Krooninen sairaus

tiivistelmä

tyypin 2 transmembraani- seriiniproteaasin matriptase ilmentyy laajasti ihmisen karsinoomia ja hematologiset syövät. Proteolyyttisen aktiivisuuden matriptase on mahdollinen kohde huumeiden ja kuvantamisen koettimia. Olemme arvioineet kohtalo aktiivinen matriptase induktion jälkeen matriptase tsymogeeni aktivoinnin. Paljastaen kahdeksan ihmisen karsinooman solut pH 6,0 indusoi vahvaa matriptase tsymogeeni aktivaatio, jota seuraa nopea estämällä muodostuvan aktiivisen matriptase mukaan hepatosyyttikasvutekijäaktivaattorin inhibiittori (HAI) -1. Näin ollen, ei ole entsymaattisesti aktiivinen matriptase havaittiin näissä soluissa. Eräät aktiiviset matriptase on kuitenkin nopeasti irtoa solunulkoiseen ympäristöön näiden karsinoomasoluja. Puute soluun liittyvä aktiivinen matriptase ja irtoaminen aktiivisen matriptase havaittiin myös kaksi hematologisen syövän riviä. Matriptase irtoaminen on korreloi läheisesti induktion matriptase aktivaation, mikä viittaa siihen, että matriptase aktivointi ja irtoaminen on kytketty kineettisesti. Kytkin sallii suhteessa aktiivisen matriptase hengissä HAI-1 esto nopea irtoaminen solusta pinnasta. Tutkimuksemme osoittaa, että solujen vapaa, aktiivinen matriptase on niukkaa ja ehkä ole tehokas tavoite

in vivo

kuvantaminen ja lääkekehityksessä.

Citation: Chu LL, Xu Y, Yang JR, Hu YA, Chang HH, Lai HY, et ai. (2014) ihmisen syöpäsoluja säilyttää Vaatimaton tasot Entsymaattisesti aktiivinen Matriptase Vain solunulkoiseen ympäristöön seuraavissa induktio Tsymogeeni Activation. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10,1371 /journal.pone.0092244

Editor: Jian Cao, Stony Brook University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 09 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Chu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute (NCI) Avustukset RO1 CA 123223 (M. Johnson ja C.-Y. Lin); Taiwan puolustusministeriön Grant MAB-102-08 (ja J.-K. Wang); ja Chi-Mei Medical Center apurahan CMNDMC-10211 (jotta J.-K. Wang ja L.-L. Chu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: C.-Y.L. on keksijä Yhdysvaltain patenttien # 6077938 ja # 6677377 ja M.D.J. ja C.-Y.L. ovat keksijät Yhdysvaltain patentti # 7355015. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Proteaasit katalysoivat proteiinien hajottamiseksi jonka peptidisidosten hydrolyysiä. Kautta säännelty pilkkominen proteiinien, proteaasit ovat mukana monissa erittäin valvotuissa fysiologisia prosesseja, kuten DNA: n kahdentuminen, solusyklin etenemisen, solukuoleman, angiogeneesin, veren hyytymisen, tulehdus, neurogenesis ja koskemattomuus. Proteaasi säätelyhäiriötä on ollut mukana monenlaisia ​​sairauksia, kuten syöpää ja sydän- häiriöt. Proteaasit ovat siksi pidetään tehokas kehityskohteet huumeiden tavoitteet ja biomarkkereita. Proteasomin estäjät, esimerkiksi, on käytetty hoitamaan hematologisten maligniteettien [1], [2] ja seerumissa proteaasin PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) on käytetty biomarkkerina valvomiseksi eturauhassyövän eri yhteyksissä [3]. Keksintö toimintoperusteisen antureista (ABP) voidaan arvioida, proteaasin toimintaa eläviä soluja tai kokonaan organismien [4]. Huolimatta menestyksestä joidenkin lääkkeiden ja koettimia, kuitenkin, kohdistaminen proteolyyttinen aktiivisuus kehittämiseksi lääkkeen ja biomarkkereiden ei ole aina ollut erittäin tyydyttävä. Niin mukavaa kuin ne ovat, proteaasit jäljittelevät diagnostiikka ja hoitoja on monia luontaisia ​​monimutkaisuutta ja rajoituksia, jotka on otettava huomioon ennen uusien lääkkeiden tai antureista kohdistaminen proteaasien ja proteaasien toimintaa. Nämä rajoitukset kuuluvat activational tilan proteaasien, toiminnallinen lokalisoinnin proteaasien, ja endogeenisten proteaasien estäjät, jotka kaikki vaikuttavat proteaasin aktiivisuutta ja voi puolestaan ​​vaikuttaa tehokkuuteen proteaasi-inhibiittorin ja koettimia.

tyyppi 2 transmembraani- seriiniproteaasi (TTSP) matriptase on erityisen kiinnostava esimerkki haasteista, proteaasi voi esittää suhteen valitsemallaan tavoitteeksi kehittämiseen kliinisiä sovelluksia ja strategioita, jotka saattavat olla tarpeen tehokkaasti työllistää estäjiä ja koettimien matriptase aktiivisuuden . Matriptase ilmentyy laajasti epiteeli- kudosten ja jopa vaaditaan ylläpitoa varten epiteelin eheyden [5] – [7]. Matriptase on yleisesti väärin säädellystä karsinoomissa kautta kohonnut ilmentyminen, lisääntynyt tsymogeeninä aktivointi, ja epätasapainon ekspression matriptase suhteessa hepatosyyttikasvutekijäaktivaattorin inhibiittori (HAI) -1, ensisijainen endogeenisen inhibiittorin matriptase aktiivisuus [8] – [10] . Lisäksi epiteelisolut, matriptase ilmentyy myös monosyyteissä [11] – [13], syöttösolut [14], kondrosyyttien [15] ja hermoesiastesolut [16], ja matriptase on liitetty nivelrikon [15] ja ateroskleroosi [13]. Ilmentymistä matriptase mast-soluissa viittaa siihen, että matriptase on mahdollista edistää allergian liittyvien sairauksien, kuten astman. Useat matriptase katalyyttinen inhibiittoreita on kehitetty, mukaan lukien pieni molekyyli ja peptidi-inhibiittoreita. Nämä matriptase inhibiittorit näytteille suurta tehoa vs. matriptase aktiivisuuden testauksen aikana käyttämällä

in vitro

määrityksissä, että useimmissa tapauksissa, ovat käyttäneet yhdistelmä-matriptase seriiniproteaasidomainissa [17] – [22]. Vasta-aine-inhibiittoreita on suunnattu erityisesti aktiivisia matriptase (toisin kuin tsymogeenimuodossa) on myös kehitetty [23], ja käyttää havaitsemaan hiirissä sitoutumisen kautta aktiiviseen matriptase pinnalla syöpäsolujen [24], [25].

Matriptase syntetisoidaan tsymogeenin ja läpikäy autoaktivaatiota hankkia sen voimakas trypsiinin kaltaista aktiivisuutta. Aktivointi matriptase nopeasti, minkä jälkeen inhibitio syntyvän aktiivisen matriptase että proteiini HAI-1 ja pysyy kiinni soluihin transmembraanidomeenin HAI-1. On epäselvää, kuinka paljon ja kuinka pitkään orastavan vapaan vaikuttavan matriptase jatkuu solun pinnalla: parametrit ovat tärkeitä mitään perustetta kehittämiseksi matriptase toiminnan inhibiittorit ja anturit kliinisiin sovelluksiin. Nykyisessä tutkimuksessa, ryhdyimme arvioida kohtalo aktiivinen matriptase seuraavista induktion matriptase tsymogeeninä aktivoitumista ihmisen karsinooman ja hematologiset syöpäsoluja. Riippumatta siitä, missä määrin matriptase tsymogeeni aktivointi indusoi, ei vapaata, aktiivista matriptase todettiin edelleen on syöpäsoluja. Mielenkiintoista on kuitenkin, pieni osa aktiivista matriptase selviää HAI-1 inhibition by on nopeasti eritettiin solunulkoiseen ympäristöön. Tutkimuksemme osoittaa, että koska ei ole vapaata aktiivista matriptase läsnä syöpäsolujen pinnalla, matriptase katalyyttinen aktiivisuus on epätodennäköistä esittää tehokas kohde kliinisiä sovelluksia.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Gelatiini ja 5,5′-Ditio-bis- (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); N-tert-butoksikarbonyyli (Boc) -Gln-Ala-Arg-7-amido-4- metyylikumariini (AMC) hankittiin Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY); Naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Omega Scientific (Tarzana, CA).

Soluviljelmät

Ihmisen rintasyöpäsoluja MCF7 ja MDA-MB-468 pidettiin muunnetussa Parannettu Minimum Essential Medium (IMEMiin), johon oli lisätty 10% FBS. Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen LNCaP, PC3 ja DU145, ihmisen munasarjan syöpäsolujen OVCAR-3, ihmisen multippelin myelooman solujen RPMI 8226-soluja ja ihmisen Burkittin lymfooma-soluja Ramos viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Ihmisen rinta- syöpäsolujen SK-BR-3, ihmisen keratinosyyttien HaCaT, ja ihmisen munasarjan syöpäsolujen OV-2008 pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Kaikki solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) paitsi HaCaT (CLS Cell Lines GmbH, Eppelheim Saksa) ja OV2008 (ystävällisesti toimittanut Dr. Gaetano Marverti, Modenan yliopisto ja Reggio Emilia, Italia) [26] .

monoklonaalisia vasta-aineita

ihmisen matriptase monoklonaalisia vasta-aineita M24 ja M69 käytettiin immuunianalyyseilla havaita koko matriptase ja aktivoitu matriptase vastaavasti [27] – [29]. MAb M69 immobilisoitu Sefaroosihelmet käytettiin immunodepletion tutkimuksiin.

Tryptic aktiivisuuden määrityksessä seuraavan induktion matriptase tsymogeeni aktivointi

induktio matriptase tsymogeeninä aktivaation karsinoomasoluja, soluja viljeltiin 150 mm ruokia tai 6-kuoppaisilla levyillä. Solut pestiin PBS: llä kolme kertaa, ja sitten inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa 150 mM fosfaattipuskurissa, pH 6,0 (7 ml 150 mm: n annoksia ja 1 ml 6-kuoppaisella levyllä) tai 150 mM fosfaattipuskurissa, pH 8,0, kuten ei -activation ohjaus. Joissakin tapauksissa, PBS: ää käytettiin ei-aktivoinnin ohjaus. Inkuboinnin jälkeen 2 M Trizma base, lisättiin pH: n saattamiseksi arvoon 8,0. Solut kaavittiin maljoilta tai kuoppiin, jotta saadaan yhdistetty suspensio, joka sisältää seoksen soluja ja irtoa proteiineja. Osa tätä seosta sentrifugoitiin 10000 rpm Eppendorf-pöytäsentrifugissa 1 min. Supernatantti kerättiin irtoa osa ja solupelletti suspendoitiin uudelleen 150 mM fosfaattipuskurissa, pH 8,0 saman määrän kuin näyte ennen sentrifugointia, jolloin solun osa. Menettely romuttamisesta solujen levyltä ja käsittely sentrifugoimalla annos ei johda vapauttamiseen matriptase tai HAI-1 soluista. Menettely on suunniteltu tuottamaan solun ja ilmastoitu puskuria identtisissä olosuhteissa, suhteen pH: n ja ionivahvuuden puskurissa proteolyyttisen määrityksessä. Kahden hematologisen syövän solut, jotka kasvavat suspensioviljelmät, suhde solujen määrä suhteessa tilavuuteen fosfaattipuskuria oli 5 x 10

5 solua /200 ui puskuria. Matriptase aktiivisuus 195 ui irtoa ja solufraktioiden arvioitiin mittaamalla 7-amino-4-metyylikumariini (AMC) vapautumista synteettistä substraattia Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 ui 5 mM kantaliuos) in mikrofluorilevyllä 96 syvennyksen mustia mikrotiitterilevyjä (Thermo Scientific). Lohkaisu synteettisen fluorogeenisen substraatin rekisteröitiin käyttäen Wallac 1420 Victor 2 mikrolevynlukijaa eksitaatioaallonpituudella 360 nm ja havaitsemaan emissio 480 nm: ssä.

Immunodepletion

M69 mAb kytkettiin kovalenttisesti Sepharose 4B 5 mg /ml geeliä kuten aiemmin on kuvattu [28]. Varten immunodepletion, näytteet (200 ui) inkuboitiin 15 ul M69-Sepharose pyörivä kylmässä huoneessa 2 tuntia. Supernatantti erotettiin helmet sentrifugoimalla ja kerättiin sitoutumaton fraktio. Helmet pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 1% Triton X100: aa neljä kertaa, minkä jälkeen jää proteiinit eluoitiin helmistä 0,1 M glysiiniä, pH 2,4, mitä seurasi neutralointi 2 M Trizma-emästä.

Western blotting

Solut lyysattiin PBS: ssä, joka sisälsi 1% Triton X-100 ja 1 mM DTNB: tä. DTNB lisättiin lyysipuskuria estää disulfidisidosten katkeamisesta [30]. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä ja yhtä suuret määrät proteiineja tai yhtä suuret osuudet solulysaateista ja ilmastoitu puskureita analysoitiin Western blot. Proteiini näytteet laimennettiin 5 x näytepuskuria, joka sisältää pelkistintä, ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 min. Proteiinit erotettiin 7,5% SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille, ja sitten tutkittiin eri mAb: iden. Sitovat mAb detektoitiin käyttämällä HRP-konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita, ja visualisoitiin käyttämällä Western Lightening® Chemiluminescence Reagent Plus (Perkin-Elmer, Boston, MA).

gelatiinitsymografialla

Gelatiini geelit valettiin lisäämällä gelatiinia (lopullinen konsentraatio 1 mg /ml), 7,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Proteiini näytteitä inkuboitiin SDS-näytepuskurissa huoneen lämpötilassa 5 min ilman pelkistintä. Elektroforeesin jälkeen, gelatiinigeelejä pestiin 2,5% Triton X-100 /PBS: llä kolme kertaa ja inkuboitiin sitten IN100 mM Tris-puskuria, pH 8,0 37 ° C: ssa yön yli. Sitten geelejä värjättiin Coomassie Brilliant Blue.

Tulokset

MCF7-rintasyöpäsolujen aktivoivat konstitutiivisesti matriptase mutta vapaan vaikuttavan matriptase ei pysy liittyy solujen

Jotta alkaa tutkia, matriptase proteolyyttinen aktiivisuus liittyy rintasyövän soluja voitaisiin käyttää kohteena lääkkeiden kehittämisessä ja /tai kuvaamista koettimet, mittasimme pilkkominen substraatin Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, jonka MCF7 rintasyöpä solut ennen ja jälkeen induktion vankka matriptase tsymogeenillä aktivointi (Fig. 1A). Matriptase tsymogeenillä aktivointi tapahtuu ilmeisesti konstitutiivisesti MCF7-soluissa, koska 120-kDa matriptase-HAI-1-kompleksi helposti havaittavissa lisäksi 70-kDa matriptase tsymogeeninä solulysaateista ennen induktiota matriptase tsymogeeni aktivointi (Fig. 1A kaista 1) . Induktion jälkeen matriptase tsymogeeni aktivointi altistamalla solut pH 6: ssa 20 minuuttia [27], [31], [32], paljon 70k Da matriptase tsymogeeni muutettiin 120-kDa matriptase-HAI- 1 kompleksi (Fig. 1A kaista 4). Me seuraavaksi mitattiin määrä tryptinen toiminnalle MCF7 alle konstitutiivisia tai hapon aiheuttama olosuhteissa, jotka saadaan kaksi eri matriptase aktivointia. Koska on mahdollista, että HAI-1 voi sitoutua ja inhiboida aktiivisen matriptase, kun molemmat proteiinit oli vapautunut solukalvon, mittasimme tryptisen aktiivisuus liittyy solujen pinnalla ilman ei-ionisen detergentin Triton X-100 . Näissä olosuhteissa ei ollut juuri lainkaan katkaisua fluoresoivan substraattien MCF7-solut, onko matriptase aktivointi oli konstitutiivisia tai voimakkaasti aiheuttama happo altistus (Fig. 1 B, käyrä 1 ja 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että nämä rintasyöpä solut eivät säilytä vapaa, aktiivinen matriptase riippumatta tasojen matriptase tsymogeeni aktivoinnin.

a.

Ihmisen maitorauhasen MCF7-syöpäsoluja inkuboitiin pH 6 aiheuttavan matriptase tsymogeenillä aktivointi (

a.

oikeassa, Act.) kanssa tai pH 6 täydennetty 150 mM NaCl ei-aktivoinnin ohjaus (

a.

vasemmalle, non-act .). Solulysaatit valmistettiin ja näytteitä säilytettiin analyysiä (kaistat 1 ja 4). Jäljellä olevat solulysaatit altistettiin immunodepletion aktiivisen matriptase-spesifinen mAb M69 immobilisoitu Sepharose helmiä heikentävistä aktivoitu matriptase, pääasiassa 120 kDa: n kompleksi (kaistat 2 ja 5, ja D). Vasta-aine sidottu aktivoidun matriptase otettiin talteen pH 2,4 puskuria, eluointi seuraa pH neutralointi (kaista 3, E). Nämä näytteet analysoitiin sitten matriptase lajien SDS-PAGE (ilman keittämällä näytteitä tai käyttämällä pelkistäviä aineita) ja Western blot käyttäen yhteensä matriptase mAb M24.

B.

Solujen immunodepleted lysaatit, ja eluaatit analysoitiin trypsiinisoija aktiivisuus pilkkomalla synteettistä fluorogeenisen substraatin kanssa Arg P1 päällä. Sillä tryptisen määritystä, solut pysyivät koskemattomina ilman Triton X-100. NA tarkoittaa ei-aktivointia; L lastaus immunodepletion, D immunodepleted fraktio; E eluutiofraktiosta; A aktivointia; RFU suhteellista loisteputki yksikköä.

Puute vapaa, aktiivinen matriptase liittyy solujen johtuu nopeasta esto aktiivinen matriptase by HAI-1. Aiemmin olemme tuottaneet matriptase monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa spesifisesti ja sitoutuu aktivoitua muotoa matriptase (onko se on monimutkainen HAI-1), ilman rajat reagoimaan matriptase tsymogeenillä [33], [34]. Käytimme tätä mAb, M69, joka on kytketty helmiä, poistaa aktivoitu matriptase, joka oli läsnä solulysaateista immunodepletion. Kuten odotettua, 120 kDa: n matriptase-HAI-1-kompleksi poistetaan tehokkaasti MCF7 solulysaateista tässä prosessissa (Fig. 1A, vertaamalla kaistat 2 ja 5 kaistat 1 ja 4, vastaavasti). 70 kDa: n matriptase proteiinin kaistalla läsnä molemmissa näytteissä ei köyhdytettyä aktivoidun matriptase mAb, joka osoittaa, että 70 kDa: n matriptase proteiinin kaistalla sekä valmisteet, sisältää vähän tai ei lainkaan aktiivista matriptase ja on matriptase tsymogeeni. Kuten odotettua, immunodepleted näytteitä ei ollut pilkkominen aktiivisuutta fluoresoivan substraatin (Fig. 1 B). Aktivoitu matriptase lajien sitoutunut M69 mAb-Sepharose-helmiä käytetään immunodeplete näytteet eluoitiin käyttäen pH 2,4 glysiini-puskuria. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä hapan puskuri aiheuttaa dissosiaatiota matriptase-HAI-1 kompleksin [33]. Neutralointi johtaa tyypillisesti uudelleen yhdistys joidenkin HAI-1 ja aktiivinen matriptase jättäen loput erottaa aktiivisen matriptase että kompleksoimattoman muodossa neutraloinnin jälkeen eluaatti, sillä seurauksella, että aktiivinen matriptase havaittiin Western blot -analyysillä käyttäen yhteensä matriptase mAb pääasiassa kuin 70-kDa. Intensiteetti 70 kDa aktiivinen matriptase bändi oli verrannollinen intensiteetti 120 kDa matriptase-HAI-1 kompleksin bändi havaittiin molemmissa tilanteissa (Fig. 1A, kaistat 3 ja 6). Tämä erottaa aktiivinen matriptase esillä tryptistä aktiivisuutta arvioitiin pilkkomalla fluorogeenisen substraatin (Fig. 1 B, käyrä 3 ja 6). Substraatti pilkkomisnopeuksien todetusta korreloivat hyvin tasojen kanssa aktiivisen matriptase havaittiin Western blot -analyysillä. Nämä analyysit vahvistavat, että 120 kDa: n soluun liittyvän matriptase laji on inaktivoitu aktiivinen matriptase monimutkainen ja että eluoitiin 70-kDa: n on todellakin aktiivinen matriptase.

Osa aktiivisen matriptase oli irtoa solunulkoiseen ympäristöön

huolimatta nopeasti HAI-1-estoa aktiivisen matriptase liittyy soluun, vapaan vaikuttavan matriptase on itse asiassa eritettiin solunulkoiseen ympäristöön ennen HAI-1 inhibition (Fig. 2). Kun MCF7 rintasyövän solut lyhytaikaisesti alttiiksi pH 6,0, jota seuraa neutralointi pH-arvoon 8,0, vahva tryptistä aktiivisuutta fluoresoiva substraatti havaitaan, että solut ja ilmastoitu puskureita (irtoa osa) (Fig. 2A). Kun solut ja irtoa jakeet erotettiin, trypsiinikartta aktiivisuus havaittiin vain irtoa fraktiot (supernatantti) ja ei liity soluun pellettejä. Nämä tiedot osoittavat, että yhdessä induktion matriptase tsymogeeni aktivointi, joitakin aktiivisia proteaasit tryptistä aktiivisuutta leviä solunulkoiseen ympäristöön. Sen kysymyksen siitä, onko tämä irtoa proteolyyttinen aktiivisuus on peräisin aktiivinen matriptase määritimme jos M69-helmiä voisi immunodeplete aktiivisuus näytteistä (Fig. 2B ja C). Immunodepletion materiaalin irtoa ohjaus- käsiteltyjä soluja ei aiheuttanut merkittävää muutosta intensiteetti 70 kDa matriptase kaistan (Fig. 2B, kaistat 1 ja 2) eikä matriptase havaittu materiaali eluoitiin helmistä (kuvio . 2B, kaista 3), sopusoinnussa puuttuminen tai vähäisyys irtoa vapaa, aktiivinen matriptase näissä olosuhteissa. Sen sijaan sen jälkeen, kun hapon aiheuttama matriptase aktivointi, ehtyminen kanssa M69-helmiä vähensi merkittävästi veren kokonaiskolesterolia matriptase läsnä irtoa osa (Fig. 2B, vertaa kaista 5 kaista 4), ja vahva 70-kDa matriptase kaista on eluaatissa helmistä (Fig. 2B, kaista 6). Tämä on sopusoinnussa oleva vapaa, aktiivinen matriptase ilmastoituna puskuriin soluista, joissa matriptase aktivointi oli indusoitu happoa altistumista. Kun analysoitiin tryptiselle aktiivisuus käyttämällä fluorogeenistä substraattimäärityksen huomasimme, että proteolyyttinen aktiivisuus väheni dramaattisesti jälkeen immunodepletion (kuvio 2C, vertaa käyrät A-L ja A-D), joka vahvistaa, että suurin osa trypsiinikartta aktiivisuuden läsnä irtoa jae oli johtuvat vapaa, aktiivinen matriptase. Läsnäolo aktiivinen matriptase irtoa jae varmistettiin edelleen havaitsemisen 70 kDa Gelatinolyyttinen aktiivisuus irtoa jae (Fig. 2D, kaista 1) ja ehtyminen 70 kDa gelatinaasi jota aktivoidaan matriptase mAb helmiä (kuvio . 2D, kaista 2). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka MCF7-rintasyöpäsolujen aktivoivat konstitutiivisesti matriptase normaaleissa olosuhteissa, suurin osa aktiivisen matriptase nopeasti inhiboituu HAI-1, vaikka pieni osa aktiivista entsyymiä voidaan nopeasti eritettiin solunulkoiseen ympäristöön. Vuodattamisesta aktiivisen matriptase solunulkoiseen miljöön tällä tavalla on yhdenmukainen havaitseminen aktiivisen matriptase ilmastoituna media rintasyövän solujen meidän tutkimuksen ennenaikaisen [35].

.

MCF7-solut indusoitiin aktivoida matriptase jonka pH 6,0, jota seuraa neutralointi pH-arvoon 8,0. Seos solujen ja puskuri (Yhdistä), pelletoidut solut sentrifugoinnin jälkeen (Cell), ja puskuri supernatantti (irtoa osa) yksinään (Shed) analysoitiin trypsiinisoija aktiivisuuden pilkkomalla synteettistä fluoresoivan substraatin Arg P1 site . RFU tarkoittaa suhteellisen loisteputki yksikkö. B. irtoa jakeet kerättiin MCF7-soluissa induktio matriptase aktivointi (Act.) Ja ei-aktivoinnin ohjaus (Non-laki.) Alistettiin immunodepletion aktivoidulla matriptase mAb M69 helmiä. Irtoa jakeet (L, kaistat 1 ja 4), köyhdytetyn jakeet (D, kaistat 2 ja 5) ja eluoidut fraktiot (E, kaista 3 ja 6) analysoitiin matriptase lajien Western blot käyttämällä mAb M24.

C.

Ja

D.

Irtoa jae kerättiin pH 6-alttiina MCF7-soluissa immunodepleted käyttäen M69 helmiä. Irtoa jae (L, kaista 1) ja immunodepleted jae (D, kaista 2) analysoitiin trypsiinikartta aktiivisuuden (paneeli

C

) ja Gelatinolyyttinen aktiivisuus gelatiinitsymografialla (paneeli

D

Gel. ZYM.). RFU tarkoittaa suhteellisen loisteputki yksikköä; A-L aktivoiduille-lastaus; A-D aktivoitu-köyhdytettyä.

Sen määrittämiseksi, ovatko muut matriptase ilmentäviä rintasyöpäsolujen säätelevät myös matriptase samalla tavalla MCF7-soluissa, olemme analysoineet näytteitä generoidaan käyttämällä MDA-MB-468 ja SK -BR-3-rintasyöpäsolujen tavanomaisissa kasvuolosuhteissa ja kun se altistetaan hapon aiheuttama matriptase tsymogeeni aktivointi. Matriptase lajit ja proteolyyttisen aktiivisuuden arvioitiin ennen yhdistelmän avulla fluoresoivaa substraattia katkaisun määrityksessä, immunodepletion ja immunoblot analyysit (Fig. 3). Samanlainen MCF7-soluissa, MDA-MB-468-soluja aktivoivat konstitutiivisesti matriptase (Fig. 3A kaista 1), ja ne voidaan indusoida voimakkaasti aktivoida matriptase seuraa nopea HAI-1-inhibitiota vasteena solujen altistuminen lievästi happamissa puskuriin (kuvio . 3A kaista 2). 120 kDa: n matriptase-HAI-1 kompleksin spesifisesti immunodepleted käyttäen aktivoitua matriptase mAb helmiä (Fig. 3A kaista 3) ja suurin osa happo-dissosioituu vapaiksi aktiivisiksi matriptase eluoitiin ja pysyi kompleksoitumattoman neutraloinnin jälkeen (Fig. 3 kaista 4 ). Tryptic aktiivisuutta havaittiin vain irtoa fraktiot eikä solufraktioista (Fig. 3B), joista suurin osa oli immunodepleted aktivoidun matriptase mAb M69 (Fig. 3C), läsnäolon vahvistamiseksi aktiivisen matriptase on solunulkoiseen ympäristöön. Kolmannen rintasyöpäsoluissa, SK-BR3 muistuttaa MCF7 ja MDA-MB-468 suhteen hapon aiheuttama matriptase aktivointi (Fig. 3d, kaista 1), immunodepletion, ja eluointi kompleksoimattoman aktivoitu matriptase aktivoidusta matriptase mAb-helmiä ( kuva 3D, kaistat 2 ja 3). Jälleen tryptinen aktiivisuus syntyy yhdessä induktion matriptase tsymogeeni aktivointi vuodatettiin ei sisällytetty solujen kanssa (Fig. 3 E), ja suurin osa irtoa tryptinen aktiivisuus peräisin aktiivisen matriptase (Fig. 3 F).

ja

D

: MDA-MB-468 ja SK-BR-3 ihmisen rintasyövän solut indusoitiin aktivoida matriptase (tai ei) pH 6 (tai kontrolli) puskuri-altistuksen. Solulysaatteja valmistettiin soluista tehtiin immunodepletion poistaa aktivoitu matriptase. Lysaatit ei-aktivoinnin ohjaus solut (N), happo-aktivoitujen solujen (A), M69 köyhdytettyä lysaatit (D), ja eluoitu fraktio (E) analysoitiin yhteensä matriptase lajien immunoblot käyttämällä matriptase mAb M24.

B

ja

E

. MDA-MB-468 (

B

) ja SK-BR-3 (

E

) käsiteltiin pH 6,0 indusoida matriptase aktivointia. Neutraloinnin jälkeen seos solujen ja puskuri (Yhdistä), Pelletoidut solut sentrifugoinnin jälkeen (Cell), ja puskuri supernatantti (irtoa osa) yksinään (Shed) analysoitiin tryptisten toimintaa.

C

ja

F

. MDA-MB-468 ja SK-BR-3-solulysaateista, joka on valmistettu post induktio matriptase aktivaatiota immunodepleted käyttäen mAb M69. Solulysaatit (A-L) ja immunodepleted fraktiot (A-D) analysoitiin tryptisten toimintaa.

asetukseen matriptase eturauhasen ja munasarjasyövän solujen

Matriptase on myös ilmaistuna eturauhassyöpä, ja kolme yleisimmin käytetty eturauhassyövän linjat, DU145, PC3 ja LNCaP kaikki näihin matriptase vaikka DU145 ilmaisee paljon vähemmän kuin muut kaksi riviä (Fig. 4A, vasemmalla, kaistat 1, 3 ja 5). Kaikki kolme riviä aktivoida matriptase vasteena solunulkoisten happoa altistuminen osoittaa läsnäolo 120 kDa matriptase-HAI-1 kompleksin (Fig. 4A, vasemmalla, kaistat 2, 4, ja 6), joka on myös havaittu, kun näytteet ovat immunoblotattiin käyttämällä aktivoitua matriptase-spesifinen mAb M69 (Fig. 4A, oikealla, kaistat 2, 4 ja 6). Acid altistuminen solut myös indusoi vuodattamalla tryptisten toiminnan osaksi solunulkoiseen ympäristöön mukaan PC3 ja LNCaP mutta ei DU145 solut (Fig. 4 B-D). Kuten rintasyövän solulinjat, suurin osa irtoa tryptinen aktiivisuutta irtoa, PC3 ja LNCaP-solut, vahvistettiin liittyvän aktiivisen matriptase jonka immunodepletion, kuten edellä on kuvattu (tuloksia ei ole esitetty). Puute havaittavissa tryptinen aktiivisuuden irtoa jonka DU145 solut näyttää johtuen alhaisesta tasosta matriptase ilmentymisen tässä solulinjassa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että eturauhassyövän solut muistuttavat rintasyövän soluja koskien nopeaa HAI-1-estoa solun aktiivisen matriptase ja vuodattaa joitakin määriä vapaata aktiivista matriptase osaksi solunulkoiseen ympäristöön.

. Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, DU145 (DU), PC3 (PC3) ja LNCaP (LN) altistettiin pH 6,0 (tai valvontaa) puskuri aiheuttaa matriptase aktivointia. Solulysaatteja pH 6-altistetuissa soluissa (A, kaistat 2, 4 ja 6) ja ei-aktivoinnin ohjaus soluja (N, kaistat 1, 3, ja 5) analysoitiin yhteensä matriptase lajien (vasemmalla) käyttäen mAb M24 ja aktivoidaan matriptase käyttäen mAb M69 (oikealla).

B

,

C

, ja

D

. Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, DU145 (

B

), PC3 (

C

), ja LNCaP (

D

) käsiteltiin pH 6,0 indusoida matriptase aktivointia. Neutraloinnin jälkeen yhdistelmä solun ja irtoa jakeet (yhdistä), solut jakeet yksinään (solu), ja irtoa jae yksin (irtoa) analysoitiin tryptisiin toimintaan. RFU tarkoittaa suhteellisen loisteputki yksikköä.

Kaksi munasarjasyövän solulinjoissa, jotka ilmentävät matriptase, OCAR3 ja OV2008, tutkittiin myös ja paljasti samat ominaisuudet suhteessa matriptase aktivaation aiheuttama altistuminen pH 6,0 kanssa nopea muodostuminen aktivoitua matriptase-HAI-1-kompleksit, jotka nestevajaus mAb M69 (Kuva. 5A). Kumpikaan solulinjaa säilytetään soluun liittyvä tryptinen toimintaa vaan irtoa toiminta puskuriin, joka varmistettiin olevan peräisin aktiivinen matriptase mukaan immunodepletion käyttämällä mAb M69 (Fig. 5 B ja C). Irtoa matriptase näytteillä Gelatinolyyttinen toimintaa, mikä taas oli nestevajaus mAb M69 (Fig. 5D).

. Ihmisen munasarjasyöpäsoluja OVCAR3 indusoitiin aktivoida matriptase pH 6,0 (tai kontrolli) puskuria. Solulysaatit immunodepleted kanssa mAb M69. Solulysaatteja ei-aktivoinnin ohjaus soluja (N, kaista 1), pH 6 aktivoitujen solujen (A, kaista 2), ja immunodepleted osa (D, kaista 3) analysoitiin matriptase lajien Western blot käyttäen M24 mAb .

B

. ja C. Solut jakeet (solu), irtoa jakeet (irtoa) ja aktivoitu matriptase-köyhdytettyä irtoa jakeet (heikentävistä) of OVCAR3 (

B

.) soluja ja OV2008 solut (

C

.) analysoitiin tryptisiin toimintaan. RFU tarkoittaa suhteellisen loisteputki yksikköä.

D.

OV2008 ihmisen munasarjasyövän solut indusoitiin aktivoida matriptase, jonka pH 6,0. Irtoa osa (kaista 1) ja aktivoitu matriptase-köyhdytettyä irtoa osa (kaista 2) analysoitiin matriptase Gelatinolyyttinen aktiivisuuden gelatiinitsymografialla.

Suurin osa aktivoitua matriptase vuodattaa hematologiseen syöpäsoluja on irtoa vapaana aktiivisena matriptase

matriptase ilmenee myös hematologisen syöpäsoluja, mutta jyrkässä ristiriidassa solujen epiteelin alkuperä, ne esitä tai erittäin alhainen HAI-1 [36], [37]. Tutkia matriptase aktivointi ja irtoaminen dynamiikan syövät tämän tyyppinen me ohimenevästi alttiiksi RPMI 8226 ihmisen multippelin myelooman solujen ja Ramos Burkittin lymfooma solujen pH 6,0 ja sen jälkeen pH oli säädetty arvoon 8 Tris-puskurilla kuten oli tehnyt epiteelin syövät. Korkea tryptisten aktiivisuuden havaittiin, että solut ja puskuri (irtoa osa) (Fig. 6A), ja kun solut ja irtoa fraktiot erotettiin sentrifugoimalla, trypsiinikartta aktiivisuutta havaittiin vain irtoa osa, ja ei liittynyt soluihin. Lisäksi tryptinen aktiivisuus oli täysin poistaa, kun irtoa fraktiot köyhdytettyä käyttäen aktivoitua matriptase mAb helmiä, joka vahvistaa, että aktiivinen matriptase on lähde tryptisten havaitaan toimintaa.

ja

B.

Ramos ihmisen Burkittin lymfooman soluissa (

) ja RPMI 8226 ihmisen multippelin myelooman solujen (

B

) käsiteltiin pH 6,0 indusoida matriptase aktivointia. Neutraloinnin jälkeen yhdistelmä solun ja irtoa jae (yhdistä), solun osa yksinään (solu), ja irtoa jae yksin (irtoa) analysoitiin tryptisiin toimintaan.

C

ja

D

.