Krooninen sairaus

tiivistelmä

EML4-ALK fuusio geeni on äskettäin tunnistettu pienessä määrässä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilaat reagoivat myönteisesti ALK estäjien. Ominaisuudet EML4-ALK fuusio geenin Chinese potilaalla on NSCLC tunnetaan huonosti. Täällä raportoimme yleisyydestä EML4-ALK, EGFR tila ja KRAS mutaatioita 208 Chinese potilailla, joilla on NSCLC. EGFR mutaatioita havaittiin 24,5% (51/208) potilaista. Yhdenmukaiset aikaisempien raporttien kanssa, nämä mutaatiot havaittiin korkeilla taajuuksilla naisilla (47,5% vs. 15,0% miehillä;

P

0,05); koskaan tupakoineet (42,3% vs. 13,9% tupakoitsijoilla;

P

0,05), ja adenokarsinooma potilasta (44,2% vs. 8,0% ei-adenokarsinooma potilaista;

P

0,05) . Oli vain 2,88% (6/208) potilailla, joilla KRAS mutaatioita tutkimuksessamme ryhmässä. Havaitsimme 7 potilaalla kanna EML4-ALK fuusio geenin (3,37%, 7/208), joista 4 tapauksissa variantti 3 (57,1%), 2 variantti 1 ja 1 muunnos 2. Kaikki positiiviset tapaukset vastasivat naispotilaiden (11,5%, 7/61). Kuusi positiivisia tapauksia olivat tupakoimattomia (7,69%, 6/78). Ilmaantuvuus EML4-ALK translokaatio naisten, savuton adenokarsinooma potilaista oli niinkin korkea kuin 15,2% (5/33). Ei EGFR /KRAS mutaatioita havaittiin keskuudessa EML4-ALK positiivisten potilaiden. Patologinen analyysi ei osoittanut mitään eroa solid sinettisormus-rengas solukuvio (4/7) ja mucinous seulamaisessa pattern (3/7) in ALK-positiivisten potilaiden. Immunovärjäyksen osoitti kasvaimensisäisellä heterogeenisuus ALK uudelleenjärjestelystä ensisijainen karsinoomien ja 50% (3/6) etäispesäkekasval- ALK-negatiivinen värjäystä. Meta-analyysi osoitti, että EML4-ALK translokaatio esiintyi 4,84% (125/2580) Valikoitumattomien potilaiden NSCLC, ja oli myös vallitsevana savuttomissa potilailla, joilla adenokarsinooma. Yhdessä EML4-ALK translokaatiot olivat harvinaisia ​​koko NSCLC potilasryhmässä, mutta olivat yleisiä NSCLC alaryhmä nainen, tupakoimaton, adenokarsinooma potilaita. Oli kasvaimensisäisellä heterogeenisuus ALK uudelleenjärjestelystä ensisijainen karsinoomien ja metastaasien.

Citation: Li Y, Li Y, Yang T, Wei S, Wang J, Wang M, et al. (2013) Clinical merkitys EML4-ALK Fusion Gene ja Assosiaatio EGFR ja KRAS geenimutaatioita 208 Chinese Potilaat, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (1): e52093. doi: 10,1371 /journal.pone.0052093

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 14 marraskuu 2012; Julkaistu: 14 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukevat osittain avustuksilla National Natural Science Foundation of China (81172233), tieteen ja teknologian tuki Key Program Tianjin (09ZCZDSF04000, 09ZCZDSF03800), Tianjin Natural Science Foundation (12JCZDJC24400), hankkeen opetusministeriön uusille Century Erinomainen Talents (NCET-10-0956), ja Wujieping Foundation (320.6720.10007, 320.6740.10008, 3.206.720,10008). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien, jossa se liittyy 5 vuoden maailmanlaajuinen eloonjäämisaste alle 15% [1], [2]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80% keuhkosyövässä [3]. Sisplatiini kemoterapian on tuottanut merkittävää eloonjäämistä oireenmukaista hoitoa potilaille, joilla on pitkälle edennyt NSCLC; kuitenkin lopputuloksia pienisoluista keuhkosyöpää pidetään edelleen epätyydyttävä [3], [4]. Perinteiset kemoterapiaa ja sädehoitoa liittyy merkittäviä sivuvaikutuksia kaikilla potilailla NSCLC, koska niiden spesifisyyden puutteen. Kehittäminen ja soveltaminen lääkkeitä, kohdistaa tiettyihin molekyylit ilmentyvät keuhkosyöpäsoluissa on kerännyt enemmän huomiota, ja huomattavaa menestystä on raportoitu useissa NSCLC potilaiden tutkimusryhmiin [5], [6], [7], kuten potilasalaryhmässä NSCLC positiivista aktivoimiseksi mutaatioita kasvutekijän reseptorin (EGFR) geeni. Nämä syövät näytteille herkkyys EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibi tai erlotinibi, käyttöä tukevat näiden lääkkeiden hoitoon kohdistuvaan NSCLC [5], [8]. Potilailla kuljettavat EGFR aktivoiva mutaatio, joilla on aiemmin hoitamaton, edenneen taudin, gefitinibi on osoitettu olevan parempi solunsalpaajille [4], [9], [10]. Hyödyllisyys EGFR TKI näillä potilailla korostaa tunnistaa genotyyppispesifinen potilaiden alaryhmissä, jotka ohjaavat valintaa kohdennettuja hoitoja.

Äskettäin välisen fuusioproteiinin N-terminaalista osaa piikkinahkaisten mikrotubuluksiin liittyvä proteiini -kuten 4 (EML4) proteiinia ja solunsisäinen signalointi osan anaplastinen lymfooma kinaasi (ALK) tyrosiinikinaasin reseptori on tunnistettu pienessä määrässä pienisoluista keuhkosyöpää [11]. Potilaat kätkeminen EML4-ALK-fuusioproteiinia osoittaa ainutlaatuinen kliinisiä patologisia ja fysiologiset ominaisuudet [12], [13]. Monet tutkimukset ovat tunnistaneet tämän fuusioproteiinin pääasiassa nuorten naisten tupakoimattomilla adenokarsinooma [11], [14], kun taas muut raportit ovat kuvanneet tätä fuusioproteiinin eri väestöissä [15], [16]. Pieni kokonaismäärä positiivisia tapauksia tunnistettiin tutkimus saattaa selittää näitä eroja. Ominaisuudet EML4-ALK in keuhkosyövässä vielä selvittämättä, erityisesti Kiinan potilaalla on NSCLC. Onko esiintyvyys EML4-ALK mutaatioita, aivan kuten EGFR-mutaatio, joka liittyy yhteen tiettyyn etnisyyden?

EGFR /KRAS mutaatioita ja EML4-ALK translokaatio kutsutaan kuljettajan mutaatioita, koska ne ovat vastuussa sekä aloittamisesta ja ylläpito keuhkosyöpään. Adenokarsinomia näytteille erillisiä genomista muutoksia, jotka voidaan luokitella kliinisesti merkittävää molekyylien alaryhmiä mukaan KRAS, EGFR, ja EML4-ALK tila. Erityiset mutaatiot näiden geenien aiheuttaa ero kasvain herkkyydet kohdennettua terapeuttisia aineita. Esimerkiksi kasvaimet kuljettaa hallitseva somaattisia mutaatioita EGFR eksonit ovat tyypillisesti herkkiä EGFR-TKI. Kasvaimet kätkeminen somaattiset mutaatiot KRAS, joka koodaa GTPaasina myötävirtaan EGFR, näyttää suurempi resistenssi näille lääkkeille. Siksi on välttämätöntä ymmärtää korrelaatioita EML4-ALK ja EGFR /KRAS mutaatioita keuhkosyöpäpotilaiden.

Täällä me raportoimaan laajoja kliinisiä ja patologisia piirteitä tässä fuusion 208 Chinese pienisoluista keuhkosyöpää ja me korreloi sen kanssa läsnäolo EGFR ja KRAS mutaatiot samoilla potilailla. Olemme myös esittää meta-analyysi EML4-ALK fuusio geenin.

Tulokset

Clinical ominaisuudet EML4-ALK fuusio geenin Kiinan pienisoluista keuhkosyöpää

Vuonna 2007 Martelli et ai. arvioitiin potilailla, jotka ilmaisivat EML4-ALK selostukset, fluoresenssi

in situ

hybridisaatio, ja todettiin, että vain noin 1,8% soluista kanna EML4-ALK-geenin fuusio [17]. Nämä tutkijat eivät pystyneet havaitsemaan EML4-ALK proteiinin immunohistokemiallisesti, Western-blottauksella tai immunosaostuksella. RT-PCR on herkin ja suosituin havaitsemismenetelmä tällä hetkellä saatavilla. Suoritimme sisäkkäisiä RT-PCR monistamaan fuusio alueen translokaation. Arvioimme herkkyys meidän sisäkkäisiä RT-PCR-monistamalla laimennettiin sarjoittain cDNA H2228 soluista. Nested RT-PCR havaitsi EML4-ALK fuusio geenin alaraja 7,8 x 10

-4 ng cDNA: sta (kuvio 1A).

Nested RT-PCR suoritettiin käyttämällä laimennettiin sarjoittain cDNA H2228-soluja. Niin vähän kuin 7,8 × 10

-4 ng cDNA voitaisiin käyttää johdonmukaisesti havaitsemiseen variantin 3 fuusio transkriptio tämän protokollan (ylempi paneeli). Edustavia geelielektroforeesi tulokset sisäkkäisiä RT-PCR (alempi paneeli). Lane merkki: 200-bp tikkaat; positiivinen kontrolli: H2228; negatiivinen kontrolli: A549. Muita kaistat vastaavat näytteet näytteille EML4-ALK translokaatio, leimattiin asian numero.

oli 208 pienisoluista keuhkosyöpää tutkimuksessamme ja niiden kliiniset ja patologiset ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Tulokset sisäkkäisiä RT-PCR-monistukset ja EML4-ALK-fuusiogeenin esitetään kuviossa 1B. Havaitsimme 7 potilaalla kanna EML4-ALK fuusio geenin (3,37%, 7/208), joka vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla (kuva 2). Näistä 7 potilasta, 2 asioihin liittyi EML4-ALK variantti 1 (28,6%, 2/7), 1 tapaus esiintyi variantti 2 (14,3%, 1/7) ja 4 tapauksessa suoritettiin variantti 3 (57,1%, 4/7) . Siksi variantti 3 voi olla hallitseva variantti Kiinalaisten pienisoluista keuhkosyöpää yli puolet EML4-ALK translokaatiot näytteille fuusioita välillä eksonissa 6 EML4 ja eksonin 20 ALK.

(A) variantti 1, (B ) variantti 2, (C) variantti 3.

kliininen piirre näissä 7 potilaista on kuvattu taulukossa 2. Kuusi tapauksista mukana adenokarsinooma ja yhdessä tapauksessa mukana adenosquamous syöpä. Testit muunlaisia ​​karsinooma olivat negatiivisia (0/106). Kuten on esitetty taulukossa 3, esiintyvyys EML4-ALK-fuusiogeenin oli 6,32% (6/95) kesken adenokarsinooma tapauksissa ja 14,2% (1/7) joukossa adenosquamous karsinooma tapauksissa. Kaikki positiiviset tapaukset vastasivat naispotilaiden, tuloksena on positiivisia naisten keskuudessa 11,5% (7/61;

p

= 0,000). Kuusi positiivisia tapauksia olivat tupakoimattomia (7,69%, 6/78). Taajuus EML4-ALK translokaatio keskuudessa naisten savuton adenokarsinooma potilailla oli 15,2% (5/33). Mediaani-ikä EML4-ALK-positiivisia tapauksia (55 ± 10,38) oli paljon pienempi kuin EML4-ALK-negatiivisella potilaalla (61,78 ± 8,71;

p

= 0,045). Ei merkitseviä välillä havaittiin geenin fuusio ja vaihe tai metastaattinen tila.

histologinen analyysi EML4-ALK-positiivisia keuhkosyöpä

Kuten kuviossa 3 on esitetty, kaikki 7 ALK-positiivisia kasvaimia ainakin kanna adenokarsinooma komponentti. Vain yksi tapaus (tapaus 4) oli polttovälin levyepiteelikarsinooma eriyttäminen (mikä vastaa 20% kasvaimen tilavuuden). Adenokarsinooma komponentti osoitti monipuolinen histomorphology, ja hallitseva kasvumalli oli papillaarinen (tai micropapillary) 1 tapauksessa (tapaus 1), acinar 3 tapauksissa (tapaukset 2, 6 ja 7), ja kiinteät 3 tapauksissa (asiat 3, 4 ja 5). Kuitenkin useimmissa tapauksissa (5/7) oli todellakin sekoitettu adenokarsinooma komponentti lukien papillaarinen tai micropapillary, sinettisormus-rengas solujen ja limakalvojen soluja. Perusteella aikaisemmin raportoitu patologinen malli ALK-positiivisten karsinoomien [18], 57,14% (4/7, asiat 1, 3, 4 ja 5) ALK-positiivisia tapauksia osoitti kiinteän sinettisormus-rengas solukuvio ja 42.86% (3/7, asiat 2, 6 ja 7) tapauksista osoitti mucinous seulamaisessa kuvio. Psammoma ruumis tunnistettiin myös asiassa 6, joka oli sekoitettu adenokarsinoomaa kanssa sinettisormus-rengas solut, limakalvojen solut ja micropapillary komponentti. Mielenkiintoista, löysimme puhtaasti noninvasive mucinous BAC (bronchioloalveolar karsinooma) asiassa 7, joissa pikari soluissa osoitti lepidic kasvumalli. Kudoksille metastaattinen imusolmukkeiden oli käytettävissä 6 ALK-positiivisia tapauksia. Papillaarisen tai micropapillary, sinettisormus-rengas solujen solunulkoisen liman, ja seulamaisessa rakenne tunnistettiin 2 (asiat 1 ja 2), 1 (asia 6), ja 3 (asiat 3, 4 ja 5) tapauksissa, vastaavasti. Viisi tapausta osoitti kiinteän sinettisormus-rengas solukuvio, ja 1 tapaus (tapaus 6) osoitti mucinous seulamaisessa malli.

Ensisijainen kasvaimia asiat 1, 3, 4 ja 5 osoittivat kiinteän sinettisormus-rengas solukuvio muodostuu kiinteää kasvua papillaarinen (tai micropapillary) tai sinettisormukseksi-rengas solujen komponentti, ja muut ensisijainen sivustoja asiat 2, 6 ja 7 osoitti mucinous seulamaisessa malli koostuu runsas solunulkoisen liman ja seulamaisessa rakenteita. Vuonna imusolmuke metastaasien, solid sinettisormus-rengas solukuvio tunnistettiin asioissa 1-5, ja mucinous seulamaisessa kuvio oli nähnyt vain asiassa 6.

Lisäksi 3-tason luokitusjärjestelmä keuhkojen adenokarsinoomat ollut histologinen malli raportoivat Sica et al. [19], mukaan lukien Grade I: kuvion, huono laatu (BAC), Grade II: kuvion väli-tason (acinar ja papillaarinen); ja Grade III: kuvion korkealuokkaisesta (kiinteät ja micropapillary). Käyttämällä tätä pisteytysjärjestelmä, vain asia 7 kuului Grade I, ja kaikki loput kuuluivat Grade III koska suurin osa niistä sekoitettiin adenokarsinooman kanssa imusolmuke etäpesäke.

Seuraavaksi suoritetaan ALK immunohistokemia värjäytymistä (ALK-IHC ) primaaristen ja etäpesäkkeitä kaikkien ALK-positiivisia tapauksia. Kuten on esitetty kuviossa 4, ALK-IHC oli positiivinen kaikilla primaareja kasvaimia, ja ALK proteiinin ilmentyminen sijaitsi sytoplasmassa. Lisäksi ALK-positiivista värjäytymistä ei havaittu kunkin ensisijaisen kasvainsolun. Oli hyvin ilmeistä, asiassa 4 kanssa adenosquamous syöpä, jossa ALK immunovärjäytyminen tapahtunut adenokarsinooma komponentin mutta ei levyepiteelikarsinooma syöpä komponentti. Tämä tulos osoitti ilmiö kasvaimensisäisellä heterogeenisuus ALK uudelleenjärjestelystä primaarikasvaimen sivustoja. Lisäksi oli vain 3 tapausta (asiat 2, 5 ja 6), jossa ALK-positiivinen värjäytyminen on etäpesäkkeitä. Muut 50% etäpesäkkeitä olivat täysin ALK-negatiivinen värjäys, mukaan lukien tapaukset 1, 3 ja 4. Tapaus 4, vaikka etäpesäkkeitä käsittää useimmat adenokarsinooma komponentin, ALK immunovärjäytyminen oli vielä täysin negatiivinen.

ALK-positiivinen immunovärjäyksellä osoitettiin primaarikasvainten kaikista 7 ALK-jäsensi keuhkosyöpäpotilaita Diffuusista värjäytymistä sytoplasmassa. ALK-positiivista värjäytymistä ei ollut ilmeinen kussakin primäärikasvain solun, erityisesti asiassa 4, joka on adenosquamous karsinooma ALK positiivista värjäytymistä vain adenokarsinooma osittain ole levyepiteelikarsinooma syöpä komponentin (merkitty punaisella tekstillä: Adeno ja Squamous). Sillä imusolmuke metastaasien, asiat 2, 5 ja 6 osoittivat ALK-positiivinen värjäytyminen ja kotelot 1, 3 ja 4 osoittivat ALK-negatiivista värjäystä.

Lopuksi ALK immunofluoresenssivärjäyksen (ALK-IF) myös työssä ALK-IHC ensisijaisen ja etäpesäkkeitä kaikissa ALK-positiivisia tapauksia, mikä edelleen vahvisti ALK-IHC havaintoja. Kuten kuvassa 5, ALK-IF oli positiivinen kaikilla primaarikasvaimia, jossa ALK proteiinin paikallistamisen solulimassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ALK-IHC, jossa 50% metastaasien osoitti täydellistä ALK-negatiivinen värjäytyminen asioissa 1, 3 ja 4. Olemme myös suorittaa RT-PCR: llä EML4-ALK-geenin cDNA: n kaikkien etäpesäkkeitä ja saatu samat tulokset, eli negatiivinen ekspression EML4-ALK-geenin asioissa 1, 3 ja 4 (tietoja ei ole esitetty). Kaikki nämä tiedot vahvistivat kasvaimensisäisellä heterogeenisuus ALK uudelleenjärjestelystä ensisijainen keuhkosyövän.

ALK-positiivinen immunovärjäyksellä osoitettiin primaarikasvaimen kaikista 7 ALK-jäsensi keuhkosyöpäpotilaita. Sillä imusolmuke metastaasien, asiat 2, 5 ja 6 osoittivat ALK-positiivinen värjäytyminen ja kotelot 1, 3 ja 4 osoittivat ALK-negatiivista värjäystä. Nämä tulokset olivat samanlaisia ​​kuin ALK immunohistokemiaa. ALK: vihreä; Ki-67: punainen; DAPI: sininen.

EGFR ja KRAS mutaatioiden ja kliinisiä tekijöitä potilaiden

Niistä 208 potilaasta tunnistimme 51 tapausta EGFR mutaatioita eksonit 18, 19, 20, tai 21 (24,5%, 51/208, taulukko S1). Mutaatiot eksonissa 18 EGFR tunnistettiin 3 tapausta; eksonin 19 deleetio havaittiin 21 tapauksessa, ja mutaatiot eksonit 20 ja 21 mutaatioita havaittiin 6 ja 26 tapauksessa, tässä järjestyksessä. Viidessä tapauksessa esillä kaksinkertainen mutaatioita näissä EGFR eksonit. Joukossa eksonit 18-21, EGFR mutaatioita esiintyi pääasiassa eksonit 19 ja 21 (90,19%, 46/51). Yhdenmukaiset aikaisempien raporttien kanssa, EGFR-mutaatio korko adenokarsinooma potilaalla (44,2%, 42/95) oli huomattavasti suurempi kuin ei-adenokarsinooma potilaalla (8,0%, 9/113;

P

= 0,000). Lisäksi EGFR-mutaatio oli merkitsevästi pienempi miehillä (15,0%, 22/147) kuin naispuolisilla potilailla (47,5%, 29/61;

P

= 0,000). Niistä tupakoimattomien, EGFR-mutaatio oli 42,3% (33/78), paljon suurempi kuin tupakoitsijoiden (13,9%, 18/130;

P

= 0,000). Ei yhdistysten havaittu välillä EGFR-geenin mutaatiot ja ikä, kliinisessä vaiheessa, kasvaimen koko tai etäpesäke tila potilaista (taulukko 3).

joukossa 208 potilasta, 6 tapausta suorittaa KRAS mutaatioita (2,88%, 6/208 ). Ei yhdistysten välillä havaittiin KRAS mutaatioiden ja ikä, kliininen vaihe, sukupuoli, patologia, tupakointi, kasvaimen koon tai etäpesäke tila potilaista (taulukko 3). Ei EGFR /KRAS mutaatioita havaittiin keskuudessa EML4-ALK-positiivisten potilaiden tutkimuksessamme.

Survival analyysi

Kuten maaliskuun 2011 181 potilaalla oli täydellinen ennusteen tietoja, mukaan lukien 49 kuolemantapausta ja 132 tapausta selviytymisen. Seuranta-ajan mediaani koko sarjan oli 591 päivää (vaihteluväli 0 päivää 1329 päivää). Teimme selviytyminen analyysi näistä 181 potilasta suhteen läsnäolon EML4-ALK -fuusiogeenit ja EGFR /KRAS mutaatioita. Havaitsimme 45 potilailla, joilla on EGFR mutaatioita, joille Keskimääräinen elinaika oli 19,3 kuukautta (578 päivää, 124-1281). Niistä 136 potilailla, joilla on normaali EGFR, mediaani elinaika oli 19,8 kk (594,5 päivää, 0-1329). Ero kokonaiselinajan mediaani kertaa näiden ryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,467). Havaitsimme 4 potilaalla on KRAS mutaatioita, joille Keskimääräinen elinaika oli 16,3 kuukautta (489 päivää, 233-818). Niistä 177 potilailla, joilla on normaali KRAS mediaani elinaika oli 19,7 kuukautta (592 päivää; 0-1329). Niistä 181 tapauksessa 7 potilasta kantaneet EML4-ALK fuusio geenin translokaatiota. Mediaani seuranta-ajan näillä potilailla oli 16,8 kuukautta (504 päivää, 360-661), joka ei ollut merkittävästi erilainen verrattuna EML4-ALK negatiivinen ryhmä 33,4 kk (594,5 päivää, 0-1329) (

P

= 0,655).

Meta-analyysi kliinisiä tekijöitä, jotka liittyvät EML4-ALK translokaatio

Kuten taulukosta 4, systemaattinen analyysi kirjallisuuden paljasti 14 julkaisuissa analysoidaan taajuuden ja kliinisiä tekijöitä liittyvä EML4-ALK translokaatio, mukaan lukien 2580 NSCLC potilaat. Näistä 125 potilasta (4,84%, 125/2580) kanna EML4-ALK uudelleenjärjestelyn. Meta-analyysi osoitti, että EML4-ALK translokaatio oli hallitseva naispotilaiden adenokarsinooma. Yksitoista tutkimukset (1825 tapausta) tutki korrelaatio tupakointi ja EML4-ALK translokaatio. Olemme havainneet huomattavan bias välillä tupakoinnin ja savuton ryhmät (

P

= 0,49), joten tiedot analysoitiin käyttämällä satunnaisvaikutusten malli. Merkittävä ero havaittiin EML4-ALK positiivisuus aseman välillä tupakoitsijoita ja tupakoimattomien (OR [95% CI] = 0,26 [0,16, 0,43], Z = 5,26;

P 0,05

) (kuvio 6A) . Nämä tulokset osoittivat, että tupakointi oli merkitsevästi liittyy EML4-ALK translokaatio. Yhdeksän raportit (1413 tapausta) arvioi EML4-ALK translokaatio in adenokarsinoomaa ja ei-adenokarsinooma ryhmiä. Olemme havainneet mitään merkittävää harhaa kahden ryhmän välillä (

P

= 0,50), joten kiinteiden vaikutusten mallin avulla. Tuloksemme viittaavat siihen, että EML4-ALK translokaatio taajuus erosivat adenokarsinooma ryhmässä verrattuna ei-adenokarsinooma (OR [95% CI] = 2,07 [1,11, 3,84], Z = 2,30;

P 0,05

) (kuvio 6B). Yksitoista tutkimukset (1777 tapausta) arvioitiin EML4-ALK translokaatio miesten ja naisten ryhmiä. Löysimme merkittävää harhaa kahden ryhmän välillä (

P

= 0,95) ja analysoi dataa kiinteiden vaikutusten malli. Tuloksemme osoittivat, että ei ollut merkitsevää eroa miesten ja naisten ryhmiä. (OR (95% CI) = 0,64 [0.40,1.04] Z = 1.80,

P

0,05) (kuvio 6C).

(A) Meta-analyysi käytettäessä satunnaista vaikutuksia malli osoitti, että tupakointi korreloi merkitsevästi EML4-ALK siirtämistä; (B) meta-analyysi dataa kiinteiden vaikutusten malli osoitti, että adenokarsinooma (AD) korreloi merkitsevästi EML4-ALK translokaatio. Translokaation oli huomattavasti yleisempää AD-ryhmässä kuin ei-AD ryhmä; (C) Meta-analyysi käyttäen kiinteiden vaikutusten malli ehdotti, että sukupuoli ei merkittävästi korreloi EML4-ALK translokaatio taajuus.

Keskustelu

Keuhkosyöpä on tuhoisa sairaus liittyy 5 vuoden pysyvyys on noin 10-15%. Vaikka uudet kemoterapeuttisia lääkkeitä on kehitetty viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on vielä kiireesti tehokkaampia hoitoja. Molekyylirakennetta suunnattu hoitoja esittää uuden strategian, viime aikoina osoittaneet, että on tärkeää osa-luokituksessa potilaat mukaan kasvainspesifisiä biologisia ominaisuuksia.

EGFR ja KRAS kaksi asiaa molekyylejä NSCLC, ja EGFR on kohdistettu EGFR-TKI. Nämä lääkkeet osoittavat suurta potentiaalia hoidettaessa potilaita, joilla on edennyt NSCLC. Lukuisat raportit ovat vahvistaneet, että teho EGFR-TKI korreloi EGFR eksonin mutaatioita [5], [8], ja että esiintyvyys EGFR mutaatioiden on korkeampi keskuudessa aasialaiset, tupakoimattomien, naaraat, ja potilailla, joilla adenokarsinooma. Soda et al. (2007) ehdottivat lisäksi mahdollisesti merkitystä onkogeeninen tapahtuman keuhkosyöpä: fuusio EML4 geenin (alue, joka vastaa N-terminaalinen segmentti) ja ALK-geenin (alue, joka vastaa solunsisäisen signaloinnin osa) luoda EML4-ALK-fuusiogeenin . EML4-ALK translokaatio edustaa uutta alaryhmä NSCLC potilaat reagoivat myönteisesti ALK estäjien [11], [20].

Työmme vahvistaa ilmaantuvuus (24,5%) EGFR mutaatioita valitsematon Kiinan väestöstä potilasta NSCLC. Joukossa eksonit 18-21, EGFR mutaatioita esiintyy pääasiassa (90,19%) eksonien 19 ja 21. yhteensopivuutta aikaisempien raporttien, nämä mutaatiot tunnistetaan korkeilla taajuuksilla naisilla, ei-tupakoitsijoita, ihmiset aasialaista alkuperää, ja adenokarsinooma potilaat. Mielenkiintoista, ilmaantuvuus (6/208, 2,88%) on KRAS mutaatioita meidän tutkimusryhmän oli hyvin alhainen verrattuna länsimaissa (12-25%) [21].

Työmme vahvistaa myös alhainen ilmaantuvuus ( 7/208, 3,37%) ja EML4-ALK translokaatio keskuudessa valitsematta pienisoluista keuhkosyöpää, joka on yhdenmukainen meta-analyysi kliinisiä tekijöitä, jotka liittyvät EML4-ALK translokaatio julkaistussa kirjallisuudessa (4,84%). Tämä tulos osoittaa, että esiintyvyys EML4-ALK mutaatioita Kiinan väestöstä on samanlainen kuin aiemmin julkaistu väestölle muiden etnisten ryhmien. EML4-ALK translokaatio ei saa liittää johonkin tiettyyn etnisyys, toisin kuin EGFR mutaatioita aasialaiset. Lisäksi analyysi EML4-ALK mutaatio variantit paljasti, että variantti 3 voi olla hallitseva variantti Kiinalaisten pienisoluista keuhkosyöpää yli puolet EML4-ALK translokaatiot näytteille fuusioita välillä eksonissa 6 EML4 ja eksonin 20 ALK. Nämä tulokset viittaavat edelleen siihen, että esiintyvyys EML4-ALK mutaatiota saavat vaihdella etnisen vaan että tietty variantti voi olla vallalla yhden tietyn etnisen ryhmän.

Tuloksemme osoittavat lisäksi, että EML4-ALK translokaatio tapahtuu pääasiassa naispuoliset, ei koskaan tupakoineet, ja adenokarsinooma potilaat. Nämä tulokset olivat erilaisia ​​kuin meta-analyysi sukupuolen, jossa ei ollut merkitsevää eroa miesten ja naisten ryhmiä. Tutkimuksessamme kaikki 7 ALK-positiivisia tapauksia oli naisia, ja syynä voi johtua paljon suurempi tupakointimäärään miehillä kuin naisilla Kiinassa. Tarkempi analyysi osoitti, että esiintyvyys EML4-ALK translokaatio naisten, savuton, adenokarsinooma potilaita on peräti 15,2%. Nämä ominaisuudet on suuri merkitys, koska nainen, savuton, adenokarsinooma potilaat valitaan tyypillisesti hyötyä EGFR-TKI hoito, joka osoittaa että EML4-ALK translokaatio näytön tulisi edeltää TKI hoitoa. EGFR /KRAS mutaatioita ja EML4-ALK translokaatio kutsutaan kuljettajan mutaatioita, koska ne ovat vastuussa sekä aloitus ja ylläpito keuhkosyöpään. Potilaat, jotka elinympäristön EML4-ALK translokaatio ei yleensä reagoi EGFR-TKI hoitoa, mutta voivat olla herkkiä ALK estäjien [11], [20].

Tutkimuksessamme vertailu EML4-ALK fuusio tila läsnäolon kanssa EGFR ja KRAS mutaatiot samassa syövän näytteistä kävi ilmi, että EML4-ALK-fuusioiden tapahtui ilman EGFR tai KRAS mutaatioita. Vaikka edellinen raportit ovat osoittaneet, että ALK fuusio voi tapahtua samanaikaisesti EGFR mutaatioita (1/305) ja KRAS mutaatioita (1/120), nämä voivat olla harvinaisia ​​tapahtumia [7], [22]. Tarkempi analyysi osoitti, että 32 tapauksessa savuton, naispuolinen, adenokarsinooma potilaat että taajuus EGFR eksonin mutaatioiden ja EML4-ALK translokaatio olivat 62,5 %% (20/32) ja 15.63% (5/32), tässä järjestyksessä, joka kattaa kaikki 78.13% (25/32) näistä potilaista. Lisäksi, Sasaki et ai. raportoi äskettäin, että 6% (3/50) ja aiemmin hoitamattomista pienisoluista keuhkosyöpää ALK uudelleenjärjestely oli samanaikainen EGFR aktivoivia mutaatioita ja että ALK uudelleenjärjestely oli aktiivinen näillä potilailla johtuen EGFR-mutaatio [23]. Koska useimmilla potilailla EML4-ALK-fuusiot eivät osoita EGFR mutaatioita, tietty molekyyli osajoukko adenokarsinoomien on ominaista EML4-ALK fuusio [14]. Nykyään tiettyjä molekyylien lääkkeitä EML4-ALK fuusio hoidetaan NSCLC sairastavien potilaiden EML4-ALK translokaatio. Siksi vaiheittaista lähestymistapaa testata geenimutaatioita keuhkoadenokarsinooma ehdotetaan: ensin KRAS, sekunti EGFR, ja sitten EML4-ALK translokaatio. Jos kasvain on positiivinen varten KRAS-mutaatio, enää molekyylitestauksella tarvitaan, ja hoitosuosituksia keskittyy kemoterapian koska kasvaimiin kätkeminen somaattiset mutaatiot KRAS, joka koodaa GTPaasina myötävirtaan EGFR, näyttää enemmän resistenssin näille kohdennettuja lääkkeitä. Jos kasvain on negatiivinen, se testataan EGFR mutaatioita ja EML4-ALK translokaatio. Positiivinen tulos joko EGFR mutaatio tai EML4-ALK translokaatio laukaisee kohdennettu hoito: EGFR-TKI tai ALK estäjä.

patologisen analyysin seulamaisessa rakenne, läsnäolo limakalvojen solujen ekstrasellulaarinen limaa, ja puute merkittävistä ydin- pleomorfisimia, voidaan kaikki nähdä EML4-ALK jäsensi syöpä, joka oli samankaltainen kuin havainnot aiemman raportin [18]. ”Solid signet-rengas solukuvio” ja ”mucinous seulamaisessa malli” ovat kaksi tunnistettavissa cytoarchitecures läsnä ainakin fokaalisesti useimmissa ALK-positiivisia kasvaimia [18]. Mitä näihin kaksi kuviota, emme nähneet merkittävää eroa solid sinettisormus-rengas solukuvio ja mucinous seulamaisessa kuvio kaikissa ALK positiivisten tapausten tutkimuksessamme (4/7 vs 3/7, vastaavasti). Mielenkiintoista on, että meidän ALK immunovärjäytyminen tulokset osoittivat, että kaikki kasvainsolut olivat ALK-positiivista värjäytymistä ensisijaisessa sivustoja, erityisesti adenosquamous karsinooma, toisin kuin muissa tutkimuksissa ilmoittaa, että suomuinen karsinooma komponentti tahroja positiivinen [18], [24]. Vielä yllättävää, huomasimme, että 50% etäispesäkekasval- olivat täysin negatiivisia ALK immunovärjäyksen (IHC ja IF). Tämä ilmiö havaittiin myös muissa tutkimuksissa EGFR mutaatioita, joka osoitti 38,0%: n kasvain (30 79), jonka kasvaimensisäisellä heterogeenisyys

EGFR

mutaatioita ja 62,0% (49 79) on homogeeninen, joko

EGFR

mutaatio tai mutaatio ei [25]. Meidän Immunovärjäyksen vahvisti myös kasvaimensisäisellä heterogeenisuus ALK uudelleenjärjestelystä ensisijainen kasvaimia, ja tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti ALK uudelleenjärjestelystä keuhkosyöpään metastaasien vs. ensisijainen sivustoja, joka osoitti molekyyli eroja. Nämä tulokset osoittavat, että geeni-ilmentymisen etäpesäketuumorikudoksen ei ole täysin samanlainen kuin primaarikasvaimen. Sillä hoidettujen potilaiden molekyylikohteena huumeet, nämä tulokset myös huomauttaa, että uusi molekyyli havaitseminen on hyvin tarpeen näille potilaille uusia metastaasien, erityisesti NSCLC potilaalla on EML4-ALK translokaatiot.

Yhteenvetona me vahvistaa, että EGFR eksoni mutaatiot ovat yleisiä potilailla, joilla on NSCLC, varsinkin naisten keskuudessa, tupakoimattomien, ja adenokarsinooma potilaat. EML4-ALK translokaatiot ovat harvinaisia ​​koko NSCLC potilasryhmässä, mutta ovat yleisiä NSCLC potilaiden alaryhmä nainen, savuton, adenokarsinooma potilaita. Läsnäolo EML4-ALK translokaatio samanaikaisessa EGFR /KRAS mutaatioiden on erittäin harvinaista keuhkosyöpäpotilaita. Tuloksemme osoittavat, että havaitseminen EML4-ALK translokaatio in potilailla, joiden NSCLC on ratkaiseva soveltamista täsmähoitoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Näytteet saatiin 208 NSCLC potilaiden, joille tehtiin kirurginen resektio ensisijainen keuhkosyöpään laitoksella Lung Cancer Surgery, Tianjin Medical University General Hospital diagnosointiin ja hoitoon 2006-2010. Kirjallinen suostumus saatiin ja tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten eettisen komitean Tianjin Medical University General Hospital. Sisällyttäminen olivat: (1) kirurginen hoito ilman edeltävää kemoterapiaa tai hoito EGFR-TKI; (2) selkeä diagnoosi NSCLC; ja (3) saatavuus kudosten biomarkkereiden tutkimuksiin. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet potilaiden mukana esitetään taulukossa 1. Keuhkosyöpä pysähdyspaikan kullekin potilaalle suoritettiin mukaisesti AJCC Cancer Staging Manual, 7. painos. Tämän tutkimuksen potilaiden oli suhteettoman luokiteltiin vaiheen III, koska tässä vaiheessa keuhkosyöpään liittyy leikkaushoitoa. Elinaika laskettiin päivänä resektio asti 6. huhtikuuta 2011. resektoitiin keuhkokudokset upotettiin välittömästi nestemäisessä typessä.

H2228, ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjan EML4-ALK -fuusiogeenin, oli American Tissue Culture Collection (ATCC), ja pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO), 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

RNA: n eristys ja käänteinen transkriptio

jäädytetyt kudokset (50-100 mg), jauhettiin jauheeksi nestemäisessä typessä ja suspendoitiin 1 ml: aan TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA) ja kokonais-RNA uuttamalla, mukaan valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA kvantitoitiin käyttämällä spektrofotometriä (Beckman-Coulter, USA), ja sen laatu arvioitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Kokonais-RNA (2 ug) käänteiskopioitu (RT) käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, USA), vähäisin muutoksin valmistajan protokollaa.