Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant kasvutekijän (EGF) signalointi liittyy kasvaimen kasvua levyepiteelisyövän pään ja kaulan ihmisillä (HNSCC), ja on merkittävä painopiste täsmähoitoihin. Setuksimabilla, monoklonaalinen vasta-aine EGFR, on onnistunut on jatkaa selviytymisen mutta on vain 10% kasvaimen kutistuminen vaste kliinisessä ympäristössä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli verrata dacomitinib (PF-00299804), seuraavan sukupolven pienimolekyylinen tyrosiinikinaasin estäjä, joka peruuttamattomasti estää useita HER-reseptoreita (HER-1 (EGFR), HER-2 ja HER-4 tyrosiini- kinaasien), jotta setuksimabi, nykyinen FDA hyväksyi anti-EGFR lääkitys HNSCC ja erlotinibin, EGFR erityisiä pienimolekyylinen tyrosiinikinaasin estäjä. Dacomitinib, erlotinibi ja setuksimabi testattiin paneelia 27 HNSCC solulinjoissa. Hoito 100 ug /ml setuksimabia tai 1 uM erlotinibin esti kasvun vähintään 50% 7/27 solulinjoissa, kun taas käsittely 1 uM dacomitinib oli samanlaisia ​​kasvun estäminen in 17/27 linjat. Solulinjat, jotka edustavat kolmea tasoa herkkyys dacomitinib tutkittiin edelleen käyttäen Western-blotteja, solusyklin ja apoptoosin analyysi. Hoito 100 nM dacomitinib vähennetään EGFR aktiivisuus ja loppupään AKT ja ERK polkuja tehokkaammin kuin hoito pelkällä 100 ug /ml setuksimabia kaikissa kymmenessä testattu linjat. Vaikka molemmat yhdisteet aiheuttaman apoptoosin samalla tasolla, dacomitinib aiheutti suuremman G0 /G1 pidätykseen. Herkkyys EGFR saarto liittyi tasot EGFR ja ERK ja ei liittynyt yhteisiä onkogeenisia mutaatioita ja kopioluvun vaihteluita. Fosforyloidun ja koko EGFR ja ERK tasot korreloivat herkkyys sekä setuksimabia ja dacomitinib. Kolme neljästä rivit erittäin herkkiä oli korkeimmat tasot fosforyloidun ja koko EGFR ja ERK joukossa kymmenen riviä valittu, kun taas kolme kestävät riviä kollektiivisesti oli alhaisin tasolla. Kumpikaan Pakt eikä Takt liittyi herkkyys.

Citation: Ather F, Hamidi H, Fejzo MS, Letrent S, Finn RS, Kabbinavar F, et ai. (2013) Dacomitinib, peruuttamaton Pan-ErbB Inhibitor Huomattavasti kumoaa kasvu pään ja kaulan alueen syöpä mallit, joilla esiintyy alhainen vastaus Setuksimabia. PLoS ONE 8 (2): e56112. doi: 10,1371 /journal.pone.0056112

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 8. tammikuuta 2013 Julkaistu: 06 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Ather et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: SL on työntekijä Pfizer. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Okasolusyöpä pään ja kaulan (HNSCC), joka koostuu syövistä peräisin suullinen ja nenän sivuonteloiden, kurkunpään, nielun, huulten ja poskionteloiden, on kuudes yleisin syöpä maailmassa jossa esiintyvyys ylitti 500000 tapaukseen vuodessa [1], [2]. Huolimatta kehittyvä malli multimodaalisuuden hallinnan integrointi kirurgisia toimenpiteitä, kemoterapiaa, ja sädehoitoa, kokonaiselossaoloaikaa edelleen huono ja 5 vuoden suhteellinen eloonjäämisluku alle 50% (SEER HNSCC tilastot). Pään ja kaulan alueen syöpä johto omistaa huomattavia mahdollisuuksia hyödyntämiseen kohdennettujen biologinen hoitoja, strategiaa, jonka on valmistanut merkittäviä edistysaskeleita hoidettaessa muita histologialtaan kuten rinta- [3], paksusuolen [4], ja keuhkosyöpä [5] . Ensisijainen aiheuttavana tekijänä keuhkojen ja pään ja kaulan alueen syöpä on tupakointi, ja molemmat on samanlaisia ​​molekulaariset ominaisuudet, jotka on patogeneesiin sairauden, kuten on keskeinen rooli ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), kasvaimen kasvua.

EGFR, joka ilmentyy vahvasti huomattava enemmistö (jopa 80-100%) ja HNSCC, on prototyypin reseptorin HER tyrosiinikinaasireseptorin perhe, joka sisältää HER1 /ErbB-1 /EGFR, HER2 /neu /erbB-2, HER3 /ErbB-3 ja HER4 /ErbB-4 [6]. Sitovat yksi sen seitsemästä ligandien (joka sisältää EGF ja TGF-alfa) indusoi homodimerisoitumisessa ja heterodimerisaation kanssa muun perheenjäsenen ja fosforylaatiota useissa tyrosiinitähteiden C-pään domeeni [7]. Sitoutuminen ligandin, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja transformoivan kasvutekijä (TGF-alfa) ja EGFR, johtaa reseptorin dimeroinnin ja solunsisäisen signaloinnin aloitus reittejä. Major loppupään signalointi on kautta Ras-Raf-MAPK-reitin. Aktivointi Ras aloittaa monivaiheinen fosforylaation kaskadin, joka johtaa aktivaatioon MAPK, ERK1 ja ERK2, joka lopulta transkription säätelemiseksi, jotka osallistuvat solujen proliferaation [8]. Toinen tärkeä tavoite EGFR signalointi on fosfatidyyli 3-kinaasi (P13K) ja loppupään proteiini-seriini /treoniinikinaasi Akt. Tämä jälkimmäinen proteiinikinaasi transdusoi molekyyli signaaleja, jotka laukaisevat ratkaiseva vaiheet solujen kasvua ja selviytymistä [8], [9].

Poikkeava aktivointi EGFR ja sen alavirran polut on liitetty useita maligniteettien [10]. N yli-ilmentyminen EGFR HNSCC on liittynyt alhaisempi hoitovaste standardin kemoterapiaa, ja lisääntynyt toistuminen ja kestävyys sädehoitoa [11], [12], [13]. Useat tarkoitettua yhdistettä EGFR tullut menestyksekkäästi kliiniseen käytäntöön syöpälääkkeissä lukien pienet molekyylit, jotka sitoutuvat tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR kuten gefitinibi [14] (AstraZeneca, keuhkosyöpä) ja erlotinibin [15] (OSI /Genentech, keuhko- ja haimasyövän) ja monoklonaalisia vasta-aineita setuksimabin [16] (BMS /Imclone, peräsuolen, keuhkojen ja pään ja kaulan alueen syöpä) ja panitumumabin [17] (Amgen, peräsuolen syöpä), jotka sitovat sen solunulkoisen alueen.

mahdollisuudet EGFR- suunnattu hoito potilailla, joilla on HNSCC on vahvistettu viime tutkimuksissa, joissa potilailla, jotka saivat setuksimabia ja säteily osoitti parempaa eloonjäämistä ja Paikallista valvontaa, toisin kuin sädehoidolle yksinään [16]. Samanlaisia ​​parannuksia havaittiin lisäämällä setuksimabin platinaa perustuvan hoidon EXTREME tutkimuksessa [18]. Kuitenkin lisäykset selviytymisen ja kasvaimen ohjaus johtuvat lisäys setuksimabin näissä tutkimuksissa on kuitenkin vaatimaton, mitataan usein kuukausia tai viikkoja. Tästä syystä tunnistamiseen ennakoivan markkereita parantaa potilaan valinnan sekä kehittää entistä tehokkaampia aineita kohdistaminen tämän tärkeän koulutusjakso ovat välttämättömiä parannetun tulosten HNSCC potilailla.

Yksi syy vastauksena EGFR-suunnattu hoito voi olla alhainen on yhteistyö ja signalointi redundanssia eri jäsenten välillä ErbB- reseptoriperheen [19]. Huolimatta esto jopa korkeimmin ilmaisi perheenjäsen (kuten silloin, kun setuksimabi estää EGFR), lisääntymistä voi jäädä esteettä, koska vaihtoehtoisen signaloinnin muista reseptorit ylläpitää aktivointi yhteiseen alavirran polut yhtyvät ErbB reseptorin perheenjäseniä. Näin ollen, useiden jäsenten ErbB- reseptorin ryhmä on järkevä lähestymistapa, erityisesti potilailla, joiden sairaus on alunperin edennyt tai ovat kehittäneet vastustuskyvyn setuksimabihoito. Tämä käsite on tukea rintasyöpä kokeneiden potilaiden syövän etenemiseen hoidon jälkeen trastutsumabin (Herceptin, Genentech), monoklonaalinen vasta-aine, jonka kohteena on HER2, ovat osoittaneet vastaukset dual EGFR ja HER2 tyrosiinikinaasiestäjä lapatinibi (Tykerb, GSK) [20] .

Dacomitinib (Pfizer) on toisen sukupolven Pan-ErbB estäjä, joka sitoutuu palautumattomasti useat jäsenet hänen perheensä, mukaan lukien erbB-1, erbB-2 ja erbB-4 [21]. Merkittävät in vitro vasteita havaittiin pieninä pitoisuuksina dacomitinib keuhkosyövän solulinjat resistentti gefitinibin [22] ja rintasyövän solulinjoissa kestävät trastutsumabille ja lapatinibille [23]. Klinikalla, vaiheen I annos laajenemisesta tutkimuksessa potilailla, joilla on edennyt pahanlaatuinen kiinteitä kasvaimia osoitti hyvin siedettyjen merkittäviä antituumorivaikutus [24]. Viimeaikaiset faasin I ja II tutkimuksissa pitkälle NSCLC ovat osoittaneet lupaavia kliinisestä tehosta mitattuna taudin vakauttaminen ja parempi ilman taudin etenemistä potilailla, jotka eteni platina hoidon ja olivat aikaisemmin saaneet erlotinibin [25]. Parantuneiden farmakokineettiset ominaisuudet, kuten lisääntynyt hyötyosuus, puoliintumisaika ja alhaisempi puhdistuma verrattuna ensimmäisen sukupolven peruuttamatonta Pan-erbB-inhibiittorit kuten CI-1033, dacomitinib on houkutteleva aine mahdollisten kliiniseen käyttöön HNSCC [21]. Tavoitteena nykyisen oli selvittää in vitro anti-leviämisen vaikutuksia Dacomitinib vuonna HNSCC solulinjoissa. Tämä sisältää mekanismien selvittämisessä, jotka selittävät toimintaa ErB suunnatun hoidon HNSCC solulinjassa malleja sekä benchmarking sen tehokkuutta suhteessa ainoa FDA hyväksyi täsmähoitoihin varten HNSCC hoitoon.

Tulokset

Cell Lines Kestää setuksimabi reagoivat Dacomitinib pieninä pitoisuuksina

paneeli 27 HNSCC solulinjojen mikä anatominen heterogeenisyys taudin käytettiin testaamaan antiproliferatiivisia vaikutuksia dacomitinib (PF-00299804) ja setuksimabi, ainoa FDA hyväksytty täsmähoitoihin in HNSCC. (Taulukko 1).

Dacomitinib esti kasvua kaikkien pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Oli kuitenkin merkittävä heterogeenisyys IC50 g-arvot koko paneelin, jossa on 4 log-kertainen ero herkin ja vähiten herkkä solulinjoissa (kuva 1a). Sulku 1 uM käytettiin ositusta reagoiva solulinjojen perustuu aikaisemmin tehdyssä tutkimuksessa rintasyövän solulinjan paneelista [23]. 17/27 solulinjat määriteltiin dacomitinib reagoiva ja IC 50 oli g pienempi kuin 1 uM. Käsittely 100 ug /ml setuksimabia johti yli 50%: isen inhibition 7/27 solulinjoissa (kuvio 1 b). Vaste solulinjat joko yhdistettä ei korreloinut primaarikasvaimen anatominen päällä.

Solut laskettiin viiden päivän kuluttua hoidon. SE tangot on saatu kokeista toistettiin ainakin kahdesti. A. Dacomitinib IC 50 g-arvot on järjestetty pienimmästä suurimpaan IC50 g loki mittakaavassa. Soluja käsiteltiin pitoisuuksilla 0,001-10 uM. B. prosentuaalinen kasvun esto Setuksimabihoitoa hoitoon. Soluja käsiteltiin kiinteällä annoksella 100 ug /ml. C. Erlotinibi IC 50 g-arvot on järjestetty pienimmästä suurimpaan IC50 g loki mittakaavassa. Soluja käsiteltiin pitoisuuksilla 0,015-10 uM. Punainen osoittaa herkkyys sulku. Sillä dacomitinib ja erlotinibin, herkkyys sulku on asetettu 1 uM, ja setuksimabi se on asetettu 50%.

Lisäksi sama paneeli käytetään arvioitaessa herkkyyttä setuksimabin ja dacomitinib in HNSCC soluissa käytettiin arvioimaan herkkyys erlotinibin, EGFR erityisiä pienimolekyylinen tyrosiinikinaasin estäjä. Vaikka erlotinibi ei ole FDA hyväksyi hoito HNSCC, se on samanlainen luokan täsmähoitoihin kuin dacomitinib. Näin voidaan arvioida, jos ero välillä dacomitinib ja setuksimabi havaittu yllä liittyy farmakologiseen eroja huumeiden luokkien, eli vasta-versus pienmolekyylisalpaaja-, eikä niiden biologinen tavoitteensa me arvioitiin myös herkkyyttä erlotinibin. Vain 25,6% (7 out of 27) HNSCC solulinjat olivat erlotinibin reagoiva ja IC 50 oli alle 1 uM (kuvio 1 C). Tämä nopeus erittäin herkkien solulinjojen (määritellään alueiksi, joilla IC50 alle 1 uM) oli (termi ”vaste” olisi varattava todellinen kliininen tutkimus, jossa käytettiin tavallista täydellinen /osittainen yhteensä tuottaa tämän arvon. Se on spesifinen tämä eikä meidän pitäisi sekoittaa lukijat prekliiniset tutkimukset, ellei se on -tuumoriksenografti tutkimus jne).

Samanlainen että setuksimabin siten, että vain 7 ulos 27 HNSCC solulinjojen oli myös yli 50% esto 100 ug /ml Setuksimabihoitoa. Tämä on jyrkässä ristiriidassa dacomitinib joka saavutti erittäin herkkä osuus 62,9% samalla 1 uM herkkyyttä sulku. Seitsemän HNSCC linjat ovat herkkiä erlotinibi (IC50 1 uM), viisi oli suurempi kuin 50% estäminen hoidon jälkeen 100 ug /ml setuksimabia. Kaksi muuta solulinjat (UMSCC-25 ja UMSCC-38), joka oli IC 50 g 0,367 ja 0,508 uM vastaavasti oli 25,9% ja 41,2% inhibitio 100 ug /ml Setuksimabihoitoa. Oli kaksi solulinjaa, joka oli yli 50% eston jälkeen setuksimabihoidon mutta ei ole vähemmän 1 uM IC 50 g erlotinibin. Solulinjat UMSCC-4 ja Fadu joka oli 75,6% ja 56,4% eston kanssa Setuksimabihoitoa, oli IC 50 g 1,19 ja 1,192 uM vastaavasti hoidon jälkeen erlotinibin. Kaikki seitsemän erlotinibin reagoiva solulinjat olivat myös dacomitinib reagoiva. Lopuista 20 solulinjoissa, 16 oli IC50 g välillä 1 uM ja 10 uM ja 4 solulinjat eivät saavuttaneet IC50 g enintään testattu pitoisuus 10 uM.

HNSCC herkkyys erlotinibille oli samanlainen setuksimabista herkkyyttä niin että vain 25,6% (7/27) paneelin olivat reagoivat erlontinib ja setuksimabi taas 62,9% (17/27 HNSCC oli IC 50 g 1 uM) oli herkkä dacomitinib. Koska setuksimabi on osoittanut kliinistä arvoa ja siten mukaisen hoidon pään ja kaulan syöpä, loput Vertailu tehtiin dacomitinib ja setuksimabi.

Yhteinen onkogeenimutaatiot ja Amplifikaatiot ovat harvinaisia ​​HNSCC ja eivät korreloi herkkyys Setuksimabia eikä Dacomitinib

Mutaatiot EGFR, K-Ras ja PI3K on osoitettu vaikuttavan vastauksena kohdennettuja hoitomuotojen [4], [26]. Nämä mutaatiot eivät ole runsaasti pään ja kaulan kasvainten näytteitä [27], [28]. Halusimme arvioida, 1) meidän solulinja paneelissa oli heijastavat samaa suuntausta ja 2) jos mutaatioita geeneistä liittyi herkkyys setuksimabin ja dacomitinib. Me tehdään mutaatio analyysiä paneelin pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja käytetään leviämisen analyysiin ja totesi, että mutaatiot olivat harvinaisia ​​ja ei voitu käyttää selittämään herkkyys setuksimabi ja dacomitinib (taulukko 1). Yksikään solulinjoista tunsivat EGFR mutaatiot eksoneissa 19 eikä 21. Vain CAL-33-solulinja osoitti mutaation eksonit 9 tai 20 PI3K (heterotsygoottinen H1047R mutantti) ja vain UMSCC-74A osoitti KRAS-mutaatio (heterotsygoottinen G12D mutantti). Molemmat näistä solulinjoista oli pienempi herkkyys dacomitinib vaikka CAL33 oli jonkin verran herkkä setuksimabi.

monistaminen reseptorityrosiinikinaasien on yhdistetty herkkyyteen hoitojen kohdistettu näihin reseptoreihin [29]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet jopa 20%: HNSCC ovat EGFR täydennetty, mutta ennustetyöväline ja ennustearvo tämä poikkeavuus on sekoitettu [30]. Teimme FISH analysoitaviksi kopiomäärän EGFR 19 ulos 27 solulinjoissa. Yksikään solulinjoista monistettiin EGFR ja vain 4/19 solulinjoja (UMSCC-5, UMSCC-11A, CAL-27 ja CAL-33) osoitti, lisääntynyt kopiomäärä EGFR (taulukko 1). Mielenkiintoista, lisääntynyt kopiomäärä EGFR ei liittynyt herkkyys dacomitinib; yksi herkkyyden linjat (CAL-27) ja yksi resistenttien linjojen (CAL-33) olivat neljä riviä voittoja EGFR.

Baseline Fosfory- ja Total EGFR tasot ja ilman EGF Atimulation korreloi Herkkyys EGFR-suunnatun Therapy

arvioimiseksi, missä määrin dacomitinib ja setuksimabi lohko EGFR signalointi pään ja kaulan alueen syövän solulinjoissa ja varmistaa jos sen tehokkuutta estämällä EGFR liittyy niiden kyvystä estää kasvua, teimme Western blot-analyysi arvioida proteiinin tasoja ja fosforylaatio asema avaimen molekyylien EGFR-signalointireitin.

suoritettiin Western blot-analyysi osajoukon solulinjojen tyypillinen ero vaste dacomitinib hoitoon. Neljä riviä valittiin herkin ryhmä (IC 50 10 nM), kolme riviä kohtalainen ryhmä (1 uM IC50 10 nM) ja kolme riviä kestävä ryhmä (IC50 1 uM). Keskimääräinen dacomitinib IC50 g valitun solulinjojen kussakin ryhmässä näytetään kuviossa 2. Soluja käsiteltiin joko 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia sekä EGF-stimuloidun ja stimuloimattomiin toteaa. Sekä koko ja fosforyloidun EGFR (tEGFR ja pEGFR) proteiinin tasot arvioitiin (kuva 3a). Yhteensä EGFR taso liittyi herkkyys dacomitinib; kolme neljästä rivit erittäin herkkä ryhmä oli korkeimmat fosforyloidun ja koko EGFR joukossa kymmenen riviä valittu, kun taas kolme kestävät riviä kollektiivisesti oli alhaisin (kuva 3a). Solulinjat kohtalainen ryhmässä oli väliportaan fosforyloidun ja koko EGFR. Vertailla pEGFR tasojen herkkä, kohtalainen ja kestävä ryhmiä, Western blot kuvat kvantifioitiin ja keskimääräinen taso pEGR kunkin herkkyys ryhmässä laskettiin ja normalisoida. Hoito joko yhdisteen merkittävästi estänyt tasot EGF-stimuloidun pEGFR on erittäin herkkä ja kohtalainen ryhmiä, mutta ei vastustuskykyisten ryhmässä (kuva 3b).

neljä solulinjat valitaan erityisen herkkä ryhmä (IC 50 g 10 nM), joista kolme oli kohtalainen ryhmästä (IC 50 G10 nM – 1 uM) ja kolme resistenttien ryhmästä (IC 50 g 1 uM). Nämä kymmenen riviä käytetään Western blot ja virtaussytometria kokeissa. Keskimääräinen IC 50 g valitun herkkä linjat on 5 nM; kohtalainen 75 nM; resistenttejä 2186 nM.

Soluja viljeltiin kirjautua-vaihe ja käsiteltiin 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia 1 tunti, hoitoa tai 10 ng /ml rekombinanttia EGF-ligandi. Solut lysaatit kerättiin sitten, ja proteiini erotettiin käyttäen Western blot-analyysi. B. Western blot kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Proteiini tasot kvantitoitiin kunkin solulinjan ja laskettiin keskiarvot ryhmittäin. Fosforyloituu EGFR normalisoitiin yhteensä EGFR. *. p 0,05, Studentin t-testi.

hoito kummallakaan lääkkeellä ei vähentänyt yhteensä EGFR tasoa (kuva 3a). Oli kuitenkin merkittävä vähentäminen yhteensä EGFR kontrolliryhmässä solujen EGF stimulaatiota. On tunnettua, että EGFR hintoihin, ja usein hajoavat stimulaation jälkeen EGF: n tai muut ligandit, jotka voivat selittää havainnon [31]. Lisäämällä joko huumeiden kuitenkin romutettu tätä vaikutusta, mikä lisää näyttöä siitä, että yhdisteitä, jotka sitoutuvat EGFR voi inhiboimaan ja hajoamista.

Dacomitinib mutta ei setuksimabi estää EGF stimuloidun EGFR Loppupään Pathways

PI3K- AKT-mTOR ja Ras-Raf-MAPK signalointireitteihin ovat alavirtaan efektoreja EGFR signalointi [8]. Halusimme arvioida vaikutuksia dacomitinib ja setuksimabi näitä reittejä. Ensin arvioitiin proteiinin tasot koko AKT (Takt) ja fosforyloitu AKT (Pakt) käsittelemällä joko dacomitinib tai setuksimabi. Vuonna ohjaus olosuhteissa, ei Pakt eikä TAKT tasot liittyivät herkkyys (kuvio 4A) joko lähtötilanteessa tai EGF stimuloi kunnossa. EGF stimulaatio huomattavasti Pakt kaikissa solulinjoissa.

Soluja viljeltiin kirjautua-vaihe ja käsiteltiin 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia 1 tunti, hoitoa tai 10 ng /ml rekombinanttia EGF ligandi. Solut lysaatit kerättiin sitten, ja proteiini erottaa käyttämällä Western blot -analyysiä. B. Western blot kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Proteiini tasot kvantitoitiin kunkin solulinjan ja laskettiin keskiarvot ryhmittäin. Fosforyloituu AKT normalisoitiin koko AKT: tä. *. p 0,05, Studentin t-testi.

Dacomitinib vähennetään Pakt tasoa kaikissa seitsemässä solulinjoissa arkojen ja maltillinen ryhmää ja yksi solulinja on resistentti ryhmässä (UMSCC-1) sekä lähtötilanteesta EGF stimuloi olosuhteissa (kuvio 4A). Dacomitinib pystyi vähentämään Pakt tasolle kestävä solulinjassa UMSCC-17B EGR stimuloiduissa olosuhteissa vain. Vuonna resistentti solulinja (UMSCC-74A) Pakt tasot hieman vähennetty EGR kannustanut kunnossa. Setuksimabihoitoa oli vähemmän voimakas vähentäminen Pakt. Setuksimabihoidon aiheuttama vähennys Pakt vain viidessä kymmenestä solulinjojen (2/4 herkkä linjat, 3/3 kohtalainen linjat ja 0/3 kestävä linjat), ja taso vähennys oli huomattavasti vähemmän kuin aiheuttama käsittelemällä dacomitinib riippumatta EGF stimulaation (kuvio 4a).

Kuten EGFR, Western blotit määrällisesti ja ryhmä tiettyjen tasojen Pakt normalisoi TAKT määritettiin ja verrattiin (kuvio 4b). Ilman EGF stimulaatiota, sekä yhdisteet vähensi Pakt tasoilla erittäin herkkä ryhmä eikä kohtalainen tai resistenttejä ryhmiä. EGF stimuloi olosuhteissa, dacomitinib pystyi vähentämään Pakt tasolla kaikissa kolmessa ryhmässä. Kaikilla testatuilla skenaarioissa, dacomitinib aiheutti suurempia vähennyksiä Pakt tasoilla kuin setuksimabi.

aktivointi Ras EGFR signalointi aloittaa monivaiheinen fosforylaation kaskadin, joka johtaa aktivaatioon MAPK, ERK1 ja ERK2, ja lopulta säätelee geenien transkriptiota osallisena solujen lisääntymisen. Yhteensä ja fosforyloitu ERK (ERK1 ja 2) proteiini (Terk ja Perk) tasot analysoitiin käsittelemällä joko dacomitinib tai setuksimabi. Vuonna ohjaus olosuhteissa Terk ja Perk proteiinin tasot olivat alemmat erittäin herkkä ryhmä ja suurempi resistenttien ryhmässä (kuva 5a ja 5b) riippumatta EGF stimulaatiota. Hoito joko yhdisteen merkitsevästi alhaisempia lisäansiot seitsemän solulinjojen erittäin herkkä ja maltillinen ryhmiä, ja vain 1 (UMSCC-1) kolmesta solulinjojen resistenttien ryhmän perustilaan (kuva 5a). Stimuloitaessa EGF, Perk tasoa merkittävästi nousseet kaikissa solulinjoissa. Tämän ehdon Dacomitinib edelleen tukossa fosforylaatiota ERK tasoa kaikissa seitsemässä solulinjoissa arkojen ja maltillinen ryhmä. Vähentämisen lisäksi lisäansiot tasoilla kestävä linja UMSCC-1, alle EGF stimuloi edellytyksellä, dacomitinib myös vähensi lisäansiot tasoilla kestävä linja UMSCC-74A. Setuksimabi pystyi vähentämään Perk tasolle haavoittuvalla (SCC-9), yksi kohtalainen (Fadu) ja yksi resistenttejä (UMSCC-74A) linja. Kaikissa skenaarioissa, dacomitinib aiheutti suurempia vähennyksiä Perk tasolla kuin setuksimabi.

Soluja viljeltiin kirjautua-vaihe ja käsiteltiin 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia 1 tunti, tai ilman hoitoa 10 ng /ml rekombinanttia EGF-ligandi. Solut lysaatit kerättiin sitten, ja proteiini erottaa käyttämällä Western blot -analyysiä. B. Western blot kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Proteiini tasot kvantitoitiin kunkin solulinjan ja laskettiin keskiarvot ryhmittäin. Fosforyloituu ERK normalisoitiin yhteensä ERK. *. p 0,05, **. p 0,01, Studentin t-testi.

Western blotit määrällisesti ja ryhmä tiettyjen tasojen lisäansiot normalisoi Terk määritettiin ja verrattiin (kuvio 5b). Ilman EGF stimulaatiota, sekä yhdisteet vähensi lisäansiot tasoilla erittäin herkkä ryhmä ja maltillinen ryhmiä, mutta ei kestä ryhmä. Vuonna EGF stimuloi olosuhteissa vain dacomitinib pystyi vähentämään Perk tasolle. Kaikilla testatuilla skenaarioissa dacomitinib aiheutti suurempia vähennyksiä Perk tasolla kuin setuksimabi.

Dacomitinib Syyt Suurempi G0 /G1 pidätys kuin Setuksimabia

Dacomitinib ja setuksimabi voi olla antiproliferatiivinen aktiivisuus indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin . Sama kymmenen solulinjat valitaan Western blot analyysit, jotka edustavat vaihtelee proliferaatiovasteet kahta yhdistettä, käytettiin analysoimaan vaikutuksia solukierron ja apoptoosin.

Dacomitinib aiheutti suuremman solusyklin pysähtymisen kuin setuksimabi. Hoidon jälkeen 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia viiden päivän ajan, oli merkittävä kasvu prosentteina solujen G0 /G1 vaihe herkkä ja kohtalainen ryhmien dacomitinib mutta ei setuksimabin kontrolliin verrattuna (kuvio 6a ). Vaikka setuksimabi teki aiheuttaa G0 /G1 pidätys, tämä vaikutus ei ollut merkittävä verrattuna kontrolliin ja huomattavasti alhaisempi kuin vaikutus dacomitinib sekä herkkä ja maltillinen ryhmiä. Siellä oli alle viisi prosenttia lasku S-vaiheen kaikki edellytykset lukuun ottamatta dacomitinib käsitellylle maltillinen ryhmä, joka oli merkittävä vähennys (kuva 6b). Yleinen suuntaus vaikutukset S-vaiheeseen jäljitteli vaikutukset G0 /G1 vaiheeseen. Johdonmukaisesti, dacomitinib hoito herkän ja maltillinen ryhmien aiheutti suuremman laskun G2 kuin Setuksimabihoitoa (kuva 6c).

Soluja käsiteltiin 100 nM dacomitinib tai 100 ug /ml setuksimabia viisi päivää ennen analyysia virtauksen cytometry. Näytetyt tiedot keskimääräinen prosenttiosuus ryhmän solujen toimeksiannot Kuva 2. A. Muutos prosentteina solujen G0 /G1 vaiheeseen. B. Muutos prosentteina solujen S-vaiheessa. C. Muutos prosentteina solujen G2 vaiheessa. *. p 0,05, Studentin t-testi.

Dacomitinib oli yhtä tehokas kuin setuksimabi indusoimaan apoptoosin. Herkällä ja kohtalainen ryhmät, molemmat yhdisteet vähentänyt solujen prosenttiosuus, jotka asuivat (kuvio 7A). Oli samanaikainen kasvu solujen prosenttiosuus, jotka olivat aikaisin tai myöhään apoptoottiset tilassa (kuvio 7B, kuvio 7C). Alle 6% soluista oli kuollut missään kokeissa (kuvio 7D). Kumpikaan lääke aiheutti merkittävää apoptoosin kestävä ryhmässä. Ei ollut merkittävää eroa yhdisteet apoptoosin.

. Muutokset% elävien solujen. B. muutoksia solujen alussa apoptoosin. C. Muutokset soluissa lopulla apoptoosin. D. Muutokset% kuolleita soluja.

Dacomitinib on tehokkaampi estäminen EGFR Signaling kuin pienimolekyylinen tyrosiinikinaasi-inhibiittori Erlotinibi

Kuten edellä todettiin, vastauksena erittäin spesifisiä EGFR-suunnatun hoito voi olla pieni, koska siellä ehkä yhteistyö ja signalointi redundanssia eri jäsenten välillä ErbB- reseptoriperheen. Niinpä arvioi dacomitinib, joka on panHER estäjä laajan spesifisyyden paneelissa 27 HNSCC ja osoitti HNSCC solulinjat ovat herkempiä sen kuin pieni molekyyli anti-EGFR tyrosiinikinaasiestäjä erlotinibin ja anti-EGFR-vasta-aine setuksimabi lisääntymismäärityksissä (katso kuvio 1), ja käyttäen osajoukko kymmenen solulinjojen osoitimme, että dacomitinib oli tehokkaampi on estää EGFR signalointi kuin setuksimabi. Luonnehdinta dacomitinib tehtiin verrattuna setuksimabi, ainoa FDA hyväksyi anti-EGFR-aine hoidossa HNSCC. Kuitenkin, erlotinibi ja dacomitinib ovat pienmolekyylisalpaajien toisin setuksimabi, joka on vasta-aine, ja siten erlotinibin kyky estää EGFR signalointi määritettiin käyttämällä Western-blottauksella.

kolme solulinjat, jotka edustavat kolmea luokkaa herkkyys on kuvattu aiemmin tarkasteltiin . Vuonna herkkä viiva HN5 dacomitinib oli tehokkaampi estäminen EGFR signalointi kuin joko setuksimabi tai erlotinibi (kuvio 8A). Vain HN5-soluja käsiteltiin 100 nM dacomitinib oli huomattavasti alhaisempi tai pEGFR verrattuna kontrolliin. EGFR signaloinnin kohtalaisen herkkä viiva, UMSCC-38 ja UMSCC-17B oli alhainen.

Soluja viljeltiin kirjautua-vaihe ja käsiteltiin 100 nM dacomitinib, 100 nM erlotinibi tai 100 ug /ml setuksimabia yksi tunti . Solut lysaatit kerättiin sitten, ja proteiini erottaa käyttämällä Western blot -analyysiä. B. Western blot kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Proteiini tasot kvantitoitiin kunkin solulinjan. Fosforyloidun ERK ja AKT normalisoituivat alfa tubuliinin ja esitetään%: n ohjaus.

Lisää merkittäviä muutoksia havaittiin vuonna alavirtaan PI3K-AKT-mTOR ja Ras-Raf-MAPK-reitin, kuten dacomitinib oli merkittävästi tehokkaampi estämään sekä fosforylaation AKT ja ERK (kuvio 8A). Western blotit määrällisesti ja Pakt ja Perk tasot esitettiin prosentteina vertailusta normalisoinnin jälkeen alfa tubuliinin kontrolloida koko proteiinia (kuvio 8B). HN5 käsitelty solu 100 nM Erlotinibin oli kaksi kertaa niin paljon Pakt kuin käsiteltiin 100 nM dacomitinib. UMSCC-38 solujen käsiteltiin 100 nM erlotinibin oli 17 kertaa enemmän Pakt kuin käsitelty saman pitoisuuden dacomitinib. Samoin, vaikka kaikki kolme lääkkeet olivat tehokkaita estävän phospho ERK on herkkä viiva HN5, UMSCC-38 käsiteltiin 100 nM erlotinibin oli 4 kertaa enemmän Perk signaali kuin UMSCC-38 soluja käsiteltiin samalla pitoisuus dacomitinib. Erlotinibi oli vähemmän tehokas estämään sekä phospho ERK ja AKT että UMSCC-38 verrattuna setuksimabia ja dacomitinib. Vuonna kestävä linja UMSCC-17B, ei erlotinibi eikä dacomitinib ollut merkittävää vaikutusta Pakt mutta dacomitinib oli tehokkaampi estäminen Perk tasolla kuin erlotinibi (kuvio 8B).

arvioimiseksi jos annoksen riippuvuutta saatetaan nähdä käyttämällä korkeampi pitoisuus dacomitinib (1 uM) testattiin estää ERK ja AKT välittämän signaloinnin resistenttiä linjaa, UMSCC-17B. Verrattuna 100 nM hoitoon, UMSCC-17B solut käsiteltiin 1 uM dacomitinib oli 25% vähennys Pakt ja 21% pienempi Perk (kuvio 8A ja 8B).

Keskustelu

peruuttamaton pan-ErbB estäjä dacomitinib on parhaillaan vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa hoitoon potilailla, joilla on keuhkosyöpä ja on osoittanut lupaavia aktiivisuutta hoidettaessa tämän maligniteetti (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01000025). Olemme vertasi vaikutuksia dacomitinib Setuksimabihoitoa, EGFR estäjä, joka on tällä hetkellä ainoa FDA-hyväksyttyjä täsmähoitoihin varten HNSCC hoitoon ja erlotinibille pienimolekyylinen EGFR estäjä ei vielä FDA hyväksytty HNSCC. Tulosten mukaan hoito yleiseurooppalainen HER estäjä kuten dacomitinib on tehokkaampaa kuin käyttämällä EGFR erityinen inhibiittorit setuksimabi ja erlotinibin.

Meidän tuloksemme osoittavat tehokkuutta dacomitinib vuonna kumoamisesta kasvun HNSCC solulinjojen in vitro. Tuloksemme osoittavat, että solulinjat, joilla dramaattinen kasvun esto Setuksimabihoitoa myös näytteillä merkittävän kasvun eston kanssa dacomitinib, mikä osoittaa, ainakin, ettei huonompi dacomitinib verrattuna setuksimabia. Kliinistä merkitystä on, että 3/27 solulinjat, 11% paneelin, kokenut yli 90% kasvun esto Setuksimabihoitoa, joka muistuttaa kliinisen havainto 10% vaste saavilla potilailla setuksimabihoito. Nämä kolme solulinjat olivat erityisen herkkä dacomitinib sekä IC 50 g-arvot alle 10 nM. Jos tämä prekliinisissä huomio pitää kliinisesti, olisimme ennustaa ne potilaat, jotka reagoivat setuksimabista myös vastata dacomitinib.