Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Achaete scute kaltainen 2 (Ascl2), perus helix-loop-helix (bHLH) transkriptiotekijä, ohjaa kohtalo suoliston kantasoluja. Kuitenkin rooli Ascl2 paksusuolen syövän kantasolujen edelleen tuntematon. Solulinjan HT-29 (47,5-95% of CD133

+ väestöstä) ja LS174T (0,45% of CD133

+ väestöstä) valittiin toiminnallinen arviointi Ascl2 paksusuolen syövän esisolujen jälkeen geeni pudotus RNA interferenssin .

Menetelmät /Principal havainnot

immunohistokemia osoitti, että Ascl2 lisääntyi merkitsevästi peräsuolen adenokarsinooman. Downregulation Ascl2 RNA-interferenssin viljellyissä koolonadenokarsinoomasolulinjalla HT-29 ja LS174T solujen vähensi solujen lisääntymisen, pesäkkeitä muodostavat kyky, invaasion ja muuttoliike in vitro, ja johti kasvun pysähtymisen tuumoriksenograftien in vivo. Ascl2 proteiini tasolla CD133

+ HT-29-soluissa oli merkittävästi korkeampi kuin CD133

– HT-29-soluja. Ascl2 saarto kautta shRNA häiriöitä HT-29-solut (shRNA-Ascl2 /HT-29-solut) johti 26,2% soluista värjäämällä CD133

+ verrattuna 54,7%: in ohjaus shRNA-Ctr /HT-29-soluja. Tasot ”stemness” liittyvät geenit, kuten CD133, Sox2, Oct4, Lgr5, Bmi1, ja C-myc, oli merkittävästi vähentynyt shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T-solujen in vitro sekä vastaava -tuumoriksenografti (CD133 ei suoritettu shRNA-Ascl2 /LS174T solut). ShRNA-Ascl2 /HT-29-solujen oli estetty kykyjä muodostaa tumorspheres verrattuna kontrolli. MicroRNA (miRNA) mikrosirut, jonka tunnuksena 26 säädelty miRNA ja 58 alassäädetty miRNA in shRNA-Ascl2 /HT-29-soluja. Ekspressiotasot let-7b, miRNA-124, miRNA-125b, miRNA-17, miRNA-20a ja miRNA-302B, osallisena säätelyssä ”stemness”, olivat määrällisesti qPCR, jotka vahvistivat heidän identiteettiään. Palauttaminen miRNA-302B, kautta matkivat, johti palauttaminen shRNA-Ascl2 /HT-29 ’stemness ominaisuuksien, kuten tumorsphere muodostumista ja ”stemness” liittyy geenien tasolla, ja elpyminen solun käyttäytymistä, kuten pesäkkeitä muodostavat kyky , invaasio ja muuttoliike in vitro.

Johtopäätökset /merkitys

Ascl2 voi olla potentiaalinen kohde inhiboimiseksi paksusuolensyöpä progenitorisolujen, ja toiminnot kautta miR-302B liittyviä mekanismi.

Citation: Zhu R, Yang Y, Tian Y, Bai J, Zhang X, Li X, et al. (2012) Ascl2 Knockdown Tulokset kasvaimen kasvussa pidätys by miRNA-302B-Related estäminen Colon Cancer kantasolut. PLoS ONE 7 (2): e32170. doi: 10,1371 /journal.pone.0032170

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 lokakuu 2011; Hyväksytty: 21. 2012 Julkaistu: 23 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat valtion säätiön luonnontieteiden People Kiina 81000154 (YY) ja Natural Science Foundation Project CQ CSTC 2008BA5034 (RW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC), kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpään maailmanlaajuisesti ja johtava syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta kehittyneissä maissa [1], on merkittävä terapeuttinen haaste syöpään. Äskettäin, syöpä kantasolujen (CSC) hypoteesi on ehdotettu selittämään toiminnalliset heterogeenisyys ja karsinogeneesiin syövän. Tämän mallin mukaan, alapopulaatio syöpäsoluja, joilla on varsi-kaltaisia ​​ominaisuuksia, yllä kasvaimen muodostumisen, etäpesäkkeiden, ja kestävyys hoito [2] – [5]. Tässä suhteessa, CSCS voidaan olettaa olevan kantasolun /kantaisä fenotyypin (yleensä kutsutaan ”stemness”). Lisäksi useissa tutkimuksissa on tutkittu proteiinia koodaavan geenien ja niiden tuotteiden, jotka osallistuvat stemness huolto- ja tuumorigeenisyyden paksusuolen syövän kantasolujen [6] – [8]. Näin ollen on tärkeää tunnistaa sääntelymekanismit ja signalointireittejä mukana paksusuolensyöpä progenitorisolujen kehittää uusia reagensseja kohdistaa tulenkestävä paksusuolen syövän kantasolujen populaation [9].

Achaete scute-, kuten 2 (Ascl2) , perus helix-loop-helix (bHLH) transkriptiotekijä, on alavirran kohde Wnt signalointia suolen kantasoluja. In situ -hybridisaatio osoitti Ascl2 ilmaisu pohjan pienten ja suurten suoliston kryptojen, mutta vähäistä ilmentymistä muissa normaaleissa kudoksissa, paitsi istukassa [10]. Yhdistetty tulokset näistä vahvistus- ja menettämisestä toiminto kokeet merkitsevät sitä, että Ascl2 ohjaa kohtalo suoliston kantasolujen [11]. Useat ryhmät ovat osoittaneet, että Ascl2 on yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä [10], [12], [13]. Lisäksi Ascl2 yli-ilmentyminen on mahdollista siirtää hierarkian kanta- ja progenitorisolujen sisällä metastaaseja johtaa itseuudistumisen sijaan erilaistumista, saattaa vaikuttaa kliininen käyttäytyminen näiden kasvainten [13]. Siten Ascl2 voi olla säätelytekijänä joka ohjaa kohtalo paksusuolensyöpä progenitorisolujen. Kuluneen vuosikymmenen aikana, useat kehityshäiriöitä väyliä, jotka säätelevät CSCS on selvitetty [14] – [17]. Kuitenkin rooli Ascl2 paksusuolen syövän esisolujen edelleen tuntematon.

solulinjaa HT-29 on CD133

+ väestöstä 47,5-95% kirjallisuudessa [18], [19] ja eristetty CD133

+ soluja HT-29 koolonisyöpäsolulinja näytteillä korkeampi Tuumorigeenisuustutkimuksissa kuin CD133

– soluja in vivo kasvaimen muodostumiseen määritys [20]. CD133 proteiini todettiin ensimmäisen pintana markkeri hematopoieettisten kantasolujen [21], myöhemmin sitä käytettiin tunnistamaan syövän kantasoluja monissa kiinteitä kasvaimia, jotka johtuvat esimerkiksi, rinta- [22], haima [23], maksa [ ,,,0],24] ja paksusuolen [18], [19]. Solulinja LS174T on CD133

+ väestöstä 0,45% kirjallisuudessa [20] ja 0,1% meidän kokeessa (tuloksia ei ole esitetty). Täten HT-29 ja LS174T soluja valittiin toiminnallinen arviointi Ascl2 paksusuolen syövän esisolujen jälkeen geeni pudotus RNA häiriöitä.

MikroRNA (miRNA) ovat ratkaisevia posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen ja mukana useissa biologiset toiminnot, mukaan lukien solun proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [25]. miRNA myös auttavat säilyttämään stemness alkion kantasolujen ja ihmisen CSCS [26] – [28]. Tutkimus toiminta Ascl2 paksusuolen syövän kantasolujen ja miRNA ilmentymisen profiilit on ratkaisevan tärkeää, jotta voidaan selvittää ominaisuudet paksusuolen syöpä progenitorisolujen, joka hyödyttää uusien lääkkeiden kehittämiseen tai uusia terapeuttisia menetelmiä, jotka on kohdistettu paksusuolen syövän kantasolujen. Lisäksi se antaa uusia oivalluksia menetelmiä hävittämiseksi paksusuolensyöpä johtuen todennäköisyys, että hävittämiseksi paksusuolensyöpä progenitorisolujen on ratkaiseva askel kohti paranna paksusuolensyöpä.

Tässä raportissa osoitamme selektiivinen saarto Ascl2 HT-29 ja LS174T solut voivat estää solujen kasvua, invaasiota ja muuttoliike in vitro, ja johtaa kasvuun pidätys in vivo, joka on osittain liittyy miRNA-302B liittyviä esto ”stemness” paksusuolisyövän kantaisä solut perustuvat kokeilut shRNA-Ascl2 /HT-29 transfektoitu miRNA-302B matkivat. Nämä tulokset osoittavat, että Ascl2 voisi olla potentiaalinen kohde paksusuolen syövän kantasolujen kehittämiseen Uusien hoitomuotojen hävittämiseksi paksusuolen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen paksusuolen adenokarsinooma solulinjat HT-29 ja LS174T, saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (Sigma, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone, USA) 37 ° C ja 5% CO

2, keskipitkän vaihdetaan joka toinen päivä. Solut siirrostettiin 80% konfluenssiin ja ympättiin 30% konfluenssiin ylläpidon optimaalisen lisääntyvän olosuhteissa.

RNA-interferenssi

sekvenssi, CCGCGTGAAGCTGGTGAAC, kohdistaminen Ascl2 (shRNA-Ascl2 /EGFP) [11 ] muodostettiin DNA-dupleksin, joka koostuu 5′-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3 ’, 5′-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3’.

pGenesil-1,1 käytettiin ilman insertin ohjaus (shRNA-Ctr /EGFP). Hehkutettu DNA-dupleksit kloonattiin plasmidiin pGenesil-1,1 digestoitiin Eco31I restriktioentsyymillä. HT-29 ja LS174T-solut transfektoitiin shRNA-Ascl2 /EGFP tai shRNA-Ctr /EGFP vektori, ja sitten valitaan 0,8 mg /ml G418: aa ja HT-29-transfektoitujen solujen ja 0,4 mg /ml G418: aa ja LS174T transfektoituja soluja, jotka alkavat 48 tuntia transfektion. Kaksi viikkoa myöhemmin, soluja pidettiin 0,4 mg /ml G418: aa ja HT-29-transfektoitujen solujen ja 0,2 mg /ml G418: aa ja LS174T transfektoituja soluja, kunnes kolmen riippumattoman vakaa transfektoidut kloonit vahvistettiin. RNA-interferenssi oli vakaa koko span kokeet alla valinnan paineessa 0,4 mg /ml G418 HT-29 transfektoiduissa soluissa ja 0,2 mg /ml G418 LS174T transfektoitujen solujen viljelyväliaineeseen.

proliferaatiotestillä

solujen proliferaatio tutkittiin päivinä 1, 2, 3 ja 4. eristetty solut ympättiin 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille (Corning, USA) lopulliseen tilavuuteen 100 ui viljelyalustaa kuoppaa kohti. Kullakin ajanhetkellä, 5 mg /ml MTT: tä (Sigma, USA) lisättiin viljelyalustaan ​​(20 ul /kuoppa) ja inkuboitiin vielä 4 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehään, jotta MTT muunnetaan formatsaanikiteet. Tämän jälkeen formatsaanikiteet liuotettiin 150 ui DMSO: ta (Sigma, USA) 10 minuutin ajan. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm mikrolevylukijalla (Thermo, USA). Kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa.

Colony muodostumisen määritys

Solut maljattiin tiheydellä 1000 solua per levy (35 mm, Corning, USA) ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 5 % CO

2. Väliaine vaihdettiin joka 3-4 päivä. Päivinä 20, solut värjättiin Giemsa ja tarkkailtiin käänteismikroskoopilla. Pesäkkeiden lukumäärät kussakin levy laskettiin. Koe toistettiin kolme kertaa ja ilmaistuna keskimäärin pesäkettä levyä.

In vitro invaasiomääritys

in vitro hyökkäys kyky solujen mitattiin käyttämällä siirtokuoppaan kammiot päällystetään matrigeelin (Corning, USA) määritys. Solut ympättiin 100 ui tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml ja 1% FBS ylemmässä kammiossa, ja alempi kammio täytettiin 600 ui viljelyalustaa 20% FBS kuin kemoattraktantti. Siirtoaltaat inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa, 5% CO

2 48 h, jotta solut hyökätä. Lopussa Inkuboinnin jälkeen solut yläpuolen Matrigel-käsitelty suodatin poistettiin pyyhkimällä pumpulipuikolla. Solut, jotka olivat tunkeutuneet kautta Matrigel-käsitelty suodatin värjättiin kristalliviolettiliuoksella. Invasiivisen läpi vaeltaneiden solujen Matrigel-käsitelty suodatin alapinnan laskettiin alle käännetyn valomikroskoopilla (Olympus, Japani), 200-kertaisella suurennuksella. Solut viidessä satunnaistetussa näkökenttien 200 × laskettiin ja ilmaistiin keskimäärin solua näkökentän. Koe toistettiin kolme kertaa.

Migration

HT-29, LS174T-soluja ja niiden transfektantit, 90-100% konfluenssiin 6-kuoppalevyillä, kasvatettiin yön yli seerumittomassa elatusaineessa . Kasvualusta korvattiin PBS: llä, ja yksisolukerrokset haavoittuneen mekaanisesti käyttäen steriloitua, yhden reunan partaterällä. Haavoittamisen jälkeen, solut huuhdeltiin kahdesti steriilillä PBS: llä ja inkuboitiin McCoyn 5A-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut, jotka oli siirtynyt haavoittuneita reunasta laskettiin 200 x suurennus käyttäen käänteisvalomikroskoopilla (Olympus, Japani). Solut 5 satunnaisesti näkökenttien 200 x ja ilmaistuna keskimäärin solua näkökentän. Koe toistettiin kolme kertaa.

Tumorsphere-muodostumisen määritykset

tumorsphere muodostumista, yksisoluiset suspensiot suspendoitiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine /F12 (DMEM /F12, Hyclone, USA) täydennetty B-27 (1 x, Gibco), 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF, Peprotech, USA), ja 20 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF, Peprotech, USA), ja sitten maljattiin 24- hyvin ultra-low kiinnityslevyt (Corning, USA) konsentraationa 1000 solua per kuoppa. Levyt analysoitiin 7-10 päivää myöhemmin tumorsphere muodostumista ja kvantitoitiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus) 100 x 400 x suurennuksilla. Myöhempinä kvantifiointi solujen määrä per tumorsphere, tumorspheres kerättiin 40 um seulan (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja erottaa toisistaan ​​0,25% trypsiiniä /0,02% EDTA tehdä yksisolususpension. Elinkelpoiset solut laskettiin käyttämällä trypaanisinieksluusiolla.

In vivo tuumorigeenisyystesti

shRNA-Ctr /HT-29, shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ctr /LS174T ja shRNA -Ascl2 /LS174T solut suspendoitiin uudelleen 100 ui (1 x 10

6 solua) 0,9% fysiologista suolaliuosta ennen injektiota. Kuusi viikkoa vanhoja BALB /c nude koirashiirien ostettiin Animal Facility tutkimuskeskuksen kolmannen Military Medical University ja ylläpidetään normaaliolosuhteissa. Kaikki kokeet suoritettiin hyväksynnän Animal Studies eettisen komitean kolmannen Military Medical University (luvan numero: sw 20090713). Hiiret inokuloitiin subkutaanisesti 1 x 10

6 eristettyjä soluja molemmille kyljissä (vasemman shRNA-Ascl2 /HT-29 tai shRNA-Ascl2 /LS174T soluja ja oikealta shRNA-Ctr /HT-29 tai shRNA-Ctr /LS174T-soluja, vastaavasti). Kasvain koot mitattiin mittaharpilla. Kasvaimen koot laskettiin käyttämällä kaavaa: (pituus x leveys

2) /2. Hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula päivänä 20 inokulaation jälkeen. Siirteet poistettiin, dokumentoitu valokuvaus ja kasvaimen painot mitataan. Kasvaimet jaettiin kahteen ryhmään, ja joko kiinteä 10% puskuroidulla formaliinilla tai säilytetään -80 ° C.

Virtaussytometria solulajittelussa ja virtaussytometria analyysi

eristämiseksi CD133

+ ja CD133

– populaatiot HT-29-solujen, yksisoluiset suspensiot inkuboitiin fykoerytriini (PE) konjugoidulla anti-ihmis-CD133-vasta-aineen (AC133 klooni, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) ja FcR salpausreagenssissa ( Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) värjäys, joka sisälsi 0,5% BSA: ta ja 2 mM EDTA: ssa 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Isotyypin hiiri-immunoglobuliini G1 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) toimi negatiivisena kontrollina. Solut analysoitiin ja lajitellaan, jossa fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Positiivisen ja negatiivisen väestön alkuun 10,8% kirkkaasti värjättyä solua tai alhaalta 7,6% heikosti värjätään solut valittiin, vastaavasti.

immunohistokemia

immunohistokemialliset tutkimukset Ascl2 suoritettiin ihmisen paksusuolen limakalvoa (n = 11), paksusuolen karsinooma (n = 11) ja tuumoriksenografteja päässä nude-hiirissä (n = 6), ihmisen paksusuolen limakalvon ja syöpäkudoksissa olivat peräisin samoista potilaista ja kaikki potilaat edellyttäen tietoista suostumusta. Parafiini poistettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen kudosten; Sitten näytteet estettiin ja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Vasta-aine havaittiin SP9002 Histostain ™ -Plus Kits (Zymed Co., USA). Kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Hiiren Ascl2 monoklonaalinen vasta-aine (taulukko S1) käytettiin laimennoksena 1:100. Kaikki kokeet suoritettiin hyväksyntää Studies eettisen komitean Southwest Hospital, kolmas Military Medical University (luvan numero: sw 20090713).

immunofluoresenssi

HT-29 ja LS174T soluja, viljellyt on steriloitu pääliliuskat, värjättiin Ascl2 primaarisen vasta-aineen (taulukko S1), jonka jälkeen inkuboitiin vuohen anti-hiiri-IgG-R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Kalifornia, USA), counterstaining DAPI, ja lopulta visualisoida laserskannaus confocal fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Inc. Saksa).

Reaaliaikainen PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen primeScript ™ RT-entsyymin sekoitetaan I, oligo-dT-alukkeita ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä (Takara, Japani). Määrittämään kertainen muutokset kunkin geenin, reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ensimmäisen juosteen cDNA, eteen ja taakse alukkeita, ja SYBR esiseos Ex Taq ™ Green II (Takara, Japani). Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S2. Reaction ja signaalin voimakkuutta mitattiin reaaliaikaisen PCR-järjestelmä (BioRad, USA). Ekspressiotasoja laskettiin suhteellinen ilmentyminen suhde verrattuna β-aktiini. Reaaliaikaisen PCR: t suoritettiin kolmena rinnakkaisena itsenäisesti.

Western blot -määritys

Solulysaatteja tai homogenoidun kudoksia tuumoriksenografteja liuotettiin SDS-näytepuskuriin, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle kalvo. Β-aktiini käytettiin kontrollina. Kalvo tutkittiin tiettyjä primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa (primaaristen vasta-aineiden on esitetty taulukossa S1), jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen IgG (H + L) -vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Kalifornia, USA) . Täplät käsiteltiin kanssa Immobilon ™ western kemiluminesenssi HRP-substraattia (Millipore, USA) ja analysoitiin geelillä kuvantaminen analyysijärjestelmää (BioRad, USA).

miRNA mikrosiruanalyysi ja miRNA kvantifiointi käyttäen kvantitatiivista PCR

6. sukupolven ihmisen miRNA mikrosiruja (Exiqon, Tanska) käytettiin vertaamaan miRNA ilmentymisen profiilien välillä shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /HT-29-soluja. Microarray sisältää yli 1891 sieppauskoettimien, joka kattaa kaikki ihmisen, hiiren ja rotan miRNA selityksin että miRBase 16.0. Kokonais-RNA uutettiin 1 x 10

7 transfektoitu stabiilisti shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /HT-29-soluihin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA). RNA: n eristys, laadunvalvonta, merkinnät, ja hybridisaatio suoritettiin Shanghai KANCHENG Biochip Company mukaan protokollat ​​miRNA microarray järjestelmään. Arrays skannattiin käyttäen Microarray Scanner, ja skannatut kuvat sitten tuotu GenePix Pro 6.0-ohjelmisto (Axon) varten ruudukontasaus ja tiedon louhinta. Monistaa miRNA laskettiin keskiarvo ja miRNA intensiteetit 50 kaikissa näytteissä valittiin laskemiseksi normalisointitekijä. Ilmaisi data normalisoitiin käyttämällä Mediaani normalisointi. Normalisoinnin jälkeen, ilmentyvät eri miRNA tunnistettiin kertaluokkamuutos suodatuksen. Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin käyttäen MEV ohjelmistoa (v4.6, TIGR).

miRNA qPCR validointi, alukkeen sekvenssit miRNA on esitetty taulukossa S3. RNA: n eristys, laadunvalvonta, cDNA koota ja qPCR tehtiin Shanghai KANCHENG Biochip Company protokollien mukaisesti. T-testiä käytettiin tunnistamaan ilmentyvät differentiaalisesti miRNA välillä shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /HT-29-vertailua.

transfektio miRNA jäljittelee tai miRNA inhibiittoreita shRNA-Ascl2 /HT-29 solut

shRNA-Ascl2 /HT-29-solut transfektoitiin 24 tunnin kuluttua sen ympätään 6-kuoppaisille levyille. Mirna jäljittelee (100 pmol) tai miRNA-inhibiittorit (200 pmol) (Guangzhou Ribobio Co., Ltd Guangzhou, PR Kiina) 250 ul: ssa seerumitonta, antibiootit väliaineessa sekoitettiin 5 ui Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) liuotettiin 245 ul: aan samaa väliainetta ja annettiin seistä huoneen lämpötilassa 20 min. Saatu 500 ui transfektion lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi 1,5 ml kasvualustaa. Kuusi tuntia myöhemmin kuhunkin kuoppaan korvattiin 2 ml: lla tuoretta elatusainetta, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Ohimenevä transfektoidut solut kerättiin sen jälkeen, kun vielä 48 tunnin inkuboinnin jälkeen lisäkokeita varten, mukaan lukien tumorsphere muodostumista, real-time PCR, western blot-analyysi, pesäkemuodostusta, invaasiomääritys ja muuttoliike analyysi. Ohimenevä transfektoidaan shRNA-Ascl2 /HT-29-soluihin käyttämällä miRNA jäljitellä negatiivinen kontrolli (100 pmol) tai miRNA inhibiittorit negatiivinen kontrolli (200 pmol) käytettiin kontrollina.

Tilastollinen analyysi

jatkuvia muuttujia, tietoja ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Erot ryhmien välillä arvioitiin Studentin t-testiä ja toistuvien toimenpiteiden ANOVA. Kaikki erot katsottiin merkitsevä tasolla p 0,05, erittäin merkittävä tasolla p 0,01. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 13.0 for Windows-ohjelmisto.

Tulokset

Ascl2 yliekspressoituu paksusuolensyöpä ja koolonsyöpäsolulinjaa, ja Ascl2 häiriöitä HT-29 ja LS174T solujen huomattavasti vähentänyt sen ilmentyminen

immunohistokemiallinen värjäys käytettiin määrittämään, onko Ascl2 ekspressoitiin ihmisen paksusuolen limakalvolla ja paksusuolen syöpä. Kasvu Ascl2 proteiinin ilmentymisen tumassa paksusuolen syövän ihmisen koolonin syöpien (kuvio 1 B) ei havaittu, kun verrattiin spesifistä värjäytymistä ja Ascl2 proteiinin tumaan crypt emäksen solujen normaalin paksusuolen limakalvon (kuvio 1A). Solut Ascl2 positiivista värjäytymistä tumassa erotettiin negatiivisesti värjätty solu tarkasti normaalissa crypt pohja (kuvio 1A). Immunofluoresenssikokeisiin värjäys osoitti, että Ascl2 ilmaistiin pääasiassa tumassa HT-29-soluja, ja heikosti ilmaistu sytoplasmassa, kun taas Ascl2 ilmaistiin pääasiassa sytoplasmassa LS174T-soluja, ja heikosti ilmaistu tumaan. Sen ekspressiokuviota Ascl2 HT-29 ja LS174T soluja oli ristiriitainen, jossa suurin osa HT-29 ja LS174T solut on suhteellisen heikko ilmentyminen (kuvio 1 C). Western blot-analyysi osoitti, että Ascl2 oli mukana molemmissa koolonsyöpäsolulinjoissa HT-29 ja LS174T-soluja (20 kDa molemmissa), mutta se puuttuu MHCC-97L, joka on maksasyöpä solulinja (kuvio 1 D).

Ascl2 ilmentyminen on erityisesti paikallistaa tumaan crypt emäksen solujen normaalia ihmisen paksusuolen limakalvon (nuolenkärki) (A), B osoittaa, että Ascl2 on erityisesti ilmaistu tumassa ihmisen paksusuolen syöpäsoluja ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa (alkuperäinen suurennos yläpaneelin A ja B: × 200; Alkuperäinen suurennos alhainen paneeli A ja B: × 400). Immunofluoresenssivärjäyksellä osoittaa Ascl2 sijaitsevat pääosin tumassa HT-29-solujen ja sytoplasmaan LS174T-soluja (C) (Alkuperäinen suurennus: x 200). Western blot-analyysi osoittaa, Ascl2 on läsnä HT-29 ja LS174T-soluja, mutta se puuttuu MHCC-97L-soluja (D). Ascl2 häiriöitä HT-29 ja LS174T soluissa johtaa merkittävä vähentäminen sekä Ascl2 mRNA analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja proteiini tasoilla analysoitiin western blot-analyysi suhteessa kontrolliin (β-aktiini) (**: p 0,01) (E ja F).

kaataa Ascl2 ilmentymistä HT-29 ja LS174T soluja, solut transfektoitiin shRNA-Ascl2 /EGFP ja shRNA-Center /EGFP vektorit, neljä vakaata-transfektoituja solulinjoja ( shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T, shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Center /LS174T solut) perustettiin. Ascl2 mRNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR pienennettiin shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T soluja verrattuna niiden ehkäiseminen (kuvio 1 E). Vastaava vähennys Ascl2 proteiinia havaittiin shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T soluja verrattuna niiden ehkäiseminen (kuvio 1 F). Ei ollut merkittävää eroa shRNA-Ctr /HT-29 ja transfektoimattomat HT-29-solujen, välillä ja shRNA-Ctr /LS174T ja transfektoimattomia LS174T-soluja, sekä Ascl2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 1E ja 1F).

Silence of Ascl2 HT-29 ja LS174T solut johti muutoksiin solun käyttäytymistä

Pesäkkeenmuodostusta määritys: shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T solujen kehitetty vähemmän pesäkkeitä 20 päivän kuluttua verrattuna niiden (p 0,05) (kuvio 2A). Lisääntymisen määritys: Leviämisen hinnat shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T ja niiden valvonta tutkittiin käyttäen MTT-menetelmällä, mukaan valmistajan protokollaa, päivinä 1-4 jälkeen kylvö. Kuten kuviossa 2B, on huomattavia eroja kasvun välillä shRNA-Ascl2 /HT-29 ja HT-29-solut, ja välillä shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Center /HT-29-solut päivinä 3 ja 4, myös välillä shRNA-Ascl2 /LS174T ja LS174T soluja, ja välillä shRNA-Ascl2 /LS174T ja shRNA-Center /LS174T soluja päivinä 3 ja 4 (p 0,05). In vitro invaasiomääritys: Invasion analyysit suoritettiin käyttäen Matrigel päällystettyjä transwell soluviljelykammioihin. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, numerot tunkeutuvat solut laskettiin. Jossa shRNA-Ascl2 /HT-29-solujen, 7 ± 3 solua kenttä (alle 200-kertainen suurennus käyttäen käännettyä mikroskooppia) tunkeutuneet kalvon läpi. Tämä määrä oli merkittävästi pienempi kuin transfektoimattomat HT-29-soluja (37 ± 5) tai shRNA-Ctr /HT-29-soluja (31 ± 6) (p 0,01). Vastaavasti, shRNA-Ascl2 /LS174T soluja, 84 ± 14 solua per kenttä (alle 200-kertainen suurennus käyttäen käännettyä mikroskooppia) tunkeutuneet kalvon läpi. Tämä määrä oli huomattavasti pienempi kuin transfektoimattomissa LS174T soluja (292 ± 32) tai shRNA-Center /LS174T soluja (296 ± 30) (p 0,01) (kuvio 2C). Migration: Lopuksi 75 ± 10 shRNA-Ascl2 /HT-29-solujen määrä kenttää kohden (alle 200-kertainen suurennus) muuttanut toiseen kaavittu reuna 48 tunnin kuluttua. Tämä määrä oli merkittävästi pienempi kuin transfektoimattomat HT-29-soluja (185 ± 15) tai shRNA-Ctr /HT-29-soluja (195 ± 25) (p 0,05). 82 ± 9 shRNA-Ascl2 /LS174T solua kenttä (alle 200-kertainen suurennus) muuttanut toiseen kaavittu reuna 48 tunnin kuluttua. Tämä määrä oli merkittävästi pienempi kuin transfektoimattomat LS174T-soluja (177 ± 21) tai shRNA-Ctr /LS174T-soluja (173 ± 25) (p 0,05) (kuvio 2D).

shRNA-Ascl2 /HT 29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T solut ovat vähemmän pesäkkeitä (*: p 0,05) (A), alempi kasvu (*: p 0,05) (B), vähemmän hyökkäsi solujen kautta Matrigel päällystetty kalvo (**: p 0,05) (D), verrattuna niiden ehkäiseminen (Alkuperäinen suurennus: × 200).

Ascl2 häiriöitä led in vivo kasvun pysähtymisen kasvainten

Jos haluat vertailla kasvuvauhti shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /HT-29-solujen, shRNA-Ctr /LS174T ja shRNA-Ascl2 /LS174T soluja, vuonna kateenkorvattomiin nude hiirissä shRNA-Ascl2 /HT-29 tai shRNA-Ascl2 /LS174T-soluja injektoitiin vasemman kyljen kun shRNA-Ctr /HT-29 tai shRNA-Ctr /LS174T-soluja injektoitiin oikeaan kylkeen vastaavasti. Kaksikymmentä päivää inokulaation jälkeen jokaisen pariksi soluja (shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ctr /HT-29-solujen kuviossa 3A, tai shRNA-Ascl2 /LS174T ja shRNA-Center /LS174T-soluja (tuloksia ei esitetä)) kussakin hiiri, vastaavasti, kaikki hiiret (12/12, vastaavasti) kehittyi kasvaimia. Tuumoritilavuudet mitattiin mittaharpilla eri ajankohtina ennen kuolemaa, vaikka painot määritettiin kuoleman jälkeen. Tilavuus ja massa shRNA-Ascl2 /HT-29 tai shRNA-Ascl2 /LS174T kasvaimet olivat merkittävästi alhaisemmat kuin shRNA-Ctr /HT-29 tai shRNA-Ctr /LS174T kasvaimet (p 0,05) (kuvio 3B ja 3C). Lisäksi Ascl2 ekspressio kasvaimen kudoksen shRNA-Ascl2 /HT-29 tai shRNA-Ascl2 /LS174T-soluja oli huomattavasti pienempi kuin shRNA-Ctr /HT-29 tai shRNA-Ctr /LS174T-soluja, määritettynä reaaliaikaista PCR ja western blot-analyysi (kuvio 3D ja 3E). Ascl2 ilmentyminen kasvainten kudoksessa shRNA-Ascl2 /HT-29 tai shRNA-Ascl2 /LS174T-soluja oli huomattavasti pienempi kuin siinä shRNA-Ctr /HT-29 tai shRNA-Ctr /LS174T-soluja, kuten on esitetty immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 3F) .

Kaikki hiiret (6/6, vastaavasti) kehittää kasvaimia 20 päivää myöhemmin, kun 1 x 10

6 shRNA-Ctr /HT-29-solut (oikea puoli ja merkitty nuolella) ja shRNA-Ascl2 /HT-29-soluja (vasemmalla puolella ja merkitty nuolenkärki) on ympätty paljaisiin hiiriin (A), LS174T-soluja ei ole esitetty. Kasvaimen tilavuus (B) ja massan paino (C) ryhmässä shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T soluissa on huomattavasti pienempi kuin ryhmä shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ctr /LS174T solut (*: p 0,05). MRNA: n (D) ja proteiini (E) tasot Ascl2 kasvainkudoksessa kehittyä shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA-Ascl2 /LS174T solut ovat pienemmät kuin kasvainkudoksessa kehitetty shRNA-Ctr /HT-29 ja shRNA-Ctr /LS174T soluja (**: p 0,01). Ascl2 Immunovärjäyksen tumassa syöpäsoluja tuumoriksenografteja peräisin shRNA-Center /HT-29 ja shRNA-Center /LS174T solut on vahvempi kuin tumassa syöpäsoluja tuumoriksenografteja peräisin shRNA-Ascl2 /HT-29 ja shRNA -Ascl2 /LS174T soluja (F).

Ascl2 ilmaisun CD133

+ ja CD133

– HT-29-solujen

Virtaussytometrianalyysi osoitetuista CD133 ilmaistiin 58,1% HT-29-soluja, jossa oli 0,1% HT-29-soluja havaittiin negatiivisen kontrollin. 98,6% soluista varmistettiin olevan CD133 positiivisia top 10,8% CD133 positiivisia HT-29-soluihin postsorting valinta, 98,1% soluista varmistettiin olevan CD133 negatiivisena himmeästi 7,6% CD133 negatiivisten HT-29-solut (kuvio 4A).

CD133 ilmentyy 58,1% HT-29-soluja. 98,6% soluista on vahvistettu olevan CD133 positiivisia jälkeinen lajittelu valinnan alkuun 10,8% CD133

+ HT-29-solujen, 98,1% soluja vahvistettiin CD133 negatiivinen postitse lajittelu valinnan himmeästi 7.6 % of CD133

– HT-29-solut (A). Ascl2 proteiinin taso suhteessa kontrolli (β-aktiini) in CD133

+ HT-29-solujen on huomattavasti korkeampi kuin CD133

– HT-29-solut (*: p 0,05) (B). On selvää tumavärjäystä of Ascl2 vuonna CD133

+ HT-29-solujen, mutta Ascl2 on lähes negatiivinen CD133

– HT-29-solut (C) (Alkuperäinen suurennus: × 200).

CD133

+ ja CD133

– HT-29-solut analysoitiin ilmentymisen Ascl2 käyttäen western blot määrityksiä. Ascl2 proteiini taso suhteessa kontrolliin (β-aktiini) in CD133

+ HT-29-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin vuonna CD133

– HT-29-solut (p 0,05) (kuvio 4B). CD133

+ ja CD133

– HT-29-soluja immunovärjättiin anti-Ascl2 vasta-, mikä osoittaa tumavärjäystä rakenteessa Ascl2 vuonna CD133

+ HT-29-solut (yläpaneelin kuvion 4C), ja vähäinen värjäytyminen Ascl2 vuonna CD133

– HT-29-solut (alhainen paneeli kuvio 4C).

prosenttiosuus CD133

+ HT-29-solujen ja ”stemness” merkkiaineet olivat huomattavan supistuisivat Ascl2 pudotus

havainto, että Ascl2 ilmaisu oli suurempi CD133

+ HT-29-solujen kuin CD133

– HT-29-solujen, johti hypoteesiin, että Ascl2 proteiini on tärkeä ilmaus CD133 vuonna CD133

+ varsi /kantaisä HT-29-soluja.