Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

Sporadic peräsuolen syöpä (CRC) kehittäminen on juokseva prosessi osoittaa ikään riippuvuus, hallitsematon epiteeliproliferaation ja laski apoptoosin. Aikana nuoruusiän kasvun solujen lisääntymistä ja apoptoosia ovat hyvin tasapainossa, joka voi olla levoton vanhetessa. Tavoitteena oli korreloida proliferatiivisia ja apoptoottisten toimintaa ikääntyvän ihmisen paksusuolen epiteelin ja peräsuolen syöpä. Testasimme myös taustalla olevan molekyylibiologian koskevat proliferation- ja apoptoosin-geenin ilmentymisen säätelemiseksi muutoksiin.

Materiaalit ja menetelmät

peräsuolen koepalat terveistä lapsista (n

1 = 14), terveet aikuisilla (n

2 = 10), aikuisten adenoomia (n

3 = 10) ja CRC (n

4 = 10) aikuisilla testattiin Ki-67 immunohistokemia ja TUNEL apoptoosimäärityksessä. Mitosis- ja apoptoosin liittyvän geenin ilmentymistä tutkittiin myös terveillä lapsilla (n

1 = 6), aikuisten (n

2 = 41) näytteistä ja CRC (n

3 = 34) in HGU133plus2. 0 mikrosirujen alustalla. Mitattu muutoksia vahvistettiin RT-PCR niin riippuvainen ja riippumaton näytejoukoilla (n

1 = 6, n

2 = 6, n

3 = 6).

Tulokset

Mitoosi-indeksi (MI) oli merkitsevästi suurempi (p 0,05) ehjä nuoruusiän (MI = 0,33 ± 0,06) ja CRC näytteet (MI = 0,42 ± 0,10) verrattuna terveisiin aikuisiin näytteitä (MI = 0,15 ± 0,06). Sitä vastoin apoptoottisten indeksi (AI) pieneni lapsilla (0,13 ± 0,06) ja merkitsevästi pienempi syöpä (0,06 ± 0,03) verrattuna terveisiin aikuisiin näytettä (0,17 ± 0,05). Kahdeksan proliferation- (esim MKI67, CCNE1) ja 11 apoptoosiin liittyvien geenien (esim TNFSF10, IFI6) oli muuttunut mRNA: n ilmentymisen sekä aikana normaalin ikääntymisen ja syövän synnyn, lähinnä indusoimaan ja vähentämällä apoptoosia kuin terveillä aikuisilla. Kahdeksan leviämisen liittyvien geenien myös CCND1, CDK1, CDK6 ja 26 apoptoosin säätelevä geenit (esim SOCS3) on eri ilmaistiin välillä nuorten ja syövän ryhmät enimmäkseen tukevat korostunut solukasvua CRC.

Johtopäätös

peräsuolen näytteitä lasten ja CRC potilaat voidaan luonnehtia samalla lisääntynyt proliferatiivisia ja laski apoptoottista toimintaa verrattuna terveisiin paksusuolen näytteitä aikuisia. Siksi solujen kineettisen muutoksia aikana peräsuolen syövän kehitystä osoittavat hallitsematon rejuvenescence vastakohtana kontrolloidun solujen kasvua nuorten paksusuolen epiteelissä.

Citation: Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et ai. (2013) Satunnaiset peräsuolen syövän kehityksen Näyttää Rejuvenescence osalta epiteeliproliferaation ja Apoptosis. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10,1371 /journal.pone.0074140

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2013; Julkaistu: 03 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Leiszter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat unkarilainen Scientific Research Fund (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-K /) 105530. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

normaalin solun uusiminen terveen paksusuolen epiteelin kestää noin 5 päivää, kautta solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia. Sijainti eri epiteelisolujen kryptissa on hyvin tyypillinen. Lisääntyvät solut enimmäkseen sijaita perusteella kryptissa, erilaistuneet solut keskellä vyöhykkeellä, kun taas apoptoottiset solut ovat lähellä luminaalipinnalla. Useat molekyyli polkuja olla tärkeä rooli fysiologisten itseuudistumisen epiteelisolujen ihmisen paksusuolessa [1] – [4].

Kuitenkin sääntely proliferatiivisia ja apoptoottisten mekanismien saattavat muuttaa normaalin ikääntymisen ja peräsuolen syövän synty. Ikääntyminen on fysiologinen mekanismi, joka alkaa hedelmöittymisen jälkeen. Se vaikuttaa lähes jokaisen solun organismin kanssa mahdollisesti lukuun ottamatta kantasoluja ja syöpäsoluja. Makroskooppiset ja mikroskooppiset muutokset ovat läsnä ikääntyminen ruoansulatuskanavassa, kuten paksusuolen [5] – [6]. Muutokset lisääntymisaktiivisuus aikana ikääntymisen on analysoitu eläinmalleissa aiemmissa tutkimuksissa [7] – [8]. Tulosten mukaan on

Mandir et al.

, Intensiivisin epiteelin uudistaminen (lisääntymistä ja apoptoosin) on todistettu nuorilla rotilla; ja tekijät päättelivät, että dramaattisia muutoksia nuorten paksusuolen epiteelissä voi liittyä suolen kehitykseen. Kuitenkin normaali maha ikääntyminen ei ole vaikutusta epiteelin uusimista [7]. Päinvastoin vuotiaiden eläinpopulaatioissa lisääntynyt solujen lisääntymistä ja laski apoptoosin paksusuolen epiteelin havaittiin ja jonka uskotaan edistävän kontrolloimattoman soluproliferaation ja kasvaimen kehittymisen, mikä saattaa selittää korkeamman peräsuolisyövän ilmaantuvuus iäkkäillä ihmisen [8].

lisäksi jotkin näistä muutokset voivat myös liittyä peräsuolen syövän synnyn. Muutokset epiteelisolujen kasvuun ja ohjelmoidun solukuoleman myös aikaisemmin tutkittu eri vaiheissa peräsuolen syövän synnyn, mutta tulokset eivät ole yhdenmukaisia. Solujen lisääntyminen ja apoptoosin voi tulla säädeltyyn ja epätasapainoinen solujen tuotantoa ja solumenetys määrittää käyttäytymisen syöpää edeltäviin tai pahanlaatuinen häiriöitä ja kasvaimen kasvua [9] – [12].

havaitsemismäärä adenoomien ja ilmaantuvuuden kehittyneiden peräsuolen adenoomien ja syöpien jatkuvasti nostaa ikävuoden jälkeen 40-50, vahvassa ikä riippuvuus [13] – [14]. Yksittäisiä koolonsyöpien osoittautuvat enimmäkseen vanhemmat aikuisväestöstä samalla lukuisia neoplastisia ja syövän esiasteita. Mukaan Vogelsteinin malli [15], peräsuolen syöpä kehittyy normaaliepiteelissä kautta premaligneja adenooma on monivaiheinen prosessi, joka kestää useita vuosia. Lisäksi geenit (esim APC, KRAS, DCC ja TP53) on perinteisesti liitetty tämän syövän etenemisen malli, äskettäin uusien geenien kanssa muuttamalla mRNA: n ilmentymisen on myös ehdotettu olevan edistää pahanlaatuisiin ja peräsuolen epiteelin [16] – [18].

on olemassa useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset, jotka voivat osoittaa mahdollinen suhde ikääntyminen ja peräsuolen syövän syntymistä. Kertyminen DNA mutaatioiden ja vahingoista, promoottori hypermetylaation, muutoksia DNA: n korjaukseen, telomeraasiaktiivisuutta ja solujen aineenvaihduntaan voivat yhä vaikuttaa ikäinen väestö johtaa koholla solujen lisääntymistä ja laski apoptoosin, joka voi johtaa sen pahanlaatuisiksi ja kontrolloimaton solujen lisääntymistä [19].

samaan aikaan useat ihmisten ja eläinten tutkimukset ovat paljastaneet vastakkaiset sääntely joidenkin molekyylien polkuja normaalin ikääntymisen ja syövän syntymistä. Toisin kuin normaalista ikääntymisestä, lisääntyvien syöpäsolut osoittavat lisääntynyt metabolia, ominaista jatkuva lisääntymisaktiivisuus ja de-erilaistuminen, ne voivat tuottaa alkion proteiineja ja ovat potentiaalisesti kuolemattomia pakenemalla apoptoosin [20]. Erityisesti apoptoosin säätelystä proteiineilla erillistä ekspressiota senescent ja syöpäsolujen esillä on downregulation apoptoosia indusoivan kasvaimen p53-proteiini [21], ja Fas /CD95-proteiinia [22], ja yli-ilmentyminen antiapoptoottisten proto-onkogeenin Bcl-2 syövän verrattuna normaaliin ikääntymiseen soluihin [23] – [25]. Onkogeenien kuten Ras, transkriptiotekijöitä esim Myc, ja kasvu signaalitransduktion liittyviä tyrosiinikinaasiaktiivisuuden reseptorien esim jäsenet EGFR perhe ovat säädellään ylöspäin joidenkin syöpien, kun taas vaimentua senescent soluissa [26] – [28].

Syöpä kehitystä voidaan pitää paikallisena, hallitsematon ”nuorentaminen” käytetään samoja molekyyli- reittejä mutta vastakkaiset sääntelyä. Vapautuneilla solujen lisääntymisen ja apoptoosin polkuja voi sallia selviytymisen etuja syöpäsoluja vastaan ​​viereisten senescent soluja, koska menetetty kyky syövän normaalia ikääntymistä [20]. Lisääntynyt epiteelisolujen lisääntymistä ruoansulatuskanavassa voidaan nähdä paitsi kolorektaalisyövässä, mutta myös alkion ja nuorten kehitystä. Olennainen polku, joka soittaa olennainen roolit sekä suolen kehitykseen ja satunnaista tai familiaalinen kolorektaalisyövissä on Wnt /β-kateniinin signalointi [29] – [30].

Kuten tiedämme, ei ole tehty tutkimus proliferaatioon ja apoptoosin sääntelyn nuorten paksu- ja epiteelin normaalista ikääntymisestä ja syövän syntymistä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli analysoida proliferatiivista ja apoptoottista aktiivisuutta ihmisen paksusuolen epiteelin aikana normaalin ikääntymisen ja peräsuolen syövän syntymistä sekä proteiinin ja geeniekspression tasolla. Peräsuolen koepaloja edustaa nuorten hallittu kasvu vaiheessa aikuisten terve tila ja hallitsematon peräsuolen syövän kehitystä testattiin mahdollisia korrelaatioita.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

jälkeen tietoon perustuva suostumus, peräsuolen biopsia otettiin aikana rutiini endoskooppinen intervention 2nd Sisätautien ja ensimmäinen osasto Lastentautien, Semmelweis University, Budapest, Unkari. Kaikkiaan 44 kudosnäytteitä analysoitiin immunohistokemiallinen tutkimus (14 tervettä lasta, 10 terveitä aikuisia, 10 adenoomia aikuisilta ja 10 CRC aikuisilta); 81 biopsianäytteissä analysoitiin mikrosiruanalyysi (6 tervettä lasta, 41 tervettä aikuista ja 34 CRC aikuisilta); ja 36 biopsianäytteissä osallistui reaaliaikainen PCR-validointi (12 tervettä lasta, 12 tervettä aikuista ja 12 CRC aikuisilta). Seitsemänkymmentäviisi mikrosirut (aikuisten näytteet) oli hybridisoitiin aikaisemmin; niiden tiedostoja käytettiin aiemmin julkaistuissa tutkimuksissa käytetään erilaisia ​​vertailuja [31] – [32] ja on saatavilla Gene ilmentymismäärä Omnibus tietokanta (sarja-hakunumero: GSE10714 ja GSE37364). Aineistot vasta hybridisoitui 6 mikrosiruja rekisteröidään GSE37267 sarjanumero numero. Ohjaus lasta saatettiin poliklinikalla peräsuolen verenvuoto, ummetus tai krooninen vatsakipu. Ileocolonoscopy oli osa niiden diagnostista menettelyä (elimellisen sairauden poissulkemiseksi) ja kudosnäytteistä osoittivat normaalia makroskooppinen ulkonäkö ja histologia. Jokainen yksilö varmistettiin histopathologists.

Immunohistokemiaa peräsuolen biopsia näytteet rutiininomaisesti kiinnitettiin formaldehydillä ja upotettu parafiini. MRNA: n tutkimuksissa, kolonoskopia näytteet säilytettiin RNAlater Reagent (Qiagen Inc, Germantown, US) -80 ° C: ssa, ennen kuin kokonais-RNA uuttamalla geenien ilmentymisen analyysi ja Taqman RT-PCR tutkimuksessa. Eettinen hyväksynnät (Nr .: 69/2008 ja 202/2009) tätä tutkimusta varten antama alue- ja institutionaalisten komitean tieteen ja tutkimuksen etiikka Semmelweis University (Budapest, Unkari). Kirjallinen suostumus saatiin etukäteen kaikkien aikuisten osallistujia ja lähiomaisille, talonmiesten tai huoltajat sen puolesta alaikäisten /lasten hyväksymä eettiset toimikunnat. Yksityiskohtainen kliinis erittely potilaan näytteitä yhteenveto

Taulukko 1

ja

Taulukko 2

.

immunohistokemiaallisesti solujen lisääntymisen

arkistoitu näytteitä 14 histologisesti normaalin paksusuolen koepaloja lapsilta, 10 normaalia paksusuolen koepaloja aikuisilta, sekä 10 aikuisten adenoomien ja 10 CRC kerättiin rutiinikäytössä tähystykseen. 1 mm halkaisijaltaan sydämiä lävistettiin pois parafiiniblokit aikuisten näytteitä ja kerätään kudossiruina (TMA). Neljä pm paksu osat leikataan molemmat päässä TMA ja yksittäisten lasten biopsianäytteissä poistettiin vaha ja nesteytyksestä immunovärjäämistä.

Kun antigeeni haku pH 9,0 Tris-EDTA-puskuriin tapahtuu mikroaaltouunissa 900 W 10 minuuttia ja sitten 370 W: ssa 40 minuutin ajan, estää endogeenisen peroksi- 1% vetyperoksidia liuotettiin metanoliin ja epäspesifisten sitoutumiskohtien käyttäen 1% naudan seerumin albumiinia 20 minuuttia kunkin suoritettiin. Laseja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-Ki-67-vasta-ainetta (klooni: MIB-1, 1:100, Dako, Glostrup, Tanska) 60 min: ssa kostutetussa kammiossa, ja sitten anti-hiiri-IgG-F (ab ’)

2 Alexa Fluor 546-konjugaattia (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 30 minuuttia.

Apoptosis havaitseminen käyttäen Tdt välittämää dUTP Nick End Labeling (TUNEL) määritys

sulattamisen jälkeen proteinaasi-K: n (20 ug /ml, 20 min), 50 ui TUNEL (TUNEL In situ Cell Death Detection Kit, fluoreskeiini, Roche, 11684795910) reaktioseosta (5 ui TdT entsyymi + 45 ui dUTP) lisättiin kudosleikkeiden TMA dioja. Sitten näytteitä inkuboitiin pimeässä kostutetussa kammiossa 37 ° C: ssa 120 minuutin ajan. Solujen tumat värjättiin Hoechst (5 ui Hoechst väriaine + 10 ml TBS, 1 min, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA).

Counting mitoosi ja apoptoottisten indeksi digitaalisen dioja

Mosaiikki biopsianäytteissä ja TMA dioja olivat digitalisoitu korkean resoluution digitaalinen skanneri (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Unkari) käyttäen monikerroksinen loisteputki skannaus on korkea numeerinen aukko (0,8) x 20 objektiivilinssin ja high dynamic range AxioCam MRM Rev.3 musta-valko kamera liitetty skanneriin. Digitaalinen objektilasit pääsee läpi tietokonenäyttö ja analysoitiin käyttäen Pannoramic Viewer (versio 1.11.43.0). Marker Counter ohjelmistomoduuli johtaa pysyvään merkinnät Counted soluja käytettiin arvioitaessa suhteellinen suhde proliferatiivisia, apoptoottisten ja normaalit solut.

Ki-67, TUNEL ja Hoechst positivities esiintynyt kaikki yhtä vahva ydin- pakkausmerkintöihin dioja. Riippuen otoskoko, 500-1000 epiteelisolujen laskettiin pituus- hyvin suuntautunut crypts. Olemme määrittäneet proliferatiivinen-apoptoottiset suhde (PAR: suhde proliferatiivisia ja apoptoottisten solujen crypts), Mitoosi-indeksi (MI: suhde lisääntyvät solut ja koko laskettiin solujen crypts) ja apoptoottinen indeksi (AI: suhde apoptoottisten solut ja koko laskettiin solujen crypts).

mRNA microarray ilmaisun analyysi

kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Määrä eristetty RNA karakterisoitiin mittaamalla absorbanssi (NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA). Laatu eristetyn RNA testattiin kapillaari- geelielektroforeesilla (2100Bioanalyzer ja RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA /). Biotinyloidut cRNA koettimet syntetisoitiin 1-8 ug kokonais-RNA ja hajanainen käyttämällä One-Cycle Target Labeling and Control Kit (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf) mukaan Affymetrix kuvaus. Kaksikymmentä mikrogrammaa kutakin hajanainen cRNA näyte hybridisoidaan osaksi HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) 45 ° C: ssa 16 tuntia. Objektilasit pestiin ja värjättiin käyttäen Fluidics Station 450 ja vasta-monistuksen värjäys mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresoivat signaalit havaittiin GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan RT-PCR

Kun microarray geenien ilmentymisen analyysi, tuloksia verrattiin muihin tietokokonaisuus saatavilla Gene Expression Omnibus tietopankin (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; sarja hakunumero on GSE18105). TaqMan polymeraasiketjureaktion käytettiin mittaamaan mRNA ilmentymisen 12 valittujen geenien, jotka osallistuvat säätelyyn solusyklin, lisääntymistä tai apoptoosia, alkuperäisiin (6 histologisesti ehjä lasta, 6 histologisesti ehjä aikuisten ja 6 CRC aikuisten näytettä) ja riippumaton näytesarjaa ( 6 histologisesti ehjä lasta, 6 histologisesti ehjä aikuinen, 6 CRC aikuinen näytettä). 18S ribosomaalisen RNA: n ja GAPDH käytettiin viitteenä.

Yhteensä RNA, laadun ja määrän valvonta toimi edellä kuvatulla tavalla. Käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit RNaasi Inhibitor, 1 ug kokonais-RNA per näyte käänteistranskriptio (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Laatu cDNA tarkastettiin SDHA reaaliaikainen PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi). Sitten 16,7 ng cDNA-templaattia kohti näytettä käytettiin ilmentymisen analyysi valitun geenin kanssa TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Mittaus suoritettiin LightCycler 480 (Roche) Mono Väri hydrolyysikoetin /UPL Probe tunnistus muodossa. Denaturoinnin jälkeen 95 ° C: ssa 10 minuuttia, 40 PCR-sykliä suoritettiin (monistaminen 95 ° C: ssa 15 sekuntia, ja 60 ° C 1 min).

Tilastollinen arviointi

tilastollista analyysiä Ki-67 immunovärjäyksellä ja TUNEL tuloksia ANOVA testi ja Tukey HSD post-testiä sovellettiin. Molemmissa menetelmissä merkitys kriteerit oli p 0,05.

mRNA: n ilmentymisen profiilit Affymetrix ilmaisu paneelit olivat pääosin valmiiksi käsitelty GCRMA taustakorjauksen menetelmää quantile normalisoinnin ja mediaani kiillottaa yhteenvetoa. SAM analyysi sovellettiin määrittämiseen proliferation- ja apoptoosin säätelevä geenien kanssa muuttamalla mRNA ilme. Seuraavat SAM käytetyt perusteet: LogFC≥abs 1, p-arvo 0,05. Kaikki nämä geenit verrattiin ja differentiaalisesti ilmaisi niitä tutkittiin tarkemmin. Ilmaisu kunkin valitun geenin eri näytettä ryhmien analysoitiin edelleen ANOVA ja testin jälkeen Tukey HSD.

aineistot ovat saatavilla Gene Expression Omnibus tietopankin (http: //www.ncbi.nlm.nih gov /geo /), sarja liittymisen numerot: GSE10714, GSE37364 ja GSE37267.

reaaliaikainen PCR validointi 12 näytteet analysoitiin kussakin vaiheessa (lapset, terveet /normaali aikuisten ja aikuisten CRC). Normalisointia, 18S ribosomaalisen RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Tilastollista analyysiä ANOVA testi ja Tukey HSD post-testiä sovellettiin. Seuraavia kriteereitä käytettiin: Taita change≤0.5 tai Taita change≥2 ja p-arvo 0,05.

Tulokset

leviämisen ja apoptoosin nuoruusiän, normaalin aikuisen, adenooma ja peräsuolen karsinoomanäytteistä

Lisääntyvät epiteelisolujen oli pääasiassa lokalisoitu juuressa kryptissa taas apoptoottisten solujen olivat lähellä luminaalipinnalla normaalissa paksusuolen limakalvon

(

Kuva 1

)

. Proliferative-apoptoottiset suhde (PAR: suhde proliferatiivisia ja apoptoottisten epiteelisolujen crypts) ja MI olivat merkittävästi korkeammat lapsilla (PAR = 3,51 ± 2,49; MI = 0,33 ± 0,06) ja CRC näytteet (PAR = 9.83 ± 7.72, MI = 0,42 ± 0,10) kuin terveillä aikuisilla näytteistä (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) (p 0,05). He osoittivat jatkuvan kasvun aikana adenooma-karsinooma-sekvenssin (ACS). PAR oli 3,99 kertaa suurempi terveillä lapsilla paksusuolen epiteelin ja 11,17 kertaa suurempi CRC verrattuna terveisiin aikuisiin epiteelin; ja PAR oli 2,8 kertaa suurempi CRC toisin kuin nuorten näytteitä. Perustuu immunhistochemical tuloksiin, MI oli 2,2 kertaa korkeampi lapsilla ja 2,8 kertaa suurempi CRC kuin että terveisiin normaali, ja 1,27 kertaa suurempi CRC toisin kuin nuorten näytteitä. Korkeimmat PAR ja MI löytyi kolorektaalisyövässä näytteissä

(

Kuva 2

)

.

Blue täplät edustavat ytimet aktiivinen solujen. Kuvat on otettu digitaalisella mikroskoopilla: normaali lapsi kudos (Ch), normaalin aikuisen kudoksen (N), adenooma (Ad) ja syövän (CRC) aikuisilla. Mitoosi toiminta laskee ikääntymisen aikana ja kasvaa aikana ACS toisin apoptoottinen aktiivisuus.

PAR ja MI lasku ikääntymisen aikana ja kasvun aikana Karsinogeneesin vastoin AI.

AI pieneni terveillä lapsilla näytteistä (0,13 ± 0,06) ja merkittävästi alhaisempi kolorektaalisyövässä näytteistä (0,06 ± 0,03) kuin histologisesti ehjä aikuisten paksusuolen näytettä (0,17 ± 0,05) (p 0,05). AI osoitti jatkuva lasku rinnalla peräsuolen ACS. Apoptotic indeksi oli osoitettu 0,76 kertaa pienempi lapsilla, ja 0,35 kertaa pienempi CRC verrattuna terveisiin normaaliin näytteitä; ja se oli 0,46 kertaa pienempi CRC verrataan nuorten näytteitä. Alhaisin AI havaittiin kolorektaalisyövässä näytteissä

(

Kuva 1

–

2

)

.

Merkittävä muutos lisääntymisaktiivisuus ei todettu välillä tervettä aikuista paksusuolen limakalvon (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) ja adenooma näytteet (PAR = 1,45 ± 0,89; MI = 0,13 ± 0,05); kun taas AI havaittiin olevan huomattavasti alhaisempi adenooma näytteistä (Normaali AI = 0,17 ± 0,05; Adenooma AI = 0,10 ± 0,04) (p 0,05).

ilmentäminen proliferation- ja apoptoosin säätelevä geenien nuoruusiän , normaalin aikuisen ja peräsuolen karsinoomanäytteistä

mRNA ilmentymistä 117 leviämisen säätelevä geenit tutkittiin HGU133 Plus2.0 mikrosiruja. Geenien ilmentyminen 5 antureista (jotka kuuluvat 4 geenejä) poikkeava aikana ikääntymisen yksin histologisesti ehjänä paksusuolen limakalvolla; mRNA ilmaus 18 antureista (kuuluva 13-geenit) muutettiin aikana peräsuolen syövän synnyn; ja 11 koettimet (kuuluu 8 geenejä /BRCA1, CCNB1, CCNE1, CDC20, CDK1, CDKN2B, MKI67 ja TFDP1 /) on eri ilmaistu molemmissa Näyteryhmä (

Kuva 3A

). Samoin geenin ilmentyminen 534 apoptoosia säätelevä geenit analysoitiin myös tässä tutkimuksessa. mRNA ilmaus 15 antureista (kuuluvat 9 geenejä) poikkeava aikana ikääntymisen yksin histologisesti ehjänä paksusuolen limakalvolla; 46 antureista (kuuluvat 32 geenejä) osoittivat muutoksia aikana peräsuolen syövän synnyn; ja 12 koettimet (kuuluu 11 geenejä /ACVR1B, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 ja ZAK /) on eri ilmaistu molemmissa Näyteryhmä

(

Kuva 3B

)

.

on lämpökartassa, lisääntynyt geenin ilmentyminen on edustettuna punaiset viivat, kun taas vähentynyt ilmentyminen vihreitä. Ensimmäiset 6 näytettä vaaleansininen osoittaa geenejä lapsilla, tummansinisen ovat terveitä aikuisia, kun taas viimeinen näytteet vihreä ovat syöpäpotilailla.

geeniekspressio muutoksia välillä nuoria ja CRC näytteitä

Proliferation- ja apoptoosin säätelevä geenit tutkittiin tarkemmin löytää geenejä erilaisten mRNA lauseke, joka voi selittää erot hallinnassa ja hallitsematon solujen lisääntymistä. Kaksitoista koettimet kuuluvat 8 leviämisen määräysvallattomille geenit (BCL2, CDKN2B, RAD9A, BRCA2, CCND1, CDK1, CDK6 ja RBL1)

(

Kuva 4A

) B ja 26 apoptoosia säätelevä geenit (AIFM2, AIFM3, BTK, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, PROK2, SOCS3, TNFRSF10B ja ZAK) ja 39 koettimilla

(

Kuva 4B

) B osoitti merkittävää muutosta lasten ja syövän ryhmien mukaan p-arvo .

on lämpökartassa, lisääntynyt geenin ilmentyminen on edustettuna punaiset viivat, kun taas vähentynyt ilmentyminen vihreitä. Tummansininen näytteet ovat terveitä lapsia paksusuolen limakalvon (Ch) ja vaaleansininen ovat kolorektaalisyövän näytteistä (CRC).

Validation geenien ilmentymisen käyttäen TaqMan RT-PCR

mRNA ilmentymistä 10 geenejä, mukaan lukien CDKN2B, MKI67, cdc2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 ja SERPINB9 todensi kanssa TaqMan RT-PCR

(

Taulukko 3

)

.

tulosten mukaan microarray analyysin leviämisen säätelevää geenit (CDKN2B, MKI67, cdc2 /CDK1 ja CCNE1), merkittävät mRNA ilmaisu muutoksia havaittiin arvolla kertamuutoksia (FC≤0.5 tai FC≥2) ja ANOVA-testiä (p 0,05) lapsilla vs. normaali ja normaali vs. CRC vertailuja; ja nämä tulokset olivat myös vahvisti Tukey-testi tapauksessa cdc2 /CDK1 ja CCNE1. PCR validointi vahvisti taipumus geenien ilmentymisen muutoksia kaikissa tapauksissa suhteen leviämisen sääntelyä. CDKN2B, MKI67, cdc2 /CDK1 ja CCNE1 osoittivat rajatapauksia merkittäviä mRNA: n ilmentymisen muutoksia aiemmin mainittiin vertailussa mukaan Taita muutosta. Tukey testin jälkeen palvelukseen geeniekspression muutoksia ikääntymisen aikana ja peräsuolen syövän syntymistä kyseessä cdc2 /CDK1 (p 0,05).

numerot apoptoosin säätelevää geenit (ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 ja SERPINB9) analysoitiin myös RT-PCR: llä. Geeniekspressiota ACVR1B, TNFSF10 ja DYRK2 oli merkitsevästi pienempi lapsilla ja CRC näytteitä verrattiin normaalin aikuisen paksusuolen limakalvo (FC≤0.5 tai FC≥2; p 0,05); ja nämä tulokset todensi RT-PCR samoin. Tulosten mukaan on Affymetrix tutkimuksen, mRNA: n ekspressiota anti-apoptoottiset geenit, kuten SOCS3, IFI6 ja SERPINB9, osoittivat merkittävästi korkeampia ilmentymistä lasten ja CRC näytteitä verrattuna, että histologisesti ehjä aikuisen paksusuolen näytteitä. PCR validointi vahvisti taipumus geenien ilmentymisen muutoksia välillä Lapset vs. Aikuisten normaali ja aikuisten Normaali vs. CRC. ANOVA ja Tukey-testi analyysi RT-PCR-tuloksiin on tarkastanut tätä muutoksia tapauksessa SOCS3 ja IFI6 (p 0,05). Ilmentyminen muuttuu valitun geenit on koottu

Taulukko 4

.

Keskustelu

Aging liittyy lisääntynyt esiintyvyys satunnaisesti peräsuolen maligniteettien, joka on yksi johtava kuolinsyitä länsimaissa [33]. Peräsuolen syöpä liittyy hallitsematon solujen lisääntymistä ja säädeltyyn apoptoosin. Nuoruusiän kasvun, toisaalta, on ominaista hallittu kasvu, solujen lisääntymistä ja apoptoosin [34].

Tässä tutkimuksessa proliferatiivista ja apoptoottinen aktiivisuus ennallaan paksu- ja epiteelin lasten ja aikuisten verrattuna vuonna adenooma ja peräsuolen syövän tutkittiin. Ilmentyminen liittyvien geenien testattiin myös mRNA mikrosiruja. Löysimme lisääntynyt proliferatiivinen ja alentunut apoptoottista aktiivisuutta lapsilla ja syövän näytteitä verrattiin normaalin aikuisen epiteelin.

Nämä tulokset viittaavat vastakkaisen molekyyli- sääntelyn lisääntymistä ja apoptoosin normaalin ikääntymisen ja peräsuolen syövän syntymistä. Tehostettu solujen kasvainsolujen lisääntymistä ilman ”ikääntyminen” voi edistää niiden mahdollisuudet säilyä viereisten senescent soluja.

Lisääntynyt solujen lisääntymistä havaittu lapsilla peräsuolen limakalvoa voidaan liittyvän fysiologisen kasvun paksusuolen kuitenkin solujen uusiutumista hidastaa normaalin ikääntymisen aikana, että histologisesti ehjä aikuisten paksusuolen kryptassa. Solujen lisääntyminen ja apoptoosin sääntelyn välillä hallittua kasvua lapsuudessa ja hallitsemattoman kasvun CRC ei ole korreloitu ennen paksusuolen limakalvolla. Täällä löysimme useita leviämisen edistämiseksi geenejä, mukaan lukien sykliini B1 /CCNB1 /sykliini E1 /CCNE1 /ja sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK1) voimistuvan sekä nuorten ja syövän näytteitä verrattiin normaalin aikuisen limakalvo (

Kuva 3

). Nämä tulokset korreloivat hyvin meidän löytää huomattavasti suurempi proliferating solufraktiois- lapsilla ja syövän kudosleikkeiden verrattuna normaalin aikuisen näytteitä. CDK todellakin on ratkaiseva rooli säätelyssä solusyklin ja kasvua eukaryoottisoluissa. CDK-kompleksit ovat erittäin konservoitunut perheen Ser /Thr-proteiinikinaasien, joka koostuu katalyyttisestä CDK-alayksikön ja aktivoimalla sykliini alayksikköön. Erilaiset CDK voi hallita eri osia solusyklin; nämä kompleksit voidaan aktivoida fosforylaatiolla, sitovia aktivoimalla sykliinien tai estämään alayksiköitä [35] – [36]. CCNB1, CCNE1 ja CDK1 ilmauksia, jotka voivat korreloida lisääntyneeseen lisääntymisaktiivisuus, oli korkeampi lapsilla ja neoplastisia paksusuolen limakalvon verrattuna normaalin aikuisen limakalvolle. Lisäksi sykliini D1 (CCND1), CDK1 ja CDK6 mRNA-tasot olivat merkitsevästi korkeammat CRC verrattuna normaaliin lapsille näytteitä, jotka voivat liittyä hallitsemattomaan soluproliferaatioon syövän (

Kuva 4

). Sykliini D1 on useita säätelyvaikutukset normaalissa solujen erilaistumista, kasvua ja aineenvaihduntaa; kuitenkin, yli- ilmentyminen CCND1 on yksi useimmin havaittu muutos ihmisen syövissä, koska se on solusyklin sääntelyn vaikutuksia G1-vaiheessa [37]. Mukaan

Zhang et al.

Tuloksia, epänormaali säätely ylöspäin sykliini D1 voi olla varhainen tapahtuma suoliston syövän synnyn [38].

Sahl et al.

Ovat tutkineet ilmentäminen sykliiniriippuvaisten kinaasien ihmisen paksusuolen syöpä. He havaitsivat, että aktivointi CDK1, CDK2 ja CDK6, joka voi fosforyloida retinoblastoomaproteiiniin, jolloin vapautumisen inhibition eteenpäin etenemisen G1-vaiheen, on yhteydessä ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän synnyn [39].

on olemassa useita sääntelyn molekyylejä, jotka voivat moduloida ja estää toiminnan CKDs, nimeltään sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjät. Meidän Tässä tutkimuksessa selvitimme mRNA ilmaisun korjauksilla CDKN2B prosesseissa ikääntymisen ja peräsuolen syövän syntymistä. CDKN2B tunnetaan myös monituumorisuppressori 2 (mts2), sykliiniriippuvaiset kinaasit 4 ja 6 sitovan proteiinin tai p15-INK4b (p15). CDKN2B sijaitsee lähellä tuumorisuppressorigeenin CDKN2A kromosomissa 9, joka on usein mutatoitunut ja poistetaan monenlaisia ​​kasvaimet. Tämä geeni koodaa sykliiniriippuvaisen estäjä, joka voi tuottaa komplekseja CDK4 ja CDK6, estämällä solujen kasvua tai solusyklin. Vuonna mikrosiruanalyysi kohtalainen mRNA ilmaus CDKN2B havaittiin hyvin hallinnassa, hyper-proliferatiivinen paksusuolen biopsianäytteissä lasten verrattuna histologisesti ehjä aikuinen paksusuolen limakalvon, ja merkittävän geenin ilmentyminen väheneminen havaittiin CRC näytteissä (

Kuva 3

). Aikaisempien tutkimusten, CDKN2B voi toimia tuumorisuppressorigeenin ja mahdollinen efektori TGFp-indusoidun solusyklin pidätys [40].

Herman ym.

Sertifioitu että geenien p15 CpG saari hypermetylaation voi aiheuttaa kasvainhäiriöt [41]. Merkittävät menetys näistä geeneistä ”toiminnot voivat myötävaikuttaa hallitsemattomaan soluproliferaatioon CRC.

immunohistokemiallinen analyysi, kohtalaisen vähentynyt apoptoottisen aktiivisuuden havaittiin terveillä lapsilla peräsuolen biopsianäytteissä verrattuna terveille aikuisille ja se väheni dramaattisesti vuonna aikana adenooma-karsinooma järjestyksessä. mRNA: n ilmentymisen korjauksilla apoptoosia aiheuttavien tai -inhibiting geenit analysoitiin tutkimuksessamme (esim ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 ja SERPINB9) saattaa selittää ilmiön.