Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Maailmanlaajuinen erot syövän esiintyvyys on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma. Keskityimme eturauhassyövän koska mikroskooppisen sairaus miehillä on yhteinen, mutta esiintyvyys kliinisen taudin vaihtelee yli 100 kertaisesti maailmanlaajuisesti. Ca

2 + signalointi on keskeinen säätelijä soluproliferaatiota, mutta on saanut vähän huomiota syövän ehkäisyyn. Me ja muut ovat ilmoittaneet vahvan annosriippuvaisen vähennys ilmaantuvuuden eturauhas- ja keuhkosyövän populaatioissa altistuvat boori (B) juomaveden ja elintarvikkeiden; ja kasvaimen ja solujen lisääntymisen eläinten ja soluviljelymalleissa.

Methods /Principal Havainnot

tutkittiin vaikutusta B Ca

2 + myymälöissä avulla syöpä ja ei-syöpä ihmisen eturauhasen solulinjoissa, Ca

2+ indikaattorit Rhod-2 AM ja Indo-1 AM ja konfokaalimikroskopialla. DU-145-soluja, inhibitio Ca

2+ vapautuminen oli ilmeistä, hoidon jälkeen Ringersin sisältävät RYR agonistit cADPR, 4CmC tai kofeiinia ja vastaavien tasojen BA (50 uM), (1, 10 uM) tai (10, 20 , 50150 uM). Vähemmän aggressiivinen LNCaP syöpäsoluja tarvitaan 20 uM BA ja ei-kasvainsolulinjaa PWR1E tarvitaan 150 uM BA merkitsevästi estävän kofeiinin stimuloimaa Ca

2+ julkaisu. BA (10 uM) ja RYR antagonisti dantroline (10 uM) olivat vastaavia niiden kyky estää ER Ca

2+ menetys. Virtaussytometria ja konfokaalimikroskopialla analyysi osoitti altistuminen DU-145-solut 50 uM BA 1 h laski tallennettu [Ca

2+] 32%.

Päätelmä /merkitys

Show B aiheuttaa annosriippuvaisen vähennystä Ca

2 + vapautumista ryanodiinireseptorista herkkä myymälöissä. Tämä tapahtui BA pitoisuuksia veressä maantieteellisesti erillisten populaatioiden. Tuloksemme viittaavat siihen korkeampia BA veressä alentaa eturauhassyövän riskiä vähentämällä solunsisäisten Ca

2 + signaalit ja varastointi.

Citation: Henderson K, Stella SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) Reseptori Aktivoidut Ca

2 + Release estyy Boorihappo eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10,1371 /journal.pone.0006009

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 17 marraskuu 2008; Hyväksytty: 20 toukokuu 2009; Julkaistu: 23 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Henderson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tämän apurahan rahoittivat henkilökohtaisia ​​varoja (CE) ja osittain Kalifornian yliopiston myrkyllisten aineiden tutkimus- ja koulutusohjelma (TSR TP) osittaista tukea KH ja SK. CE on tohtorin mentori KH ja SK. TSR TP rahoitus oli opiskelijoiden apurahoja rajoitu opiskelijoiden tukea ja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Yksi tapa solut reagoivat ympäristön ärsykkeisiin on avaamalla kanavia välillä sivustoja varastoituja kalsiumia, kuten Endoplasmakalvosto (ER), Golgin, ja mitokondriot ( mt), jotka sisältävät runsaasti vapaita Ca

2+ pitoisuuksia (500 uM), ja sytoplasmassa, joka sisältää alhainen vapaa Ca

2+ pitoisuuksia (100 nM) [1]. Nopea nousu sytoplasman Ca

2 + voidaan saavuttaa capacitative kalsiumin pääsy (CCE), joissa vapautuminen varastoitu Ca

2+ jonka ryanodiinireseptorista (RYR) ja IP

3-reseptori (IP

3R) sytoplasmaan seuraa tulva solunulkoisen Ca

2+. CCE aktivoi Ca

2+ sitovia proteiineja, jotka säätelevät useat solun toimintoja, kuten geenin transkriptio, solujen lisääntymistä, rakkula eritystä, ja apoptoosin [2], [3]. Soluliman Ca

2 + pitoisuudet palautuvat normaaleiksi Ca

2+ poistetaan kuljettajat kuten Na

2 + – Ca

2+ lämmönvaihdin solukalvon, sarcoplasmic endoplasmisessa ATPaasi ( SERCA) ER kalvo, Ca

2+ uniporter mitokondrioita, ja sitoutumalla suurella affiniteetilla sitoutuvia proteiineja [4], [5]. Tässä raportissa esitetään todisteita siitä, että fysiologiset tasot boorihappoa (BA) estävät tallennettujen Ca

2 + vapautumista RYR agonisti herkkien alueiden.

Boori (B) on 9

th yleisin alkuaine meriveden (425 uM B) ja viime aikoihin asti hylättävä biologisesti merkityksetöntä [6]. B on sidottu hapen luonnossa ja fysiologisten nesteiden 98,4% on läsnä muodossa B (OH)

3 boorihappoa ja 1,6% B: (OH)

4

– boraatti. Biologia on käyttänyt tätä elementtiä rakenteessa useita molekyylejä kuten: Antibioottien sienet [7]; quorum sensing auto induktori 2 bakteereissa [8]; ja rhamnogalacturonan-II dimeeri kasveissa [9]. Kasveissa, B vaaditaan soluelongaatiota, kukinnan ja siementen muodostumisen ja on olennainen osa ravintokasveja. Varauksetonta BA läpäisee solukalvon root orvaskeden solujen sytosoliin passiivisella diffuusiolla ja tämä helpottaa NIP5; 1 kuljettajat [10]. BA on osittain muunnetaan boraattia sytosoliin (pKa 9,6) ja kulkeutuu xylem käyttäen vienti transporter BOR1 [11], [12]. Ihmisen homologi BOR1 nimetty NaBC1has on raportoitu olevan läsnä nisäkässolulinjoissa ja parantaa solujen lisääntymistä matalissa BA pitoisuuksina [13], mutta tämä ei vielä vahvistettu toisella laboratoriossa. Vaikutus BA kasvuun ja soluproliferaation taimen, seeprakala ja nisäkkäiden HEK ja HeLa-solut seuraa käännetyn U-muotoinen suurempia pitoisuuksia aiheuttaa solujen kasvun estäminen [13] – [15]. Pitoisuudet 60-100 uM BA estävät solujen proliferaatiota eturauhassyövän soluissa, kun taas suuret pitoisuudet 500-1000 uM BA tarvitaan inhiboimaan ei-kasvain eturauhasen epiteelisolujen yli samassa ajassa [16].

Ihmisen veren BA heijastavat paikallinen geologia, veden laatuun ja kasvien ruokavaliota maailmanlaajuisesti eri 2-120 uM (21-1232 ng B /g märkää veressä) vapaana elävä tervettä miestä ja naista [17 ], [18]. Useat ihmisen tutkimuksissa on havaittu laskua riski eturauhasen ja keuhkosyöpää, ja epänormaali kohdunkaulan sytopatologialle suhteessa määrään B nautitun ruoan ja veden [19] – [22]. Eräs tutkimus ei noudata suojaava vaikutus, mutta erosi muiden tutkimusten avulla eri B ruokaa tietokantaan ja arvioitu B sisältöä joissakin elintarvikkeissa [23], [24].

biologinen uskottavuus varten kemopreventatiivisille vaikutus BA tukevat useita rivejä tutkimuksen. Immuunipuutteisilla hiirillä, BA lisäravinteen vähensi kasvua siirrettyjen ihmisen eturauhasen kasvaimia, väheni IGF-1 kudoksissa, ja alensi seerumin prostataspesifisen antigeenin tasot [25]. Soluviljelmässä, BA vähensi leviämisen ihmisen syövän eturauhasen solulinjoissa annoksesta riippuvaisella tavalla ja esti solujen vaeltaminen ja invaasiota [16], [26], [27]. Havaitsimme suhde BA: n kyvystä estää eturauhassyövän soluproliferaatiota ja kalsium signalointi jälkeen massaspektrometria osoittivat affiniteetti BA NAD

+ pienennettiin fosforylaation ja siten mahdollisesti biologisiin asetuksen [28], [29]. BA osoitettiin myös olla ei-kilpaileva estäjä ADP-ribosyyli cyclase [30]. Tämä sai meidät tutkimaan sen vaikutuksia NAD

+ /cADPR Ca

2 + julkaisu kautta. Osoitimme, että farmakologinen tasoja BA (250 ja 1000 uM), mutta ei methylboronic happo, vähentynyt NAD

+ stimuloi vapautumista Ca

2+ vaikuttamatta kalsiumin vapautuminen kun ruiskutetaan sellaisenaan [27]. Ei ollut selvää, näiden tutkimusten jos BA estämällä Ca

2+ julkaisu häiritsemällä NAD

+ muuntaminen cADPR, estämällä vapauttamaan Ca

2 + myymälöissä, tai häiritsevät CCE. Lisäksi se nosti esiin mahdollisuuden, että BA pitoisuudet veren normaalin välillä voisi estää Ca

2 + vapautumista ryanodiinireseptorista (RYR) herkkä myymälöissä. Tässä osoitamme, että fysiologisia tasoja BA estää Ca

2 + vapautumista RYR reagoiva liikettä ihmisen eturauhasen epiteelisolujen ja alemman luminal Ca

2 + tasoilla.

Methods

Cell viljelmät

Kokeet käytetään eturauhassyövän solulinjoissa DU-145 ja LNCaP ja ei-kasvainsolulinjaa PWR1E. Soluja kasvatettiin ja pidettiin soluviljelmälevyihin 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. Sillä confocal kokeissa soluja viljeltiin lasipeitinlevyihin 24 tuntia ennen suorittamista määrityksiä ja opiskeli konfluenssiin alle 80%. DU-145 ja PWR1E solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja LNCaP oli lahja tri Allen Pantuck Department of Urology, Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. RPMI soluviljelyaine täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), ja L-glutamiinia (200 mM). PWR1E ei-kasvain-soluja ylläpidettiin Keratinosyyttien väliaineessa, joka sisälsi streptomysiiniä (100 ug /ml), L-glutamiinia (200 mM), 2,5 ug ihmisen rekombinantti EGF, ja 25 mg naudan aivolisäkeuutetta (Gibco, Carlsbad, CA). Boron tyhjennetty kasvualusta valmistettiin käyttämällä boorin erityisiä Ioninvaihtopuhdistuksen Amberlite IRE-743 (Sigma), kuten aiemmin on kuvattu [16], ja muutetaan seuraavasti. Yhdeksän grammaa autoklavoidaan IRA-743 ioninvaihtohartsia lisättiin 500 ml median ja sekoitetaan koskevasta Orbit pyöritin 75 arvoon 100 rpm 15 ja 20 tunnin 9 ° C: ssa.

mittaus Ca

2 + Transients

Storage Ca

2+ muutoksia seurattiin käyttämällä kalsiumherkkää väriaine Rhod-2, AM esterin (Biotium, Hayward, CA), joka kertyy organelles. Rhod-2,-AM-esteri on Kd 1 mM ja sen on osoitettu lokeroida, erityisesti mitokondrioissa, mutta me osoittavat, muissa soluelimiin sekä (Fig. 1). Käytimme myös ER Tracker vihreä ja Mito Tracker green (Molecular Probes, Carlsbad, CA) yhdessä Rhod-2, Am esterin. Ne ovat erittäin spesifisiä fluoresoivia leimoja Endoplasmakalvosto ja mitokondrioita, vastaavasti. Analysoimme Ca

2+ muutoksia vastauksena BA ja eri agonistit valitsemalla kiinnostavia alueita soluissa että päällekkäin punainen Rhod-2 Ca

2+ etiketti vihreä ER tracker (Fig. 1A) [31] – [33]. Rhod-2,-AM-esteri valmistettiin 1 mM varastoliuosta DMSO: ssa ja laimennettiin joko täydellinen RPMI-elatusaineeseen tai täydellinen Keratinosyyttien median 3 uM. Soluja inkuboitiin Rhod-2-AM-esteri (5 uM) ja ER tai Mt Tracker (0,5 uM, 250 nM) RPMI tai Keratinosyyttien media 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Ca

2+ vapautuminen stimuloitiin käyttäen agonisteja yhdessä eri pitoisuuksien BA Ringerin liuokseen. Kuvat kerättiin Zeiss 510 LSM 5 Pascal asennettu pystyasentoon (Zeiss Axioplan 2) varustettu Axoplan X63 (NA 0,95) vesiupotukseen tavoite. HeNe laser käytettiin virittämään Rhod-2 543 nm. 488 nm laserdiodista käytettiin virittämään ER tai Mt Tracker. Päästöjen kerättiin valomonistinputkella läpi 560 nm LP suodatin Rhod-2 ja 505 LP-suodatin ER ja Mito seurantoja. Muita suurennos, aikasarja, ja taustan vähentäminen kontrolloitiin käyttäen Zeiss LSM hankinta ohjelmisto. Kaikki kuvat on hankittu 12 bit.

. Kaksi DU-145-solut leimattiin punaisella fluoresoivalla solunsisäisen kalsiumin fluorofori, Rhod-2, ja vihreän fluoresoivan solulimakalvostoon etiketti, ER tracker. Keltainen tarkoittaa päällekkäisyys Ca

2+ ja ER ja ympyrä on mielenkiintoinen alue (ROI) analysoitu näissä kokeissa. Nuolet osoittavat soluelimiin: Nucl (nucleolus), Nucl (nucleus), ER (Endoplasmakalvosto) B. Kaksi DU-145-solut leimattiin punaisella fluoresoivalla solunsisäisen Ca

2+ fluorofori, Rhod-2, ja vihreä fluoresoiva mitokondrioiden etiketti, Mito tracker. Keltainen tarkoittaa päällekkäisyys kalsiumin ja mitokondrioita. Nuolet osoittavat soluelimiin: Nucl (nucleolus), Nucl (nucleus), mt (mitokondrioita).

Analyysi Ca

2+ vapautuminen käyttäen konfokaalimikroskopia

BA hoitovaihtoehtoja annosteltiin Ca

2 + vapaa Ringerin liuos valmistettiin käyttämällä ultrapuhdasta vettä poistamiseksi B [16], [34]. Ca

2+ vapautuminen RYR aktivoitiin lisäämällä joko 25 uM cADPR 10 uM digitoniinia läpäiseviksi soluja, tai 20 mM kofeiinia tai 100 uM 4-kloori-m-kresolia (4cmc) kokonaisissa soluissa [35] , [36]. Esto Ca

2+ vapautuminen saatiin aikaan käyttämällä 10 uM dantroleenin tai vaihtelevia pitoisuuksia BA läsnä agonistin [37]. SERCA estyi käyttämällä 10pM syklopiatsonihappo (CPA) [2]. Kaikki huumeiden hakemukset olivat 30 sekunnin ajan kalsiumia vapaa Ringerin liuoksessa (143 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCI

2, 10 mM glukoosi, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA-2H

2O, 1 mM EGTA), nähdäksesi Ca

2 + vapautumista myymälöissä ilman tulo ulkoisia Ca

2+. Drug hakemusta seurasi kolmen minuutin pesu Ringerin liuoksessa, joka sisältää kalsiumia (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 10 mM glukoosi, 10 mM HEPES). Ratkaisuja toimitettiin perfuusiota kammioon nopeudella 1 ml /min käyttämällä single-pass, painovoimalla perfuusiosysteemissä. Konfokaaliset kuvat otettiin joka toinen ja alkoi 2 minuuttia ennen ensimmäistä käsittelyä sovellus, jotta voidaan luoda pohja linja fluoresenssin intensiteettiä. Muutos fluoresenssin voimakkuutta (f) aiheuttama huumeiden hakemus on verrattuna keskimäärin lähtötilannemääritys joka koostui kolmesta mittauksesta ennen hakemuksen lääkkeen (fo). Kaikki mittaukset normalisoitiin perusviivaan tällä tavalla käyttämällä suhdetta f-fo /fo. Tyypillisesti 6-10 solut analysoitiin yhdessä näkökentässä ja kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme riippumatonta valmisteluja. Järjestys huumeiden hakemus perustui aluksi kokeilua peräkkäisen agonisti vain sovelluksissa. Jos 2

toinen soveltaminen agonistin aiheutti alemman Ca

2+ julkaisu kuin 1

st, soluja käsiteltiin agonistilla plus BA ensin. Tämä vältetään mahdollisuus, että mitattu esto Ca

2+ vapautuminen johtuu BA johtuu osittain tulenkestävä soluihin tehnyt niin aiemmin hoidettu agonistilla.

Analyysi tallennettujen kalsiumpitoisuus

DU-145 eturauhassyövän soluja käsiteltiin BA 1-72 tuntia median riisuttu booria käyttäen Amberlite IRA-743 ioninvaihtohartsia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), kuten aiemmin on kuvattu. Juuri ennen analyysiä solut poistettiin levyltä käyttämällä 1% trypsiinihajotuksen, sentrifugoitiin, ja merkitään 45 minuuttia standardimediumeja 3 uM Rhod-2 AM esterin Säilytys Ca

2+ analyysi. Voidakseen seurata soluliman Ca

2 + tasot, solut leimattiin 5 uM Indo-1 AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 45 minuutin ajan. Leimatut solut pestiin sitten ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan normaalia media. Fluoresenssi analysoitiin käyttämällä Beckton Dickinson BD-LSR I analyyttinen virtaussytometrillä. Rhod-2 heräte saatiin aikaan 514 nm argon laser ja analysoidaan (581 nm) FL-2 kanavaa. Indo-1 oli innoissaan UV laserilla (351 nm) ja analysoitiin 400 nm (FL5) ja 510 nm (FL4) kaistanpäästösuodattimia. Tulokset Indo-1 leimattuja soluja annetaan suhteet fluoresenssi (FL5 /FL4). Eteen ja sivusirontavirtaussytometriaa käytettiin portille ulos solu fragmentit [38]. Raaka-virtaussytometrillä analysoitiin käyttäen FLOWJO ohjelmistoa (Treestar Software, San Carlos, CA, USA). Tulokset on esitetty% Ca

2+ tasot verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Varastointi Ca

2 + tasot analysoitiin myös BA käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen vertaamalla Ca

2 + varastointi tyhjentämistä vastauksena 100gM thapsigargin käyttäen konfokaalimikroskopia [39].

Tilastollinen analyysi tietojen

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD ja analysoitiin käyttäen Studentin pariksi tai parittomalla t-testillä tai yksisuuntaista ANOVA monivertailuja Dunnettin useita vertailu post-hoc-testi käyttäen Graphpad Prism 4.0. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Yhtälö epälineaarinen kuvapankissa sitova (hyperbeli) Y = B max * X /(K

d + X) käytettiin laskemaan K

d ja Bmax- arvoja Graphpad ohjelmistoa.

Kemikaalit ja tarvikkeet

B poistettiin vedestä ja median aikaisemmin kuvattuja menetelmiä käyttäen [13]. Kofeiini, 4-CMC, ATP, CPA, dantroleenin, thapsigargin, cADPR, digitoniini ja boorihappo saatiin Sigma (St. Louis, MO) laimennettuna kalsiumittomalla Ringerin liuos varmistaa, että jos DMSO oli läsnä pitoisuudet olivat korkeintaan 0,1 %. Kaikki liuokset valmistettiin tuoreena ennen perfuusiota. Superfuusiolla 0,1% DMSO kalsiumittomalla Ringerin liuos ei vaikuttanut ER Ca

2+ tasoja tai kuvantamisen vastauksia.

Tulokset

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, fysiologisia pitoisuuksia BA estävät vapautumista Ca

2 + alkaen RYR herkkä myymälöissä ihmisen eturauhassyövän ja ei-kasvain epiteelisolujen. DU-145-soluja ladattiin Rhod-2 ja ER Tracker tai Mito Tracker onko Rhod-2 osastoihin yhdessä tai molemmissa osastoissa. Ei ollut mahdollista hahmotella Ca

2 + signaloinnin ER versus mitokondriot elävissä soluissa käyttäen konfokaalimikroskopia. Rhod-2 merkitty Ca

2+ mitokondrioita, ER, nucleolus, ja muut alueet solussa (Fig. 1A-B). Meidän kokeissa yhdistelmä ER Tracker ja Rhod-2 käytettiin määrittelemme kiinnostavat alueet sivustoihin tallennettujen Ca

2+ (Fig. 1A). Tämä alue sisältyy Ca

2 + myymälää sijaitsevat ER ja mitokondrioiden (Fig. 1A-B). Soveltaminen BA 0,1-1000 uM yksinään ei osoittanut välitöntä mitattavissa olevaa vaikutusta varastoinnin Ca

2+ käyttäen konfokaalimikroskopia (tuloksia ei ole esitetty).

Boorihappo estää Ca

2+ vapautumista vastauksena ryanodiinireseptorista agonistit

Voit selvittää BA esti Ca

2 + vapautumista RYR, käsittelimme DU145 soluja kolmen eri RYR agonistit yhdistettynä BA. Kilpailukykyinen ligandia sitova analyysi osoitti BA oli samassa paikassa palautuva kilpaileva estäjä cADPR, endogeeninen agonisti RYR (Fig. 2A-C). Tasapainodissosiaatiovakio, (K

D) cADPR oli 15,10, mutta kun läsnä on BA nousi 49,39. Inhibitio BA purettiin lisäämällä pitoisuutta cADPR ja läsnäolo BA ei muuttanut enimmäismäärä sitoutumiskohtia (B max) (taulukko 1).

. 50 uM BA esti 25pM cADPR aiheuttama Ca

2+ julkaisu (n = 6; *** p 0,001). B. Kilpailukykyinen ligandin sitoutuminen tutkimus osoitti BA oli voitettavissa kilpailukykyinen antagonisti cADPR yhdessä sivuston mallia. Pitoisuudet BA pidettiin 50 uM. Matalilla cADPR pitoisuuksina BA siirtynyt Ca

2+ julkaisu vastaus oikealle, mutta tämä kääntyi korkeammissa cADPR pitoisuuksina ja maksimi vaste (B max) ei muutettu. Kukin tietopiste on keskiarvo n = 6 R

2 on 0,9155 ja 0,8606 varten cADPR ilman ja BA: n kanssa vastaavasti.

analysoidaan vaikutus BA muihin RYR agonistien ehjien solujen. Ensin käytetään kofeiinia [20 mM] agonisti, joka tehostaa RYR herkkyys sen natiivi ligandiin, Ca

2+. Vastauksena kahden peräkkäisen sovelluksia kofeiinia, toinen julkaisu oli hieman suurempi kuin ensimmäinen (Fig. 3A). Tämä sekvenssi toistettiin sitten BA lisätty yhdistettynä kofeiinin toisen sovelluksen. Tulokset näistä kokeista osoittavat, että BA vähentää Ca

2+ vapautumista annoksesta riippuvaisella tavalla 10-150 uM BA (Fig. 3B-F). Sitten tutkittiin, mikä vaikutus BA 4CmC suora agonistina RYR. Peräkkäiset sovelluksia 50pM 4CmC johti vastaava Ca

2+ julkaisu (Fig. 4A). Kuten havaitaan kofeiinia, BA vähentynyt 4CmC stimuloidaan Ca

2+ vapautumista annoksesta riippuvaisella tavalla (Kuva. 4B-E). Kuitenkin esto alkoi 1 uM BA ja saavutti maksimin 10 gM BA.

. Ca

2 + vapautumista DU-145-soluissa vasteena peräkkäisten sovelluksia 20 mM kofeiinia (n = 6, * p = 0,0168). B. 10gM BA merkittävästi estyy Ca

2+ julkaisu (n = 6, ** p 0,01). C. 20 uM M BA estivät merkittävästi Ca

2+ julkaisu (n = 6, * p = 0,0163). D. 50gM BA merkittävästi estyy Ca

2+ julkaisu (n = 6, ** p = 0,0042). E. 150 uM BA merkittävästi estyy Ca

2 + julkaisu, n = 6, *** p = 0,0001. F. yhdistetty data-analyysi osoittavat estävää annosvasteen vaikutus BA kofeiinia stimuloidut Ca

2+ julkaisu, (n = 6 per pitoisuus, ** p 0,01). Kuviot 2-9, kukin pylväs merkitsee vastetta 6 kokeissa (n = 6) kopioidaan 3 kertaa. Viiva skannaa oikealle kunkin pylväsdiagrammin edustavat vasteita yhdestä kokeen.

. Peräkkäiset sovellukset 4-CMC ei muuttanut kalsiumin vapautuminen vaste (n = 6, NS). B. 0,1pM BA ei estänyt Ca

2+ julkaisu. C. 1,0pM BA esti Ca

2+ julkaisu (n = 6, * p 0,05). D. 10gM BA esti Ca

2+ julkaisu (n = 6, *** p = 0,0005). E. Yhdistetty data-analyysi osoittavat annoksesta riippuvainen Ca

2+ julkaisu vaste (n = 6 per pitoisuus (** p 0,01).

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että estävää vaikutusta BA soluproliferaatioon klo IC

50 DU-145-soluissa oli noin 10% vähemmän tehokkaita vähemmän aggressiivisia LNCaP eturauhassyöpäsolulinja. lisäksi BA ei pystynyt saavuttamaan 50% vähennys proliferaation ei ollut kasvainta PWR1E eturauhasen epiteelisolujen kokeissa käyttäen enintään 4 kertaa IC

50 DU145 [16]. Tutkimme näitä solulinjoja onko BA oli myös vähemmän tehokkaita estämään kofeiiniherkille Ca

2 + vapautumista. esto Ca

2+ julkaisu vastauksena kofeiinia LNCaP eturauhaskasvainsoluissa tapahtuivat 20 uM-150 uM BA (Kuva. 5A-D). Siten LNCaP olivat vähemmän herkkiä BA verrattuna DU-145. LNCaP-soluja ei reagoi 4CmC hoitoon (ei esitetty). PWR1E ei ollut kasvainta, hyperplasic eturauhasen solulinja tarvitaan 150 uM BA estää kofeiini stimuloidaan Ca

2+ vapautumista (kuvio. 6A-D). PWR1E soluja ei reagoi 4CmC hoitoon (ei esitetty).

. 20 uM BA estämällä kalsiumin vapautumisen (n = 6, * p = 0,0226). B. 50gM BA eston Ca

2+ julkaisu (n = 6, ** p = 0,0019). C. 150 uM BA esto kofeiinin aiheuttama Ca

2+ julkaisu (n = 6, *** p 0,0001). D. Yhdistetty data osoittaa pitoisuudesta riippuvaista inhibitiota kofeiinia stimuloi release (n = 6, ** p 0,01).

. Peräkkäiset kofeiini sovelluksia PWR1E eturauhassoluhomoge-. (N = 6, NS). B. 50gM BA ja kofeiinin aiheuttama Ca

2 + julkaisu ei osoita inhibitiota (n = 6, NS). C. 150 uM BA esti kofeiinin aiheuttama Ca

2+ julkaisu (n = 6, ** p = 0,0029). D. Yhdistetty data ei näy yhtään annosvaste ja esto vain 150 uM (n = 6, * p 0,05).

Boorihappo estää syklopiatsonihappo aiheuttama Ca

2 + vapautumista ER

vapautuminen ER Ca

2 + myymälää joitakin ei-innokkaaksi soluja voidaan stimuloida käyttämällä syklopiatsonihappo (CPA), joka estää SERCA tavalla samanlainen thapsigargin, mutta voi pestä pois [40] . BA (+0,1-1000 uM) yksin ei muuttanut varastointi kalsiumpitoisuus aikana kokeen (ei esitetty). Vastaukset peräkkäisen sovelluksia CPA [10 uM] ei hajota (Fig. 7A). Samanaikainen soveltaminen CPA ja 1 uM BA aiheutti merkittävän laskun vapautumisen ja 10pM BA aiheuttivat lähellä täydellisen inhibition (Fig. 7B-D). Sitten testattiin vaikutusta dantroleenin, tunnettu estäjä RYR Cartr

2+ julkaisu CPA. Huomasimme, että 10pM dantroleenin esti CPA stimuloidaan Ca

2 + vapautumisen taso vastaa 10 uM BA (Fig. 8A-B).

Solut testattiin CPA + BA seuraa CPA. A. Peräkkäiset sovelluksia CPA ei muuttanut Ca

2+ julkaisu (n = 6, NS). B. 0,1 uM M BA ei estänyt CPA stimuloi Ca

2+ julkaisu (n = 6, NS). C. 1,0pM BA esti CPA stimuloidaan Ca

2+ julkaisu (n = 6, ** p = 0,0037). D. 10gM BA esti CPA stimuloidaan Ca

2+ julkaisu (n = 6, *** p 0,0001).

. Solut testattiin CPA (10 uM) + dantroleenin (10 uM) ja sen jälkeen CPA (n = 6, *** p 0,0001. B. BA esti CPA stimuloidaan Ca

2+ julkaisu pitoisuutena riippuvaisella tavalla. estävä vaikutus dantroline ja BA vastasivat 10 uM, CPA (n = 6, ** p 0,01).

Boorihappo hoito alentaa varastointi [Ca

2+] ilman vaikutusta on soluliman [Ca

2+]

Tuloksemme osoittavat BA esti Ca

2 + julkaisu johtaa meidät analysoimaan suhteellinen [Ca

2 +]

st tasot käyttäen Rhod-2 värjätään solut ja suhteellinen [Ca

2+]

cyt tasot käyttäen Indo-1 värjättyjen solujen ja virtaussytometria. Altistuminen DU-145 soluja BA [10-50 uM] 24 tuntia ei vaikuttanut [Ca

2+]

syt (Fig. 9A). kuitenkin vähennykset [Ca

2 +]

st (22%) esiintyi 10pM BA johti 32% vähennys [Ca

2 +]

st 50 uM BA 1 tunti (Fig. 9B). Kumpikaan suuremmat BA pitoisuuksia eikä hoidon 10pM BA jopa 72 tuntia johti edelleen vähentää [Ca

2+]

st (Fig. 9BC). sitten suoritettiin konfokaali mittaukset thapsigargin kannustanut Ca

2 + vapauttaa jälkeen DU-145-soluja esikäsiteltiin BA (50 uM) 24 tuntia ja havaittiin 35%: n lasku Ca

2+ julkaisu (Fig. 9D).

. Suhteellinen [Ca

2 +]

cyt altistumisen jälkeen 0, 10 ja 50 uM BA 24 tuntia (n = 5, NS). B. [Ca

2 +]

st prosenttina 0 hoidon DU-145-solut käsiteltiin 0-250 uM BA 24 tuntia. Boorihappo [10-50 uM] pienentää ER kalsiumpitoisuus yli 22% -32% verrattuna käsittelemättömiin soluihin (n = 5, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C. vähentäminen [Ca

2 +]

st in DU145 soluissa käsitelty 50pM BA 1-72 tuntia (n = 5, ** p 0,01). D. Konfokaaliset mittaus osoitti solujen esikäsittely BA 24 tunnin alensi thapsigargin stimuloidaan Ca

2+ julkaisu käsittelemättömiin soluihin verrattuna (n = 6, *** p 0,0001).

Keskustelu

Tämä tutkimus raportoi odottamattomaan havaintoon, että tallennetut Ca

2+ vapautumista ja luminal tasoja voidaan moduloida fysiologisesti relevantit Ba DU-145 eturauhassyövän epiteelisolujen. Tämä on merkitystä ymmärrystä syöpäriskin koska veren BA määräytyvät kulutus B juomavedessä ja kasviperäisten elintarvikkeet [17]. Se on todennäköisesti ensimmäinen soluvasteen B altistumista ja siten lähtökohta ymmärtää, miten riski eturauhas- ja keuhkosyöpä on vähentää B annoksesta riippuvaisella tavalla [16], [21], [22]. BA näytteillä ominaisuuksia klassinen antagonisti, koska se ei ollut välitöntä vaikutusta Ca

2 + vapauttaa levitettäessä itse ja sen vaikutukset olivat agonistin riippuvaisia. BA annosriippuvaisesti esti Ca

2+ julkaisu vastauksena cADPR, endogeeninen agonisti RYR, ja agonistien kofeiinia ja 4-CMC (Fig. 2-5). Meidän kilpailukykyinen ligandin sitoutumisen analyysi, BA näytetään ominaisuus single-site-antagonisti, että se oli palautuva korkeammilla pitoisuuksilla cADPR (kuva 2B). BA kasvoi K

d, 15,1-49,4, mutta ei vaikuttanut BMAX (taulukko 1). BA: n on osoitettu sitoutuvan cADPR suurina pitoisuuksina, mutta BA: n kyky inhiboida cADPR, kofeiinia ja 4CmC indusoiman Ca

2+ julkaisu osoittaa, että n fysiologiset pitoisuudet BA voi sitoutua cADPR sitoutumiskohtaan on RYR vakauttaa Ca

2 + kanava-aktiivisessa tilassa [30].

leviämisen LNCaP on raportoitu olevan noin 10% vähemmän herkkä ja PWR1E ei-tuumorisoluissa yli 4 kertaa vähemmän herkkä BA kuin DU-145-soluissa [16]. Havaitsimme myös tämä malli herkkyyttä BA: n kyky estää kofeiinia stimuloi Ca

2+ julkaisu. Pienin vaikuttava pitoisuus DU-145 oli 10 uM BA, LNCaP oli 20 uM BA, ja PWR1E oli 150 uM BA (Fig. 3F, 5D 6D). Lisäksi laski vastata BA, sekä LNCaP ja PWR1E olivat ei-reagoivat 4CmC hoitoon. RYR isoformit 1 ja 2, mutta ei 3 tiedetään aktivoida 4CmC joissakin solulinjoissa [41]. On mahdollista, että solulinja erot olivat erojen vuoksi RYR isoformeja tai niiden ilmentymistä. LNCaP solulinjat on osoitettu ilmentävän RYR 1 ja 2, mutta ei 3 [42]. Emme löytäneet tutkimukset kirjallisuudessa että tunnistettu RYR isomuotojen DU-145 tai PWR1E solujen tahansa eturauhasen solulinjaan.

munuaisfunktiotestit ovat osoittaneet BA reabsorboituu munuaisten ei-raskaana olevilla ja raskaana [43]. Löydetyksi elektrogeeninen, jännitesäätöinen Natriumbikarbonaatti kytketty boraatti co-kuljettaja (NaBC1) rotan munuaistiehyessä saattaa selittää havainnon, mutta se ei ole vielä vahvistanut toiseen laboratorioon. NaBC1 ilmentyminen indusoi proliferaatio HEK ja Hela-solujen aktivoimalla MAPK-reitin 16 tunnin kuluttua altistuksesta [13]. Ei tiedetä tällä hetkellä, onko NaBC1 ilmaistaan ​​eturauhassyövän ja ei-tuumorisolulinjoja, mutta erot sen ilmentyminen on esitetty mahdollisena selityksenä vaihtelu solujen herkkyys BA välillä eturauhassyövän ja ei-kasvainsoluissa [10 ].

lähemmin BA: n kyky estää tallennetun Ca

2 + julkaisu testasimme sen vaikutuksia läsnäollessa CPA (Fig. 7-8). CPA estää SERCA kanava johtaa tyhjennys Ca

2 + myymälöissä [44]. Tutkimuksemme osoitti, että BA annoksesta riippuvaisella tukossa CPA välittämä Ca

2 + vapautumista DU-145-soluja. Havaitsimme myös vähentäminen varastoinnin Ca

2+ tasolla 22% ja 32% 10-50 uM BA käsitelty DU-145-soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. STIM proteiinit ovat osallisena käynnistävät Ca

2+ virtaa osaksi ER [45] – [48]. Jos BA vähentää Ca

2+ vuodon kautta RYR kanavia suuria menetyksiä saattavat vuotaa läpi preseniliinit ja muut ei-kanava proteiineja, jotka eivät edistä STIM proteiineja. Tämä johtaisi laski varastoitu Ca

2+ tasoja, jotka eivät pysty signaalin täyttöä.

tärkeys Ca

2+ solusyklin ohjaus ja leviämisen on vakiintunut alueella syöpätutkimukseen mutta sitä ei ole tutkittu toimintamuotona syövän ehkäisyyn [49] – [51]. BA: n kykyä moduloida solujen lisääntymisen on yhdistetty muutoksiin Sykliini ja MAPK väylän DU-145, HEK293 ja HeLa-solut [13], [16], [26]. On kuitenkin mahdollista, nämä vaikutukset esiintyvät vastauksena vähennykset Ca

2 + vapautumista tai varastointiin. Eturauhassyövän LNCaP-solulinja, HUMEZ havaittu, että IGF (5 ng /ml), joka lisää solujen kasvua, ER [Ca

2 +]

ER, kun taas TNF-alfa (1 ng /ml), joka vähentää solujen lisääntymistä, pienentää [Ca

2 +]

ER [52].

Yhteenvetona BA on aiemmin raportoitu vähentävän eturauhassyövän riskiä ihmisillä ja vähentää kasvaimen kasvua ja eturauhasen syöpäsolun lisääntymisen, migraation ja invaasion. Tuloksemme osoittavat, että fysiologisia tasoja BA estävät agonistin stimuloi vapautumista tallennettujen Ca

2+ annoksesta riippuvaisella tavalla ja alemmalla varastoidaan Ca

2 + tallennustilatasoilla.