Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä, vaikka se on kauhea keskuudessa ruoansulatuskanavan syöpien, on huonosti diagnosoitu, ja edelleen, tilanne on pahentanut vuoksi hankitun lääkeresistenssin vastaan ​​yhden tunnetun lääkehoitoa. Aikaisemmat tutkimukset ovat korostaneet kasvua estäviä vaikutuksia vanhemman sukupolven fluorokinolonit, nykyinen tutkimus pyritään arvioimaan niiden kasvua estäviä vaikutuksia uudemman sukupolven fluorokinoloni, gatifloksasiinin, on haimasyöpä solulinjoissa MIA PaCa-2 ja Panc-1 sekä valaista taustalla molekyylitason mekanismeja. Tässä me raportoimme että Gatifloksasiini tukahduttaa leviämisen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solujen aiheuttamalla S ja G

2-vaiheen solusyklin pysähtymiseen ilman apoptoosin induktion. Blockade in S-vaiheen solusyklin liittyi lisääntynyt TGF-β1 ilmentyminen ja translokaatio Smad3-4 kompleksin tumaan myöhempien aktivointi p21 MIA PaCa-2-soluissa, kun taas TGF-β signalointi heikennettyjä Pancin-1-solut osoittivat S-vaiheen pysähtymisen suoraan aktivoimalla p27. Kuitenkin gatifloksasiinia välitteisen G

2-vaiheen solusyklin pysähtymisen havaittiin olevan p53 riippuu sekä solulinjoissa. Tutkimuksemme on kiinnostava, koska fluorokinolonien on kyky tunkeutua haiman kudos, joka voi olla erittäin tehokas torjunnassa haiman syöpiä, jotka liittyvät yleensä menetyksen tai alisäätely CDK-inhibiittorit p21 /p27 sekä mutaatiostatuksesta inaktivaation p53. Lisäksi, gatifloksasiinia havaittiin myös synergisiä vaikutuksia Gemsitabiini, ainoa tunnettu lääke vastaan ​​haimasyöpä, sekä laaja kirjo syöpälääke sisplatiinia. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että Gatifloksasiini hallussaan syövänvastainen toimintaa vastaan ​​haimasyöpä ja on lupaava ehdokas asetettava uudelleen alkaen laajakirjoisten antibioottien syöpälääke.

Citation: Yadav V, Sultana S, Yadav J, Saini N (2012 ) Gatifloksasiini indusoi S ja G

2-Phase solukierron pysähtymisen in haimasyöpäsoluissa kautta p21 /p27 /p53. PLoS ONE 7 (10): e47796. doi: 10,1371 /journal.pone.0047796

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 03 toukokuu 2012; Hyväksytty: 17 syyskuu 2012; Julkaistu: 25 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Yadav et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia (NWP-13 ja EXP0011) neuvostolta tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR), Intia. VY tuettiin Senior Research Fellowship CSIR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haimasyöpä, pahanlaatuinen kasvain haima on tällä hetkellä viidenneksi yleisin syöpäkuolemien syy [1]. Huolimatta diagnoosien parantamista, ennuste on edelleen huono, koska myöhässä oireet ilmenevät, aggressiivinen kasvaimen kasvua ja syvällinen desmoplastic reaktio [2]; [3]. 5 vuoden pysyvyys on noin 15-20%, haima- resektio tapauksessa haimasyövän [4]. Sen lisäksi leikkaus, adjuvanttihoitoa gemsitabiinihoidon ja erlotinibin on osoitettu parantavan ennusteen kokoisen haimasyövän tapauksissa [5]. Joten, on kasvu eloonjäämisaste tavanomaisen solunsalpaajahoidosta verrattuna leikkausta [6], mutta silti on olemassa tarve kehittää tai tunnistaa mahdollisuudet syöpälääke lisääntynyt valikoivuus ja alentunut toksisuus.

Viime vuosina vanhemmat sukupolven fluorokinolonit kuten Moksifloksasiinia ja Siprofloksasiini jolla laajakirjoinen antibiootti aktiivisuus, ovat osoittaneet kasvua estäviä vaikutuksia indusoimalla apoptoosin ja solukierron pysähtymisen erilaisissa syöpäsolulinjoissa [7] – [10]. Nämä nonantimicrobial toimet ovat tehneet niistä ainutlaatuisia muun laajakirjoisia antibiootteja. Gatifloksasiini tai 8-metoksi fluorokinoloneja on uudempi (neljäs) sukupolven fluoroquinolone jolla on samanlainen antibiootti vaikutuksia kohdentamalla bakteerin DNA-gyraasi ja topoisomeraasi [11] – [13], ja se on myös voimakas lääke useissa erittäin tarttuvien tautien, kuten, seksuaalisesti tarttuvat taudit, toksoplasmoosi ja Tularemia [14] – [16]. Kuten muutkin fluoroquinolone perheenjäsenet on myös tiedetään olevan tiettyjä immunomodulaarisia vaikutuksia

in vitro

erilaisissa solulinjoissa sekä se on alle kliinisissä tutkimuksissa hoitoon keuhkotuberkuloosi [17]; [18]. Ottaa niin paljon samanlaisia ​​vaikutuksia muihin fluorokinolonien perheenjäsenten, ei kasvua estävä vaikutus syövän solulinjoja on raportoitu Gatifloksasiini. Lisäksi haimakudos läpitunkeva hyötysuhde on hyvin raportoitu [19] tapauksessa fluorokinolonien joka houkutteli meidät tutkimaan mekanismia, jolla Gatifloksasiini vaimentaa haiman syöpäsolujen kasvua. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus gatifloksasiinin eloonjäämiseen ja leviämisen haimasyövän solulinjoissa (MIA PaCa-2 ja Panc-1) ja totesi, että Gatifloksasiini pystyi tukahduttaa leviämisen molemmissa solulinjoissa, joissa MIA PaCa-2 on enemmän herkkä kuin Pancin-1. Differentiaalinen tulos voi johtua ero funktionaalisten TGF-β-reseptorien kaksi solulinjoissa MIA PaCa-2 herkkyys TGF-β1 ja Panc-1 on kestävä kuin niiltä puuttuu toiminnallinen TGF-β tyypin I reseptori [20]. Huomasimme, että Gatifloksasiini pysäyttää solut G

2-vaiheen kautta inaktivaatio cdc2-cyclinB1 kompleksi fosforylaatio cdc2 on Tyr15 kautta p53 aktivaation. Lisäksi osoitamme, että Gatifloksasiini voivat aiheuttaa p21 ja p27 tasoilla MIA PaCa-2 ja Panc-1-soluissa aiheuttaen S-vaiheen pysähtymisen. Olemme lisäksi osoittaneet, että Gatifloksasiini pystyi synergisiä antiproliferatiivinen aktiivisuus Gemsitabiini ja sisplatiinia molemmissa solulinjoissa.

Tulokset

Gatifloksasiini hillitsee haimakarsinooma- Solut

In vitro

arvioimiseksi anti-proliferatiivinen vaikutus gatifloksasiinin, käytimme MIA PaCa-2 ja Panc-1 haimakarsinooma solulinjat. Ensin tutkittiin erilaisten annosten vaikutuksen (0-400 ug /ml) gatifloksasiinin elinkelpoisuudesta MIA PaCa-2 ja Panc-1-soluja 24 h ja 48 h käyttäen MTT-määritystä. Kuten kuviossa 1 on esitetty, GFX-hoito johti ajasta ja annoksesta riippuvaa vähenemistä soluproliferaation MIA PaCa-2 ja Panc-1-soluissa, vaikkakin eri tasoilla. Gatifloksasiini hoito johti 15-46% (p = 0,002) vähentää solujen elinkelpoisuuden MIA PaCa-2 ja 1-43% (p = 0,007) vähentää solujen elinkelpoisuuden Pancin-1-soluissa 24 tunnin kuluttua (kuvio 1A i) . Havaitsimme 19-73% (p = 0,0016) lasku solujen elinkelpoisuuden MIA PaCa-2 ja 11-72% (p = 0,00016) vähentää solujen elinkelpoisuuden Pancin-1 solujen 48 h (kuvio 1A ii). Yllä olevat tiedot osoittavat selvästi, MIA PaCa-2 olevan herkempiä Gatifloksasiini kuin Panc-1 kaikilla annoksilla. Silmiinpistävä havainto nämä tiedot olivat väheneminen elinkelpoisuus, on selvempi suuremmilla annoksilla (100, 200 ja 400 ug /ml), gatifloksasiinin hoidon jälkeen 24 h ja 48 h hoito molemmissa solulinjoissa ja siten otimme nämä pitoisuudet ja aika kohdat suorittaa lisäkokeita.

MTT-määritystä MIA PaCa-2 ja Panc-1-solujen hoidon jälkeen Gatifloksasiini (0-400 ug /ml) 24 tuntia (Ai) ja 48 h (AII). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa), joka annettiin tarttua yli yön ja käsiteltiin seuraavaksi kasvava pitoisuus gatifloksasiinin 24 ja 48 tuntia. Pystyakselilla% proliferaationopeus taas vaaka-akseli edustaa lisääntyvä keskittyminen Gatifloksasiini ug /ml. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. * P 0,01 verrattuna vehikkelikontrolliin. (B) anneksiini V-PE sitoutumisen MIA PaCa-2 (i-v) ja Panc-1 (vi-x) hoidon jälkeen Gatifloksasiini 48 tuntia arvioituna 7-AAD ja anneksiiniV värjäystä. (I) ja (vi) Ajoneuvon käsiteltiin kontrolli-soluissa, (ii) ja (vii) solut käsiteltiin 100 ug /ml, (iii) ja (viii) käsiteltyjä soluja 200 ug /ml, (iv) ja (ix) solut käsiteltiin 400 ug /ml gatifloksasiinin. (V) MIA PaCa-2-solut ja (x) Pancin-1-soluja käsiteltiin curcumin 60 uM 24 tuntia positiivisena kontrollina. Pystyakselilla 7-AAD positiivisia soluja taas vaaka-akseli edustaa anneksiini V-PE-positiiviset solut. Edustajalle kolmen erillisen kokeen on esitetty samanlaisia ​​tuloksia. (C) Western blot analyysi ekspression Bax-proteiinin vaikutuksen alaisena gatifloksasiinin ajan (24, 48 h) ja annos (0, 100, 200, 400 ug /ml) riippuvalla tavalla. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (D) kaspaasi 3, 8, 9 toiminta MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini ajoissa (24, 48 h) ja annos (0, 100, 200, 400 ug /ml) riippuvalla tavalla. Pylväsdiagrammi edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Gatifloksasiini indusoi solusyklin pysähtymiseen S ja G

2 – vaihe haimakarsinooma- Solut ilman induktio Apoptosis

tutkimme seuraavaksi Gatifloksasiini välittämää väheneminen elinkelpoisuutta MIA PaCa-2 ja Panc-1-soluissa johtuu apoptoosin /nekroosin. Ensin tarkistetaan apoptoosin anneksiini-määrityksellä. Kuten kuviossa 1B emme löytäneet merkittäviä muutoksia apoptoottista /necrotic väestö lainkaan annoksina gatifloksasiinin verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin molemmissa solulinjoissa 24 h sekä 48 tuntia vastaavasti. Edelleen rajat vahvistaa meidän anneksiini data, me seuraavaksi tarkastetaan ilmentymistason proapoptoottiset proteiinin Bax Western blotting ja kaspaasi -3, -8 ja -9 annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla vaikutuksen alaisena gatifloksasiinin. Emme löytäneet mitään merkittävää muutosta joko Bax-proteiinin taso (kuvio 1 C) tai kaspaasi -3, -8 ja -9 aktiivisuutta (kuvio 1 D), mikä osoittaa, että Gatifloksasiini ei estä elinkelpoisuutta soluja. Tulokset Anneksiini V: n ja kaspaasi toimintaa myös validoitu käyttämällä positiivisena kontrollina, kurkumiini (60 uM 24 h).

Seuraavaksi me

mitattiin

solusyklin

tilan MIA PaCa-2 ja Panc-1-solujen läsnä ollessa, 100, 200, 400 ug /ml gatifloksasiinin 24 tunnin kohdalla ja 48 tunnin (kuvio 2 ). Solusyklin jakelu analyysi osoitti, että Gatifloksasiini vaikeuttaa solusyklin etenemistä pysäyttämällä solut S ja G

2-vaiheessa niin solulinjoissa. In MIA PaCa-2-soluissa, kasvaa osuus solujen S-vaiheessa oli 9 ± 1,1% (ajoneuvo käsitellyissä soluissa) 21 ± 2,1% (400 ug /ml), jossa on samanaikainen väheneminen prosentteina solujen G

2 faasi vehikkelikäsitellyt 31 ± 2,1%: sta 18 ± 2,7% (400 ug /ml) eikä muutosta prosenttiosuus solujen G

1 vaihe havaittiin soluissa alttiina till 24 h. Kuitenkin 48 tuntia, solut alkoivat kertyvät G

2 vaihe 24 ± 3% (ajoneuvo käsitelty) 67 ± 2,5% 200 ug /ml Gatifloksasiini ja tämä pienennettiin 40 ± 2% 400 ug /ml gatifloksasiinin (kuva 2i ja ylempi paneeli). In Panc-1, solut alkoivat kertyvät S-vaiheessa 8 ± 1% (ajoneuvo käsitelty) 14 ± 1,5% (400 ug /ml), mutta toisin kuin MIA PaCa-2, solujen alkoi kertyminen G

2- vaihe 24 h lähtien 29 ± 1% (ajoneuvo käsitelty) 56 ± 3% ja oli rajoitettu takaisin 32 ± 1,05% 400 ug /ml (kuvio 2ii ja ylempi paneeli). Kasvua ei SubG1 huippu havaittiin molemmissa solulinjoissa. Yhdessä meidän tiedot viittaavat vahvasti siihen, että Gatifloksasiini ei indusoi apoptoosia vaan aiheuttaa pidätys solujen S ja G

2-vaihe haimakarsinooma- soluissa.

Effects of Gatifloksasiini solusyklin tutkittiin käyttämällä PI ( propidiumjodidia) värjäys. Soluja käsiteltiin (0-400 ug /ml) Gatifloksasiini 24 ja 48 tuntia, kerättiin ja värjättiin PI. Täällä Pink huippu edustaa G

1-vaihe, vihreä huippu edustaa S-vaiheen ja Blue huippu edustaa G

2-vaihe vastaavasti. Ylempi paneeli osoittaa edustava kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin ja alapaneeli edustaa bar kaavio solujen eri vaiheissa. Pylväsdiagrammi edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (I) edustaja -pylväsnäyttö MIA PaCa-2, (ii) edustaja -pylväsnäyttö Pancin-1.

Gatifloksasiini aiheuttaa aktivointi TGF-β1 /Smad Complex /p21 MIA PaCa-2 ja aktivointi p27 in Pancin-1

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että yksi fluorokinoloni, siprofloksasiini tukahduttaa paksusuolensyöpä soluproliferaatiota pidättämällä ne S-faasin läpi TGF-β1 ja TGF-β1 on myös hyvin tuntemia syy solukierron pysähtymisen haiman syöpäsoluissa [21]; [22]. To

tutkia

onko Gatifloxacin-

indusoi

S-vaiheen pidätys oli

TGF

-β

riippuvainen

tarkistimme tasot TGF-β1 transkriptionaalisella sekä translaation tasolla. Olemme löytäneet Gatifloksasiini hoitoa (100, 200, 400 ug /ml) lisätä TGF-β1 ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla 1,5-2-kertaisesti (p 0,01), transkriptionaalisella tasolla, ja 1,3-2-kertainen (p 0,01) on translaation tasolla kuluttua 48 h MIA PaCa-2 solujen mutta ei Pancin-1-soluissa (kuvio 3AI 3Bi). Koska me

todettu merkittävä kasvu

TGF-β1 ilmentyminen tasolla 400 ug /ml, teimme aika-kurssi tutkimus ja havaittu, että TGF-β1 alkoi kasvaa kopioinnin suhteen kuluessa 4 h (p = 0,023) hoidon ja saavutti korkeintaan 12 h (p 0,01) ja sitten tasaantui 16 h (kuvio 3Aii). Kuitenkin etenevästi, TGF-β1 aktivoituu 8 h kuluessa (p = 0,039) ainoastaan ​​ja saavutti sen suurinta ilmaisun 16 h (p 0,01) (kuvio 3Bii), joka arvioidaan reaaliajassa PCR ja western-blottauksella. On yhä enemmän todisteita siitä, että Smad transkriptiotekijöiden välittää kasvua estävää vaikutusta transformoiva kasvutekijä-β1 (TGF-β1) monissa solutyypeissä [23]. Tutkia suhteellinen osuus yksittäisten Smad proteiinien TGF-β1 signalointi, proteiinin ilmentymistä Smad2 ja Smad3 analysoitiin western blotting solu-uutteiden kuluttua 48 h gatifloksasiinin hoidon (100, 200, 400 ug /ml) MIA PaCa-2 solut. Kuten kuviossa 3Ci, havaitsimme merkittävän kasvun fosfo-Smad3 (

pSmad3 Ser 423

) vaikkei ollut mitään muutosta tasot

phospho

–

Smad2

(

pSmad2 Ser 467

) jälkeen 48 h gatifloksasiinin käsittelyä lainkaan annoksilla MIA PaCa-2-soluissa. Lisäksi kasvu fosforia

Smad3

(

pSmad3

) havaittiin olevan annoksesta riippuvaisella tavalla (1,3-2,4-kertainen, p = 0,0127) verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Tarpeeksi todisteita on tukea että aktivoitu Smad2 tai Smad3 dimerisoituu kanssa Smad4 ja siirtyy tumaan, jolloin aktivoitu kompleksit assosioituvat Smad sitovan elementin (SBEs) in promoottorit lukuisten geenien johtaa niiden induktio [24] – [26]. p21

Waf1 /CIP1 on yksi tällainen geeni, jonka tiedetään olevan osallisena TGF-β1 säätelyyn solujen lisääntymisen [27]. Sen ratkaisemiseksi, onko Smad3 translokoituu vastauksena TGF-β1 stimulaation MIA PaCa-2-solut, arvioimme subsellulaarisen jakauma Smad3 /4 ja odotetusti, väheneekö Smad-3 ja Smad-4-proteiinin ilmentymistä havaittiin sytosolifraktion ja oli samanaikainen kasvu Smad-3 ja Smad-4-proteiinin ilmentyminen tumafraktios- in Gatifloksasiini käsitelty MIA PaCa-2-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 3Cii). Samalla myös analysoida ekspression p21

Waf1 /CIP1, loppupään efektori TGF-β1, jonka tiedetään olevan tärkeä säätelijä solusyklin etenemisen. Kuten p21, p27 on sykliiniriippuvaisen estäjä, joka säätelee G

1-S vaiheesta solusyklin etenemisen, joten pyysimme ilmentymistä p21 ja p27 Western blot analyysi [28]. Havaitsimme merkittävän kasvun (1,4-1,7-kertainen, p = 0,038) tasojen p21 ja merkittävää laskua (0,57-0,35-kertainen, p = 0,012) tasojen p27 annoksesta riippuvalla tavalla 48 h jälkeen gatifloksasiinin kohtelun kuin ajoneuvojen käsitellyt solut (kuvio 4AI). Mielenkiintoista kasvavan p21 havaittiin vasta TGF-β1 aktivointia ts kuluttua 12 h (p = 0,035), in MIA PaCa-2-solut (kuvio 4Aii). Kuitenkin jos kyseessä on Pancin-1-soluja, jotka puuttuvat toiminnallinen TGF-β1 emme löytäneet aktivoitumista p21, mutta me löytää aktivoinnin p27. Havaitsimme merkittävän kasvun (1,8-2,3-kertainen, p = 0,021) tasojen p27 annoksesta riippuvalla tavalla 48 h jälkeen gatifloksasiinin kohtelun kuin ajoneuvon käsiteltyjen solujen (kuvio 4AI). Samalla myös tarkistaa tasoja Skp2 joka välittää ubikitinaation ja hajoaminen p27 /p21 sekä solulinjoissa MIA PaCa-2 ja Panc-1 vasteena Gatifloksasiini hoitoon (0, 100, 200 ja 400 ug /ml) [29] . Löysimme merkittävä kasvu (2,7-4,3-kertainen, p = 0,008 in MIA PaCa-2-soluissa ja 4,3-6,3 kertaiseksi p = 0,005 in Pancin-1) in Skp2 tasot molemmissa solulinjoissa. Kuten odotettua löysimme käänteinen korrelaatio Skp2 ja p27 /p21 (Kuva 4AI). Yhdessä tämä tutkimus osoittaa, että TGF-β1 /Smad3 /p21, on yksi niistä polkuja, joka johtaa S-vaiheeseen pysähtymisen MIA PaCa-2-soluissa ja p27 pelaa keskeinen rooli S-vaiheessa pidätyksen Pancin-1-soluissa.

(A) (i) Real Time PCR-analyysi TGF-β1 ilmentyminen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla, (ii) Real Time PCR-analyysi TGF-β1 ilmentyminen in MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 400 ug /ml gatifloksasiinin ajasta riippuvalla tavalla. 18S rRNA käytettiin normalisoimaan tuloksia. (B) Western blot-analyysi TGF-β1 ilmentyminen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla (i) western blot-analyysi TGF-β1 ilmentyminen MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 400 ug: /ml Gatifloksasiini ajassa riippuvaisella tavalla (ii). Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. Bar Graph on keskiarvo ± SEM. (C) (i) vaikutus Gatifloksasiini on reseptorivälitteisen Smad: ien (pSmad-2 ja pSmad-3), kun arvioidaan kokosolulysaatissa in MIA PaCa-2-soluissa. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (Ii) translokaatio Smad 3-4 kompleksin solulimasta tumaan vaikutuksesta gatifloksasiinin annos (0, 100, 200, 400 ug /ml) ja aika riippuvaisella tavalla (0, 6, 12, 18, 24 h) arvioitiin western blottauksella. Nuclear ja Sytoplastiset jakeet erotettiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Lamin B (Nuclear erityinen proteiini) ja α-Tubulin (Sytoplasmiset erityinen proteiini) käytettiin lastaus valvontaa.

(A) (i) Western blot-analyysi p21, P27 ja Skp2 ilmaisun MIA PaCa -2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla. β-Actin käytettiin kuormituksen valvonta p21 ja p27, kun taas Lamin B käytettiin lastaus valvonta Skp2, (A) (ii) Western blot-analyysi p21 ilmentymisen MIA PaCa-2-solut käsiteltiin 400 ug /ml gatifloksasiinin ajassa riippuvaisella tavalla. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. Bar Graph on keskiarvo ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 vs. kontrolli. Gatifloksasiinia välitteisen S-vaiheessa pidätys on TGF-β1 riippuvaisia ​​MIA PaCa-2 (B) (i) MTT-määritystä MIA PaCa-2 ja Panc-1-solujen läsnä ollessa rekombinantti-TGF-β1: ssa 48 tuntia. Pystyakselilla% proliferaationopeus taas vaaka-akseli edustaa lisääntyvä keskittyminen rekombinantti-TGF-β1 ng /ml. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. * P 0,01, # p 0,05 vs. kontrolli. (B) (ii) lakkauttaminen S-faasin pysähtymisen MIA PaCa-2-soluissa arvioimana PI (propidiumjodidia) värjäystä. Solut, jotka on transfektoitu TGF-β1 siRNA (48 h) ja salattu siRNA alongwith transfektoimattomia soluja käsiteltiin 100 ug /ml 400 ug /ml Gatifloksasiini (24 h) 24 h transfektion, kerättiin ja värjättiin PI. Vasen paneeli edustaa pylväsdiagrammi, jossa pystyakselilla% DNA sisällön S-vaiheen ja vaaka-akseli edustaa Gatifloksasiini pitoisuutta ug /ml. Pylväsdiagrammi edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,01, # p 0,05 vs. kontrolli. Oikea paneeli esittää western blot varten knockdown tehokkuuden TGF-β1 siRNA. (1) edustaa transfektoimattomia kontrollisoluja, (2) TGF-β1 siRNA transfektoiduissa soluissa, (3) TGF-β1 siRNA transfektoituja soluja 400 ug /ml gatifloksasiinin, (4) siRNA transfektoidut solut, (5) siRNA transfektoitujen solujen 400 ug /ml gatifloksasiinin. Gatifloksasiini välittämä S vaiheen pysähtymisen on p21 riippuvainen MIA PaCa-2 ja p27 riippuvaisia ​​Pancin-1-soluissa. (C) lakkauttaminen S-faasin pysähtymisen MIA PaCa-2 solut transfektoitu p21 siRNA (i) ja Panc-1-solut transfektoitu p27 siRNA (ii), vastaavasti arvioituna PI (propidiumjodidia) värjäystä. Solut, jotka on transfektoitu p21 /p27 siRNA ja salattu siRNA (48 h) alongwith transfektoimattomia soluja käsiteltiin 100 ug /ml 400 ug /ml gatifloksasiinin (24 h) 24 h transfektion, kerättiin ja värjättiin PI. Vasen paneeli edustaa pylväsdiagrammi, jossa pystyakselilla% DNA sisällön S-vaiheen ja vaaka-akseli edustaa Gatifloksasiini pitoisuutta ug /ml. Oikea paneeli esittää western blot varten knockdown tehokkuuden p21 tai p27 siRNA. (1) edustaa transfektoimattomia kontrollisoluja, (2) p21 /p27 siRNA transfektoiduissa soluissa, (3) p21 /p27 siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin 400 ug /ml gatifloksasiinin, (4) salattu siRNA transfektoidut solut, (5) salattu siRNA transfektoitujen solut, joita käsiteltiin 400 ug /ml gatifloksasiinin. Pylväsdiagrammi edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,01, # p 0,05 verrokkiin nähden.

Gatifloksasiini välittämä S-vaihe pidätys on TGF-β1 /p21 riippuvainen MIA PaCa-2 ja p27 Riippuu in Pancin-1 solut

vahvista roolin TGF-β1 tukahduttamaan leviämisen, yhdistelmä-TGF-β1 transfektoitiin klo monipuolinen annoksilla (0-100 ng /ml) MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut 48 tuntia ja MTT-määritys suoritettiin . Havaitsimme, että yli TGF-β1 suppressoi merkittävästi MIA PaCa-2 solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. Havaitsimme merkittävän vähenemisen (35%, p 0,05, kuvio 4Bi) soluproliferaatioon pitoisuutena 100 ng /ml MIA PaCa-2-soluja, mutta ei Panc-1-soluissa. Meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​sen havaintojen Francisco j nicolas

et al

mikä viittaa Pancin-1 olevan vastustuskykyisiä TGF-β1 aiheuttama kasvun pysähtyminen. Edelleen vahvistaa roolia TGF-β1 välittämisessä S-vaiheen pysähtymisen aiheuttama Gatifloksasiini in MIA PaCa-2, me tukkinut TGF-β1 ilmentyminen käyttämällä siRNA ja tekivät solusyklin analyysi. Kuten kuviossa 4Bii, S-vaihe pidättämisestä poistetaan kokonaan kaikilla kolmella annoksella gatifloksasiinin käytetään TGF-β1 siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna salattu siRNA transfektoidut solut tai transfektoimattomat solut. Näin ollen meidän vieressä pyrittiin määrittämään roolia p21 ja p27 S-faasin pysähtymisen TGF-β1 herkkä MIA PaCa-2 tai resistenttejä Pancin-1-soluissa. Huomasimme, että p21 siRNA transfektoitu MIA PaCa-2 (kuvio 4Ci) ja p27 siRNA transfektoiduissa Pancin-1-soluissa (kuvio 4Cii) estää voimakkaasti Gatifloksasiini aiheuttamaa S-vaiheen pysähtymisen verrattuna salattu siRNA lainkaan annoksilla. siRNA välittämä kaataa TGF-β1, p21 ja p27 vahvistettiin myös käyttäen western blot-analyysi (kuvio 4Bii, Ci ja CII). siRNA välittämä Knockdown tulokset viittaavat siihen, että S vaihe pidätys Gatifloksasiini on TGF-β1 /p21 riippuvainen MIA PaCa-2 ja p27 riippuvaisia ​​Pancin-1-soluissa.

Gatifloksasiini Estää Pakt ja aiheuttaa G

2-vaiheinen pidätys p53 riippuvaisella tavalla molemmissa solulinjoissa

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että p53 voi aktivoida ilmentymistä p21 joka sitten estää sykliiniriippuvaisten kinaasien ja johtaa solusyklin pysähtymiseen [30]. Samoin Pakt on myös osoitettu olevan kriittinen säätelijä solujen eloonjäämistä ja solusyklin etenemisen lisäksi negatiivisesti säätelemällä p53 [31]. Näin ollen, seuraavan kerran tarkistanut p53 yhteensä AKT ja Pakt läsnä tai poissa ollessa vaihtelevia annoksia gatifloksasiinin. Kuvio 5A ja 5B ilmeni aktivoitumista p53 sekä transkription ja translaation tasolla. Löysimme Gatifloksasiini hoitoa 100 ja 200 ug /ml annos lisää p53 ilmentymistä 1,4-2 kertaiseksi (p 0,01) transcriptionaly ja 1,8-2,45-kertainen (p 0,01) etenevästi in MIA PaCa-2-soluissa ja 1,75-2,5-kertainen (p 0,013) transcriptionaly ja 1,4-2,0 kertaiseksi translationaalisesti in Pancin-1-soluissa 48 tunnin jälkeen (kuvio 5Ai, 5Bi) verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Emme löytäneet mitään muutosta p53 mRNA-tasolla /proteiinin taso molemmissa solulinjoissa 400 ug /ml Gatifloksasiini (kuvio 5B). Koska meillä on enintään ilmaisu 200 ug /ml, teimme ajan tietenkin kokeessa 200 ug /ml gatifloksasiinin ja havaittiin, että p53: n ilmentyminen alkoi kasvaa 8 h kuluessa gatifloksasiinin hoidon, transcriptionaly (p = 0,032) sekä translationaly (p = 0.022) in Pancin-1-soluissa, mutta siellä viivästyi lisääntyminen p53 ilmentymistä MIA PaCa-2-soluissa, joka laukaisee merkittävästi vasta 24 h transcriptionaly (p = 0,034) sekä translationaly (p = 0,048) ja maksimaalinen 40 h (p 0,01) ja sen jälkeen molemmissa solulinjoissa (kuvio 5Aii, 5Bii). Kuten kuviossa 5Bi, gatifloksasiinin (100, 200, 400 ug /ml) käsittely aiheutti merkittävän laskun Pakt (Ser 473) tasojen annoksesta riippuvaisella tavalla 0,86-+0,51 kertaisesti (p = 0,027) in MIA PaCa-2 ja 0,89 -0,41 kertainen (p 0,01) Pancin-1-soluissa ilman mitään muutosta koko AKT tasoilla. Aikamme-kurssi kokeilu osoitti, että jopa 16 tuntia ei ollut paljon väheneminen p-Akt (Ser 473) nähden, mutta sen jälkeen 16 h oli

merkittävä

laskua Pakt tasojen (p 0,01) MIA PaCa -2-soluja. In Panc-1-solut, jopa 24 h ei ollut laskua Pakt tasoilla ja lasku tuli merkittävä 32 h (p 0,01) lähtien, kun läsnä on 400 ug /ml gatifloksasiinin hoitoa (kuvio 5Bii).

(A) (i) Real Time PCR-analyysi p53-ilmentymisen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla, (ii) Real Time PCR-analyysi p53-ilmentymisen MIA PaCa-2, ja Pancin-1-soluja käsiteltiin 200 ug /ml Gatifloksasiini ajassa riippuvaisella tavalla. 18S rRNA käytettiin normalisoimaan tuloksia. (B) (i) Western blot-analyysi p53, AKT ja Pakt ilmentymisen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla, (ii) Western blot-analyysi p53, AKT ja Pakt ilmentymisen MIA PaCa-2 ja Panc-1-solut käsiteltiin Gatifloksasiini ajassa riippuvaisella tavalla. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. Bar Graph on keskiarvo ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 verrattuna kontrolliin.

Seuraavaksi, jotta tutkia pidätyksen aiheuttama Gatifloksasiini on p53 riippuvainen transkription estäjän ActinomycinD (ActD) ja inhibiittorin Sykloheksimidi (CHX) käytettiin ja solusyklin analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 6A, kun läsnä on 200 ug /ml gatifloksasiinin oli täydellinen G

2-vaiheen pysähtymisen, joka poistettiin, kun läsnä on CHX (2 ug /ml) ja ActD (1 ug /ml) sen jälkeen, kun 48 h molemmissa solulinjoissa. Oikea paneeli kuviossa on esitetty tehoa CHX ja lain D vähentämisessä p53 tasoilla. Tuloksemme ehdotti, että Gatifloksasiini aiheuttaa G

2-vaiheen pysähtymisen p53 riippuvaisella tavalla. Emme voineet käyttää siRNA tässä, koska se on hyvin dokumentoitu, että molemmat MIA PaCa-2 ja Panc-1 on mutaatio p53 [32]. Edelleen vahvistaa roolia p53 Gatifloksasiini aiheuttama G2 pidätys, vertaamalla vastauksia isogeenisiin HCT116 villityypin p53 + /+ ja puutteellinen p53 – /- solulinjoissa tehtiin. Käsittelimme sekä solulinjoissa gatifloksasiinin (100, 200, 400 ug /ml) 24 tuntia ja havaittu merkittävä kasvu p53-proteiinin tason villityypin HCT116 p53 + /+, joka oli samanlainen kuin MIA PaCa-2 ja Panc-1. Tämä induktio kuitenkaan ei havaittu p53 puutteellinen HCT116 p53 – /- solut, joita käsiteltiin samoissa olosuhteissa (kuvio 6Bi). Vertasimme myös solupopulaation pidätettiin G2-vaiheen jälkeen Gatifloksasiini hoitoa sekä solulinjojen HCT116 solulinjat. Tuloksemme osoittivat merkittävää kasvua G2-vaiheen pysähtymisen 27%: sta 41%: in HCT p53 + /+ solulinja mutta ei muutosta G2-vaiheessa alaryhmän HCT p53 – /- solulinja siten osoittaa kohti teoriaamme p53 tavoitteeksi asetettiin gatifloksasiinia (kuvio 6Bii). Sitten vahvisti myös vaikutusta samanaikaisesti tarkistamalla p53-proteiinin annoksesta riippuvaisella tavalla (Gatifloksasiini 0, 100, 200, 400 ug /ml) kahdessa muussa p53 positiivinen MCF7 (2-3,08-kertainen kasvu, p = 0,0078 ) ja A549 (2,1-4,8-kertainen kasvu, p = 0,0085) (kuvio 6C).

(A) Vasen paneeli näyttää Solusyklianalyysiä of MIA PaCa-2 ja Panc-1 soluja viljellään läsnä ollessa tai puuttuessa p53 transkription estäjä ActinomycinD (1 ug /ml) tai translationaalisen estäjä sykloheksimidiä (2 ug /ml) yhdessä 200 ug /ml Gatifloksasiini 48 tuntia ja oikea paneeli esittää p53-proteiinin ilmentymistä MIA PaCa-2 ja Panc- 1-solujen läsnä ollessa tai ilman 200 ug /ml gatifloksasiinia tai ilman 2 ug /ml CHX tai 1 ug /ml ActD. % Täällä osoittaa prosenttiosuuden G

2 vaihe alaryhmästä. (B) (i) Western blot analyysi p53 ilmentymisen HCT116 p53 + /+ ja P53 – /- solulinjoja käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvalla tavalla 24 h. (Ii) Solusyklin analyysi HCT116 p53 + /+ ja P53 – /- käsiteltiin Gatifloksasiini (0-400 ug /ml) 24 tuntia. % Täällä osoittaa prosenttiosuuden G

2 vaihe alaryhmästä. (C) Western blot-analyysi p53-proteiinin ilmentymisen MCF 7 ja A549-soluja käsiteltiin Gatifloksasiini annoksesta riippuvaisella tavalla. Bar Graph on keskiarvo ± SEM. * P 0,01, verrattuna kontrolliin.

Gatifloksasiini Vähentää tasot S ja G

2-vaiheen Regulatory CDK ja Sykliinit molemmissa solulinjoissa

leikellä biokemiallisia tapahtumien hallintaan siirtyminen yhdestä solusyklin vaihe tarkastelimme tasot useiden solusyklin proteiineja hoidon jälkeen Gatifloksasiini. Sykliini A, sykliini E ja CDK2 säätelee normaali S-vaiheen etenemisen [33]; [34], ja löydettiin Gatifloksasiini vähentämään merkittävästi ekspressiotasot näiden proteiinien sekä solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla 48 h jälkeen (kuvio 7A). Samalla tavalla Gatifloksasiini hoitoon sekä solulinjoissa aiheutti myös säätelyä alaspäin sykliini B1 ilmentymisen, joka on mukana G

2-vaiheen etenemisen. Kuitenkin löysimme kasvu ilmaus estävän fosforylaation cdc2 at Tyr-15 sekä koko CDC-2 tasossa molemmissa solulinjoissa, vaikkei ollut mitään muutosta ilmaus Cdc25c.

(A ) vaikutus Gatifloksasiini S ja G

2-vaihe sääntelyn Sykliinit ja CDK arvioimana western blot analyysi MIA PaCa-2 ja Panc-1-soluissa (B) Gatifloksasiini (100 ug /ml) synergizes antiproliferatiivinen vaikutus Gemsitabiini (0.91nM /l) ja sisplatiinia (10 uM) in MIA PaCa-2 ja Panc-1 soluja arvioitiin MTT: llä.