Krooninen sairaus

tiivistelmä

konneksiinit (Cx), jotka muodostavat aukkoliitos solujen väliset kanavat selkärankaisilla, on osoitettu tukahduttaa transformoidun solun kasvun ja kasvaimen kehittymisen, mutta mekanismi (t) ovat edelleen suurelta osin spekulatiivisia. Tässä me määrittelemme molekyylitasolla, jolla Cx26, mutta harvemmin Cx43 tai Cx32, selektiivisesti antaa kasvun hidastuminen syöpäsoluihin. Toiminnallinen solujen välinen kytkentä on osoitettu olevan tarpeen, tuottaa osittain estää solusyklin johtuu pitkäaikaisesta aktivoinnin useita mitogeenisesta kinaasien. PKA on sekä välttämätöntä että riittävää, että Cx26 aiheuttama kasvun estäminen matalan seerumin ja puuttuminen ankkurointi. Aktivointi PKA ei liittynyt kohonnut cAMP tasoja, mutta näyttivät johtuvan uusjakoon cAMP koko solupopulaation, poistamalla solusyklin heilahtelut cAMP tarvitaan tehokasta solusyklin etenemisen. Cx43 ja Cx32 eivät välittää tämän uudelleenjako, toisin kuin Cx26, nämä kanavat ovat suljettuja aikana G2 /M-vaiheen solusyklin kun cAMP-pitoisuus. Vertailut Tuumorisolulinjojen osoittavat, että tämä on yleinen malli, jossa kasvun hidastuminen mukaan konneksiinit esiintyvät aina cAMP heilahtelee solusyklin ja aukkoliitos avoinna koko solusyklin. Täten aukko junktionaalinen kytkentä, ilman ulkopuolisia signaaleja, tarjoaa yleiset keinot rajoittaa mitoosinopeudella solupopulaatioiden.

Citation: Chandrasekharin A, Kalmykov EA, Polusani SR, Mathis SA, Zucker SN, Nicholson BJ (2013) Intercellular uudelleenjako cAMP taustalla selektiivinen esto syöpäsolun kasvuun Connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10,1371 /journal.pone.0082335

Toimittaja: David M. Ojcius, University of California Merced, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2013; Hyväksytty: 30 lokakuu 2013; Julkaistu: 3. joulukuuta 2013

Copyright: © 2013 Chandrasekharin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat seuraavasti: NIH – R01 CA048049, P30 CA54174, P01 AG19316, ja P30 AG013319. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Gap risteykset ovat ryhmät solujen väliset kanavat, jotka ovat ainoat välittäjiä suoraan solujen välisen vaihdon pienten aineenvaihduntatuotteiden ja signalointi molekyylien monisoluisten järjestelmissä [1,2]. Selkärankaisissa, nämä kanavat koostuvat kiinteästi kalvon proteiineja, joita kutsutaan konneksiinit (Cx), jossa on neljä transmembraanidomeenien ja sytoplasminen N- ja C–termini. Kuusi konneksiinit tulevat yhdessä muodostamaan hemichannel tai connexon, ja kaksi tällaista hemichannels vastustamasta soluista telakka luoda solujen väliseen aukkoliitos kanava [3]. Integraali, mutta erikoistunut rooli aukkoliitokset vaihteli kudoksissa helpottaa läsnäolo vähintään 21 eri konneksiini isoformia ihmisissä, erottuva proteiineja, jotka luokitellaan niiden molekyylipainon [4], ja geeni nimikkeistön kuvattu [5 ]. Cx43, Cx32 ja Cx26 proteiinit tutkittiin tässä koodaa

GJA1

,

GJB1

ja

GJB2

geenien, vastaavasti.

Lähes koska niiden löytö, aukkoliitokset ovat sekaantuneet kuten tuumorisuppressoreilla useissa kudoksissa [6]. Tämä on vahvistettu geneettinen näytöt lukuisia kasvain muodoissaan, mukaan lukien rintasyöpä [7], eturauhassyöpä [8], ja melanooma [9]. Lukuisia kasvaintyypeissä ja transformoitujen solulinjojen, osoittavat laski konneksiini proteiinin ilmentymisen ja /tai aukkoliitos toiminnallisuus (tarkistetaan 10). Lisäksi on olemassa useita dokumentoituja tapauksia, joissa eksogeeninen ekspressio konneksiinit transformoidussa solulinjassa voi merkittävästi estää sen transformoitu ominaisuuksia ja sen kyky muodostaa kasvaimia paljaissa hiirissä [Cx43 C6-glioomasoluissa [11]; Cx43 in 10T1 /2 alkion mesenkyymisolujen [12]; Cx43 ja Cx32 LNCaP eturauhassyövän solut [13]; Cx26 HeLa kohdunkaulan syöpäsolut [14]; Cx26 ja Cx43 MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen [15,16], ja; Cx32 in SKHep1 hepatoomasolujen [17]. Jälkimmäinen on myös johdonmukainen lisääntyminen maksan kasvainten synnyssä havaittu Cx32 – /- hiirissä [8,18].

kasvu tukahduttaminen transformoituneiden solujen Cx ilmaisu on yhdistetty sääntelyyn pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit (esim Bcl-2) [19,20], tai muutokset solusyklin proteiineja, kuten marraskuu (CCN3) [21], Skp2 [22] ja p21 [23,24]. Kuitenkin saataisiin aikaan suora yhteys tahansa näistä tapahtumista ja vaihtoa signalointimolekyylien solujen välillä kautta aukkoliitokset on osoittautunut vaikeasti. Edistymisestä tässä suhteessa on rajoittanut rajoitetusti tietoa sekä päisevyysominaisuuksiin konneksiinit sekä ajallisesti ja jakelu pienimolekyylipainoisen metaboliitin pitoisuutta monisoluisten populaatioissa. Joissakin tapauksissa konneksiinit on ehdotettu tukahduttaa kasvun jopa ilman osoitettavissa aukkoliitos kanavan aktiivisuutta [15,21,24,25,]. Tämä voisi tapahtua vuorovaikutuksia muiden proteiinien tiedetään sitoutuvan konneksiinit (katsaus [26]) välityksellä toimivat hemichannels, jotka voivat edistää solukuolemaa [27], tai jopa läpi mis-lokalisoinnin osien proteiinin ( 25). Kuitenkin lopullinen yhteyksiä tahansa näistä prosesseista ja anti-onkogeenisen tekijöitä vielä laadittu.

Vaikka rooli solun kytkennän, verrattuna muihin konneksiini toimintoja, on yhä aihe keskustelua tuumorisuppressiogeeneksi, linkki välillä aukkoliitos kytkimen ja mitogeneesiä on perustettu useita ei-patogeeninen olosuhteissa. Useat kasvutekijät, kuten EGF: n [28] ja PDGF [12] on osoitettu aiheuttavan ohimeneviä irrottamisen solujen osana välitön varhainen vaste, joka edeltää aloittamisen mitoosin. Onkogeenit kuten

v-src

on osoitettu olevan samanlaisia, mutta pitempään kestävä vaikutus kytkimen [29].

In vivo

, osana regeneratiivisen vasteen seuraavaa osittaista hepatektomiaa, akuutti menetys aukkoliitokset välillä hepatosyyttien nähdään välittömästi ennen ensimmäisen aallon mitoosin [30]. Kuten on käynyt kasvaimissa, molekyyli perusteella mitogeenisen esto liittyy solujen kytkentä on vielä ratkaistava. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittelemään molekyylimekanismin kasvun tukahduttaminen konneksiinit HeLa-soluissa, erittäin hyvin tunnettu transformoitu kohdunkaulan syövän solulinja, ja testata yleistys tällaisten mekanismien muiden solutyyppien. Tuloksemme osoittavat, että Cx26 nimenomaan mahdollistaa kulun cAMP solujen välillä, tasoittaa huiput ja kaukalot cAMP jotka tapahtuvat solusyklin aikana ja kautta PKA aktivointi, mikä viivästyttää solusyklin. Vaikutus on konneksiini erityinen, koska muut konneksiinit, kuten Cx43 ja 32, lähellä solusyklin aikana juuri silloin, kun cAMP-tasojen kerääntyä. Tutkiminen useiden kasvainsolulinjojen ilmaisee yleisyyttä tätä niin kauan kuin cAMP heilahtelut ovat nähneet ja kanavat avoinna koko solusyklin.

Tulokset

Cx26, mutta ei Cx32 tai 43, inhiboivat transformoitu kasvu HeLa-solujen

HeLa-solut ovat yleisesti tutkittu kohdunkaulan syövän solulinja, joista puuttuu endogeeninen aukkoliitokset, mutta sallivat vankka ilme, sopiva kaupan ja jalostuksen ulkoisesti ilmaistaan ​​konneksiinit. Olemme käyttää tätä järjestelmää kuvaamaan konneksiini kasvua ominaisuudet valmistamalla yhdistettiin klooneja ilmentävien HeLa-solujen Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32), ja Cx26 (HeLa26). Kukin HeLa transfektanttien ilmaista konneksiinit samalla tasolla, ja mukaan ennustetun MW Western blot (kuvio S1). Ne muodostavat tyypillinen aukkoliitos plakkien solu-solu-liitäntä (kuvio 1A), ja osoittaa samaa vauhtia siirron valmiiksi ladattu Kalseiiniväriä ympäröiviin merkitsemätön soluja, jossa ~ 95% ladattu soluista on kytketty ainakin yksi naapuri, ja 73-83% ensimmäisen kertaluvun naapureita vastaanottaa väriainetta (taulukko 1).

(A) Immunofluoresenssivärjäystä käyttäen sopivia anti-Cx-vasta, esiintyy ominaiset ilmentymistä konneksiinit vuonna plakkien solujen välillä. HeLaPar testattu negatiivinen kaikkien kolmen anti-Cx-aineita (anti-Cx26 vasta-tulokset on esitetty tässä) (asteikko baaria, 10 pm).

(B) kasvu HeLaPar (neliöt) kanssa altaat HeLa kloonien transfektoitu Cx26 (ympyrät), Cx32 (käännetyn kolmion) tai Cx43 (pystyssä kolmio), saatettiin 3 päivää seerumistarvaatio (päivinä 0-3) ja sen jälkeen 3 päivänä 1% seerumia (päivät 3-6), paljastaa selektiivinen kasvu tukahduttaminen Cx26. Edustavat tiedot yksi kolmesta kokeesta, pistein edustavat keskiarvoa ± SEM kolminkertaisten maljauksessa.

(C) Topologia kaavio Cx26, jossa solunulkoinen pinta yläosassa, kuvaa sijainti kahden pisteen mutantteja käytettiin tässä tutkimuksessa, jotka haittaavat eri näkökohtia kanavan toiminto (R75Y ja T135A).

(D) Immunoflourescence värjäystä anti-Cx26-vasta-aine osoittaa, että sekä mutantti konneksiinit muodossa plakkeja solun pinnalla, jossa R75Y ottaa hieman pienempi, harvemmin laattoja, ja T135A, joilla on suuremmat ja useammin plakkeja kuin villityyppisen Cx26 (paneeli A) (asteikko baaria, 10 um).

(E) Hemichannel funktio määritettiin LY värin sisäänottoa väriaine pudottamalla määritys (Scout et al., 2002). Vasemmassa paneelissa näkyy faasikontrastikuvassa (Tähdet osoittavat solujen aloittamisesta väriaine) ja oikea paneeli esittää fluoresoiva kuva (asteikko baaria, 20 gm). Huomaa, että jotkut väriaine-positiiviset solut näyttävät olevan saaneet väriaineen läpi solujen väliset siirto alkuperäisestä solusta, joka otti väriaineen HeLa26 kulttuureissa.

(F) vertailu kasvu matalan seerumin (vrt paneeli B) mutantti Cx26 ilmentävien solujen (Cx26T135A – timantit, Cx26R75Y – kolmiot) kanssa ilmentävät p- HeLa26 (ympyrät) ja HeLaPar solut (neliöt), osoittaa, että funktionaalinen solujen välinen kanavien villityypistä Cx26 tarvitaan kasvun hidastuminen. Edustavat tiedot yksi kolmesta kokeesta, pistein edustavat keskiarvoa ± SEM kolminkertaisten maljauksessa.

Gap Junction

Hemichannel

HeLa Cell Type

% Yhdessä

% ensimmäisen kertaluvun

b Kytkimen

% Cells täyttö Solunulkoisilla Dye

c

Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 10.43NTCx 3296 ± 2,0180 ± 9.53NTCx 2693 ± 0,6783 ± 8,283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Toiminnallinen analyysi Gap risteykset ja Hemichannels.

a prosenttiosuus esiasennettu solujen kulkee väriaineen ainakin yhden vastaanottimen solu.

b prosenttiosuuden ensimmäisen kertaluvun soluja (eli heti vieressä luovuttajan solu) vastaanottaa väriainetta jälkeen 6 tuntia pinnoitus.

c solujen prosenttiosuus osoittaa väriaineen oton Lucifer Yellow (LY) (katso kuva 1 E). Tulokset eivät sisällä soluja saaneen LY toissijaisesti kautta kytkimen (ts Cx26) .NT: Ei testattu CSV Lataa CSV

Vaikutus konneksiini ilmaisun muuttumisiin kasvuominaisuudet HeLa-solujen arvioitiin matalan (1%) seerumin oloissa ja poly (2-hydroksietyylimetakrylaatti) (polyHEMA) päällystetyillä levyillä, jotka eivät tue solu-substraatti-adheesio [31]. Huolimatta samantasoista kytkimen kaikissa konneksiini transfektanteissa, huomasimme, että vain HeLa26 osoitti kasvun hidastumisen, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten (Mesnil et al., 1995). HeLa26 näyttää 3-kertainen enää kaksinkertaistaa kertaa matalan seerumin olosuhteissa (kuvio 1 B), ja ≥2 kertaa hitaampi ankkurointi riippumatonta kasvua (kuva S2) verrattuna vanhempien HeLa-soluja (HeLa Par) tai muu konneksiini transfektantit, kuten on osoitettu kolmessa riippumattomassa HeLa26 klooneja. Kaikki tiedot esitetään tässä saatiin altaat klooneja sekoitettu samassa suhteessa kutakin koetta varten.

Intercellular viestintä Cx26 on tarpeen kasvun hidastuminen

tietty toiminto Cx26 vastaavan kasvun hidastuminen arvioitiin käyttäen Cx26 pistemutaatioita että ablatoitu kanava toiminto. Cx26T135A mutaatio sytoplasmisen lopussa kolmannen transmembraanidomeeni (kuvio 1 C) estää avaamisen joko aukkoliitos kanavia tai hemichannels [32]. Cx26R75Y mutaatio ensimmäisen solunulkoisen silmukan (kuvio 1 C) estää aukkoliitos kanavan muodostumiseen, mutta jättää hemichannel toimivat pääosin ennallaan [33]. Aukkoliitos ja hemichannel ominaisuudet kaikki Cx26 rakentaa sekä Cx43 ja 32, varmistettiin käyttäen Lucifer Yellow kuljetus soluihin, tai ottoa median mekaanisen stimulaation (kuvio 1 E), vastaavasti (yhteenveto). Molemmat Cx26 mutantteja muodosta plakkeja HeLa-soluissa (kuvio 1 D), joka osoittaa, että nämä mutaatiot edelleen tukea kokoonpano aukkoliitos rakenteita [32]. Plakit näytti olevan lukuisia, kun on kyse HeLa26T135A, ja pienempi, kun kyseessä on HeLa26R75Y (vrt kuviot 1A ja D), mikä on yhdenmukaista aiempien viitteitä siitä, että Cx26R75Y voi vähentää stabiilisuutta ja koko aukkoliitos plakkien [34].

Toisin kuin villityypin (villi- tyyppisen) Cx26, kumpikaan Cx26-mutanttien aiheuttamaa kasvua vaimentava HeLa-soluja, joko alhaisen seerumin (kuvio 1F), tai alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa (kuvio S2). Siten solujen välisen viestinnän tarvitaan kasvun hidastuminen mukaan Cx26. Vaikka hemichannel funktio HeLa26R75Y teki vähentää kyllästystiheyden, mikä viittaa osittaiseen rooli hemichannels suuntaa solun pakkaus, vaikutus oli kohtalainen 20%, verrattuna villityy- pin Cx26, joka vähentää kyllästystiheyden 60%. Vaikka solujen välinen kytkentä on selvästi tarpeen konneksiini välittämää käänteinen transformoitujen kasvuominaisuudet, kytkentä muilla konneksiinit (Cx43 ja Cx32) oli tehoton, mikä osoittaa ainutlaatuinen rooli Cx26 kanavia.

Kasvu vaikutukset Cx26 aukkoliitokset välittyvät palautuva solusyklin lohkot

Ensimmäisessä vaiheessa tunnistamaan mekanismin, jonka Cx26 aukkoliitos kytkentä tukahduttaa muuttaneet kasvun HeLa-solujen, kysyimme tätä oli seurauksena lisääntynyt solukuolema tai vähentää solujen jakautumista. HeLa26 solut osoittivat ei lisätä TUNEL värjäys tai kaspaasi-3: n aktiivisuuden (ei esitetty), mikä osoittaa, että Cx26 ei lisännyt apoptoosia HeLa-soluissa (taulukko S1). Oli lisääntynyt jonkin verran, anneksiini V ja Hoechst merkintöjä HeLa26 soluja, mutta nämä solut eivät osoittaneet morfologisia tunnusomaiset piirteet solukuolema, nekroosia tai autophagy. Sen sijaan he osoittivat piirteitä yhdenmukaisia ​​soluja, jotka on voitu estetty sytokineesiin (katso jäljempänä), jotka tyypillisesti osoittavat suurempaa kalvon läpäisevyyttä. FACS-analyysi HeLa Par ja Cx26 transfektanteissa seuraava levittämisestä 1% seerumia tymidiiniä /nokodatsoli lohko (G2 pidätys), paljasti pitkittyneen irtautuminen mitoosia HeLa26 soluissa, joissa ilmenee viivästyksiä kaikissa vaiheissa solusyklin. (Kuvio 2A). HeLa43, HeLa32, ja kaksi mutantti Cx26 HeLa transfektantit näytä solusyklin jakaumat samanlainen HeLa Par (tuloksia ei ole esitetty). Samanlaisia ​​tutkimuksissa verrattiin kasvuun vapautumisen jälkeen G1 lohko aiheuttama kaksinkertainen tymidiinillä lohko tulokset olivat samanlaiset, jossa poistuminen G1 /S on erityisesti viivästynyt HeLa26 soluissa verrattuna HeLa43, HeLa32, ja mutantti Cx26 HeLa transfektantteja (tuloksia ei ole esitetty).

(A) solusykli jakauma HeLaPar (yläpaneeli) ja HeLa26 (alapaneeli) analysoitiin FACS [erottamalla solut G1 (vaaleanharmaa palkit), S (tumman harmaat tolpat) ja G2-M (musta palkit) vaiheita] on ilmoittanut aikoina jälkeen 1% seerumia lisäksi seuraavat seerumistarvaatio. HeLa26 soluilla hitaampi eteneminen solusyklin läpi (esim. Aika palata G2: 24 tuntia verrattuna 16 tuntia HeLaPar), sekä merkittävä synkronoinnin menetyksen. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

(B) värjäys tuman DAPI (vasen sarake) paljastaa paljon korkeampi taajuus multilobed ydinten Cx26 ilmentävät solut (10-14% – paneelit iii, v ja vii) kuin HeLaPar soluja (2 – 5% – paneeli i). Co-värjäys sama solujen gamma-tubuliinin (oikea sarake) esittää joko yksi (lepotilassa olevat solut) tai kaksi (jakautuvien solujen) sentrosomien in HeLaPar soluissa (paneeli ii). Sitä vastoin HeLa26 soluissa (kaistat IV, VI ja VIII) usein jakaa yhden sentrosomimäärän jakamiseen useiden ytimet (nuolet), tai on klusterin useita keskusjyvänen (nuolenkärki) (asteikko baaria, 10 pm).

(C ) prosenttiosuus monilohkoinen solut määritetään eri päivinä sen jälkeen, kun on lisätty 1% seerumia, on johdonmukaisesti suurempi HeLa26 (täytetyt pylväät) kuin HeLaPar (avoimet pylväät), jossa suurin ero on 1 päivä. Data on keskiarvo ± SEM. * Merkitsee merkitys p-arvo 0,05. ** Tarkoittaa merkitystä p-arvot 0,005.

Hoechst tai DAPI-värjäyksen 1% seerumia paljasti merkittävän kertymistä Monimuotoinen ytimiä, tai multi-tumallisten solujen HeLa26 (≥10% 24 tunnin kuluttua seerumin lisääminen) verrattuna nähdään HeLa Par ( 4%) (kuvio 2B). Nämä solut ovat huomattavasti suurempia ja litistetty kuin yhden ytimiä, ja näyttävät niiden epäonnistuminen täydellinen M vaihe ja /tai sytokineesiin. Nämä ydin- poikkeavuudet liittyvät joko yhdellä (nuolet kuvassa 2B, iv ja vi), tai useita (nuolenkärki kuvassa 2B viii) sentrosomien yhden solun sisällä, jaettu usean ytimiä, tai ydin- lohkoa. Tämä on päinvastoin kuin tavanomaiset kaksi sentrosomien liittyy jakamalla HeLa Par-solut (avoin nuoli kuvassa 2B ii), ja ehdottaa, että HeLa26 solut on ongelmia säätelyyn sentrosomimäärän päällekkäisyyttä. Ehjä ydinvoiman kalvot, puute tiivistyneen kromatiinin, ja puuttuminen TUNEL merkintöjä HeLa26 (taulukko S1), osoittavat, että solut eivät anna apoptoosin, mutta lopulta poistu mitoosin. Tämän mukaisesti, kun taas monilohkoinen tai usean nukleoiduissa solut ovat aina runsaampaa HeLa26 kulttuureissa, ne eivät kertyy ajan mittaan (kuvio 2C).

Cx26 aukkoliitos kytkentä vaikuttaa tasot ja aktiivisuuden useiden mitogeenisestä signalointimolekyylien

yhdenmukainen havaitut vaikutukset Cx26 on solusyklin HeLa-solujen, aktivaation tila useita mitogeenisen säätävät havaittiin kroonisesti kasvoi HeLa26 verrattuna HeLa Par solujen ja muiden Cx transfektanttien (Cx26R75Y esitetty esimerkkinä) kasvun aikana 1% seerumia (kuvio 3 ja kuvio S3). Tarkemmin sanottuna tasot CDK-inhibiittorit, p21 ja p27, joka suoraan säätelevät G1 (p21 ja p27) ja G2 (P27) eteneminen, olivat 1,5- 2 kertaa suurempi HeLa26 soluissa aikana seerumistarvaatio (0 ajankohtana), ja oli suurempi 48 tai 24 tunnin kuluttua 1% seerumia lisäksi vastaavasti.

(AG) Protein tasoilla HeLaPar (avoimet pylväät), HeLa26 (umpinaiset pylväät) ja HeLa26R75Y (kirjava baaria) kvantitoitiin digitoiduista kuvia Western blotteja (kuvio 2, täydentävä data) heti seerumistarvaatio (päivä 0), ja päivittäinen jälkeen 1% seerumia lisäys. Tasot jokaiselle proteiinin normalisoitiin kuin HeLaPar soluja vuorokautena 0. Actin toimi sisäisen kuormituksen valvonta. Tasoilla CDK-inhibiittorit, p21 (A) ja p27 (B), ja suhde fosforyloidun (aktivoitu) ja yhteensä tasoilla MAPK perheenjäsenten ja niiden sääntelyviranomaisten, MEK (C), ERK (D), JNK (E) p38MAPK (F) ja katalyyttinen alayksikkö PKA (G) olivat kaikki suurempi HeLa26. Tämä korkeus, ilmeistä aikana seerumistarvaatio jatkunut 1-3 päivää, riippuen proteiinin.

(H) cAMP tasot arvioitiin ELISA HeLaPar (avoin baari), HeLa26 (suljettu bar) ja HeLa26T135A (ruudutettu pylväs). Toisin kuin PKA aktiivisuuden, cAMP-tasot eivät osoittaneet yhdenmukaisia ​​kasvaa HeLa26 verrattuna muihin solutyyppeihin. HeLa26R75Y soluilla cAMP-tasot samanlainen HeLa26T135A. Tiedot ovat keskiarvo ± keskiarvon vähintään kolmen erillisen kokeen. Tähdet osoittavat tapaukset, joissa toimintaa HeLa26 on huomattavasti suurempi (* = p 0,05; ** = p 0,005) kuin molemmat HeLaPar ja HeLa26R75Y tai T135A soluja.

Useat jäsenet mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (MAPK) perhe, joka tunnetaan säädellä p21 ja p27 tasolla (Erk 1/2, p38 ja JNK) (kuva 3 CE), osoitti nousee jatkuvasti (2- ja 3-kertaisesti) HeLa26. Kaksi kinaasien edelleen vastavirtaan, MEK ja proteiinikinaasi A (PKA) katalyyttistä alayksikköä alfa (kuva 3 F ja G), osoitti jopa suurempi pitkäaikainen nousu aktiivisuuden HeLa26 (3- tai 5-kertaisesti yli 72 tunnin kuluttua seerumin lisäys). Nämä korotukset ei havaittu kaikissa mitogeenisesta reittejä kuin mitään muutoksia Akt tai p70 S6 kinaasin havaittiin.

Vaikka pitkittynyt aktivaatio MAPK liittyy pienentynyt solunjakautumisen [35,36], niiden akuutti aktivointi on tyypillisesti pro-mitogeenisesta. Tämän mukaisesti ensimmäisen 2 tunnin kuluessa 1% seerumia stimulaatio, HeLa Par soluista osoitti ohimenevää aktivointi Erk ja JNK ja lasku p38, jota seurasi uudelleen pohjapinta valtion. Sen sijaan HeLa26 eivät osoittaneet nämä ohimeneviä aktiivisuuden muutokset (kuva S4), mutta vain hitaampi alku aktivointi alkaa ~ 2 tunnin kuluttua seerumin lisäksi.

aktivointi PKA on sekä välttämätöntä että riittävää kasvun tukahduttaminen Cx26

toiminnallinen panos korkeus näiden kinaasien Cx26 kasvun hidastuminen arvioitiin siRNA pudotus tutkimukset Erk, JNK ja PKA katalyyttinen alayksikkö alfa. siRNA: t aikana lisätty alkuperäisen seerumistarvaatio, 24 tuntia, ennen kuin lisättiin 1% seerumia, aiheutti 5-kertaisen JNK ja 2-kertainen väheneminen Erk ja PKA (kuvio 4A). Korkeammat siRNA tasot eivät ole tottuneet välttämään myrkyllisiä vaikutuksia soluihin, koska jokainen näistä signalointipolkujen tarvitaan myös tyvisolusyöpä jako.

(A) lysaatit of HeLa26 (vasen paneeli), käsiteltiin satunnaisessa järjestyksessä siRNA (kontrolli), tai siRNA: t, jotka ovat spesifisiä kinaaseja esitetty, valmistettiin 24 sen jälkeen, kun seerumin lisäksi ja tutkittiin vasta-aineiden kokonaisproteiinia kuten vasemmalla puolella kunkin blot. Tasot kaikkien kinaasien vähennettiin, joissa JNK lasku on dramaattisin. Lysaattien HeLaPar solujen (oikea paneeli) transfektoitu CA-PKA (konstitutiivisesti aktiivinen) konstruktio osoitti paljon suurempi ilmaus PKA kuin transfektoimattomia valvontaa. Aktiini toimi latauskontrollina.

(B) Kasvu eri siRNA käsiteltyjen HeLa26 solut (avoimet pylväät), tai HeLaPar solut ja ilman konstitutiivisesti aktiivista PKA lauseke (umpinaiset pylväät) verrataan suhteena solujen numero 24 jälkeen, ja aikaan, seerumin lisäys. Rooli konstitutiivisen aktivaation kunkin mitogeenisen kinaasien kasvun inhibitio HeLa26 näkyy käänteisen Cx26 johtuvan kasvun tukahduttaminen niiden siRNA: t. Tämä on dramaattisin tapauksessa PKA, jossa kasvu palautuu samalle tasolle kuin HeLaPar soluja. Kasvu tukahduttaminen HeLaPar solujen, samassa määrin kuin nähdään HeLa26, CA-PKA ilmaisu osoittaa, että PKA yksin voi välittää tätä vaikutusta. Merkittäviä eroja kasvun on merkitty tähdellä (p 0,05).

Ensimmäisen 24 tunnin 1% seerumia, HeLa Par solut kaksinkertaistunut määrä, kun taas HeLa26 solut osoittivat merkittävää kasvua (kuvio 4B ), sopusoinnussa viive solusyklin etenemisen havaittu FACS-analyysi kuviossa 2A. Hoito siRNA on satunnaisessa järjestyksessä ei ollut vaikutusta tähän kasvumalli. Erk ja JNK siRNA erikseen tai yhdessä, aiheutti osittain menetetyksi kasvun eston HeLa26 soluissa, mutta siRNA ja PKA aiheutti täydellisen paluuta kasvun mallia HeLa Par soluja. Lisäksi yli-ilmentyminen PKA katalyyttisen alayksikön alfa HeLa-soluissa (kuvio 4A, oikea paneeli) tukahdutetaan niiden kasvua samassa tahdissa kuin HeLa26 soluja (kuvio 4B). Näin ollen, vaikka aktivoituminen muita loppupään kinaasien edistää sääntelyn HeLa solujen kasvua, PKA aktivointi näyttää olevan vallitseva vaikuttava tekijä, on sekä välttämätöntä ja riittävää, että vaikutukset Cx26 HeLa kasvuun matalan seerumin.

aktivointi PKA mukaan Cx26 rako junktionaalinen kytkentä aiheuttaa uudelleenjako cAMP, eikä korkeus sen tason

ensisijainen tehtävä PKA edellä osoitettiin voimakkaasti syytöksiä cAMP kuin todennäköinen kasvun sääntely signaali. Kuitenkin vertailut globaalin cAMP tasoja HeLa26, HeLa Par ja HeLa26R75Y viljelmät (kuvio 3H) paljastaneet mitään johdonmukaista eroja solulinjojen kolmen päivän kasvun 1% seerumia. Kuitenkin, cAMP: n on osoitettu olevan läpäisevä Cx26 aukkoliitos kanavien HeLa-soluissa [37,38]. Koska toiminnalliset solujen väliset kanavat tarvitaan PKA aktivointia ja kasvun hidastuminen, tämä johti meidät tutkimaan, onko diffuusio cAMP solujen suuria pitoisuuksia soluihin, joilla on alhaisempi pitoisuudet voisivat johtaa suuremman osan solujen aktivoidulla PKA, ilman vaatimusta ylimääräisiä cAMP-tuotantoa.

jotta suoraan visualisoida cAMP tasoja tilallisesti, FRET toimittaja työllistää EPAC kuin cAMP tunnistava verkkotunnuksen välissä CFP ja YFP fluoroforeilla tuotiin soluihin transfektiolla. Valkaisu YFP (akseptori) fluorphore johti lisääntymiseen CFP (luovuttaja) fluoresenssi (23%) (kuvio 5A), jota ei havaittu, kun CFP ja YFP ilmaistiin yksin (2%) tai yhdessä, mutta eri molekyylit ( ~ 4%). CAMP: 8-Br-cAMP (cAMP-agonisti), forskoliinia (adenyylisyklaasi aktivaattori) ja 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinia (fosfodiesteraasi-inhibiittori) aiheutti menetys FRET 10%, johtuen luultavasti laajentaminen EPAC molekyylin cAMP sitova (data yhteenvetona kuviossa 5B). FRET lukemat yksittäiset solut ei-synkronoitu HeLa Par ja HeLa26 kulttuureissa kuvattiin on -konfokaalimikroskoopilla korreloivat DNA sisältöä ja ydinvoiman morfologia. CAMP tasot HeLa Par-solujen määrä nousi ~ 2-kertaiseksi välifaasina ja mitoosin. Tämä ero oli lähes täysin hävinnyt HeLa26 soluissa, lisääntyneen interphase tasoa ja alentuneesta mitoosi soluissa (kuvio 5C). Seuranta cAMP tasolla koko normaalin solusyklin HeLa par soluissa synkronoidaan kaksinkertainen tymidiinin blokin, vahvisti, että cAMP tasot pysyvät alhaisina G1 ja S, nousu G2, huippu metafaasissa, ja sitten laskevan loppuvuoden mitoosin (kuvio 5D) . Nämä ”huippujen ja laaksojen” cAMP näyttävät eliminoitu HeLa26 soluissa johtuen diffuusion cAMP suhteellisen harvat M vaiheen soluja, jotta suurin osa G1 /S-vaiheessa olevien solujen. Lisääntyneet cAMP G1 /S-vaiheessa olevien solujen indusoi aktivointi PKA, joka on kasvua inhiboiva tässä vaiheessa solusyklin [39]. Tämä selittää tuloksia kuvassa 4B, jossa knock-down PKA (varsinkin aikana G1 /S-vaiheessa) voidaan poistaa Cx26 kasvua tukahduttava vaikutus Cx26, kun taas sen aktivoinnin voi jäljitellä sitä.

(A) edustusto hyväksyjä Valovalkaistuminen FRET, kasvua in luovuttajan (CFP) fluoresenssi seuraava täydellinen akseptorin (YFP) fotobleknande.

(B) FRET tehokkuus on vähäinen, kun CFP ja YFP ilmaistaan ​​erikseen tai yhdessä, mutta ei linkitetty common carrier. FRET tehokkuutta kaksoisleimattua EPAC rakentaa nousee lähes 10-kertaiseksi, mutta putoaa vain 3-4-kertaisesti yli taustan kun cAMP-arvot kohoavat.

(C) FRET mittaukset 1 päivä sen seerumi Lisäksi yksittäisistä soluista joko interphase tai mitoosia osoittavat, että muutokset cAMP-tasojen kanssa solusyklin nähdään HeLa-soluissa on eliminoidaan ilmaus Cx26.

(D) FRET analyysi populaation HeLaPar solujen synkronoidaan G1, osoittaa oscillatory kuvio cAMP kanssa solusyklin, jossa tasot jäljellä alhainen koko interphase, ja korkeimmillaan aikana metafaasivaiheen osan mitoosin.

Mittakaava edustavat ~ 40 uM. Vähintään 25 solujen keskiarvo kullekin solutyypin ja solusyklin vaiheessa FRET.

(E) Immunosytokemia aktiivisen fosfo-PKA (katalyyttinen alayksikkö alpha) 1 päivänä 1% seerumin lisäys (ylärivi) paljastaa heterogeeninen värjäys kuvio HeLaPar soluissa ja soluissa, jotka ilmentävät Cx43 tai aukkoliitos kanava puutteellinen Cx26R75Y mutantti. Vastaavasti p-PKA tasot HeLa26 ovat korkeampia ja yhtenäisempi kaikissa soluissa. Tilanne yksittäisten solujen net p-PKA-signaalin ja DNA-pitoisuus DAPI värjäys paljastaa korrelaatio (alempi kaaviot), jossa p-PKA tasot ovat alhaiset G1 /S (alempi DNA-pitoisuutta) ja korkea G2 /M (korkeampi DNA sisältöä). Tämä ero on jyrkästi vuonna HeLa26 kulttuureissa.

Vahvista jos tämä uudelleenjako cAMP oli yhdenmukainen yleiseen kasvuun PKA fosforylaation aktivoivaa Thr197 sivustolla [40] olimme havaittu (kuvio 3G), tutkimme myös alueellisen malleja p- PKA värjäystä HeLa Par, 26, 43 ja 26R75Y viljelmät (kuvio 5E). Värjäytyminen yksittäisten solujen oli hyvin heterogeeninen kaikissa kulttuureissa osoittavat nopeaa kasvua matalan seerumin (HeLa Par, Cx43 ja Cx26R75Y). Co-värjäys DAPI paljasti selvän korrelaation voimakkuus P-PKA merkitseminen jokaisen solun sen DNA sisältö (kuva 5E – tonttien alle jokainen immuunifluoresenssivasta kuva), jossa korkeampi P-PKA DNA-replikaation jälkeen kun noudatetaan Havaittu huippu cAMP tasoja M vaiheessa kuvassa 5B. HeLa26 solut esitetään poikkeus tähän kuvioon, että solujen värjäys oli tasaisempi. Ei ole yllättävää, korrelaatio P-PKA intensiteetin DNA pitoisuus oli myös vähentynyt huomattavasti, sopusoinnussa poikkeaa vain vähän näemme cAMP-tasojen välillä M vaihe ja S-vaiheen solujen Näiden viljelmien (kuvio 5C). Nämä tulokset ovat vain helposti selittää uudelleenjako cAMP kautta Cx26 kanavia, soluista suurempia pitoisuuksia (M vaihe), soluihin pienemmillä pitoisuuksilla (G1 /S-vaiheessa). Tämä ilmeisesti johtaa paljon suurempi osa solujen saavuttaa cAMP-tasojen riittää indusoimaan fosforylaation PKA, mikä sen aktivointi ja yleistä säätelyä PKA aktiivisuus viljelmän ilman todellista kasvua yleistä cAMP-tasot.

Cx43 ja Cx32 kanavat olivat tehottomia tukahduttaminen kasvun näiden kanavien lähelle solusyklin aikana

koska HeLa43 ja HeLa32 soluilla vankka solujen välinen kytkentä, ja annettava ennen näyttöä siitä, että cAMP voi kulkea tehokkaasti läpi sekä Cx43 ja Cx26 kanavia näillä soluihin [37], pyrimme määrittämään miksi Cx43 ja 32 olivat tehottomia tukahduttaa kasvua. Koska cAMP tasoja vain kasvaa aikana M vaiheessa, jossa se on raportoitu, että kuilu junktionaalinen kytkentä voi pienentää, tutkimme jos nämä kolme konneksiinit säädellään differentiaalisesti solusyklin aikana. Solut synkronoitu S-vaiheessa kaksois- tymidiinin lohko normaalissa (10%) seerumin. Toisin käyttäytyminen alhaisessa seerumissa (kuvio 1), kaikki HeLa-solulinjat kasvoivat yhtä suuria normaalissa seerumissa. Aste synkronisesti, sekä solusyklin etenemisen vapautumisen jälkeen lohkon, havaittiin olevan sama kaikille kolmelle konneksiini transfektanttien normaalissa seerumissa olosuhteissa. .

tukeminen Information

Kuva S1.