Krooninen sairaus

tiivistelmä

Non-Small-Cell-Lung-Cancer (NSCLC) osuus on noin 85% kaikista keuhkosyövässä ja edelleen huonosti ymmärsi. Vaikka signalointipolkujen operatiivinen aikana elin kehittämistä ja Sonic Hedgehog (Shh) ja liittyvät Gli transkriptiotekijöiden (Gli1-3), on äskettäin todettu uudelleen NSCLC, niiden toiminnallista roolia edelleen epäselvä. Täällä arveltu, että Shh /Gli1-3 voisi välittää NSCLC autonomisten lisääntymistä ja epiteelin /strooman signalointia kasvainkudoksen. Tässä yhteydessä olemme tutkineet aktiivisuus Shh /Gli1-3 signalointia NSCLC sekä, syövän ja strooman solut. Me raportoimme tässä, että esto Shh signalointi aiheuttaa merkittävä lasku leviämisen NSCLC-solujen. Tämä vaikutus välittyy Gli1 ja Gli2, mutta ei Gli3, säätelemällä sykliini D1 ja sykliini D2 ilme. Vaikka eksogeenisen Shh ei kyennyt indusoimaan signalointia joko A549- keuhkoadenokarsinooma tai H520 keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä soluja, molemmat solujen havaittiin erittävän Shh ligandiin, joka indusoi fibroblastien lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike, invaasio, ja kollageenin synteesiä. Lisäksi Shh erittämä NSCLC välittää tuotantoa proangiogeeninen ja metastaattisen tekijöitä keuhkojen fibroblasteista. Tuloksemme siis osoitettava, että Shh on tärkeä rooli välittämisessä epiteelin /mesenkymaaliset ylikuulumisen NSCLC. Vaikka autonominen Gli toimintaa ohjaa NSCLC leviämisen, lisääntynyt Shh ilmentymisen NSCLC liittyy fibroblastien aktivoitumisen kasvaimeen liittyvät strooman. Tutkimuksemme korostetaan merkitystä opiskelun strooman liittyvän solujen yhteydessä NSCLC uusista ennustetta ja hoitovaihtoehdot.

Citation: Bermudez O, Hennen E, Koch I Lindner M, Eickelberg O (2013) Gli1 sovittelee Keuhkosyöpä Cell Proliferation ja Sonic Hedgehog-Dependent mesenkyymisolun aktivointi. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10,1371 /journal.pone.0063226

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 09 lokakuu 2012; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2013; Julkaistu: 7. 2013

Copyright: © 2013 Bermudez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Helmholtz Association. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on tappavin syöpä maailmassa. Tällä hetkellä ei ole tehokasta hoitoa vaihtoehtoja olemassa keuhkosyöpää ja 5 vuoden pysyvyys on vain 14% potilaista, joilla hoito [1] kantavassa puuttuu tehokas pitkäaikaisen hoidon liittyy monimutkaisuuden keuhkosyöpä ja siten tarpeesta ymmärtämään paremmin biologiaa keuhkojen syövän synnyn. Vähän huomiota on tähän mennessä osoitettu kasvaimeen ympäröivän mikroympäristön, joka muodostaa kasvaimeen liittyvien strooman ja toimii aktiivisesti mukana kasvainten synnyssä. Viime vuosina, yhä enemmän näyttöä on korostanut, että on tärkeää strooman kasvaimen aloittamista, etenemistä ja aineenvaihduntaa monien syöpien [2] – [7]. Samoin signalointia stroomasoluihin on osoitettu olevan olennainen pahanlaatuisiin epiteelisolujen [2], [5], [6].

Pathways mukana organogeneesin ja keuhkojen haarautuvia morfogeneesiä, mukaan lukien Hedgehog ( hh) signalointi, on hiljattain tunnistettu keskeisten toimijoiden ihmisen syövissä [8]. Kolme Hedgehog (Hh) geenit olemassa nisäkkäillä, Sonic Hedgehog (Shh) kaikkein laajasti ilmaistu geeni. Eritetyn Shh sitoutuu reseptoreihin Patched (Ptch) läsnä solukalvon vastaanottavan solun. Sitoutuminen Shh on Ptch vapauttaa tukahduttaminen että Ptch kiinnostavuus tasoittaa, seitsemän transmembraani- span reseptorin kaltainen proteiini välttämättömiä transduktion Hedgehog signalointi. Smoothenedin helpottaa vuorovaikutusta eri Hedgehog alavirran efektoreina ensisijainen värekarvojen, jolloin aktivointi transkriptiofaktoreiden Gli [9]. Ihmisissä kolme Gli sinkkisormen proteiineja (Gli1, Gli2 ja Gli3) järjestää Hedgehog-spesifinen vaste solussa säätelemällä geenin ilmentymistä. Geenit Hedgehog-reitin itse mukaan lukien Gli1 ja Ptch1 ovat tavoitteita Gli, jotka edustavat takaisinkytkentäsilmukka jotka toimivat lukemiselle Hedgehog toimintaa [10]. Aktivointi ihmisen kanoninen Hh-reitin riippuu ekspressioon Ptch-reseptorien (Ptch1, Ptch2) ja valereseptori Hhip (Hedgehog-vuorovaikutuksessa proteiini) [11]. Solunsisäisiä proteiineja, jotka säätelevät Gli vakaus, kuten SUFU (suppressori sulatettua) ja SPOP (pilkku-tyyppinen POZ proteiinia) soittaa myös tärkeä rooli päätettäessä Gli aktiivisuuden ja siten aktivaation kanoninen Hedgehog-reitin [12]. Viime vuosina tutkimukset ovat korostaneet olemassaolon kaanoniin Hedgehog-reitin, joka ei edellytä täydellistä Shh-Ptch-SMO-Gli akselilla. Ei-kanoninen Hedgehog signalointi riippuu SMO mutta riippumaton Gli, jotka säätelevät tubulogenesis ja apoptoosin, on kuvattu endoteelisoluissa [13] .Kun aikaa, Gli transkriptiotekijät näkyvät integroiva alusta lukuisia signaloinnin panoksia, perustamisesta toinen laatuaan ei-kanoninen Hedgehog signalointi, riippuvainen Gli mutta riippumaton SMO. Tämä koskee haiman adenokarsinooma, jossa Gli transkriptio säätelee TGF-ß ja K-ras [14].

Hedgehog signalointireitin on kriittinen rooli selkärankaisen kehittymisen aikana ohjaamalla solujen kasvua, selviytymistä, kohtalo ja kuvio kehon suunnitelman. Muutoksia Shh koulutusjakson aikana keuhkojen kehitykseen vaikuttaa epiteelin /mesenkymaaliset vuorovaikutusta ja johtaa aluevaltaus morphogenesis vikoja, heikentäen keuhkojen toimintaa. Vaikka Shh signalointi on välttämätön keuhkojen kehitykseen, rooli, että tämä signalointireitille voi olla aikuisten keuhkoissa jäi epäselväksi ja on juuri nyt alkaa tutkia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että on tärkeää Hedgehog signaloinnin idiopaattinen keuhkofibroosi, tappava sairaus tuntematon ethiology. Bolaños ym ovat raportoineet, että eri osatekijät Hedgehog-reitin ovat yli-ilmennetään IPF keuhkoissa ja IPF fibroblasteissa. Lisäksi fibroblasteista IPF keuhkoista havaittiin vastaamaan Shh ja tämä vaste korreloi fibroblastien aktivoitumisen

vitro

[15]. Riippumaton tutkimuksessa Cigna et al [16] osoitti, että ensisijainen ihmisen fibroblastit normaalista ja IPF keuhkojen ilmaista pääkomponentit Hedgehog signalointireitin, joka liittyy solujen lisääntymistä ja ilmentymistä myofibroblastic merkkiaineiden fibroblasteissa. Nämä tutkimukset tuovat esiin merkityksen Hedgehog signaloinnin keuhkofibroosi, roolia tämän reitin eri keuhkosyöpään jää epäselväksi. Keuhkosyövästä luokitellaan histologinen tyyppi: yleisimpiä keuhkosyöpään on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen-karsinooma (SCLC). NSCLC ja SCLC paitsi näytteille kokoerot ja ulkonäkö syöpäsolujen, mutta myös erilaiset ennustetta ja kliinisen hoidon. Koska heterogeenisuus kunkin keuhkosyöpään alatyyppiä, ylimääräisiä histologisia ja molekulaarinen tarvitaan valita tarkempi käsittely. Perinteisesti NSCLC seulottiin ja hoidettiin EGFR ja K-

ras

mutaatioita. Kuitenkin ulkonäkö resistenssin näille hoitoja ja kuvauksen uusia molekyyli allekirjoitukset ovat korostaneet tarvetta parempaan kasvain molekyyli-profiili-terapiasta. Jotkut tutkimukset ovat kuvattu yhdistyksen välillä uudenlaisia ​​geenin ilmentymisen tiettyjä osia NSCLC [17], [18], ja toiset ehdottavat soveltamista uuden kasvaimen molekyyli profilointi tulevaisuudessa hoitoja. Esimerkiksi arviointi MMP2 ja b-kateniinin ilmentymistä on ehdotettu olevan potentiaalinen diagnoosissa NSCLC eri ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia [19]. In SCLC, kasvaimen alkeellisia neuroendocrine ominaisuuksia, Shh havaittiin aktivoidaan neuroendocrine progenitorisolujen ja kasvainsolujen hiirissä [20], [21]. Vaikka nämä tutkimukset tukevat juxtacrine /autokriinisen aktivointi Hh vuonna SCLC, ei ole selvää, miten tämä -systeemi aktivoituu NSCLC, yleisin alatyyppi keuhkosyöpään. Koska kliinisiä ja biologisia eroja NSCLC ja SCLC, me arveltu, että mekanismi aktivoitumisen Shh NSCLC eroaa SCLC. Meidän tavoitteena oli tutkia aktiivisuuden Shh signaloinnin NSCLC sekä syövän ja strooman soluja. Jotta voidaan arvioida, kuinka tärkeää on Shh signaloinnin NSCLC soluissa, olemme suorittaneet Knockdown kolmesta Gli transkriptiotekijät (Gli1-3), jotka välittävät solunsisäisiä Shh signalointi, ja tutki niiden vaikutus NSCLC leviämistä. Lisäksi olemme arvioineet, miten NSCLC-solut ja keuhko fibroblastit vastasi eksogeenisen Shh leviämisen kannalta, solumigraation, invaasio, ja soluväliaineen remodeling.

Tulokset

Syklopamiini, siili Inhibitor, vähentää NSCLC leviämisen ja elinkelpoisuus

Yksi haitalliset ominaisuudet syöpien on sääntelyn soluproliferaatioon. Siksi olemme tutkineet sitä roolia, Shh voisi olla NSCLC leviämisen käyttäen soluja adenokarsinooma ja soluja squamous kohdunkaulan, ensimmäinen ja toiseksi yleisin keuhkosyövän vastaavasti. Aluksi käytimme Syklopamiini, kasviperäinen steroideihin alkaloidi, joka estää Smoothenedin (SMO), G-proteiiniin kytketty reseptori, joka transdusoi Shh signaali solussa, estää Shh väylän NSCLC soluissa. Kun käsiteltiin syklopamiinilla, A549 adenokarsinoomasoluja ja H520 okasolusyöpä keuhkosyöpä osoittivat merkittävää vähenemistä solujen määrä erityisesti pidemmän aikaa pistettä (kuviot 1A ja B). Syklopamiinia myös vähensi solujen eloonjäämistä (metabolinen aktiivisuus arvioitiin MTT: llä) (kuviot 1A ja B) ja tämä vaikutus oli tärkeämpi kasvavia annoksia estäjän (Kuva S1A ja Kuva S3E). Sulkea pois, että syklopamiinia ei provosoida sytotoksista epäspesifinen vaikutus NSCLC soluihin, apoptoosi määritettiin upon syklopamiinihoidon. Vaikka syklopamiinia aiheuttama kasvoi hieman laajuus apoptoottisten solujen osuus apoptoottisten solujen ei eronnut käsittelyjen välillä-solujen ja ei-käsiteltyjen solujen (kuvio S1B ja Kuva S3F). Sen vahvistamiseksi konkreettisena vaikutuksena syklopamiinin NSCLC leviämisen ja elinkelpoisuus, SMO hiljentäminen suoritettiin. SMO pudotus aiheutti lasku sekä A549 ja H520-solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuuden (tietoja ei ole esitetty). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että tukkeutuminen Hedgehog-reitin kautta SMO inhibition, vähentää ei-pienisoluisen keuhkosyövän leviämisen ja elinkelpoisuus.

Lung A549-soluja (A) ja keuhkojen levyepiteelikarsinooma karsinooma H520-soluja (B) viljeltiin läsnä tai poissa ollessa 10 uM syklopamiinia 5 päivää. Proliferaatiota arvioitiin solu laskenta ja solujen eloonjäämistä MTT: llä. * P 0,1; ** P 0,05. (C) The Hedgehog-reagoiva transkriptiotekijöiden Gli1, Gli2 tai Gli3 tippuu alas siRNA A549-soluja. RT-qPCR tehtiin vahvistaa erityisiä hiljentäminen kunkin Gli ja arvioida ilmentymistä Hedgehog-reseptorin Ptch1. Tulokset on esitetty kertainen eroja mRNA-tasojen (2

∧∧Ct) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (NC siRNA), joilla ei ole homologiaa selkärankaisen transcriptome. ** P 0,05, *** p 0,01. Vaikutus hiljentäminen Gli1, Gli2 tai Gli3 A549-solujen lisääntymisen arvioitiin solujen laskenta (D) ja solun selviytymisen MTT: llä (E). Tulokset on esitetty prosentteina kuin suhteellinen proliferaation ja suhteellinen eloonjäämisen verrattuna transfektoitu negatiivisen kontrollin siRNA (NC). * P 0,1. (F) edustaja faasikontrasti- mikroskooppinen kuvat 72 tunnin siRNA esittelyyn. (G) RT-qPCR suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi siRNA on Gli1, Gli2 ja Gli3 ilmaus G1 /S faasin Sykliineiksi D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) ja sykliini E (Cyc E1). Tulokset on esitetty kertainen mRNA tasoilla (2

∧∧Ct) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (NC siRNA), joilla ei ole homologiaa selkärankaisen transcriptome. * P 0,1; ** P 0,05. (H) Western blot sykliini D2 A549-soluja, jotka on transfektoitu Gli siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA (NC). Blotting beta-aktiini käytettiin latauskontrollina.

vaiennettu Gli1 Vähentää NSCLC leviämisen moduloimalla sykliini D Expression

Vaikka Syklopamiini on todettu vaikuttavan solujen lisääntymistä muuntyyppisissä syöpäsolut, erityinen mekanismi, jolla Shh signalointi säätelee NSCLC syöpä lisääntymistä edelleen heikko. Esimerkiksi ei tiedetä, miten kukin 3 ihmisen Shh-transkriptiotekijöiden Gli myötävaikuttaa NSCLC leviämisen. Jotta käsitellä tätä kysymystä, käytimme pieniä häiriöitä RNA: t (siRNA) hiljentää Gli1, Gli2 ja Gli3. Kun on erityinen ja tärkeä väheneminen mRNA tasot Gli1 ne eivät vaikuttaneet myöskään Gli2 tai Gli3 mRNA (kuvio 1 C), solujen lisääntymisen ja solujen elinkyky laski A549 adenokarsinoomasoluil- (kuvio 1D-F). Irtisanomisaika, vaiennettaisi Gli1 aiheuttanut väheneminen Ptch1 mRNA (kuvio 1 C). Koska transkriptio Ptch1 riippuu Gli1, vähentämisestä Ptch1 mRNA toimii ylimääräisenä kontrolli osoittaa, että vaiennettaisi Gli1 oli biologisesti tehokas. Erityiset vaiennettu Gli2, joka vähensi Gli2 mRNA-tasot ja ei laskenut joko Gli1 tai Gli3 mRNA-tasot (kuvio 1C), pieneni hieman A549 solujen lukumäärä ja solujen elinkelpoisuus, vaikkakaan ei tilastollisesti merkittävällä tavalla (kuvio 1 D ja E). Lopuksi siRNA on Gli3 mielessään tärkeä väheneminen Gli3 mRNA mutta ei laskua Gli1 tai Gli2 mRNA (kuvio 1 C), ei vähentänyt A549 adenokarsinooma solujen lisääntymisen tai solujen elinkykyä (kuvio 1 D ja E) ja sen sijaan aiheutti hieman lisääntynyt solujen määrä A549 adenokarsinooma soluja (kuvio 1 D) yhdessä kasvua Gli1 mRNA-tasot (kuvio 1 C). Vuonna H520 squamous keuhkokarsinoomasoluja (kuvio S3) ja suuri cell carcinoma soluja (tuloksia ei ole esitetty), erityiset hiljentämisen Gli1, Gli2 tai Gli3 oli samanlainen vaikutus solujen proliferaatioon ja sykliini ilmaisun. Tärkeää on, että ilmaus Shh liittyvien geenien ja sykliinejä päälle Gli1, Gli2 ja Gli3 hiljentäminen ei johtunut Hprt1 ilmaisun koska samankaltaista ekspressio havaittiin kun 3 riippumatonta viittaus geenejä käytettiin A549 (kuvio S2) ja H520-soluissa ( Kuva S4).

jotta tutkia miten vaiennettaisi Shh koulutusjakson vaikutusten keuhkoadenokarsinooma leviämisen, olemme arvioineet muutoksia ilmaus sykliinien D ja E mukana G1 /S solusyklin siirtyminen, kun Gli alassäätöä. Kiinnostaa, siRNA on Gli1 ja Gli2 aiheutti merkittävän laskun sykliini D2 ja lievä väheneminen sykliini D1 mRNA (kuvio 1G). Lasku sykliini D2 ilmaisun yhteydessä Gli1 ja Gli2 pudotus havaittiin mRNA vaan myös proteiinin taso (kuvio 1 H). Ottaen huomioon, että Gli2 voivat vaikuttaa sykliini D ilmaisu, me arveltu, että yhdessä Gli1, tämän transkriptiotekijän voi säädellä solujen lisääntymistä merkittävällä tavalla. Jotta voitaisiin vahvistaa tämän hypoteesin, olemme ymmärtäneet kaksinkertainen hiljentäminen Gli transkriptiotekijöiden. Vaikka yksittäinen vaiennettaisi Gli2 ei laskenut merkittävästi solujen elinkelpoisuuden, kaksinkertainen hiljentämisen Gli1 ja Gli2 teki (kuvio S1C). Vuonna H520 keuhkojen levyepiteelikarsinooma masoluja, erityiset knockdovvn Gli1 ja Gli2 siRNA todettiin vähentävän samalla tavalla sykliini D1 ja sykliini D2 ilmentymistä (kuvio S3A). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että saarto Shh signalointireitin joko syklopamiinilla tai häiritsemällä transkriptiotekijä Gli1 pienenee NSCLC lisääntymistä.

NSCLC Solut eivät Aktivoi Shh Pathway Upon Eksogeeninen Shh Treatment

Koska saartoa Shh koulutusjakson vähenee NSCLC leviämisen, me tutkimme, eksogeenisiä Shh tuottaa lisäys soluproliferaatioon näissä soluissa. Keuhkoadenokarsinooma A549-soluja ja H520 squamous karsinoomasoluja käsiteltiin ihmisen rekombinantti-Shh ei osoittanut muutosta joko solujen määrä (kuviot 2A ja D) tai solujen selviytymistä (kuviot 2B ja E). Lisäksi solut eivät aiheuta elimellisen muutoksen käsittelemällä (kuviot 2C ja F). Nämä tulokset viittaavat siihen, NSCLC-solut eivät reagoi Shh. Voidakseen vahvistaa Shh hoitoon, käytimme ensisijainen alkion hiiren soluja raajasilmuihin, kudos, joka on osoitettu olevan herkkiä Shh. Kun Shh hoitoa, nämä solut osoittivat huomattavaa kasvua Gli1 ja Ptch1 mRNA-tasot (60 kertaiseksi ja 9-kertainen nousu vastaavasti verrattuna ei-käsitellyissä soluissa, kuvio S5). Kun A549-soluja käsiteltiin Shh, hyvin vaatimaton nousu (1,65-kertainen) in Gli1 mRNA-tasot 8 tuntia ja Gli1 proteiinin tasot 24 tunnin havaittiin. Kuitenkin pidemmän aikaa pistettä ei ollut ollut mitään merkittäviä muutoksia joko Gli1 tai Ptch1 lauseke (kuviot 3A ja B). Sillä H520-soluissa, merkittävät muutokset joko Gli1 tai Ptch1 mRNA ja proteiini taso havaittiin (kuviot 3C ja D). Nämä tulokset osoittavat, että

in vitro

, molemmat NSCLC-solujen, verrattuna tunnettuihin Shh-reagoiva solut, eivät erityisesti reagoi ulkoapäin Shh.

Lung A549-solut (A-C ) ja keuhkojen levyepiteelikarsinooma H520 karsinoomasolut (D-F) on käsitelty tai ei ole rekombinantti-Shh (500 ng /ml). Solujen proliferaatio määritettiin solujen laskenta (A, D), ja solujen selviytymisen MTT: llä (B, E) on osoitettu kertaa. Edustaja faasikontrasti- mikroskooppiset kuvat A549-solut (C) ja H520-solujen (F) on esitetty.

NSCLC-soluja käsiteltiin tai ei ole rekombinantti-Shh (500 ng /ml) on ilmoitettu ajat . RT-qPCR suoritettiin arvioimaan Gli1 ja Ptch1 mRNA-tasot, kun hoito A549-soluja (A) ja H520-solut (C). Tulokset esitetään kertaiseksi eroja mRNA tasolla (2

∧∧Ct) verrattuna ei-käsiteltyjen solujen kunakin ajankohtana. Western blot suoritettiin arvioimaan Gli1 ja Ptch1 proteiinin tasot A549-soluja (B) ja H520-soluissa (D), käsiteltiin tai ei ole Shh. ß-aktiini käytettiin latauskontrollina. Eritys ihmisen Shh arvioitiin supernatanteista A549 ja H520-solujen ELISA (E) ja vahvistettiin Western blot käyttämällä vasta-ainetta tunnustetaan erittyvän aktiivinen muoto Shh (upotettavat E). Western blot suoritettiin H520 supernatantin (H520 sup.) Ja yhdistelmä-Shh (Rec. Shh) käytettiin positiivisena kontrollina. (F) knockdovvn Shh geenin siRNA toteutettiin H520-soluissa. Shh eritys arvioitiin ELISA ja ilmaistaan ​​prosentteina suhteellisena erityksen verrattuna soluihin transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (NC), jossa ei ole homologiaa selkärankaisen transcriptome. ** P 0,05 (G) jälkeen hiljentäminen Shh, NSCLC-soluja käsiteltiin tai ei rekombinanteilla Shh (500 ng /ml). RT-qPCR suoritettiin arvioimiseksi Gli ja Ptch1 mRNA-tasoja. Tulokset esitetään kertaiseksi mRNA erojen (2

∧∧Ct) käsitellyissä soluissa verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin.

NSCLC solut erittävät Shh Ligandi

Käyttämällä tiettyä ELISA-koe ihmisen Shh, huomasimme, että A549 adenokarsinoomasolua ja voimakkaammin H520 levyepiteelikarsinooma syöpä tuottaa Shh (170 ja 2800 pg /ml vastaavasti, kuvio 3E). Tämä eritys voi liittyä endogeenisen Shh tuotanto näiden NSCLC solut, koska pitoisuus Shh keskipitkällä jokaisen solutyypin oli hyvin alhainen, verrattavissa asiayhteyteen (vesi).

Jotta vahvistaa nämä tulokset ja tutkia jos nämä NSCLC-solut tuottavat myös muut muodot Hedgehog ligandin, olemme arvioineet ilmaisua Sonic, Desert (Dhh) ja Intian Hedgehog (Ihh) A549 ja H520-soluissa. Vaikka emme voi havaita RT-qPCR Dhh ja Ihh, olemme havainneet, että Sonic Hedgehog ilmaistiin A549 ja H520-soluissa, on enemmän ilmaistaan ​​viimeksi mainitut (tuloksia ei ole esitetty). Näiden tulosten perusteella, olemme siis keskittyneet Shh koko tutkimukseen. Lisäksi, koska H520 solut tuottavat ja erittävät merkittäviä määriä Shh ligandin, päätimme keskittyä näihin NSCLC soluissa jatkotutkimuksiin liittyvät Shh eritystä. Arvioida tarkemmin läsnä ollessa aktiivinen muoto Shh H520 supernatantissa, Western blot suoritettiin tunnistavaa vasta-ainetta jalostettujen aktiivinen muoto Shh (N-Shh). Läsnä ollessa N-terminaalinen erittyy peptidi Shh supernatantissa H520-solujen ja siten vahvistettiin (upotus kuvio 3E).

Koska H520-solut erittävät merkittävän määrän Shh, mutta eivät reagoi eksogeenistä Shh, pyrimme tutkia jos tämä puute vastaus liittyi kyllästymisen endogeenisen Hedgehog aktiivisuuden näissä soluissa. Tätä varten olemme suorittaneet vaiennettaisi Shh geenin H520-soluissa. Kun knockdovvn Shh, joka vähentää 70% eritystä Shh H520-soluissa (kuvio 3F), eksogeeniset Shh lisääntynyt Gli1 mRNA-tasoja näissä soluissa (kuvio 3G). Tämä lisäys, sekä hieman lisäys Ptch1 mRNA (kuvio 3G) osoittavat, että H520-solut voivat reagoida Shh kun niiden endogeenisten tasojen Shh pienenevät.

Lung Sidekudosmuodostussolujen voimakkaasti Vastaa Eksogeeninen Shh

Koska NSCLC-solut voivat erittää Shh ligandin, mutta ne eivät ole vahvasti vastaa eksogeenisen Shh, tutkimme mikäli Shh voisi pikemminkin aktivoidaan viereisen stroomasoluissa. Todellakin, keuhkojen fibroblasteja käsiteltiin hiiren Shh osoitti voimakasta Hedgehog-reitin aktivointi käsittelemällä: Gli1 mRNA-tasot kasvoivat jopa 800 kertaa ja Ptch1 mRNA-tasot oli kertainen lisäys 250, erityisesti 48 ja 72 tuntia (kuvio 4A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ihmisen Shh (kuvio 4A). Shh hoito lisäsi myös Gli1 ja Ptch1 proteiinitasolla (kuvio 4B). Jotta tietää, jos keuhkojen ihmisen fibroblasteista NSCLC ympäristöstä voisi myös vastata eksogeenisten Shh, ensisijainen ihmisen keuhkojen fibroblasteja eristettiin resektoitiin keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä. Mielenkiintoista on, Gli1 ja Ptch1 mRNA-tasot lisääntyivät myös, kun Shh hoitoon näissä soluissa (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat, että

in vitro

, keuhkojen fibroblastit ovat erittäin Shh-reagoiva solut, toisin kuin NSCLC epiteelisoluihin.

Mouse keuhkojen fibroblastit CCL206 käsiteltiin tai ei ole 500 ng /ml rekombinantti hiiren Shh tai 500 ng /ml ihmisen Shh 24, 48 ja 72 tuntia. (A) mRNA tasot Gli1, Gli2, Gli3 ja Ptch1 käsittelemällä arvioitiin RT-qPCR. Tulokset esitetään kertaiseksi eroavaisuuksien mRNA tasolla (2

∧∧Ct) käsiteltyjen solujen verrattuna käsittelemättömien solujen kunakin ajankohtana. * P 0,1; *** P 0,01. (B) Western blot suoritettiin muutosten arvioimiseksi Gli1 ja Ptch1 proteiinin tasot CCL206 fibroblasteja käsiteltiin tai ei hiiren Shh (500 ng /ml). ß-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Ensisijainen ihmisen fibroblasteja käsiteltiin tai ei rekombinantilla ihmisen Shh (500 ng /ml) 24, 48 ja 72 tuntia. RT-qPCR arvioimiseksi suoritettiin mRNA tasoilla Gli1, Gli2, Gli3 ja Ptch1. Tulokset esitetään kertaiseksi mRNA erojen (2

∧∧Ct) käsitellyissä soluissa verrattuna ei-käsiteltyjen solujen kunakin ajankohtana. * P 0,1; ** P 0,05; *** P 0,01.

Sen tutkimiseksi, jos ei saatu vastauksia eksogeenisen Shh NSCLC soluissa johtui väärästä vastaanotosta Shh ligandin näissä soluissa, olemme arvioineet reseptoreiden eks- Ptch1, Ptch2 ja Hhip, pidetään valereseptori, A549, H520-soluja ja CLL206 fibroblasteissa. Ptch1 ilmentyminen havaittiin olevan suurempi kuin Hhip sekä NSCLC solutyypeissä (kuvio S6). Lisäksi suhteellinen ekspressio Ptch1 oli korkeampi A549 ja H520-soluissa kuin CCL206 fibroblasteissa, kun taas suhteellinen ilmentyminen valereseptori Hhip oli tärkeämpi keuhkojen fibroblasteja kuin NSCLC-soluja (kuvio S6). Siten tasapaino Ptch ja Hhip ilmaisua ei näytä liittyvän (mRNA-tasolla) ei-reagointikykyä NSCLC ulkoapäin Shh. Kuten solunsisäisiä proteiineja, kuten Sufu ja Spop säädellä positiivisessa ja negatiivisessa muodossa Gli vakautta vastaavasti olemme arvioitiin sitten jos epätasapaino näiden Gli sääntelijöiden voisi selittää ei-reagoiva NSCLC ulkoapäin Shh. Emme löytäneet eroja suhteellinen ilmentyminen Sufu verrattuna ilmentymisen Spop varten samaa solutyyppiä (kuvio S6). Lopuksi, olemme arvioineet jos suhteellinen ilmaus Hh-reseptoreita ja Gli sääntelyviranomaiset olivat erilaiset NSCLC ja keuhkojen fibroblasteista päälle Shh hoitoa. Mitään eroja ei havaittu ilmentymistä Ptch1, Ptch2, Hhip, Sufu ja Spop kun Shh hoidon lyhyellä (1, 3, 8 h) tai pidemmän ajan pistettä (24, 48 h) (tuloksia ei ole esitetty).

Lung Sidekudosmuodostussolujen Vastaa Shh erittämien NSCLC H520 Cells

Voit testata, onko Shh erittävät H520 okasolujen oli bioaktiivisia, keuhkon fibroblastit hoidettiin H520 supernatanttia. Tämä johti kasvuun Gli1 ja Ptch1 mRNA-tasot hiiren vastasyntyneen (kuvio 5A) ja aikuisen ihmisen keuhkojen fibroblastit (kuvio 5B). Jotta voidaan arvioida, jos tämä vaste oli välittämä Shh erittyy H520-solujen ja läsnä supernatantissa, siRNA Shh suoritettiin H520-soluissa. Tämä tärkeintä laski Shh-mRNA: n määrät ja läsnä on N-Shh supernatantissa (kuvio 5C) ja lisäksi vähennetään 90% tasot Gli1 ja 50% tasot Ptch1 fibroblasteissa käsiteltiin H520 supernatantti (kuvio 5D) .

. Keuhkojen fibroblastit olivat ilman seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin sitten tai ei ole supernatantissa H520-solujen 24, 48 tai 72 tuntia. (A) RT-qPCR suoritettiin analysoida Gli1, Gli2, Gli3 ja Ptch1 mRNA tasot CCL206 käsitelty H520 supernatanttia. Tulokset esitetään kertaiseksi RNA tasojen käsitellyissä soluissa verrattuna ei-käsiteltyjen solujen kunakin ajankohtana. ** P 0,05; *** P 0,01. (B) Ensisijainen ihmisen fibroblasteista keuhkojen levyepiteelikarsinooma carcinoma pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja käsiteltiin tai ei ole H520 supernatanttia osoitetut ajat. RT-qPCR arvioimiseksi suoritettiin Gli1, Gli2, Gli3 ja Ptch1 mRNA-tasoja. Tulokset on esitetty kertainen mRNA tasot käsitellyissä soluissa verrattuna ei-käsiteltyjen solujen kunakin ajankohtana. * P 0,1, ** p 0,05. (C) knockdovvn Shh tehtiin H520 solujen siRNA. Tehokkuus Shh Knockdown vuonna H520-soluissa varmistettiin western blot toteutettu supernatantissa H520 transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli siRNA (NC) tai siRNA Shh. (D) CCL206 fibroblasteja käsiteltiin 24, 48 ja 72 tunnin supernatantin kanssa joko H520 transfektoitujen solujen negatiivisena kontrollina siRNA tai supernatantissa H520-soluja transfektoitiin siRNA Shh. RT-qPCR tehtiin muutosten arvioimiseksi Gli1, Gli2, Gli3 ja Ptch1 mRNA-tasoja. Tulokset on esitetty kertainen mRNA tasoilla (2

∧∧Ct) on CCL206 käsiteltyjen solujen supernatantin kanssa, ja H520 transfektoitiin siRNA Shh verrattuna fibroblasteja käsiteltiin supernatantin H520 transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA. * P 0,1; ** P 0,05; *** P 0,01.

Shh Pathway Parantaa Lung Fibroblast Proliferation, invaasio ja kollageenin kerrostumista

Olemme osoittaneet tässä, että NSCLC-solut eivät merkittävästi reagoi ulkoapäin Shh mutta voi erittää bioaktiivisia Shh indusoi aktivointi Hedgehog signalointi keuhkojen fibroblasteista. Nämä tulokset osoittavat, että Shh on tärkeä rooli välittämisessä syövän epiteelin-strooman ylikuulumisen NSCLC. Tässä asetelmassa olemme tutkineet mahdollisia biologisia vaikutuksia Shh aktivoinnin keuhkojen fibroblasteista. Olemme keskittyneet eri puolia merkitystä syövän yhteydessä, kuten solujen lisääntymisen, migraation invaasion ja soluväliaineen remodeling. Vaikka yhdistelmä-Shh lisääntynyt solujen eloonjäämistä ja solujen lisääntymistä keuhkojen fibroblasteista (kuviot 6A-C), syklopamiini vähensi sitä (kuviot 6D-F). Tämä vaikutus näyttää olevan vuoksi spesifisesti inhibition Hedgehog-reitin syklopamiinihoidon korreloi lasku Gli1 ja Ptch1 ilmentymisen CCL206 fibroblasteissa (kuvio S7A). Mielenkiintoista on, H520 supernatantti myös parannettu keuhkojen fibroblastien solujen lisääntymistä (kuvio S7b-D). Kuten fibroblastien on osoitettu olevan tärkeitä helpottaa syövän maahanmuuton ja invaasio, menimme tutkimiseen vaikutuksista Shh näissä prosesseissa. Fibroblasteja käsiteltiin joko Shh tai syklopamiinilla, ja että niiden siirtymä kirjattiin jopa 72 tuntia hoidon jälkeen. Kun taas Shh lisäsi etäisyyttä muuttoliikkeen fibroblasteissa syklopamiini merkittävästi vähentynyt (kuva 7A). Jotta tutkia jos Shh voisi vaikuttaa fibroblastivaeltamista loukkaantumisen jälkeen ärsyke, joka voi paremmin edustaa muutokset tapahtuvat kasvainkudoksen, suoritimme haavan paranemista määrityksiä. Ei-käsiteltyjä soluja, fibroblasti muuttivat haava-alueen asteittain tavalla, jolloin haavan jälkeen 30 tuntia. In Shh-käsiteltyjä soluja, tämä prosessi on nopeampi ja johti haavan jälkeen 26 tuntia (kuviot 7B ja C). Päinvastoin, syklopamiini vähentynyt fibroblasti ala siirtyy haava-alueen ja ei aiheuttanut haavan (kuviot 7B ja C). Sitten pyrkimyksistä jos Shh voisi vaikuttaa fibroblastien hyökkäystä. Tätä varten käytimme siirtoaltaat päällystetty kollageenia, joka jäljittelee paremmin soluväliaineen ja siten kudoksen yhteydessä. Solut ladattiin päällä Transvvell- ja alustassa Shh tai syklopamiinia asetettiin pohjalle, jolloin muodostumista kaltevuus. Solujen lukumäärä transmigrating lisääntynyt läsnä ollessa Shh kun syklopamiinin laski fibroblasti hyökkäyksen kautta kollageenin päällystetyn kalvon (kuvio 7D). Vaikka Shh signalointi säätelee keuhkojen fibroblastivaeltamista ja invaasio, mitään vaikutusta havaittiin joko Shh tai syklopamiinia fibroblasti adheesiomäärityksiä (tuloksia ei ole esitetty). Koska epäjärjestystä ja muutokset arkkitehtuurin kasvaimeen microenvironment ovat kriittisiä tunnusmerkkejä syöpä, olemme tutkineet jos aktivaatio Shh reitin keuhkoissa fibroblasteissa voisi liittyä soluväliaineen remontin. Eksogeeninen Shh lisääntynyt ilmentyminen matriisin metallopeptidaasi MMP-9 (kuvio 7E), proteolyyttinen entsyymi, joka on keskeinen rooli syövän etenemiseen. Mielenkiintoista, Shh hoito lisäsi myös kollageenisynteesistä soluväliaineen muodostama fibroblasti (kuvio 7F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että Shh herättää vaste keuhkojen fibroblastien jotka voidaan korreloida muuttoliike, invaasio ja soluväliaineen remodeling.

leviämisen CCL206 keuhkojen fibroblasteista arvioitiin solujen laskenta (A, D) ja solujen eloonjäämistä