Krooninen sairaus

tiivistelmä

Krooninen tulehdus-edistänyt etäpesäke on pidetty suuri haaste syövän hoidossa. Tulehdusta edistävä sytokiini TNFa voi aiheuttaa syöpää invaasiota ja etäpesäkkeiden liittyvät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Kuitenkin mekanismit eivät ole täysin selvä. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että TNFa indusoi EMT ihmisen HCT116-soluissa ja siten edistää peräsuolen syöpä (CRC) ja metastaasit. TNFa-indusoitu EMT karakterisoitiin hankkimalla mesenkymaalisten karamaisen morfologia ja lisäämällä ilmentymistä N-kadheriinin ja fibronektiinin kanssa samanaikaisesti alentava E-kadheriinin ja Zona occludin-1 (ZO-1). TNFa hoito lisäsi myös ilmentymistä transkriptiotekijä Snail, mutta ei Slug, ZEB1 ja Twist. Yliekspressio Snail indusoi siirtymistä E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen HCT116-soluissa, joka on ominaista EMT. Kääntäen, knockdovvn Snail vaimensi merkittävästi TNFa aiheuttama EMT in HCT116-soluissa, mikä viittaa siihen, että Snail on keskeinen rooli TNFa aiheuttama EMT. Mielenkiintoista, altistuminen TNFa nopeasti kasvanut Snail-proteiinin ilmentymisen ja Snail ydinvoiman lokalisointi mutta ei mRNA tasolla säätelyä. Lopuksi osoitimme, että TNFa koholla Snail vakauden aktivoimalla AKT-reitin aktivaation ja myöhemmin tukahduttaa GSK-3β toimintaa ja vähentää yhdistys Snail GSK-3β. Knockdown GSK-3β entisestään vahvistanut meidän havainto. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että AKT /GSK-3β-välitteisen stabilointi Snail tarvitaan TNFa-indusoidun EMT CRC-soluissa. Tutkimuksemme tarjoaa paremman käsityksen tulehduksen indusoiman CRC etäpesäkkeitä.

Citation: Wang H, Wang H-S, Zhou B-H, Li C-L, Zhang F, Wang X-F, et ai. (2013) epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) indusoima TNF-α Vaatii AKT /GSK-3β-välitteisen stabilointi Snailin peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10,1371 /journal.pone.0056664

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 19 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Basic Research Program of China (973 Program, No. 2011CB935800), ja National Natural Science Foundation of China (nro 30873032 ja nro 81071712). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Krooninen tulehdus on todettu olevan läheisesti tuumorigeneesiin liittyvistä [1], [2]. Lisääntyvä todisteita ovat osoittaneet, että tulehduksellinen kasvain microenvironment keskeinen rooli kasvainten kehittymiseen ja etäpesäkkeiden [3]. Kasvain microenvironment pitkälti takana ovat tulehdussolujen, jotka helpottavat soluväliaineen erittely, angiogeneesi, ja kudoksen uudelleen, mikä edistää kasvaimen soluliikkuvuus [4]. Lisäksi kasvainsolut voivat itse erittää tulehdusta edistäviä sytokiineja, jotka edistävät suoraan pahanlaatuisia etenemiseen [5]. Monimutkainen vuorovaikutukset kasvain ja tulehdussolujen välittävät tulehduksellisten sytokiinien ovat olennainen osa kasvaimen microenvironment [6]. Tuumorinekroositekijä α (TNFa), joka on tulehdusta edistävä sytokiini, pääasiassa tuotetaan makrofagit, on keskeinen molekyyli säännellään tulehduksellisten prosessien kasvaimen edistämisen. Asennus todisteita ehdotti, että TNFa välittää monia kriittisiä prosesseja syövän etenemisen, mukaan lukien onkogeenin aktivaatio, DNA-vaurioita, ja kasvaimen etäpesäkkeiden [7].

Epithelial-mesenkymaalitransitioon (EMT), olennainen fenotyyppinen muuntaminen alkionkehityksen aikana, kudos remodeling, ja haavan paranemista, on korvaamaton rooli tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden [8] – [10]. EMT on palautuva prosessi, joka usein tapahtuu invasiivisia edessä monet metastasoituneen syöpien [11]. EMT voidaan laukaista eri vastaanotetut signaalit kasvaimen mikroympäristössä, kuten TGFp, EGF, WNTs ja Notch [12]. Aikana prosessit EMT, epiteelisolujen menetys välistä adheesiota, hankkia fibroblasti-ominaisuuksiltaan ja lisätä vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia [13]. Yksi hyvin määriteltyjä ominaisuuksia EMT on menetys E-kadheriinin ilmentymisen [8]. Joukko transkriptiotekijöiden, kuten Snail, Slug, ZEB1, Twist, ovat sekaantuneet valvonnassa EMT [14]. Snail, sinkki sormen transkriptiotekijä ensimmäinen tunnistettu Drosophilan, on osoittautunut keskeiseksi EMT säädin [15]. Tutkimukset osoittivat, että Snail tukahduttaa E-kadheriinin transkription sitoutumalla E-box sivusto promoottori E-kadheriinin [16] – [18]. Roolit Snail in EMT asetuksessa on raportoitu monissa syöpätyypit, kuten rinta-, munasarjakarsinooma jne [14], [18], [19]. Hiljentäminen Snail vakaa RNA-interferenssi indusoi täydellisen mesenkymaalisten epiteeli- siirtyminen (MET) MDCK-Snail-soluissa, jotka on yhteydessä estyminen hyökkäyksen [20]. Lisäksi korkea ilmentyminen Snail myös korreloi kasvaimen, toistumisen, solmukohtien etäpesäkkeitä ja huono tuloksia potilailla [21] – [25]. Useat tulehduksen välittäjäaineiden, kuten TGF, hypoksia ja IL-6 voi ylössäätää Snail ja käynnistää sen vuoksi EMT [3]. Nämä havainnot korostavat, että microenvironment sääntelyssä Snail ja aloittamisen EMT.

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä maailmanlaajuinen terveysongelma. Useimmat kuolemantapaukset CRC johtuu etäpesäkkeitä, jotka ovat vastustuskykyisiä perinteisiin hoitoihin. EMT on erittäin merkittävä asia CRC etäpesäkkeiden [26]. Kuitenkin rooli TNFa EMT CRC on harvoin tutkittu ja taustalla molekyylitason mekanismi jää epäselväksi. Täällä osoitti, että TNFa aiheuttama EMT stabiloimalla Snail in HCT116 ja Caco-2-soluihin. Olemme myös osoittaneet, että TNFa stabiloi Snail aktivoimalla AKT reitin ja siten GSK-3β toimintaa ja vähentää yhdistys GSK-3β ja Snail.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

NF-KB-inhibiittori BAY11-7082, ERK-inhibiittoria PD98059, p38 MAPK estäjä SB-203580, PI3K-inhibiittori LY294002, GSK-3β estäjä litium (LiCl: ää) ja proteasomin inhibiittoria MG132 saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Ensisijainen vasta-aineita E-kadheriinin, Zona occludin-1 (ZO-1), Etana, ZEB1, p-GSK-3β (ser9), GSK-3β, p-Akt (Ser473), Akt, ja β-kateniinin saatiin Cell Signaling Technology (MA, USA). Primaarista vasta-ainetta vastaan, histoni H2A.X saatiin Bioworld (Bioworld Technology, Minneapolis, MN, USA). Proteiini A /G Sepharose ja ensisijainen vasta-aineiden N-kadheriinin, ubikitiini, β-aktiini, α-tubuliinin saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Ensisijainen vasta-fibronektiiniin saatiin Boster Biological Engineering. (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, Alexa Fluor 488/594 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, DAPI ja lipofektamiini 2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Rekombinantti ihmisen TNFa-proteiinin ostettiin PeproTech. PrimeScript® RT reagenssipakkauksen ja SYBR® Premix Ex Taq ™ olivat tuotteita Takara. E.Z.N.A® HP Total RNA Kit ostettiin Omega Bio-Tek (Doraville, USA). Smart allas siRNA ihmisen Snail ja GSK-3β olivat RIBOBIO.

Cell Culture

HCT116 ja Caco-2 peräsuolen sinoomasolulinjoja saatu Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). HCT116-soluja ylläpidettiin McCoy’5a elatusaineessa (Gibco BRL), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, ja Caco-2-soluja viljeltiin DMEM-elatusaineessa (Gibco BRL), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa inkubaattorissa.

TranswellTM Migration ja invaasiomääritys

Muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin Boyden kammioissa. Polykarbonaatti suodattimet (8 um huokoskoko, Corning) esipäällystetty matrigeelin Matrix (BD Biosciences) käytettiin invaasiomääritys, ja päällystämättömän suodattimia käytettiin migraatiokokeessa. Solut (1 x 10

5) 300 ul väliaineessa (sisälsi 0,1% FBS) kanssa tai ilman sitä 20 ng /ml TNFa kylvettiin ylemmässä kammiossa. Sitten 600 ml väliainetta 10% FBS lisättiin alempaan kammioon ja toiminut kemotaktinen aine. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, maahanmuuton, solut vaelsivat ja liimattu kiinni alempaan kammioon kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 20 min, värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin pystyssä mikroskooppi (5 kentät per säiliö). Sillä invaasio solut ylemmässä kammiossa kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 20 min. Sitten Matrigel mekaanisesti poistaa suodattimesta pumpulipuikolla. Solut kiinni alapinnalle suodattimen värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin pystyssä mikroskooppi (5 kentät per säiliö). Jokainen muuttoliike ja invaasiomääritys toistettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Gene Yli-ilmentyminen ja RNA-interferenssi

Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle (2 x 10

5 solua /kuoppa) ja jätettiin kulttuuriin vasta seuraavana päivänä. Sitten ne transfektoitiin 2 ug: plasmidivektori tai 100 pmol siRNA oligomeeri sekoittuu lipofektamiinin 2000 reagenssilla seerumin vähentää väliaineessa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Medium vaihdettiin loppuun viljelyalustaan ​​6 tuntia myöhemmin, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2 inkubaattoriin vielä 24-48 tuntia ennen sadonkorjuuta.

Quantitative Real-Time PCR

Yhteensä mRNA soluista uutettiin hoidon jälkeen määritettynä ajankohtana. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi tuotettu 500 ng kokonais-RNA: ta. Kvantitointi kohde- ja viite (GAPDH) geenien suoritettiin kolminkertaisena on LightCycler® 480 II (Roche, Applied Science). Alukkeet, joita käytetään kussakin reaktiossa olivat seuraavat: E-kadheriinin eteenpäin 5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 ’ja reverse 5′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; N-kadheriinin, eteenpäin 5’-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 ’ja reverse 5′-GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3’; Snail, eteenpäin 5’GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 ’ja reverse 5′- TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′; ZEB1, eteenpäin 5’-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 ’ja reverse 5′-GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3′; Kierre, eteenpäin 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 ’ja reverse 5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′; Slug, eteenpäin 5’-TTCGGACCCACACATTACCT-3 ’ja reverse 5′-GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3’; GAPDH, eteenpäin 5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ’ja reverse 5′- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’. Sen jälkeen, kun normalisoitu GAPDH-geenin, ekspressiotasot kutakin kohdegeenin laskettiin käyttäen vertailevaa kynnyksen syklin (CT) menetelmää. ACt-arvot laskettiin seuraavan kaavan mukaan ACt = ct (geeni) -ct (GAPDH) korrelaatio analyysi, ja 2-ΔΔct laskettiin kaavan ΔΔct = ACt (kontrolliryhmä) -Δct (koeryhmä) määrittämisessä suhteellista. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Western-blottaus-analyysi

Solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä fosfaattipuskurilla (PBS), ja sitten lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,5% Na-deoksikolaattia, 5 ug /ml aprotiniini, 5 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja denaturoitiin keittämällä Laemmli-puskurissa. Yhtä suuret määrät proteiinia näytteistä ladattiin kuoppaa kohti ja erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, ja sitten siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-kalvoja. Seuraavat estää 5% rasvatonta maitoa huoneenlämmössä 2 h, membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1:1,000 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:5,000 laimennos) 2 h huoneenlämpötilassa. Im- kompleksit havaita käyttämällä Western-blottaus Plus Chemiluminescence reagenssia (Life Science).

Immunofluoresenssi

Soluja viljeltiin kammion dioja, seerumia 12 tuntia, sitten altistetaan TNFa varten osoitettu aika. Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,3% Triton X-100: ssa 10 min. Sen jälkeen, kun esto vuohen seerumia 2 tuntia huoneenlämpötilassa, soluja inkuboitiin vasta-aineiden E-kadheriinin, N-kadheriinin, fibronektiini, ZO-1 tai Snail (1:100 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli. Levyjä pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488 tai Alexa Fluor 594-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita (1:1,000 laimennos) 1 h huoneen lämpötilassa. Tumat värjättiin DAPI (10 ug /ml) 10 min. Näytteitä tutkittiin CLSM (Zeiss) analysoida ilmentyminen E-kadheriinin, N-kadheriinin, fibronektiini, ZO-1 ja tumaansiirtymiseen Snail.

Immunosaostaminen

Soluja pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin 4 ° C: ssa immunosaostuksella lyysipuskurissa, joka sisälsi 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glyserolia, 1 mM Na

3Vo

4, 1 mM NaF, 1 mM ditiotreitolia, 1 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli fluoria, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia ja 1 ug /ml aprotiniinia. Yhtä suuret määrät proteiinia, immunosaostettiin käyttäen anti-Snail tai anti-GSK-3β-vasta-aineen, ja immuunikompleksien sidottiin proteiini A /G Sepharose. Helmet pestiin lyysipuskurilla ja alistettiin western blotting anti-ubikitiini, anti-Snail tai anti-GSK-3β-vasta-ainetta.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmen erillisen kokeen, ellei toisin mainita. Tiedot analysoitiin kaksisuuntaisella parittomalla Studentin t-testi minkä tahansa kahden ryhmän välillä. Yksisuuntainen ANOVA-varianssianalyysin käytettiin arvioimaan eron avulla ryhmien välillä. Nämä analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism Software Version 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

TNFa Edistää Migration ja invaasiota HCT116 Cells

tuumorisoluja aggressiivinen fenotyyppi hankkia muuttavien ja invasiivisia valmiuksia. Tämä edistää levittämistä kasvainten solujen kaukaisiin elimiin [8]. Siirtyminen ja hyökkäys kyvyt HCT116-solujen vaikuttaa TNFa mitattiin käyttäen siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Kuten kuviossa 1A ja C, TNFa hoito johti merkittävään kasvuun solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Verrattuna kontrolli määrä siirtynyt ja invasiivisen-solujen määrä nousi noin 4-kertainen (siirtymä) ja 20-kertainen (hyökkäys) käsittelyn jälkeen TNFa (Fig. 1 B ja D).

(A) HCT116-soluja sallitaan siirtyä transwell kammioihin 24 tuntia, kun läsnä tai poissa TNFa (20 ng /ml). 24 tunnin kuluttua, siirrettyjä solut kiinnitettiin, värjättiin, ja valokuvataan. Suurennus, 100 x. (B) lukumäärä siirtynyt solujen. Tiedot edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. (C) käsittelyn jälkeen tai ilman TNFa (20 ng /ml) 48 h, HCT116-soluja, jotka oli levinnyt läpi matrixgel ja osaksi alle puolelle suodattimen kiinnitettiin, värjättiin ja valokuvattiin. Suurennus, 200 ×. (D) määrä invasiivisia soluja. Tiedot edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. * P 0,05 verrattuna ohjaus.

TNFa EMT vuonna HCT116 Solut

Lisääntynyt maahanmuutto ja invaasio kyvyt kasvainsolujen muistuttavat tapahtumista EMT, jonka aikana, The epiteelin päättäjät E-cadhein ja ZO-1 ovat alassäädetty, kun taas mesenkymaaliset markkereita N-kadheriinin ja fibronektiini ovat säädelty [27]. EMT on HCT116-solujen havaittiin stimuloinnin jälkeen 20 ng /ml TNFa: aa varten 4 päivää. Solut johti merkittävään muutokseen morfologiassa, mistä mukulakivi morfologia mesenkymaalisten karamaisen ja fusiform piirteitä (Fig. 2A). Immunofluoresenssianalyysi osoitti, että tämä morfologinen muutos liittyy säätelyä alaspäin epiteelisolujen ominaisuuksia E-kadheriinin, ZO-1 ilmentymisen ja säätelyä mesenkymaalisten ominaisuuksien fibronektiinin ja N-kadheriiniekspressiota (Fig. 2A). Vastaavasti, western blotting-analyysi vahvisti lisäksi yhä ilmentymistä fibronektiinin ja N-kadheriinin, ja vähentämällä ilmentyminen E-kadheriinin ja ZO-1-proteiinin tasot (Fig. 2B). Lisäksi qRT-PCR-analyysi osoitti, että TNFa hoito alassäädetty E-kadheriinin ja säädelty N-kadheriinin mRNA tasolla (Kuva. 2C). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että HCT116-solut oli tehty EMT jälkeen käsitelty TNFa.

(A) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 4 päivää. Cell morfologiset muutokset liittyvät EMT näkyvät faasikontrastikuvassa. Expression of E-kadheriinin, ZO-1, fibronektiini, N-kadheriinin analysoitiin immunofluoresenssin. Tumat visualisoitiin DAPI värjäystä. Mittaviivat: 20 pm. (B) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 4 päivää, ja ilmaisu E-kadheriinin, ZO-1, fibronektiini, N-kadheriinin, Snail, ZEB1, Twist, Slug analysoitiin western blotting. p-aktiini palvelimia kuin latauskontrollina. (C) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 4 päivää. MRNA-tasot E-kadheriinin, N-kadheriinin, Snail, ZEB1, Twist, Slug analysoitiin qRT-PCR: llä. * P 0,05 verrattuna ohjaus.

Etana on ratkaiseva TNFa-välitteistä EMT

Koska transkriptiotekijöiden Snail, ZEB1, Twist ja Slug on olennaiset roolit säätelyssä EMT [14] meidän olivatko niiden ilmaisuja olivat säädellään ylöspäin HCT116-soluissa jälkeen käsitelty TNFa. Käsittelemättömiin soluihin verrattuna, TNFa kasvoi merkittävästi Snail-proteiinin taso, mutta ei mRNA: n taso (Fig. 2B ja C). Kuitenkin TNFa hoito muuttanut ole mRNA eikä proteiinin tasot ZEB1, Twist, Slug (Fig. 2B ja C).

yli-ilmentynyt Snail lisätutkimuksia sen roolit TNFa aiheuttama EMT of HCT116-solujen. Solut transfektoitiin pcDNA-Snail ja ohjaus pcDNA-3,1, vastaavasti. Expression of Snail ja EMT markkereita havaittiin immunofluoresenssilla ja western-blottauksella. Tulokset osoittivat, että lisääntynyt Snail ilmentyminen indusoi EMT-, kuten morfologisia muutoksia ja aiheutti siirtyminen E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen HCT116-soluissa (kuvio. 3A ja B). Nämä havainnot osoittivat, että ektooppinen ilmentyminen Snail voi laukaista EMT sisään HCT116-soluissa. Näiden havaintojen perusteella arvioimme, että Snail ylössäätöä voi olla ratkaiseva TNFa aiheuttama EMT in HCT116-soluissa.

(A) pcDNA-Etana (Etana) tai kontrolli pcDNA- 3,1 (Vector) ilmaistiin in HCT116-soluissa 48 tuntia. Cell morfologiset muutokset liittyvät EMT näkyvät faasikontrastikuvassa. Expression of E-kadheriinin ja N-kadheriinin analysoitiin immunofluoresenssin. Nuclei visualisoitiin DAPI värjäystä. Mittaviivat: 20 pm. (B): n ilmentyminen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja Snail alkaen HCT116 transfektoitujen solujen pcDNA-Snail tai kontrollivektorille tutkittiin western blottauksella. p-aktiini palvelimia kuin latauskontrollina. (C) HCT116-solut, jotka on transfektoitu Snail erityisiä si-RNA: ta (si-Snail) tai negatiivinen kontrolli si-RNA: ta (si-NC) stimuloitiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 48 h, ja morfologisia muutoksia havaittiin joiden faasikontrastimikroskopiaan. (D) HCT116-soluja, jotka on transfektoitu si-Snail tai si-NC-stimuloitiin tai ilman TNFa (20 ng /ml) 4 päivää, ja ilmaisu E-kadheriinin ja Snail havaittiin Western blot. β-aktiini-palvelimia kuin latauskontrollina.

suoritetaan edelleen Knockdown määrityksiä tarkistaa, että Snail on keskeinen säädin TNFa aiheuttama EMT. HCT116-solut transfektoitiin ei-kohdistuksen ohjaus si-RNA: n tai si-Snail 24 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin TNFa: n eri aikaan. Morfologisia muutoksia havaittiin alle faasikontrastimikroskoopilla. Ilmaukset Snail ja E-kadheriinin havaittiin Western-blottauksella. Verrattuna kontrolliryhmään, karamaisen morfologisia muutoksia ei havaittu heti TNFa lisäys SI-Snail transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3C). Hiljentäminen Snail myös heikennettyjä TNFa-indusoidun-säätely E-kadheriinin, joka ei havaittu kontrolli si-RNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3D). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että Snail on välttämätön TNFa aiheuttama EMT in HCT116-soluissa.

TNFa säätelee vakautus- ja solunosasijaintia Snail

aiemmin havaittu, että TNFa lisääntynyt Snail-proteiinin tasoa, mutta ei mRNA tasolla (Kuva. 2B ja C). Tämä tulos viittaa siihen, että säätely ylöspäin Snail by TNFa esiintyvät transkription jälkeisellä tasolla. Edelleen varmistamiseksi tätä näkemystä, HCT116 ja Caco-2-soluja käsiteltiin TNFa: n ja 0-8 h, ja Snail-proteiini ja mRNA havaittiin Western-blottauksella ja qRT-PCR: llä, vastaavasti. Tulokset osoittivat, että proteiini taso Snailin parannettu 1 h TNFa: n stimulaation ja lisääntyneen aikariippuvainen (Fig. 4A). Kuitenkin mRNA taso Etana ei ollut merkittävää muutosta jälkeen TNFa hoidon (Fig. 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että säätelyä Snail TNFa saattaa johtua proteiinin stabiloimiseksi.

(A-B) HCT116 ja Caco-2-soluja käsiteltiin TNFa: n (20 ng /ml) ja ajat ilmoitettu, ja proteiini (A) ja mRNA (B) tasot Snail tutkittiin western-blottauksella ja qRT-PCR vastaavasti; (C) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 6 tuntia. Kiinnityksen jälkeen solun sijainti Snail (vihreä) tutkittiin immunofluoresenssivärjäyksen ja tumat värjättiin DAPI (sininen). Mittaviivat: 20 pm.

Koska transkriptio tekijät voivat toteutua vain, jos he siirtyvät tumaan [28], myös määritti tumaansiirtymiseen aktiivisuuden Snail immunofluoresenssilla. Ydin- paikallistaminen Snail arvioitiin HCT116-soluissa stimuloidaan tai ilman TNFa 8 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, verrattuna kontrolliryhmään, TNFa lisäsi merkittävästi ydinvoiman translokaatiota Snail.

TNFa sovittelee Snail stabilointi kautta aktivointi AKT ja GSK-3β

Tutkiakseen molekyylitason mekanismeista TNFa -välitteisen Snail vakauttaminen, estäjät NF-KB: n (BAY11-7082), PI3K /AKT (LY294002), MAPK (PD98059), p38 (SB-203580) käytettiin, koska TNFa voi indusoida aktivointi näistä reiteistä. HCT116 ja Caco-2-soluja esikäsiteltiin estäjillä 1 tunti, ennen kuin TNFa: n stimulaatiota ja sen jälkeen ilmentyminen Snail määritettiin western blottauksella. Olemme havainneet, että PI3K /AKT-estäjällä (LY294002), mutta ei muiden, esti täysin TNFa-stabiloitu Snail (Fig. 5A), mikä viittaa siihen, että aktivointi PI3K /AKT-reitti on vastuussa TNFa-välitteisen Snail vakauttaminen.

kautta. (A) HCT116-soluja esikäsiteltiin SB-203580 (20 uM), PD98059 (20 pM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) 1 tunti vastaavasti seurasi stimulaatio TNFa: lla (20 ng /ml) 6 h. Ilmentyminen Snail tutkittiin western blottauksella. Caco-2-soluja esikäsiteltiin SB-203580 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) 1 tunti vastaavasti seurasi stimulaatio TNFa: lla (20 ng /ml) 6 tuntia. Ilmentyminen Snail tutkittiin western blottauksella. (B) HCT116-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman LY294002 (20 uM) 1 tunti, minkä jälkeen stimulaation kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 6 tuntia. Ilmentyminen Snail ja aktivoinnista AKT ja GSK-3β tutkittiin western blottauksella. (C) HCT116 ja Caco-2-soluja käsiteltiin TNFa: n (20 ng /ml) ja ajat on ilmoitettu. Ilmentyminen pGSK-3β ja GSK-3β tutkittiin western blottauksella. (D) Ohjaus- ja GSK-3β si-RNA ilmennettiin HCT116-soluissa 42 tuntia, minkä jälkeen käsiteltiin kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) vielä 6 tuntia. Ilmentyminen Snail ja GSK-3β tutkittiin western blottauksella. (E) HCT116-soluja käsiteltiin TNFa: n (20 ng /ml) tai LiCI: n (40 mM) 6 tuntia. Ilmentymisen Snail, pGSK-3β, GSK-3β, ja β-kateniinin analysoitiin western-blottauksella. (F) jälkeen käsitelty HCT116-solujen kanssa tai ilman TNFa (20 ng /ml) 6 tuntia, Snail ja β-kateniinin sijaitsevat kalvon ja ydin- eristettiin vastaavasti ja sitten analysoitiin western-blottauksella.

snail on pääasiassa säätelee GSK-3β, kinaasi sijaitsee alavirtaan PI3K /AKT-reitin [24], [29], [30]. GSK-3β ylläpitää aktiivista tilassa defosforyloitiin muodossa. Sen määrittämiseksi, onko vakauttamiseen Snail TNFa välittyy sääntelyä GSK-3β aktiivisuutta, käsittelimme HCT116 soluja LY294002 ennen TNFa hoitoa, ja sitten ilmaus p-AKT, p-GSK-3β, ja Snail määritettiin western blotting. Olemme havainneet, että tasot p-AKT, p-GSK-3β, ja Snail lisättiin sen jälkeen, kun TNFa: aa hoidon 6 h, samalla kun nämä vaikutukset olivat päinvastaiset, kun käsittelemällä LY294002 yksin tai yhdessä TNFa: n kanssa (kuvio. 5B). Olemme ensi mitattiin ajan funktiona GSK-3β fosforylaation ja totesi, että ilmentyminen p-GSK-3β kasvoi ajasta riippuva tavalla siitä TNFa stimulaation HCT116 ja Caco-2-solut (Fig. 5C). Nämä tulokset osoittivat, että stabilointi Snail TNFa johtuu esto GSK-3β aktiivisuutta. Edelleen vahvistavat havaintomme, me pudotti ilmaus GSK-3β in HCT116-soluissa käyttäen tiettyjä GSK-3β si-RNA (Fig. 5D). Verrattuna kontrolli, alas-säätely GSK-3β selvästi kohonneita tasoja Snail ilmentymisen (Fig. 5D). Kuitenkin TNFa-välitteistä Snail vakauttaminen ei vielä koholla jälkeen knockdovvn GSK-3β (Fig. 5D). Vastaavasti, kun käsitellään HCT116-soluja LiCl, voimakas GSK-3β estäjä mukaisesti TNFa: n hoitoon, ilmaukset Snail, p-GSK-3β, ja β-kateniinin (proteiini säätelee GSK-3β) lisättiin ( kuva 5E). Kuitenkin säätely ylöspäin β-kateniinin ei ollut niin ilmeinen kuin Snail. Se saattaa johtua solunsisäisiä lokalisoinneissa välillä β-kateniinin ja Snail ovat erilaisia. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, me eristetty Snail ja β-kateniinin päässä kalvo ja ydin- ja HCT116-solujen käsiteltyjen tai ilman TNFa. Tulokset osoittivat, että erilaiset Snail, β-kateniinin olemassa solukalvon ja TNFa lisää tumaansiirtymiseen Snailin ja β-kateniinin, mutta ei vaikuta kalvon β-kateniinin (Fig. 5F). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että TNFa säädelty Snail in HCT116-soluissa aktivoimalla AKT signalointi, jotka johtavat fosforylaation GSK-3β ja myöhemmin vakiinnuttaa Snail.

TNFa vaimentaa Ubiquitylation of Snail estämällä Association of Snail ja GSK-3β

Koska proteiinin stabiilisuutta Snail säädellään kautta ubikitiinistä välittämän proteasomaalisten huonontumisen me spekuloi onko vakauttamiseen Snail TNFa välittyy tukahduttaminen Snail ubiquitylation. Tämän hypoteesin testaamiseksi, HCT116-soluja käsiteltiin TNFa tai proteasomin inhibiittoria MG132: ssa 6 tuntia, ja sitten Snail immunosaostettiin yhtä paljon lysaatit. Ubikitinaation tila Snail havaittiin Western-blottauksella anti-ubikitiini-vasta-ainetta. Tulokset paljastivat, että verrattuna MG132, TNFa dramaattisesti tukahdutti ubiquitylation of Snail, vaikka koko vakiintunut Snail proteiinit olivat rinnakkain (Fig. 6A). Koska GSK-3β on tärkein kinaasi fosforyloi Snail ja sitten indusoi proteiinien hajoaminen Snail [24], tutkimme seuraavaksi yhdistyksen Snail ja GSK-3β. HCT116-soluja käsiteltiin TNFa tai MG132: ssa 6 tuntia, ja sitten Snail immunosaostettiin yhtä paljon lysaatit, ja siihen liittyvä GSK-3β mitattiin western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, yhdistys Snail GSK-3β väheni soluissa käsitelty TNFa, verrattuna soluihin käsitelty MG-132. Vastaavasti, kun GSK-3β immunosaostettiin HCT116-solut, niihin liittyvät Snail oli merkittävästi vähentynyt käsiteltyjen solujen TNFa, verrattuna soluihin käsiteltiin MG-132 (Fig. 6B). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että TNFa esti yhdistys Snail GSK-3β ja myöhemmin tukahdutti ubiquitylation of Snail.

(A) HCT116-soluja käsiteltiin TNFa (20 ng /ml) tai MG132 (10 uM ) 6 tuntia. Sen jälkeen kun Snail immunosaostettiin yhtä paljon lysaatit (kaksi alinta paneelit), The ubikitinaa- Snail- tutkittiin western blottauksella. (B) HCT116-soluja käsiteltiin TNFa: n (20 ng /ml) tai MG132 (10 uM) 6 tuntia. Snail tai GSK-3β immunosaostettiin vastaavasti yhtä paljon lysaatit ja siihen liittyvän GSK-3β tai Snail havaittiin Western blottauksella.

Keskustelu

Suuri haaste syöpähoidon aikana on etäpesäkkeiden aiheuttama krooninen tulehdus. Kuitenkin mekanismit eivät ole täysin esitetty. Useat tulehduksen välittäjäaineita, kuten TGFp ja IL-6, on osoitettu, että edistetään ja metastaasit syöpien [3]. TNFa on merkittävä pro-inflammatorinen sytokiini, jolla on laaja valikoima biologisia vaikutuksia, mukaan lukien tulehdus, apoptoosi, solujen lisääntyminen ja erilaistuminen [31]. Vaikka TNFa on pidetty syöpälääke, se on tällä hetkellä tunnustettu, että kroonisesti koholla TNFa kudoksissa voi edistää kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden [32]. On joitakin raportteja, että TNFa ilmentyminen lisääntyy seerumissa CRC potilaista [33]. TNFa ilmentyminen liittyy myös syövän etenemisen paksusuolen adenokarsinooman [34]. Lisäksi korkea TNFa ilmentyminen liittyy vahvasti uusiutunut CRC potilailla, joilla on positiivinen imusolmuke metastase [34]. TNFa saattaa olla käyttökelpoinen Maker varhaiseen toteamiseen CRC. Tässä tutkimuksessa selvitettiin tärkeä signalointi akseli, joka säätelee tulehdusta edistävien sytokiinien ja indusoi EMT. Huolimatta keskeinen rooli NF-KB tulehduksellisissa prosesseissa, osoitimme, että AKT /GSK-3β-välitteisen vakauttaminen Snail tarvitaan TNFa aiheuttama EMT CRC soluissa. Perustuu havaintojen ehdotimme mallia, jossa TNFa up-regulation Snail aktivoimalla AKT signalointi ja estää siten GSK-3β aktiivisuutta. TNFa myös estää yhdistyksen Snail ja GSK-3β. Ja sitten TNFa vakiintunut Snail siirto tumaan, pienenee epiteelin päättäjät E-kadheriinin ja ZO-1 ilmaisuja, lisää mesenkymaalisten päättäjät N-kadheriinin ja fibronektiiniä ilmaisuja, lopulta aiheuttaa EMT ja edistää kasvainten etäpesäkkeitä.

EMT on pidetty ensimmäisenä vaiheena kasvaimen invaasion ja metastaasin. Viimeaikaiset tutkimukset paljastivat, että ilmaus profiilit EMT korreloivat kasvaimen laadut ja etäpesäkkeiden Rintasyövän [35], [36].