Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä (OC) on kaikkein vaarallisin gynekologinen maligniteetti. Huolimatta edistysaskeleet hoidossa OC kanssa kombinatorisista hoito, mukaan lukien kirurgia ja platinapohjaisen kemoterapian, potilaat yleensä on huono ennuste korkeiden kemoterapian resistenssin. Tässä testasimme hypoteesia, että DNA-vaurioita vastaus (DDR) reittejä osallistuvat vastus OC potilaiden platina kemoterapiaa. Valitut DDR signaalit arvioitiin kahdessa ihmisen munasarjasyöpäsolulinjoihin, yksi herkkä (A2780) ja yksi resistenttejä (A2780 /C30) platinaa kohtelu sekä perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) OC potilaista, herkkä (

n

= 7) tai resistenttejä (

n

= 4) myöhemmin kemoterapiaa. PBMC terveillä vapaaehtoisilla (

n

= 9) tutkittiin rinnakkain. DNA-vaurioita arvioitiin immunofluoresenssilla γH2AX värjäys ja komeetta määritys. Korkeammalla luontaisen DNA-vaurioita havaittiin A2780 kuin A2780 /C30 soluissa. Lisäksi luontainen DNA-vaurioita tasot olivat merkittävästi korkeammat OC potilailla verrattuna terveisiin vapaaehtoisiin, sekä platina-herkillä potilailla suhteessa platina-vastustuskyvyn (kaikki

P

0,05). Sen jälkeen karboplatiinihoitoa, A2780 solut osoittivat alempi DNA korjaus hyötysuhde kuin A2780 /C30 soluissa. Myös seuraavat karboplatiinihoitoa PBMCdden

ex vivo

, DNA korjaukseen tehokkuus oli merkittävästi korkeampi kuin terveillä vapaaehtoisilla kuin platina-resistenttien potilaiden ja pienin platinaa arkaluonteisiinkin (t

1/2 katoamisesta γH2AX pesäkkeitä: 2,7 ± 0,5 tuntia, 8,8 ± 1,9 h ja 15,4 ± 3,2 H, vastaavasti, käyttäen comet, t

1/2 platinaa aiheuttaman vahingon korjaamiseen: 4,8 ± 1,4H, 12,9 ± 1,9 h ja 21,4 ± 2,6H, vastaavasti; kaikki

P

0,03). Lisäksi karboplatiini aiheuttaman apoptoosin oli korkeampi A2780 kuin A2780 /C30 soluissa. Vuonna PBMC, apoptoosin hinnat olivat korreloi käänteisesti DNA korjaukseen tehokkuutta näiden solujen, ovat huomattavasti korkeammat Platinasensitiivisten kuin platina-resistenttien potilaiden ja alin terveillä vapaaehtoisilla (kaikki

P

0,05). Olemme päätellä, että häiriöitä DNA korjaukseen reittejä mitattuna PBMC OC potilaista korreloi lääkeaineen herkkyys näiden solujen ja heijastavat henkilökohtaista vastausta platinapohjaisen kemoterapian.

Citation: Stefanou DT, Bamias A, Episkopou H , Kyrtopoulos SA, Likka M, Kalampokas T, et ai. (2015) Poikkeava DNA Damage Response Väylät Voi ennustaa Platinum Kemoterapia munasarjasyövässä. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10,1371 /journal.pone.0117654

Academic Editor: Goli samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIASSA

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 12 marraskuu 2014; Julkaistu: 06 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Stefanou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tietoja on saatavilla alkaen Helios Digital Repository: https://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Ateenan University Medical School avustuksen ELKE 097, ja jonka ECNIS (Environmental Cancer, ravitsemus ja Individual herkkyys) Network of Excellence Euroopan unionin (sopimus nro. 513943). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on viidenneksi yleisin syöpätyyppi naisilla ja johtava kuolinsyy gynekologisia maligniteetteja kanssa epiteelikarsinooman ollessa yleisin lajike [1,2]. OC on tyypillisesti diagnosoidaan edenneessä vaiheessa ja usein kantaa synkkä ennuste, vaikka nykyinen hoitostrategioita kuten aggressiivinen kirurginen cytoreduction ja platina-paklitakselikemoterapia näyttävät ovat parantaneet merkittävästi suhteellista eloonjäämisen näiden potilaiden 5 vuoden pysyvyys oli yli 40% [3]. Perustettu ennustavat tekijät OC sisältävät vaiheessa histologisen alatyypin, kasvaimen ja tilavuus sairautta jäljellä sytoreduktiivisen leikkauksen [4,5].

kolme erilaista platina yhdisteitä, nimittäin sisplatiini, karboplatiini ja oksaliplatiini, joita käytetään tällä hetkellä kliininen käytäntö, jolla on lukuisia viitteitä, jotka kattavat laajan kirjon kiinteiden kasvainten [6]. Niiden sytotoksinen toiminta kohdistuu reaktiolla DNA ja kehittämään DNA-vaurioita muodostuminen ristisidosten, Pt-d [GpG] (1,2-juosteensisäiseen ristisidosten, 65%), Pt-d [APG] ( 1,2-juosteensisäiseen ristisidosten, 25%) ja vähemmässä määrin Pt-d [GpNgG] (1,3-juosteensisäiseen ristisidosten), säikeiden- ristisidosten (ICLs, eniten sytotoksinen) ja yhden nukleotidin vahinkoja guaniini [7]. Nukleotidin Leikkauskorjauksessa (NER) on tärkein prosessi, jossa platina juosteensisäisellä siltoja ja yhden nukleotidin vahinko guaniinin korjataan [8,9]. Toisaalta, ICL korjaus on monimutkainen ja edellyttää sekä NER, Fanconin anemia korjaukseen liittyvä reitti, translesion synteesi ja homologista rekombinaatiota [10-12]. Mielenkiintoista, ICLs korjaus etenee muodostumisen kautta DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t), jotka edustavat kaikkein vaarallisin muoto DNA-vaurioiden [13]. Muodostuminen DSB seuraa aina fosforylaation histoni H2AX, variantti H2A proteiinin perheen, joka on osa histoni oktameerin on nukleosomeja. Histoni H2AX fosforyloituu kinaasien kuten ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja ATM-Rad3 liittyvien (ATR) on PI3K koulutusjakso [14]. Tämä hiljattain fosforyloituu proteiini, γH2AX, on ensimmäinen askel rekrytoinnissa ja paikallistamisen DNA korjaukseen proteiineja.

nisäkäsperimän on suojattu genotoksinen loukkaukset verkosto DNA-vaurioita vastaus (DDR) reittejä, jotka käynnistyvät havaitseminen DNA vaurioiden erityisillä anturit [15]. Myöhempi vaihe on aloittamisen signaalitransduktion kaskadi, joka aktivoi eri genomi-suojaus reittejä. Koska DDR on kokonaisvaltainen signalointi prosessi, joka määrittää solun kohtalon joko korjaamalla DNA-vaurioita tai apoptoosin, sen rooli on ollut mukana tautiprosessissa ja menestyksen kemoterapiaa. Itse asiassa on osoitettu, että poikkeavuudet DNA korjaukseen reitit on tärkeä rooli pahanlaatuisiin OC [16]. Myös DNA: n ekspression korjaus proteiineja, kuten Breast Cancer 1 (BRCA1) ja Leikkauskorjauksessa cross komplementaatioryhmä 1 (ERCC1) ovat korreloi huonon säilymisen pitkälle OC ja todettiin olevan markkereita vastustuskyvyn platinapohjaisen lääkkeet [17- 19]. Lisäksi meidän aiemmat tutkimukset keskittyivät tasojen DNA-vaurioita perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) useista myeloomaa sairastavilla potilailla ovat osoittaneet, että DNA-vaurioita voisi takautuvasti erottaa potilaiden eriasteisia terapeuttisen vasteen, joka tarjoaa perustan esitarkastuksen ja valitessa näitä potilaita todennäköisesti hyötyä tästä hoitoa [20-24].

tässä teimme tutkimuksen testata oletusta, että DDR, ratkaiseva mekanismi solujen eloonjäämistä, on mukana kestävyys platinaa kemoterapiaa . Huomasimme, että OC potilaat ovat ominaisia ​​suurempi luontainen DNA-vaurioita verrattuna terveisiin vapaaehtoisiin, ja että tehokkuus DNA korjaukseen mitattuna PBMC OC potilaista korreloi lääkeaineen herkkyys näiden solujen ja heijastaa yksilöllinen vaste platinapohjaiseen kemoterapiaan.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Kaikki potilaat sisällytetty tähän analyysiin hoidettiin yhden toimielimen (Alexandra Hospital, Ateena, Kreikka). Verinäytteet saatiin kahdeksantoista (

n

= 18) potilailla, joille tehdään leikkaus epäillään munasarjasyöpä (keski-ikä 62 vuotta, vaihteluväli 34-77) (taulukko 1) ennen mitään terapeuttista hoitoa. Yhdeksän (

n

= 9) terveiden ihmisten, ikä- ja sukupuolijakauman potilaille (kaikki naaraat, keski-ikä 60 vuotta, vaihteluväli 29-73) oli toimivat kontrolleina. Kaikki potilaat olivat lavastettuja mukaan FIGO lavastus järjestelmää. Kemoterapia aloitettiin kuukauden kuluessa leikkauksesta. Paklitakseli 175 mg /m

2 3 tunnin aikana välittömästi sen jälkeen karboplatiinin 5-6 AUC 60 minuutissa annettiin 3 viikon välein. Kuusi solunsalpaajahoitojaksoa annettiin. Seitsemän potilaat eivät saaneet leikkauksen jälkeen kemoterapiaa: 3 oli rajatapaus kasvaimia, 1 potilas kuoli leikkauksen jälkeen, kun taas 3 potilasta kieltäytyi hoitoa leikkauksen jälkeen. Platinum herkkyys 11 potilasta, jotka saivat ensilinjan kemoterapiaa arvioitiin mukaan naistentautien Cancer Intergroup komitea (GCIC) perusteet [25]. Näillä kriteereillä oli 4 platina kestävät ja 7 platina-herkille potilaille. Elossa olevien potilaiden tulee olla vähintään seurannan 2 vuotta. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen mukaan Helsingin julistuksen periaatteet, ja tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Alexandra Hospital.

Cell hoito

Platinasensitiivisten A2780 ja platina kestävät A2780 /C30 solulinjoilla [26] ystävällisesti Dr. George Koukos (Munasarjojen Cancer Research Center, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA). Soluja viljeltiin yksikerroksisessa käyttämällä RPMI 1640, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, 100 ug /ml streptomysiiniä, 100units /ml penisilliiniä, 0,3 mg /ml glutamiinia ja 0.3unit /ml insuliinia 37 ° C: ssa inkubaattorissa jatkuvasti kaasutettiin 5% CO

2. Soluja käsiteltiin sisplatiinin (0-100μg /ml 0-24h), jota seurasi inkubointi huumeiden-väliaineessa 0-24h tai karboplatiini (0-300μg /ml 0-24h), mitä seurasi post-inkuboinnin huumeiden vapaa väline 0-24h.

PBMC-solut eristettiin juuri otetusta perifeerisestä verestä käyttäen standardimenetelmiä [23]. Sitten soluja stimuloitiin osaksi leviämisen käyttäen 10 ug /ml fytohemagglutiniinia (PHA) 48 h 37 ° C: ssa RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS: ää, 50 mg /l penisilliiniä, 50.000lU /l streptomysiiniä ja sen jälkeen käsiteltiin sisplatiinin (0-300μg /ml jopa 3h), jota seurasi inkubointi huumeiden-väliaineessa 0-24h tai karboplatiini (0-1800μg /ml jopa 24), jota seurasi post-inkubaatio lääke-väliaineessa 0-24h.

Sytotoksisuusmääritvs

jälkeen lääkehoitoa, elävät solut laskettiin trypaanisinivärin-syrjäytymistä [27]. Lyhyesti, inkuboinnin jälkeen lääkeaineen kanssa, solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen alustaan. Yhtä suuri tilavuus 0,4% trypan blue-reagenssia lisättiin solususpensioon ja elinkelpoisten solujen prosentuaalinen arvioitiin. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Yhden solun geelielektroforeesilla (Comet assay) B

yksisoluiset geelielektroforeesi määritys suoritettiin emäksisissä olosuhteissa, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Lyhyesti, alikvootit 5×10

4 käsittelemätöntä tai platinaa lääkkeellä käsiteltyjen solut suspendoitiin matalan sulamispisteen agaroosia (1%) PBS: ssä (135mmol /l NaCI: a, 2,5 mmol /l KCI, pH 10) 37 ° C: ssa, ja leviämistä päälle täysin himmeä mikroskoopin esipäällystetty ohut kerros 1% normaalin sulamispisteen agaroosia (Biozyme, Hameln, Saksa). Solususpensiota välittömästi peitetty peitelevyllä ja levyt pidettiin 4 ° C: ssa 1 tunti, jotta jähmettymisen agaroosin. Poistamisen jälkeen peitelevyllä, solut altistettiin lyysipuskuria (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 1% Triton X-100) 4 ° C: ssa 1 tunti. Sitten levyt sijoitettiin vaakasuoraan geelielektroforeesilla kammioon. Kammio täytettiin kylmällä elektroforeesin puskuria (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH 13) ja liukuu pidettiin 4 ° C: ssa 40 minuuttia, jotta DNA rentoutua. Elektroforeesi suoritettiin 40 minuuttia (1V /cm, 255mA). Elektroforeesin jälkeen levyt pestiin neutraloinnin puskurilla (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5) 10 min ja sitten H

2O 10 min. Kaikki preparatiivisen vaiheet suoritettiin pimeässä estää muita DNA-vaurioita. Objektilasit värjättiin 20 ui 1 ug /ml DAPI ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon Eclipse 400) on varustettu CCD-4230A videokamera. Digitaaliset kuvat hankittiin käyttäen kuva-analyysiä järjestelmä (Kinetic Analysis, Wirral, UK). Olive Tail Moments [OTM = (Tail Mean-Head Mean) x (% DNA) /100] 100 solua /hoito kunto arvioitiin.

Immunofluoresenssi- antigeenin värjäystä ja konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi analyysi

alikvootit 2×10

4 käsittelemätöntä tai platinaa lääkkeellä käsiteltyjen solujen kiinni peitelasi päällystetyn 1 M HCl: lla ja 50 mg /ml poly-D-lysiinillä ennen käyttöä, määritetään lisäämällä 4% paraformaldehydi, liuos 6 min huoneen lämpötilassa ja säilytettiin -70 ° C: ssa, kunnes analyysi Patm (seriini-1981, Santa Cruz), patr (seriini-428, Cell Signaling), pChk1 (seriini-345, Santa Cruz), pChk2 (treoniini-68, Abcam) ja γH2AX (seriini-139, Cell Signaling) [29]. Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja blokattiin 0,5 ml kuoppaa kohti blokkauspuskuria (0,1% Triton X-100, 0,2% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä) 1 tunti huoneenlämmössä kosteutetussa laatikossa. Estetty soluja inkuboitiin vasta-aineiden Patm, patr, pChk1, pChk2 tai γH2AX estopuskurissa 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen estopuskurilla, soluja inkuboitiin vuohen anti-hiiri-vasta-aine, FITC-leimatut, pariksi vuohen anti-kani, TRITC leimataan kaksinkertainen merkintä (Invitrogen) laimennoksena 1: 4000 blokkauspuskuriin 1 h huoneen lämpötilassa pimeässä. Peitelaseja sovellettu, ja reunat suljettiin kynsilakkaa. Kuvat visualisoitiin Leica TCS SP-1 konfokaali laser skannaus mikroskoopilla. Pesäkkeet laskettiin manuaalisesti 200 solua /hoidon tilan ja tulokset ilmaistaan% ja γH2AX positiivisia soluja (keskiarvo ± SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta; positiiviset solut määritellään soluja, yli 5 pesäkkeitä solua kohti.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi arvioitiin käyttäen Cell Death Detection ELISA-PLUS Kit (Roche Applied Sciences), mukaan valmistajan ohjeet. Lyhyesti, soluja käsiteltiin eri annoksilla karboplatiinin (solulinjoissa, 0-300μg /ml; PBMC: itä, 0-1800μg /ml) 24 h jälkeen inkuboitiin lääkkeen väliaineessa 24 tuntia. Sitten solut kerättiin valmistamiseksi solulimafraktiot, jotka sisälsivät DNA-fragmentteja. Yhtä suuret tilavuudet näitä solulimafraktiot inkuboitiin anti-histoni-vasta-aine-päällystettyihin kuoppiin (96-kuoppaisilla levyillä), ja histonit DNA-fragmenttien annettiin sitoutua anti-histoni-vasta-aineita. Peroksidaasi-leimatun hiiren monoklonaalinen DNA-vasta-aineita käyttää paikallistamaan ja havaitsemaan sitoutuneen hajanainen DNA käyttäen fotometrinen tunnistus 2,29-atsino-di- (3-etyylibents- sulfonaatti) substraattina. Testi määrällisesti apoptoosin kuin kertainen lisäys (ilmaistuna Enrichment Factor, EF) tason apoptoosin käsiteltyjen näytteiden käsittelemättömiä näytteitä. Laskimme erityisiä rikastamiseen mono- ja oligo-nukleosomien vapautuu sytoplasmaan seuraavan kaavan avulla: (EF) = [(absorbanssi käsiteltyjen solujen) /(absorbanssi soluja ilman lääkehoitoa)]. Lopuksi, yksittäiset apoptoosin määrä ilmaistiin karboplatiinin annokseksi, joka riittää laukaisemaan induktio tietyn Enrichment Factor (EF = 3).

Tilastollinen analyysi

tehokkuus DNA: n korjaukseen ja induktio apoptoosin verrattiin ryhmien välillä yksilöiden käyttää ei-parametriset testit. Tarkemmin, Kruskal Wallis analyysiä käytettiin vertailuissa kaikissa kolmessa ryhmässä, ja Wilcoxonin summa testi pareittain vertailuissa. Korrelaatioita arvot eri DDR liittyvät parametrit sisällä solulinjoja tai PBMC eri OC potilaat arvioitiin Spearmanin korrelaatiokertoimen (kaikki ryhmät yhdistetty). Arvioida lineaarisen välinen DNA-vaurioita ja platina huumeiden annoksen, apoptoosin ja DNA-vaurioita sekä apoptoosin ja pan-tumavärjäystä, lineaarinen regressio näiden parametrien suoritettiin.

P

-arvo vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Jotta voidaan ottaa huomioon useita vertailuissa Bonferonni korjausta käytettiin.

Tulokset

DNA korjaukseen platinaa aiheuttaman vaurion munasarjasyöpäsolulinjoihin korreloi lääkkeen herkkyys näiden solujen

tutkia molekyylitason mekanismeja osallisena lääkeaineen herkkyys platinaa kemoterapiaa, muutokset keskeisiä molekyylejä solun DDR-reitin (Patm, patr, pChk1, pChk2, γH2AX) arvioitiin kahdessa munasarjasyöpäsolulinjoihin: yksi platina-herkän (A2780) ja yhden platinaa resistenttejä (A2780 /C30) [26]. -Soluja käsiteltiin eri annoksilla sisplatiinin (0-100μg /ml) 0-24h seurasi inkubointi huumeiden-väliaineessa 0-24h. Molemmat solulinjat osoittivat annoksesta riippuva nousu muodostumista kaikkien keskeisten molekyylien tutkimus (Fig. 1A, D). Maksimaalinen tasot näiden molekyylien havaittiin 6h jälkikäsittelyä, pysyi vakaana tai hieman laskussa sen jälkeen (Kuva. 1 B). Mielenkiintoista, γH2AX oli suurinta induktio keskuudessa avainmolekyylejä tutkittu. Pienin sisplatiini pitoisuus, jossa γH2AX induktio voitiin havaita oli 2,5 ug /ml 1 h (Fig. 1 C). Lisäksi, soluja käsiteltiin karboplatiini (0-300μg /ml) 0-24h seurasi post-inkubaatio lääke-väliaineessa 0-24h. Samanlaisia ​​tuloksia, jotka saatiin sisplatiinin kokeissa havaittiin. Toisin sanoen molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuva nousu muodostumista kaikkien keskeisten molekyylien havaittiin (Fig. 1 E, F). Lisäksi maksimaalinen taso näistä molekyyleistä havaittiin loppuun 24 hoidon, vähenee sen jälkeen. Jälleen γH2AX osoittivat korkeimmat induktio keskuudessa avainmolekyylejä tutkittu. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että immunofluoresenssimenetelmällä kvantifiointi γH2AX pesäkkeitä on tehokas tapa mitata DNA aiheuttaman vaurion platina huumeita.

A2780 /C30-solut (edustaja kaksi OC solulinjoja) käsiteltiin (A) sisplatiini (0-100μg /ml) 3 tuntia, tai (B), jossa 100 ug /ml sisplatiinia, sitten inkuboitiin lääkkeen väliaineessa eri ajanjaksoiksi (0-24h), tai (C) suhteellisen pieniä annoksia (0- 15 ug /ml), sisplatiinia enintään 3 h, ja analysoitiin lopussa hoidon avulla konfokaalimikroskopialla. Positiivisissa soluissa: solut, joissa on yli 5 pesäkkeitä solua kohti. Virhepalkit edustavat keskihajonta. In (D) tyypillinen kuvat osoittavat avain molekyylien tutkimuksen avulla mikroskoopilla analyysi A2780 /C30-soluja käsiteltiin 100 ug /ml sisplatiinia 3 h; ylempi kuvat, immunofluoresenssilla antigeeni värjäys; bottom kuvat, solutumissa merkitty DAPI. (E) A2780 /C30-soluja käsiteltiin karboplatiini (0-300μg /ml) 24 h tai (F), jossa 100 ug /ml karboplatiinia eri ajanjaksoiksi (0-24h) ja analysoitiin käyttäen konfokaalimikroskopialla. Virhepalkit edustavat keskihajonta. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

tasot platina-indusoidun DNA-vaurioita sekä solulinjoja arvioitiin myös käyttämällä emäksistä comet. Tämä versio komeetta määritys havaitsee DNA muuttoliikkeen aiheuttama katkeamisen, emäksinen labiili sivustoja, ja ohimeneviä korjaus sivustoja [30]. Käsittelyn jälkeen solujen 0-150μg /ml sisplatiinia 3 h (Fig. 2A, C) tai 0-300μg /ml karboplatiinia 24 h (Fig. 2B, C), on lineaarinen annos-riippuvainen lisäys DNA-vaurion tasoa saatiin sekä solulinjat, mikä osoittaa, että menetelmä on herkkyys ja tarkkuus voidaan havaita ja mitata platina-indusoidun DNA-vaurioita.

A2780 /C30-soluja (tyypillinen kahden OC solulinjat), käsiteltiin (A) sisplatiinia ( 0-150μg /ml) 3 tuntia tai (B) karboplatiini (0-300μg /ml) 24 h, ja analysoitiin lopussa hoidon avulla comet. Virhepalkit edustavat keskihajonta. In (C) tyypillisiä comet kuvia A2780 /C30-solujen ei-käsiteltyjen (NT), käsiteltiin 50 ug /ml sisplatiinia (cis-50), 100 ug /ml sisplatiinia (cis-100), 150 ug /ml karboplatiinia (karbo-150 ) tai 300 ug /ml karboplatiinia (hiili-300). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Lisäksi, käyttämällä kaksi tehokasta lähestymistapaa validoitu edellä tasojen luontainen DNA-vaurioita arvioitiin käsittelemättömään solulinjoissa. Molemmat immunofluoresenssilla γH2AX värjäystä ja emäksinen comet osoitti merkittäviä eroja kahden solulinjoista, joissa luontainen DNA-vaurioita on suurempi A2780 kuin A2780 /C30 soluissa. Erityisesti käyttämällä γH2AX Immunofluoresenssivärjäystä A2780 soluissa ilmeni 28,8 ± 3,4% positiivisia soluja (eli solut, joissa on yli 5 pesäkkeitä solua kohti) ja A2780 /C30 17,4 ± 3,4% positiivisia soluja (

P

= 0,01; Taulukko 2 ). Lisäksi käyttämällä comet, A2780 solut osoittivat OTM arvot 33,9 ± 5,5 mielivaltaista yksikköä, kun taas A2780 /C30 solut osoittivat 14,4 ± 2,9 yksikköä (

P

0,001; taulukko 2).

näytteille DNA korjaukseen tehokkuus näissä kahdessa solulinjassa, soluja käsiteltiin karboplatiini (0-300μg /ml) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen post-inkubaatio lääke-väliaineessa 0-24h ja indusoidun DNA-vaurion ( eli yhteensä DNA-vaurioita normalisoitu luontainen DNA-vaurioita) analysoitiin lopussa lääkehoidon. Molemmat immunofluoresenssilla γH2AX värjäystä ja comet osoittivat merkittäviä eroja kahden solulinjoista. Toisin sanoen molemmissa solulinjoissa DNA-vaurioita saavuttanut korkeimman tason lopussa lääkehoidon, jossa DNA-vaurion ollessa merkittävästi suurempi A2780 kuin A2780 /C30-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Sen jälkeen, karboplatiini aiheuttaman DNA-vaurion tasot alenivat ja laajuus korjaus oli merkitsevästi pienempi A2780 kuin A2780 /C30-solut (

P

0,03). Erityisesti käyttämällä konfokaalimikroskopia γH2AX pesäkkeitä poistettiin t

1/2 = 5,2 ± 0,7H A2780 /C30 solut ja 11,7 ± 2,6H A2780 soluissa. Käyttämällä komeetta määrityksessä t

1/2 arvot Karboplatiinin aiheuttaman vahingon korjaamiseen A2780 /C30 ja A2780-soluja 9,9 ± 1,3H ja 16,7 ± 3.4h, vastaavasti.

Lisäksi Area alle Curve (AUC) karboplatiini aiheuttama DNA-vaurioita, parametri, joka heijastaa yleistä DNA-vaurioita aiheutuvat kustannukset alkuperäinen vahinko muodostumiseen ja DNA korjaus laskettiin (taulukko 2). Käyttämällä γH2AX Immunofluoresenssivärjäystä A2780 solut osoittivat AUC-arvot [ilmaistuna (% suhteessa γH2AX positiivista värjäytymistä soluissa) x (karboplatiini annos)] on 17200 ± 3650, ja A2780 /C30 solut 12400 ± 2140 (

P

= 0.01). Lisäksi komeetta määritys vahvistettiin edellä mainitut päätelmät, joissa A2780 soluissa osoittaa AUC-arvot [ilmaistuna (OTM x karboplatiini annos)] on 14900 ± 3280, kun A2780 /C30 solut osoittivat AUC-arvot 9400 ± 1150 (

P

= 0,01 ).

lisäksi, molemmat solutyypit käsiteltiin eri annoksilla karboplatiinin (0-300μg /ml) 24 tunnin ajan ja apoptoosin induktio mitattiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen. Olemme havainneet, että apoptoosin hinnat olivat korkeammat A2780 soluissa kuin A2780 /C30-solut (

P

= 0,001; taulukko 2). Erityisesti A2780-solut osoittivat todisteita apoptoosin karboplatiinia alhaisilla annoksilla kuin 43,8 ± 5.6μg /ml, kun taas A2780 /C30-soluja tarvitaan annoksella 78,5 ± 9.2μg /ml, mikä osoittaa, että lääke solujen herkkyys korreloi käänteisesti DNA: korjaus kapasiteetti (taulukko 2).

huomionarvoista havainto oli, että seuraavat karboplatiinihoitoa, murto-osa soluista osoitti hajanainen, kirkas yleiseurooppalainen ydinvoiman γH2AX värjäystä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yleiseurooppalainen ydinvoiman γH2AX värjäys edustaa ennalta apoptoottista signaalia liittyvät ATM- ja JNK-riippuvaista apoptoosia replikoinnin aikana [31]. Mukaisesti saatujen tulosten DNA korjaukseen tehokkuus kokeissa havaitsimme korkeampi yleiseurooppalaisen ydinvoiman γH2AX värjäystä [ilmaistiin AUC (% yleiseurooppalaisen tumavärjäystä solut) x (karboplatiini annos)] A2780 soluissa (13400 ± 2850) kuin A2780 /C30-soluja (7500 ± 1760) (

P

= 0,001, taulukko 2).

puutteellinen DNA korjaukseen platinaa aiheuttaman vahingon PBMC OC potilaiden korreloi paremmin kliiniseen tulokseen

Palatakseni PBMC yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [32], huomasimme, että hoidon jälkeen ei-jakamalla PBMC platinaa lääkkeiden, hyvin alhainen tai nolla induktio määrien avainmolekyylejä tutkittavana havaittiin. Näin ollen, ensin käsitelty PBMC yhdeksän terveillä vapaaehtoisilla eri annoksilla PHA jopa 72 aiheuttaa solujen lisääntymisen. Optimaaliset tulokset saatiin seuraavat 48 h inkubointi PBMC: t 10 ug /ml PHA: ta (tuloksia ei ole esitetty). Sitten PBMC-soluja käsiteltiin sisplatiinin (0-300μg /ml jopa 3h), jota seurasi inkubointi huumeiden väliaineessa 0-24h tai karboplatiini (0-1800μg /ml jopa 24), jota seurasi post-inkubaatio lääkkeetön väliaineessa 0-24h. Mukaisesti ja tulokset solulinjojen kokeissa, joko platinan lääkkeiden, annoksesta riippuvan induktion kaikkien keskeisten molekyylien havaittiin (Fig. 3A, C), jossa γH2AX jälleen, jolla on suurin induktion hinnat (Fig. 3B , D). Lisäksi tasot platina-indusoidun DNA-vaurioita PBMC samassa yhdeksän terveillä vapaaehtoisilla mitattiin käyttäen emäksistä comet. Olemme myös havainneet, että

ex vivo

hoitoon PBMC: t sisplatiinin (Fig. 3E) tai karboplatiini (Fig. 3F) oli annosriippuvainen nousu DNA-vaurion tasoa. Yhdessä tulokset molemmissa solulinjoissa ja PBMC kokeet osoittavat, että immunofluoresenssimenetelmällä määrällistä γH2AX pesäkkeitä ja emäksinen comet ovat kaksi tehokasta lähestymistapaa kvantifiointiin platina aiheuttaman DNA-vaurioita kliinisissä näytteissä.

PBMC yhdeksältä terve vapaaehtoiset olivat

ex vivo

käsitelty (A) sisplatiinin (0-300μg /ml) 3 tuntia tai (B) 150 ug /ml sisplatiinia, sitten inkuboitiin huumeeton väliaineessa eri ajanjaksoiksi (0- 24h), ja analysoitiin sen jälkeen käyttäen konfokaalimikroskopia. Lisäksi PBMC: t samasta terveillä vapaaehtoisilla käsiteltiin (C), jossa karboplatiinin (0-1800μg /ml) 24 h tai (D), jossa 1400μg /ml karboplatiinia eri aikoja (0-24h) ja analysoitiin lopussa hoidon avulla konfokaalimikroskopia. Virhepalkit edustavat keskihajonta. Lopuksi, PBMC: t käsiteltiin (E) sisplatiinia (0-150μg /ml) 3 tuntia tai (F) karboplatiini (0-1800μg /ml) 24 tunnin ajan ja analysoitiin sen jälkeen käyttämällä comet. Rasiakuvaajien osoittaa tilastollisen jakauman tasoja DNA-vaurioita. Vaakasuorat viivat sisällä laatikot edustavat mediaaniarvot ja pystysuorat linjat ulottuvat ylä- ja alapuolella laatikon osoittavat maksimi- ja minimiarvot, vastaavasti. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Tämän jälkeen käyttämällä näitä määrityksiä tarkastelimme luontainen tasoja DNA-vaurioita käsittelemättömän PBMC kolmen ryhmän yksilöiden (terveillä vapaaehtoisilla, potilailla herkkä ja potilaat resistenttejä platina kemoterapiaa ). Molemmat γH2AX immunofluoresenssivärjäyksen ja comet osoittivat merkittäviä eroja kolmen ryhmän yksilöiden (kaikki

P

0,05, taulukko 3), jossa luontainen DNA-vaurioita on suurempi OC potilailla kuin terveillä vapaaehtoisilla. Mielenkiintoista mukaisesti saatujen tulosten munasarjasyöpäsolulinjoihin kokeissa korkeampi sisäinen DNA-vaurioita havaittiin PBMC potilaiden herkkä verrattuna kestävät myöhemmän platinapohjaista solunsalpaajahoitoa (γH2AX,

P

= 0,05; komeetta määritys,

P

= 0,003, taulukko 3, Fig. 4A-D). Erityisesti käyttämällä γH2AX Immunofluoresenssivärjäystä Platinasensitiivisten potilailla esiintyi 16,8 ± 2,3% positiivisia soluja, platina-resistenttien potilaiden 8,9 ± 2,4%, kun taas terveillä vapaaehtoisilla osoitti 3,9 ± 1,2% positiivisia soluja (taulukko 3, Fig. 4A). Käyttämällä comet, potilaat herkkä platina kemoterapiaa osoitti OTM arvot 20,1 ± 5,5 mielivaltaista yksikköä, platina kestävät 7,8 ± 2,5, kun taas terveillä vapaaehtoisilla osoitti 2,4 ± 1,1 yksikköä (taulukko 3, Fig. 4C). Mielenkiintoista, vahvistaa, että erot DDR signaalit ovat todella heijastavat platina- herkkyys sijaan kasvaimen tyyppi, potilaat, joilla on sama histotype jaettiin herkkiä ja resistenttejä platina hoidon ja luontaisen DNA-vaurioita tasoja verrattiin. Vaikka kukin alaryhmä sisältää pienen määrä näytteitä, tulokset osoittivat, että erot luontaisen DNA-vaurioita tasot ovat heijastava platinaa herkkyyteen. Esimerkiksi vakavien kasvaimia vain käyttäen γH2AX värjäystä, herkille potilaille (

n

= 6) osoitti korkeampaa luontaisen DNA-vaurioiden (keskiarvo, 16,6% positiivisia soluja, alue, 13,1-23,2%) kuin resistenttejä potilas (

n

= 1; 7,5%). Lisäksi selkeä solujen munasarjasyövän vain, herkkä potilas (

n

= 1) osoitti 18,5% positiivisia soluja, kun taas resistenttien potilaiden (

n

= 3) vain 9,4% (vaihteluväli 6,3 -13,7%). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä comet.

(A) Rasiakuvaajat osoittaa tilastollisen jakauman tasojen luontainen DNA-vaurioita käsittelemättömän PBMC: käyttäen immunofluoresenssilla kvantifiointia γH2AX. HV, terveillä vapaaehtoisilla; Sens: OC potilaat herkkiä myöhemmin platinaa hoito; Res: OC potilaat resistenttejä myöhemmin platinaa hoitoa. (B) Tyypillinen kuvia konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi analyysi PBMC kolmesta ryhmästä; ylempi kuvat, γH2AX värjäys; bottom kuvat, solutumissa merkitty DAPI. (C) Rasiakuvaajat osoittavat tilastollinen jakauma tasojen luontainen DNA-vaurioita käsittelemättömän PBMC käyttäen emäksistä comet. (D) Tyypillinen komeetta kuvia käsittelemättömästä PBMC kolmen ryhmän yksilöitä. Rasiakuvaajien esittää tilastollisen jakauman tasoja DNA-vaurioita PBMC: stimuloi osaksi leviämisen käyttäen PHA ja käsiteltiin karboplatiinin (0-1800μg /ml) 24 h, (E) immunofluoresenssi kvantifiointi γH2AX ja (F) emäksinen comet. Vaakasuorat viivat sisällä laatikot edustavat mediaaniarvot ja pystysuorat linjat ulottuvat ylä- ja alapuolella laatikon osoittavat maksimi- ja minimiarvot, vastaavasti. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Jotta voidaan tutkia DNA: n korjaukseen tehokkuutta kolmeen ryhmään yksilöiden, seuraavan 48 tunnin inkubointi PBMC: t 10 ug /ml PHA: ta, soluja käsiteltiin karboplatiinin (0 -1800μg /ml) 24 h, post-inkuboitiin huumeeton väliaineessa 0-24h ja indusoidun DNA-vaurioita analysoitiin. Molemmat γH2AX immunofluoresenssivärjäyksen ja comet osoittivat samanlaisia ​​tuloksia. Eli kaikki yksilöt analysoitiin DNA-vaurioita saavutti korkeimman tason lopussa huumehoidon, jossa DNA-vaurioita on suurempi OC potilailla kuin terveillä vapaaehtoisilla; platina-herkille potilaille osoittivat korkeampia DNA-vaurioita kuin platina-vastustuskyvyn (tuloksia ei ole esitetty). Tämän jälkeen DNA-vaurioita tasot karsittiin ja laajuus korjaus oli korkeampi terveillä vapaaehtoisilla kuin potilailla. Mielenkiintoista mukaisesti saatujen tulosten solulinjoista kokeita, platina-herkkä potilailla havaittiin merkitsevästi pienempi korjaus hyötysuhde kuin platina-vastustuskyvyn (

P

0,03). Erityisesti käyttämällä konfokaalimikroskopia γH2AX pesäkkeitä poistettiin t

1/2 = 2,7 ± 0,5 h myös terveiden, 8,8 ± 1,9 h platina kestävät ja 15,4 ± 3,2 H platina-herkillä potilailla.