35 sykliä, ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 5 minuuttia. Alukesekvenssit käyttää, on kuvattu kuviossa. S2.

Homing kypsien DC: iden in NOD-SCID-hiirissä

NOD /LTSZ-scid /scid hiiret saatiin Jackson Laboratories ja oli kasvatettu eläin laitoksen meidän instituutti. Tutkimus suoritettiin kiinni toimielimen suuntaviivat karjanhoito ja on hyväksynyt IAEC-väärennöskeskukset /CPCSEA (Institutional eläinten eettisen komitean-väärennöskeskukset /komitean tarkoitus Ohjaus ja valvonta eläinkokeita. Hyväksyntänumero: IACUC-Institutional Animal hoidon ja käytön komitea, EAF-Experimental Animal Facility /2004 /B-71). Eläinten toimenpiteet, joissa suonensisäiseen infuusio suoritettiin anestesiassa. Hiiret 4-6 viikon iässä olivat altistuneet sub tappavan annoksen 300 rad koko kehon sädehoidon peräisin

60Co lähde (Gamma Chamber 5000, BRIT, Navi Mumbai, Intia). 10

6 AA

+ DC ja AA

– DC: ta infuusiona häntälaskimon osa kuolettavasti säteilytettyä hiiriä (n = 43; infuusio AA

+ DC – 20 hiirtä, AA

– DC – 20 hiirtä ja PBS – 3 hiirtä). Hiiret tapettiin 18 tuntia arvioida ohjautumisen ihmisen DC: itä luuytimessä. Homed solut tunnistettiin DC värjäämällä ihmisen CD11 c mAb. Hiiren CD 45.1 mAb käytettiin tyhjäksi läsnäolo solujen peräisin hiirestä.

Tilastollinen

Eri muuttujat AA

+ DC ja AA

– DC verrattiin. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä Sigma Stat (Version-2,03) ja kuvaajat valmistettiin käyttämällä Sigma Plot ohjelmisto (versio 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) ja GraphPad Prism 5 Software (San Diego, Kalifornia, USA). Tilastollisia analyysejä eroja kahden ryhmän suoritettiin käyttäen t-testiä. Todennäköisyyden arvo: P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***) katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Morfologiset ja fenotyyppinen karakterisointi DC

AA

+ DC ja AA

– DC näyttää samanlainen morfologia.

DC esiasteita syntyy kuluttua 21 päivän laajentaminen MNC rikastettiin jonka muoviinkiinnitysvaiheiden menetelmä ja edelleen eriytetty kuin DC [20]. Oli marginaalinen ero absoluuttisen määrän DC tuottaman kaksi menetelmiä sama määrä alkaa väestöstä (noin 3 x 10

7 AA

+ DC ja 2,5 × 10

7 AA

– DC per 10

7 tulo MNC). Morfologia AA

+ DC ja AA

– DC oli vertailukelpoinen. Todettiin, että DC: iden sekä asettaa näytteille ominaisuus verhottuja morfologia ja DC klusterien Kuva. S3. Vaihekontrasti kuvat osoittivat tyypillisiä kiinnittynyt epäkypsiä DC: itä, sekä asettaa [S-3 (A)]. Kun oli lisätty kypsymisen ärsykkeiden tyypillisiä kiinnittymättömät DC klustereita havaittiin molemmissa viljelmissä [S-3 (B)]. Wright-Giemsa-värjäyksellä kypsien tarttuvien solujen osoittaa, että läsnä DC: iden dendrites vuonna kaksi [S-3 (C)].

AA

+ DC ja AA

– DC näyttää samankaltaisia DC fenotyyppi.

In vitro

syntyy DC värjättiin paneeli DC erityisiä ja DC liittyviä merkkejä ja analysoitiin virtaussytometrillä. Kuva. 1A kuvaa virtaussytometristen profiilia yhdestä edustavasta näytteestä prosenttia positiivisia soluja ja MFI-arvot suluissa. AA

+ DC ja AA

– DC osoitti korkeaa ja vastaava prosenttiosuus soluista, jotka ilmentävät eri kostimulatorista molekyyliä, kuten CD40, CD80, CD86, DC-liittyvä integriini CD11 c, adheesiomolekyylien, kuten CD54 ja CD58, MHC luokan II molekyylejä kuten HLA ABC ja HLA DR. Kuva. 1B ja 1C kuvaa fenotyyppiset profiilin kannalta prosentin positiivisuus ja MFI vastaavasti kolmen näytteen (keskiarvo ± SD, n = 3). Ekspressio myeloidista markkeri CD 33 todettiin merkittävästi suurempi AA

+ DC: iden (67,4%) verrattuna AA

– DC: iden (38,7%) Fig. 1B. MFI-arvot adheesiomolekyyli CD 58 todettiin merkittävästi suurempi AA

+ DC (1423) verrattuna AA

– DC (1048) Kuva. 1C. Yhdessä AA

+ DC ja AA

– DC osoittavat samanlaista morfologia ja tyypillisiä interstitiaalinen DC-fenotyypin.

(A) FACS histogrammi profiilia edustavan kokeen. Täytetty histogrammit esittävät isotyyppikontrollia ja avoin ne esittävät erityisiä ilmiasuun vastaaviin MFI-arvot suluissa. (B) On nähty, että täysin kypsät DC synnytettiin ja ei ollut paljon eroa ekspressiotasoja eri pinnan markkereita, paitsi CD33 (myeloidista) oli suurempi AA

+ DC sarjaa (keskiarvo ± SD, n = 3, P≤0.05 *). (C) Pylväsdiagrammi DC erityisiä ja niihin liittyviä markkereita kannalta rahalaitoksen CD 58 (adheesiomolekyyli) erotus havaittiin huomattavasti korkeampia (keskiarvo ± SD, n = 3, P≤0.05 *). (D) reseptorin välittyvät antigeenin oton AA

+ DC ja AA

– DC: dekstraani-FITC otto DC (n = 3, keskiarvo ± SD). Ohjaus arvo (otto 4 ° C) vähennetään kunkin testin arvo (sisäänotto 37 ° C: ssa).

toiminnallinen karakterisointi DC

Kyky endosytoosin AA

+ DC oli korkeampi verrattuna AA

– DC.

epäkypsiä DC on ominaista, että antigeenin oton eri mekanismeja. Analysoimme kykyä

in vitro

syntyy DC niiden reseptorin välittämää antigeenin oton mittaamalla FITC koodattu dekstraani ottoa. AA

+ DC ja AA

– DC olivat yhtä tehokkaita reseptorin välittämää sisäänotto 30 min ja 60 min aikavälein testattu. AA

+ DC näytteillä korkea ja verrattavissa FITC-dekstraanin otto verrattuna AA

– DC Fig. 1D (keskiarvo ± SD, n = 3).

In vitro

syntyy DC esiintyi enemmän sisäänoton 60 min välein verrattuna 30 min, mikä osoittaa, että ne ovat toiminnallisesti aktiivisia ja niillä on lisääntynyt otto kasvaessa ajan.

Parannettu

in vitro

kemotaksista AA

+ DC kohti CCL19.

Migration of DC kohti kemokiinin kaltevuus on tärkeä toiminnallinen ominaisuus, koska siinä immunoterapiassa protokollien niiden on pystyttävä siirtymisen injektiokohtaan kohti imusolmukkeisiin, jossa ne ovat vuorovaikutuksessa T-solujen kanssa ja käynnistää immuunivasteen. Kuva. 2A osoittaa, solut suspendoitiin IMDM lisättiin ylempään kammioon ja 0 tuntia. Eikä itsestään Migraatio havaittiin kuopissa jälkeen 3 tuntia, jossa CCL-19 ei lisätty (Fig. 2B). Enemmän määrä AA

+ DC (Fig. 2D) siirtyneet tekemään CCL-19 verrattuna AA

– DC (Fig. 2C) ja ero oli tilastollisesti merkitsevä (* p≤0.05, ** p≤0.01 ; n = 3, Fig. 2E). Siirtyminen kohti CCL19 on lähinnä siksi, että DC: t ilmentävät CCR7 reseptoria. Kun me värjäsi DC kahden sarjat CCR-7-reseptorin vasta-aine, AA

+ DC ja AA

– DC osoitti 93,25% ja 91,89% positiivisia soluja vastaavasti yhdessä MFI-arvot suluissa (Fig. 2F ). Mean MFI-arvot 3 näytteiden AA

– DC olivat 821 ± 156 ja AA

+ DC oli 1089 ± 392. Siten molempien näytteillä korkea ja samantasoinen CCR7- ilmaisua. Spesifisyys CCR7–CCL19 reseptoriligandilla Reaktio varmistettiin lisäksi estämällä reseptori kanssa CCR-7 esto Ab ja sen jälkeen testaamalla leviämiskyky. Kuten nähdään Fig. 2G oli merkittävä väheneminen solujen kulkeutumista esikäsitelty estävää vasta-ainetta kahteen kulttuureissa. Muuttoa testi soluja oli jälleen merkittävästi suurempi kuin kontrollisolut. Tämä data osoitti, että lisäämällä AA erilaistumisen aikana vaiheessa DC merkittävästi parantaa niiden muuttavien kyky.

3 tunnin kuluttua (B) N: o spontaani muuttoliike havaittiin kuopissa, joissa CCL-19 ei lisätty. Vähemmän no. AA

– DC (C) siirtyneet tekemään CCL-19 kuin AA

+ DC (D). (E) AA

+ DC osoitti tilastollisesti tehokas siirtymistä CCL-19 verrattuna AA

– DC (n = 3, keskiarvo ± SD). (F) FACS histogrammi profiilia edustava koe osoittaa ilmaus Kemokiinireseptorin CCR-7 yhdessä MFI-arvot suluissa. Täytetty histogrammit esittävät isotyyppikontrollia ja avoin ne osoittavat tietyn fenotyypin. (G) Salvataan CCR-7 Ab aiheuttaa huomattavaa vähenemistä muuttoliike sekä AA

+ DC ja AA

– DC (n = 3, keskiarvo ± SD). [P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ DC osoitti parempia T-Cell stimuloivan toiminnon.

DC on ominaista niiden kyky stimuloida allogeenisiä T-soluja . Tätä kykyä arvioitiin MLR. MLR suoritettiin sekoittamalla AA

+ DC ja AA

– DC: iden allogeenisten T-solujen Ääreisverenkierrosta eri suhteissa. Triplikaatteina otettiin kunkin pitoisuuden testattu. T-solujen lisääntymistä mitattiin tymidiinin määritystä, kuten on kuvattu menetelmissä. Tiedot kuviosta. 3 (keskiarvo ± SD, n = 3) osoittavat, että AA

+ DC ovat korkeammat allostimuloivaa kapasiteettia. Erot olivat tilastollisesti merkittäviä neljässä kuudesta DC: T-solu suhteilla testattu. Klo 01:10 suhde, tymidiinin AA

+ oli korkeampi kuin AA

– set.

AA

+ DC osoitti parempaa T-solujen stimulaation kuin AA

– DC , erot olivat merkittäviä neljässä kuudesta DC: T-solu suhteet testattu (* P≤0.05, ** P≤0.01). Edustavat tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta. TdR = tymidiini.

sytokiiniprofiilin AA + DC: iden on suotuisampi adoptiiviseen immunoterapiaa.

IL-12 ei ainoastaan ​​signaalit kehittämiseksi efektoritoiminnoista T-soluissa, mutta myös ohjelmia solujen hengissä toiminnallisina muistisolujen [23].

In vitro

DC: ille olivat, jotka voivat erittää korkea IL-12 p70 ja alhainen IL-10. AA

+ DC osoitti parempaa IL-12 p70 erityksen profiilin verrattuna AA

– DC (Fig. 4). AA

– DC on tänään ollut korkeampaa IL-10 eritystä verrattuna AA

+ DC (n = 3). Suhde IL12 /IL10 oli korkeampi AA

+ DC: itä, kuten on esitetty kuviossa. S4. Nämä havainnot viittaavat siihen, että AA

+ DC on parempi Th1 suotuisa sytokiiniprofiilia verrattuna AA

– DC, mikä tekee niistä parempi vaihtoehto kliiniseen käyttöön.

Tulokset osoittavat, että DC tuottamat molemmat viljelyolosuhteet olivat kykenee erityksen IL-12 p70: n ja IL-10. (A) AA

+ DC osoitti parempaa IL-12 p70 eritystä verrattuna AA

– DC. (B) Samoin AA

+ DC on alhainen IL-10 eritystä profiilin verrattuna AA

– DC. Tietojen kolme riippumatonta näytettä on esitetty (n = 3, keskiarvo ± SD). [P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ DC osoittaa korkeampi

in vitro

CTL-aktiivisuus

Kuva 5A esittää CTL tiedot yhdestä edustava näyte. On selvästi nähtävissä, että AA

+ DC: t ovat tehokkaampia efektorifunktioon T-solujen eli aikaan tappaa MCF-7-solujen CTL-määrityksessä verrattuna AA

– DC: itä. Tappaminen on huomattavasti suurempi neljä vaihdetta efektori kohdesolun pitoisuuksia. Kaksi muuta näytettä osoitti myös samansuuntaisesti (kuvio. S5). CTL: iä, jotka ovat peräisin AA

+ DC osoitti parannettu efektoritoiminto eli tehostetun yleinen tappaminen verrattuna CTL: iä, jotka ovat peräisin AA

– DC. Jotta negatiivinen kontrolli set, AA

+ DC ja AA

– DC setit maturoitiin LPS, TNF-α ja CD40L [20]. CTL: t täten syntyvää eivät olleet tehokkaita tappamaan kohde MCF-7 solulinja. Ei tappamista ei havaittu kummassakaan sarjaa (tuloksia ei ole esitetty). Koska Lisänegatiivikontrollina varten Kohdespesifisyyden CTL: iä on saatu MCF-7 lysaattia pohjustetaan DC käytettiin CTL määrityksessä vastaan ​​H1299 solulinjaa mutta ei tappava vaikutus nähtiin näissä sarjaa sekä (CPM-arvot tymidiinin tapauksessa kontrolli oli 12649,33 ± 30.73 SD. pulssialtistuksen ja unpulsed ryhmä korkeimmalla tavoite T-solujen suhde oli 12405,66 ± 36.35 SD ja 12537,33 ± 27.47 SD vastaavasti).

(A) CTL data yhdestä edustavasta näytteestä eli tappaminen tavoitteesta ( MCF-7) solut CTL tuottamat AA

+ DC /AA

– DC pulssi MCF-7 solulysaattia. CTL: iä, jotka ovat peräisin AA

+ DC osoitti parannettu efektoritoiminto eli tehostetun yleinen tappaminen verrattuna CTL: iä, jotka ovat peräisin AA

– DC. Tappaminen on huomattavasti suurempi neljä vaihdetta efektori kohdesolun pitoisuuksia. (* P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001). (B) geeniekspressioprofiili kolmen avainentsyymien liittyy AA reitin yhdessä taloudenhoito geeni GAPDH. On huomattava ylös-säätely transkriptin tason avaimen entsyymi COX-2: DC viljeltiin läsnäollessa AA.

mRNA-tasot keskeisten osallistuvien entsyymien AA aineenvaihduntaan ovat korkeampia AA

+ DC

transkriptipitoisuuksissa kolmen entsyymien liittyy arakidonihapon polku, kuten COX-1, COX-2, PLA

2, havaittiin RT-PCR suoritetaan kohti standardimenetelmillä. Geelin kuvia RT-PCR on esitetty kuviossa. 5B. Kuva. 6B.