Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kaksi molekyylejä, jotka ovat houkuttelevia täsmähoitoihin ovat kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori gamma (PPARy). Tutkimme mahdollinen ylikuuluminen näiden 2 reittejä, varsinkin äskettäisen todisteita siitä PPARy varten syövän hoitoon.

Keskeiset havainnot

Koska arvioitu MTT määrityksiä gefitinibi (EGFR estäjä) ja himmenevissä C (PPARy-agonisti) inhiboi kasvua 9 virtsarakon syövän solulinjat annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta vaihteleva herkkyys. Lisäksi yhdistelmä gefitinibin ja DIM-C osoittivat maksimaalinen esto solujen lisääntymisen verrattuna kunkin lääkkeen yksin. Nämä havainnot vahvistettiin

in vivo

, jossa yhdistelmähoito maksimaalisesti esti kasvaimen kasvua verrattuna kuhunkin hoito yksinään verrattuna kontrolliin (p 0,04). Induktio PPARy ilmaisun kanssa tumakertymään havaittiin vasteena kasvavien pitoisuuksien gefitinibin aktivoimalla transkriptiotekijän CCAT /tehostaja-sitova proteiini-β (CEBP-β). Näissä solulinjoissa, DIM-C merkitsevästi herkistyneet virtsarakon syöpä solulinjoja, jotka olivat resistenttejä EGFR esto on aikataulu-spesifisellä tavalla.

Johtopäätös

Nämä tulokset viittaavat siihen, että PPARy-agonisti DIM-C voivat on erinomainen vaihtoehto rakkokasvaimista vastustuskykyisiä EGFR esto ja yhdistelmän tehokkuus saattaisi saavuttaa aikataulussa sifisistä.

Citation: Mansure JJ, Nassim R, Chevalier S, Szymanski K, Rocha J, Aldousari S, et ai. (2013) uudella mekanismilla PPAR Gamma induktio kautta EGFR Signalling Muodostaa Rational varten Yhdistelmähoito sisään virtsarakon syövän. PLoS ONE 8 (2): e55997. doi: 10,1371 /journal.pone.0055997

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 syyskuu 2012; Hyväksytty: 03 tammikuu 2013; Julkaistu: 08 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Mansure et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Cancer Research Society. (https://www.src-crs.ca/en-CA) W. Kassouf on vastaanottaja kliinisen tutkimuksen tutkija palkinnon FRSQ. (https://www.frsq.gouv.qc.ca/en/index.shtml). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lähes kaikki Metastasoivassa virtsarakon syöpä periksi tauti, jossa mediaanielossaolosta 18 kuukauden vaikka paras käytettävissä solunsalpaajahoitojen. Koska ymmärrystä biologian urothelial karsinooma (UC) paranee, uusia lähestymistapoja on tutkittava. Kaksi signalointi molekyylejä, jotka ovat houkuttelevia täsmähoitoihin ovat epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (PPARy). EGFR-toiminto on erittäin houkutteleva keskuudessa laaja valikoima biologisia tavoitteiden osallisena urothelial karsinooma (UC) eteneminen. Vaikka mekanismia, jolla EGFR säätelee tuumoribiologiassa virtsarakon syöpä ei ole selkeästi määritelty, on osoitettu, että EGFR signalointi säätelee solujen selviytymistä, proliferaatiota, erilaistumista, ja hyökkäys [1]. Lisäksi EGFR on liitetty kasvaimen angiogeneesin ja metastaasin [2]. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa EGFR: n estäjien pään ja kaulan, keuhko-, ja paksusuolen syövän osoitti, että vain pienellä osalla potilaista tuntui hyötyä tästä lähestymistavasta. Kontekstissa kuin Small Cancer Lung Cells (NSCLC), osoitettiin, että kliiniset vasteet liittyivät aktivoivia mutaatioita EGFR-tyrosiinikinaasi-domeenin, mikä viittaa siihen, että ymmärrettäisiin paremmin biologisten vaikutusten EGFR: n estäjien syövän auttaa tunnistamaan kasvaimia, jotka reagoivat terapiaan [3], [4]. Vaikka yksikään 17 ihmisen UC solulinjoissa eikä yksikään 75 primaarikasvainten arvioitiin M. D. Anderson Cancer Center sisälsi aktivoimalla EGFR kinaasialue mutaatiot [5], EGFR: n estäjien estetty solusyklin etenemisen 6/17 UC solulinjoissa. Olemme osoittaneet, että suuri EGFR liittyy aggressiivinen fenotyyppi [6], ja että modulointi GSK-3β voi olla ennustaja vastaus EGFR: n estäjien virtsarakon syöpä [7]. Me uskomme, että EGFR edelleen vahva signalointi akseli etenemisessä virtsarakon syövän jossa sen esto voi hyötyä valikoiduilla potilailla.

Toinen reseptorin kiinnostava on PPARy, ligandi aktivoituvan reseptorin ja jäsen tumareseptorisuperperheen of transkriptiotekijöiden [8], [9]. Tärkeää on, PPARy on tärkeä rooli syövän synnyssä. PPARy ilmentyy erittäin Tuumorinäytteissä eri paikoissa, kuten virtsarakon syöpä (tarkistetaan viite [10]). PPARy on mielenkiintoinen kohde syöpähoidon ei pelkästään sen kohonnut ilmentyminen kasvaimissa, mutta myös siksi, PPARy aktivointi johtaa vähentynyt soluproliferaatioon, vähentynyt G

0 /G

1 S-vaiheeseen etenemisen, lisääntynyt terminaali eriyttäminen, ja apoptoosin [11], [12], [13]. Edelleen, PPARy-agonistit ovat voimakkaita angiogeneesin estäjiä

in vitro

ja

in vivo

, mikä johtuu osittain downregulation VEGF [14], [15]. Äskettäin uuden luokan PPARy-agonistit, 1,1-bis (3′-indolyyli) -1 – (

p

-substitutedphenyl) metaanit (PPARy-aktiivinen DIM-Cs), on kehitetty ja osoitettu huomattavasti tehokkaampi kuin edellisen sukupolven huumeita. Me julkaisi ensimmäisen raportin merkittävää antitumorigenic aktiivisuutta PPARy-aktiivisten DIM-Cs UC soluissa

in vitro

ja

in vivo

[16]. Voimakkaiden PPARy-aktiivinen DIM-Cs oli houkutteleva ja optio lisäarviointia hoidossa UC.

Tekniikan tutkimus on osoittanut, että PPARy-agonistit lisäävät gefitinibin n antituumorivaikutus, mahdollisesti välittyvät induktion PTEN ilmaisun

vuonna vitro

[17]. Lisäksi Kurkumiini oli osoitettu aiheuttavan PPARy ilmaisun ja inhiboivat maksan tähtisolut [18]. Toiset ovat osoittaneet, että curcumin voivat myös estää EGFR aktivoitumista ja näiden havaintojen lisäksi tukevat mahdollisia ylikuuluminen kahden signalointi akselia kohteisiin.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää ylikuulumisen näiden kahden signalointi akseleita niillä jotkut yhteinen alavirran signalointia efektoreja ja arvioida yhdistelmä PPAR-agonistin ja EGFR-inhibiittoria voidaan vastustusta EGFR hoidon virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

UC solulinja 253J BV syntyvät 253J ihmisen UC-solulinja, kuten aikaisemmin on kuvattu [19], ja sen toimitti ystävällisesti tri Colin PN Dinney alkaen M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas. UM-UC-sarjan urothelial sinoomasolulinjoja tässä tutkimuksessa käytetyt olivat perimältään ominaista ja antamat malli ydin Urogenitaalinen Erikoistunut ohjelmat tutkimuksen huippuyksikkö virtsarakon syöpään MD Anderson Cancer Center [20].

Drugs

Gefitinibi (IRESSA ZD1839) toimitti AstraZeneca, Lontoo, Iso-Britannia) ja suun kautta käytettävissä PPARy-aktiivinen DIM-C jalomielinen lahjoitus tohtori S. Turvallinen, Houston, TX kuivana jauheena.

proliferaatiomääritystä

Virtsarakon syöpä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla gefitinibin (0,001 uM 100 uM) ja DIM-C (0,01 uM 10 uM) in EMEM: n, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 48 hs Soluproliferaatio arvioitiin käyttämällä MTT-määrityksiä (Sigma-Aldrich, Kanada). GI50 arvo määriteltiin keskiarvo lääkeaineen pitoisuus, joka syntyy 50% kasvun inhibitio.

Western blot -analyysi

Solut kerättiin ~75%: sta 80% konfluenssiin lyysipuskuria (RIPA ) ja cocktail fosfataasi ja proteaasinestäjien (Roche Diagnostics, Saksa). Proteiinit alistettiin SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA) puolikuivan elektroblottauksen. Ensisijainen monoklonaalisia vasta-aineita [EGF-reseptori (15F8), tubuliinia ja b-aktiini (Cell Signaling Technology, New England, MA)] ja PPARy (sc-7273, Santa Cruz Biotechnology, Kalifornia, US) on sovellettu tunnistamaan bändejä kohteisiin. Lisäksi seuraava kanin vasta-solujen signalointi käytettiin: Akt; fosfo-Akt (Ser473); GSK-3β; fosfo-GSK-3β (Ser9); p21 Waf1 /CIP1; p44-42 MAPK (Erk1 /2); fosfori-P44 /42 MAPK (Erk1 /2). Anti-kani-anti-hiiri-immunoglobuliinit (lgG: t), joka on kytketty HRP /piparjuuri käytettiin sekundääriset vasta-aineet mukaan primaarisen vasta-aineen.

Immunofluoresenssi

Soluja viljeltiin kahdeksan hyvin muovi kammiot pestiin jäällä kylmällä PBS: llä, joka sisälsi proteaasin estäjiä (Roche Diagnostics, Saksa) ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa gefitinibin (0, 2, 4 ja 8 uM) 24 hs, ja sitten inkuboitiin hiiren monoklonaalisella PPARy primääristä vasta-ainetta (1:50) yön yli. Immunofluoresenssi paljastettiin käyttäen anti-hiiri-vasta-aineet on kytketty FITC: tä (Alexa Fluor 488) tai rodamiini (CY3; Invitrogen). 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) käytettiin värjäämään ytimet. Mikrovalokuvista otettiin käänteismerkkisinä Olympus IX-81 mikroskooppi varustettu CoolSnap HQ digitaalikamera ja ImagePro + (versio 5.0.1, Media Cybernetics).

RNA: n eristäminen ja Real Time PCR

kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), protokollan mukaisesti, jonka valmistaja. CDNA: n synteesi suoritettiin käyttäen Quantitec Reverse Transcription Kit (Qiagen, Mississauga, ON). RT-PCR-monistaminen, validoitu alukkeita Qiagen (Hs_CEBPB_2_SG QuantiTect Primer Assay QT00998494) käytettiin. Ei genomista DNA saastumisen tai pseudogeenien havaittiin PCR ilman käänteistranskriptio askel kokonais-RNA käytetty. β aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Reaktiot aloitettiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 s, 60 ° C: ssa 20 s. Sulamispiikit PCR-tuotteiden määritettiin lämpöä denaturaatio yli 35 ° C: n lämpötilaero on 0,2 ° C /s 60-95 ° C: ssa. Sykli numerot ylittäminen mielivaltainen kynnysarvo (

C

t) määritettiin käyttäen MyIQ laiteohjelmiston, versio 1.0.410 (BioRad, CA, USA). Kertainen muutos kohde-mRNA suhteessa p aktiini laskettiin seuraavat: fold muutos = 2

-ΔΔ

C

t jossa ΔΔ

C

t = (

C

t

tavoite –

C

t β aktiini)

aika

X

– (

C

t

tavoite –

C

t β aktiini)

aika 0 aika

X

on aika pisteen jälkeen 3 hs gefitinibi. Aika 0 edustaa kokeen alkamisaika (ei lääkettä lisätty).

Virtsarakon tuumoriksenografteja

Nainen karvattomia hiiriä (hankittiin Charles Rivers, Wilmington, MA) injektoitiin subkutaanisesti KU-7-soluissa (10

6 solua injektiota kohti). Eläimet kunkin sarjan (10 hiirtä ryhmää kohden) satunnaistettiin ja koe- ja lumelääkeryhmässä. DIM-C annettiin 60 mg /kg 3 kertaa viikossa ja gefitinibin annettiin 2 mg /vrk, 5 kertaa viikossa. Kaikki lääkkeet ja plasebo annettiin suun kautta letkulla. Hoitoa jatkettiin 4 viikon ajan ja sen jälkeen kasvaimet kerättiin ja painotettu. Kasvaimet olivat pakastettu nopeasti nestetyppeen myöhempää analyysia.

Tämä tutkimus suoritettiin seuraavan vakiotoimintamenettelyt hoito ja käyttö Laboratory Animals että McGill University Animal Care komitea. Protokolla hyväksyttiin Facility Animal Care komitean Research McGill University Health Center (Luvan numero: 5428). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

immunohistokemia

Serial osiin tuumoriksenografteja hiiristä hoidettiin lumelääkkeellä ja yhdistelmähoitona (gefitinibi plus DIM-C ) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jossa on primäärinen vasta-aineita PPARy (sc-7273 hiiren monoklonaalinen IgG

1-vasta-aine 1:1000 laimennus, Santa Cruz, CA, USA), p21 (12D1 kani-vasta-aine 1:100 laimennus, solusignalointia, MA, USA). Vuohen polyklonaalinen anti-kani-lgG-sekundäärinen vasta-aine, joka oli konjugoitu HRP lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Värin kehittyminen suoritettiin DAB substraatti (Sigma Aldrich, Kanada), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Immunovärjäys arvioitiin semikvantitatiivinen perustuva menetelmä keskimäärin viisi pesäkkeitä on elinkelpoisten solujen prosentuaalinen positiivisia ilme. Näytteet sijoitettiin perustuu intensiteetti vasta-ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä kunkin dian. Verrattiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä.

Microarray Analysis

virtsarakon kasvaimia ksenografteja, oli sektoreihin värjättiin hematoxilin ja eosiinilla ja tuumorit kartoitettiin edelleen erillään. Kokonais-RNA uutettiin kuten aiemmin on kuvattu. RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop-ND1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) ja laatua seurattiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Genome Quebec Innovation Center, CA). Microarray analyysit suoritettiin McGill University ja Genome Quebec Innovation Center, käyttäen Illumina BeadArray ™ teknologiaa. HumanHT-12 Expression BeadChip ™ käytettiin ja se sisälsi yli 22000 koettimien NCBI RefSeq tietokanta, joka tarjoaa suuremman suorituskyvyn käsittelyä 12 näytettä per siru. On kattavuus 99,99% kaikista helmi tyyppejä tahansa HumanHT-12. TotalPrep RNA -monistustarvikesarjaa Ambion käytettiin suorittamaan yhden kierroksen vahvistus 50-500 ng kokonais-RNA. CDNA synteesi ja

in vitro

transkriptio vahvistusta seurasi hybridisaatio. BeadChips oli kuvattu käyttäen Illumina n BeadArray tai Iscan lukija. Tilastollinen analyysi ja visualisointi tietojen microarray kokeiluja suoritettiin käyttäen ohjelmistopakettia FlexArray versio 1.6 kehittämä ja tarjoama Genome Quebec. Toiminnalliset ja signalointireitin analyysit arvioitiin käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot analysoitiin käyttämällä STATA versio 10.0 ohjelmisto. Tulokset

in vivo

verrattiin käyttäen toistettiin toimenpidettä ANOVA ja Fischerin tarkka testi. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

perustason ilmentyminen PPARy ja EGFR on paneeli urothelial sinoomasolulinjoja

Olemme aiemmin raportoitu, että esto EGFR signalointi akseli ja aktivointi PPARy akselin ovat molemmat tehokkaita merkittävästi proliferaation ihmisen karsinoomasolut läpi eri reittejä, osittain lähestyy PI3K /Akt, sykliini D1, ja sykliiniriippuvainen estäjät [7], [16]. Aiemmissa työssä olemme osoittaneet merkittävää ilmentymistä perheenjäsentensä politiikan eri UC solulinjat [7]. Tutkimiseksi edelleen vuorovaikutuksen kahden signalointi akselia, ensin seulotaan luonnehtimaan tasoa EGFR ja PPARy ilmaisun poikki paneelia 9 UC solulinjoissa. Kuten kävi ilmi, kuviossa 1 A, kaikki solulinjat testattiin ilmaistaan ​​eri tasoilla EGFR ja PPARy. Emme osoittaa korrelaatiota lähtötasolle ilmaisun ja taudin vaiheeseen, joista 9 solulinjat on johdettu (pinnallinen invasiivisia metastaattinen). Olemme myös määrittäneet annosvastetta joukossa urothelial sinoomasolulinjoja (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, UM-UC13, RT4, 253JP, 253J-BV, KU7) eri pitoisuuksia EGFR estäjä (gefitinibin) ja PPARy-agonistin (DIM-C) jälkeen 72 hs hoidon (kuva 1 B). Pystyimme osittaa useisiin UC solulinjat vaihtelevat herkästi suhteellisen resistenttejä EGFR esto, kun taas ei havaittu merkittäviä muutoksia perustella kerrostumista vastauksena DIM-C. Huomata, UC5, herkin solulinja gefitinibi, on erilainen kuin muualla solulinjat, koska se sisältää EGFR-geenin monistaminen.

(A) Expression PPARy ja EGFR suhteessa endogeenisten tasojen β- aktiini ja tubuliinin vastaavasti ja edustettuina yksiköissä joukossa 9 virtsarakon syövän solulinjoissa heijastaa eri vaiheissa taudin (pinnallinen invasiivisia ei etäpesäke, Invasive ja imunestejärjestelmän Metastasis). (B) annosvasteyhteys virtsarakon syövän solulinjoista PPARy-agonistin (DIM-C) ja EGFR-estäjä (gefitinibi). GI50 arvo määriteltiin keskimääräinen pitoisuus huume, joka tuottaa 50% kasvun eston verrattuna kontrolleihin.

Effects yhdistetyn EGFR estäjät ja PPARy agonistit Therapy

tutkineet antiproliferatiivisia vaikutuksia yhdistelmähoitoa, gefitinibi ja DIM-C, verrattuna kunkin lääkkeen yksin virtsarakon syöpäsolujen kasvua

in vitro

. Kasvu ja soluproliferaatiota seurattiin MTT määritykset ja suoritettiin kaksi varsin EGFR-resistenttejä solulinjoja (KU7 ja UM-UC13). Soluja käsiteltiin 72 hs ja käytetty kiinteä suhde eri fraktioiden GI50 (0,25, 0,5, 1,0 ja 2,0) kunkin lääkkeen yksinään mukainen mediaani vaikutus menetelmällä. Maksimaalinen inhibitio soluproliferaatiota osoitettiin yhdistetyssä hoidossa verrattuna joko lääkeainetta yksinään (kuvio 2). DIM-C sulatettu resistenttejä soluja herkkiä EGFR eston.

Kasvua seurattiin MTT määrityksissä. Soluja käsiteltiin gefitinibin 5 uM ja DIM-C 3 uM, ja niitä verrattiin kunkin lääkkeen yksin. Red: gefitinibi; Keltainen: DIM-C; Sininen: gefitinibin + DIM-C.

vaikutus Yhdistelmä on EGFR Downstream Signaling ja PTEN Expression

Sitovat EGFR sen ligandin johtaa aktivoitumiseen eri signaalien, kuten Ras /Raf /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi reitin (MAPK) [21]. Siksi tutkimme vaikutus yhdistelmän fosforylaatiota tila p42 /44 MAPK (Erk1 /2). Kuten kuviosta 3A nähdään, merkittävää ajan myötä deaktivointi Erk reitin havaittiin, verrattuna kontrolliin, solujen kesken käsiteltiin gefitinibin 5 uM ja DIM-C 3 uM. Lisäksi, kuten aiemmin mainittiin, ilmaus PTEN kasvaa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), käsiteltiin PPARy-agonistit, rosiglitatsoni [17]. Siksi tutkimme myös vaikutuksen yhdistelmän käyttöä PTEN ilme. Kuten kuviossa 3B on esitetty, ei ole eroa PTEN ilmentyminen havaittiin, verrattuna kontrolliin, kun soluja käsiteltiin yhdistettiin gefitinibin ja DIM-C 24 hs.

(A) fosforylaatio kuvio p42 /44 MAPK (Erk1 /2) käsitellyissä soluissa gefitinibin 5 uM ja DIM-C 3 uM 5, 15 ja 30 minuuttia. T0 on käsittelemätön kontrolli. Kokosolulysaateista immunoblotattiin phosho-p42 /44 MAPK ja p42 /44 MAP. GAPDH käytettiin lastaus valvonta Western blotting. (B) vertailu PTEN ilmentyminen solulinjoissa käsitelty gefitinibin 5 uM ja DIM-C 3 pM 24 hs. T0 on käsittelemätön kontrolli.

Vaikutukset Hoito virtsarakon kasvaimen kasvua in vivo

Sen arvioimiseksi, ovatko nämä löydökset voidaan kääntää

in vivo

nude-hiiret olivat istutettiin ihonalaisesti suhteellisen resistenttejä virtsarakon syöpäsolujen (KU-7-soluissa). Hiiriä käsiteltiin kohdennettuja aineiden suun kautta letkulla (PPARy-aktiivinen DIM-Cs annetaan 60 mg /kg 3 kertaa viikossa, gefitinibi annetaan 2 mg /päivä 5 kertaa viikossa, tai molemmat) ja 4 viikkoa. Kuten kuviossa 4 on esitetty, kasvaimen painot olivat merkittävästi pienentyneet yhdistetään ryhmässä verrattuna kunkin lääkkeen yksin verrattuna kontrolliin (

p

0,02). Nämä havainnot viittaavat siihen yhdistetty hoito on parempi antituumorivaikutus. Lisäksi geeni-ilmentymisen profilointi analyysi virtsarakon ksenograftien, osoitti, että useita geenejä, jotka osallistuvat solusyklin, solukuoleman, solujen kasvun ja lisääntymisen oli eri ilmaistaan ​​yhdistetyssä hoitoryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. (Pöytä 1). Merkillistä, sykliiniriippuvainen estäjä (CDKN1A tai p21), joka toimii säätelijänä solusyklin etenemisen G1-, oli merkitsevästi upregulated (Taita muutos 2,6,

p

arvo 0,02) ja tämä oli vahvistanut immunohistokemia osoittaa suurempi osuus p21 positiivisten solujen yhdistetyn varren

in vivo

(66% vs. 15%, p 0,001) (kuvio 5A) sekä

in vitro

(kuvio 5B) . Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että PPARy on tärkeä rooli välittäjänä erilaistumista kaskadi ilmentymisen sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjät, jolloin saadaan aikaan molekyyli mekanismi kytkennän kasvun pysähtymisen ja adiposyyttien erilaistumiseen [22].

Virtsarakon kasvaimen kasvua yhdistelmähoidon hoitoryhmään verrattuna vertailuryhmään (P 0,02). Kymmenen hiirtä ryhmää kohti hoidettiin lumelääkkeellä; DIM-C annettiin 60 mg /kg 3 kertaa viikossa; Gefitinibin annettiin 2 mg /vrk, 5 kertaa viikossa. Kaikki lääkkeet hallinnoima letkulla suun kautta. Hoitoa jatkettiin 4 viikkoa.

(A) immunohistokemia (IHC) värjäytymisen p21 -tuumoriksenografti kudoksissa. Hiiriä lumelääkettä tai yhdistelmähoidolla (Gefitinibi 2 mg /vrk, 5 kertaa viikossa ja DIM-C 60 mg /kg, 3 kertaa viikossa). Graphic oikealla puolella edustaa määrällisesti positiivista värjäytymistä soluissa. (B) In vitro ekspressio p21 Western blot lysaattia käsiteltyjen solujen gefitinibin 5 uM ja DIM-C 3 uM 24 hs. Graphic oikealla puolella edustaa kvantifiointiin p21 ilmaisun liittyvien GAPDH.

EGFR esto indusoi gene expression PPARy on annosriippuvaisesti

arvioitiin vaikutus gefitinibin jäseniin PPARy signalointi akseleita. Kaksi resistentit solut (KU-7 ja UM-UC13) käsiteltiin eri pitoisuuksilla EGFR-inhibiittoria 24 hs. PPARy ilmentyminen määritettiin Western blot-analyysit, kuten aiemmin on kuvattu. Kuten on esitetty kuviossa 6A, dramaattinen induktio PPARy ilmentymisen havaittiin molemmissa solulinjoissa, annoksesta riippuvalla tavalla, minkä jälkeen EGFR estoon. On kiinnostavaa, että tumakertymään PPARy havaittiin myös sen jälkeen, kun säätelyä, joka on itse asiassa aktiivinen muoto reseptorin. (Kuvio 6B). Nämä havainnot vahvistettiin

in vivo

, kuten kuvassa 7, joka osoittaa PPARy lauseke on korkeampi keskuudessa ksenograftikasvaimissa käsitelty gefitinibin verrattuna lumeryhmään. Huomattavaa on, että ydin- värjäytymistä havaittiin myös, mikä viittaa tumaansiirtymiseen PPARy induktion jälkeen sen ilmaisun.

(A) kertainen kasvu verrattuna kontrolli määritettiin jälkeen normalisoinnin β-aktiini ulkoista kuormitusta kontrolli. (B) lisääntymisen merkkejä ja tumakertymään PPARy hoidon seurauksena gefitinibin (24 hs).

graafinen alemmalla tasolla edustaa määrällisesti positiivista värjäytymistä soluissa. Mustat nuolet osoittavat tuman värjäytymisen.

Aikataulu-erityinen tehokkuus Combination Therapy

Jos solut herkistyneet EGFR eston kautta induktion PPAR ilmaisun, niin voisi olettaa, että teho yhdistelmähoito voidaan myös vaikuttaa merkittävästi ja parantaa jono gefitinibin ja DIM-C. Itse asiassa, havaitsimme merkittävää vaikutusta proliferaatioon joukossa kolme suhteellisen resistenttejä ja yksi herkkiä solulinjoja gefitinibille (KU-7, UM-UC3, UM-UM13), kun soluja esikäsiteltiin gefitinibin 24 hs mahdollistamiseksi induktioon PPARy ilmaisu verrattuna siihen, kun solut olivat samanaikaisesti altistukseen ja DIM-C (kuvio 8). Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, PPAR-agonistin voisi merkittävästi herkistää UC solulinjat, erityisesti niistä, jotka olivat resistenttejä EGFR esto, joka aikataulun sifisistä ja tarjoavat erinomaisen mahdollisuuden yhdistelmähoitoa.

kolme suhteellisen resistenttejä solulinjoja gefitinibille (UM-UC3, UM-UC13, ja KU-7) ja yksi herkkä (UM-UC6). Kasvu (MTT määritykset) jälkeen 48 hs hoidon. Gefitinibi: 2 uM. DIM-C: 2 uM.

C /EBPβ Expression jälkeen Gefitinibi aiheuttama-PPARy Expression

Huomattavaa näyttöä siitä, että CCAAT /tehostajana sitovan proteiinin beta (C /EBPβ) toimii transkriptioaktivaattorina varten PPARy geenien [23], [24]. Tämä uskomus tukee se, että proksimaalinen sen promoottorit hallussaan C /EBP säätelyelementtejä, jotka ovat välttämättömiä transaktivaatiota PPARy-promoottori-reportteri siirtogeenien. Me raportoimme tässä vakuuttavia todisteita siitä, että peräkkäinen induktio PPARy ilmentymisen EGFR inhibitio välittää C /EBPβ (kuvio 9). Kun soluja esikäsiteltiin gefitinibin samoina pitoisuuksina käytetään ilmentymisen indusoimiseksi PPARy, lisäys C /EBPβ oli myös havaittu viittaa gefitinibin indusoi-PPARy-ekspressio voidaan välittää C /EBPβ.

(A ) RT-PCR: llä käsiteltyjen solujen gefitinibin (B) Western blot CEBPβ ​​ilmentymisen KU-7 ja UM-UC-13-solulinjojen vastauksena eri pitoisuuksia gefitinibin.

keskustelu

tulokset suuri elin prekliinisissä tutkimuksissa ja kliinisissä kokeissa viittaavat siihen, että kohdistaminen EGFR edustaa merkittävästi syövän hoidossa. Kuitenkin kysymys konstitutiivista resistenssin suuri määrä potilaita ja kehittymistä hankitun resistenssin hoitovasteen edelleen tutkimaton tutkimusten kohteena. Syöpäsolun vastustuskykyä EGFR antagonistit voisivat johtua useista syistä, kuten geneettiset muutokset, joiden avulla ne voivat olla luontainen vastustuskyky syöpälääkkeiden. Lisäksi useat eri molekyylitason muutoksia tärkeää EGFR riippuvaisia ​​tai riippumattaman solusignalointi reitit voivat olla vastuussa resistenssin kehittymistä nämä inhibiittorit. Esimerkiksi olemme aikaisemmin osoittaneet irrottamalla EGFR mitogeeniseen polkuja voi aiheuttaa resistenssiä EGFR-antagonistien [7]. Tällä hetkellä yhdistetty hoito on tullut läpimurtoa syövän hoidossa. Alueella kasvaimen yksiköiden, kuten lähestymistapa on tuottanut vaikuttavia tuloksia. Yhdistelmähoito PPARy-agonistit ja muut aineet on todettu olevan tehokkaampi kuin joko ainetta yksinään. [25], [26]. Virtsarakon syöpäsoluja

in vitro

ja virtsarakkokasvain

in vivo

, osoitimme, että PPARy aktiivinen DIM-Cs osoitti merkittäviä antituumorigeenistä aktiivisuutta ja olivat voimakkaita estäjiä virtsarakon syövän kasvua verrattuna rosiglitatsonin kanssa, nykyisin käytetty synteettinen PPAR-agonistin [16]. Yhdessä yhteenlaskettu kohdistaminen sekä EGFR ja PPARy akseleita voi paljastaa lupaavia molekyylejä kohdistaa virtsarakon syöpään. Kuitenkin meidän tulokset ovat osoittaneet, että ihmisen uroteelisyöpä solulinjoissa näyttää selvästi heterogeenisyys kohti herkkyyttä EGFR: n estäjien. Suuresti kiinnostavista tasot ilmentymisen EGFR ja PPARy vaihtelivat huomattavasti eri solulinjoissa, mutta ei korreloinut taudin vaiheesta (vaihtelevat pinnallinen papillaarisen invasiivisia ja etäpesäkkeitä). Lisäksi tämä korrelaatio ei ollut täydellinen kuin hyvin herkkyys joko EGFR estäjän tai PPAR-agonistin kanssa lukuunottamatta UM-UC5 joka osoittaa korkeita EGFR ja näyttää korkea herkkyys EGFR estäjä. Nämä havainnot vahvistavat tulokset muista ryhmistä, jotka ovat ilmoittaneet, paneelissa 17 ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa, että huolimatta vahvan korrelaation joukossa gefitinibi-reagointikykyä, EGFR pinta ilmaisun ja p27Kip1 proteiinin ilmentymistä kaikkein reagoiva linjat, gefitinibi-vaste ei ollut niin tiukasti sidottu pinta-EGFR paneelissa solulinjojen koko [27]. Nämä tulokset ovat merkittäviä, mutta ovat edelleen epäselvää perustason ilmentyminen voisi ennustaa EGFR riippuvainen kasvun virtsarakon syöpään. Toisaalta, kun kaksi resistenttejä solulinjoja (KU-7 ja UM-UC13) käsiteltiin kiinteän suhde eri jakeet GI50 kunkin lääkkeen yksinään (gefitinibi tai DIM-C), yhdistelmähoito saattaa kohdistaa lisäainetta inhibitio UC-solujen lisääntymisen. Nämä tulokset tarjotaan lisää tietoa mahdollisten yhdistettyjen hoidon vastustus joko lääkkeellä yksin, erityisesti EGFR estäjä. Todellakin, meidän

in vivo

havaintojen osoitti positiivisesti vaikutukset yhdistetyn EGFR: n estäjien ja PPARy-agonistit kasvuun ihmisen urothelial kasvaimia. Itse asiassa, ksenografteja nude-hiiriin suhteellisen resistenttejä virtsarakon syövän solujen (KU-7-solut) oli huomattavasti pienempi kasvaimen paino yhdistetty ryhmä, toisin kullekin hoito yksinään verrattuna kontrolliin. Nämä havainnot osoittavat, että jopa suhteellisen resistenttejä soluja,

in vitro

osoittivat herkkyys

in vivo

yhdistetyssä hoidossa, mikä viittaa siihen, PPARy-agonisti voidaan mahdollisesti käyttää herkistää virtsarakon syövän solulinjat, jotka olivat resistenttejä EGFR esto.

Äskettäin curcumin oli osoitettu aiheuttavan PPARy ilmentymisen maksan tähtisolut ja estävät solujen lisääntymistä mahdollisesti

kautta

EGFR aktivointi [28]. Tässä tutkimuksessa, Zhou et al, on raportoitu, että keskeytys PDGF ja EGF signalointireitteihin mukaan curcumin, stimuloi geenin ilmentymistä PPAR-aktivoidussa Maksan tähtisolut (HSC), mikä väheneminen solujen kasvua, mukaan lukien induktio solun pysähtymiseen ja apoptoosiin . Samoin havaitsimme induktio PPARy ilmentymisen kun EGFR resistenttien KU-7 ja UM-UC13 soluissa. Tämä oli houkutteleva tulos, koska induktio PPARy ilmentymisen havaittiin annoksesta riippuvaisella tavalla, ja seurasi tumakertymään PPARy, joka on itse asiassa funktionaalisen reseptorin muotoon. Meidän uusi havainto heijastaa että teho yhdistelmähoito voi myös vaikuttaa merkittävästi ja parantaa sekvensoitiin gefitinibin ja PPARy-agonisti. Todellisuudessa, PPARy-agonistin selvästi herkistyneet virtsarakon syövän solulinjat, erityisesti niistä, jotka olivat resistenttejä EGFR inhibition, joka aikataulu-spesifisellä tavalla, mikä viittaa siihen, se voi olla erinomainen vaihtoehto, kun solut ovat resistenttejä edellä mainitun monoterapioihin. Mekanismi induktion PPAR geenin ilmentymisen gefitinibi on vielä epäselvää. Aikana adipogeneesin huomattavia todisteita osoittaa, että CEBP /β toimii transkription aktivaattori PPAR-geenien [23]. Tämä uskomus tukee se, että proksimaalinen promoottorit PPARy omaavansa C /EBP säätelyelementtejä välttämättömiä sen transaktivaation. Lisäksi on osoitettu, että CEBP /β ilmaistaan ​​varhaisessa vaiheessa sen jälkeen käsittelemällä erilaistumisen indusoijat [29], jota seuraa ilmaisu PPARy. Itse asiassa, meidän havainnot osoittaa EGFR-inhibition indusoi CEBP /β ilmaisun ja kiinnostavaa, sen säätelyä havaittiin myös varhaisessa vaiheessa sen jälkeen, kun gefitinibi hoidon, prosessi hyvin samanlainen aktivointi adipogeenisen geenien erilaistumisen aikana, ja joka edeltää induktion PPARy-geenin ilmentymisen. Kuitenkin tulevaisuudessa tutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan määrittää suoraa roolia C /EBPβ induktioon PPAR ilmaisun välittämän gefitinibi. Tulkittaessa tuloksemme, on tärkeää tunnustaa rajoitukset prekliinisissä tutkimuksissa.