Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä tai keuhkojen karsinooma muodostuu pääosin epiteelin soluja, jotka ovat ohuita ja viiva alveolaarinen pinnat keuhkojen kaasun vaihtoon. ANO1 /TMEM16A, alunperin tunnistettu hengitysteiden epiteelisolujen kuuluu Ca

2 + aktivoitujen CI

– kanavaa (CaCCs), jotka toimivat säädellä epiteelin eritystä ja solujen määrän ylläpidosta ionin ja kudosten homeostaasin. ANO1 /TMEM16A on äskettäin osoitettu olevan erittäin ilmaistu useissa epiteelissä peräisin karsinoomat. Kuitenkin rooli ANO1 keuhkosyövässä on tuntematon. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että esto kalsiumin aktivoimien kloridikanavan ANO1 /TMEM16A estää kasvaimen kasvua ja invaasiota ihmisen keuhkosyöpä. ANO1 ylössäädellään erilaisissa ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Koputtaa alas ANO1 pienet hiusneula-RNA: iden estivät proliferaatiota, migraatiota ja hyökkäys GLC82 ja NCI-H520 peruuttaa solujen arvioitiin CCK-8, olisi-paranemista, siirtokuoppaan ja 3D pehmytagar määrityksiä. ANO1 proteiini yli-ilmennetään 77,3% tapauksista ihmisen keuhkojen adenokarsinooman kudoksia havainnut immunohistokemiallisesti. Lisäksi kasvaimen kasvua nude-hiirissä istutettiin GLC82 solujen merkittävästi tukahdutti ANO1 hiljentäminen. Yhdessä havaintomme todistamaan, että ANO1 yliekspressio edistää kasvaimen kasvua ja invaasiota keuhkosyöpään; ja tukahduttaa ANO1 yli-ilmentyminen voi olla terapeuttista potentiaalia keuhkosyövän hoidossa.

Citation: Jia L, Liu W, Guan L, Lu M, Wang K (2015) Inhibition of Calcium-aktivoitu Chloride Channel ANO1 /TMEM16A vaimentaa Tumor kasvu ja Invasion Human Lung Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10,1371 /journal.pone.0136584

Editor: Shang-Zhong Xu, University of Hull, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 05 elokuu 2015; Julkaistu: 25 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat tutkimusapurahoja KWW ministeriön Science and Technology of China (2013CB531302 ja 2014ZX09507003-006-004) ja National Science Foundation of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä tai keuhkojen karsinooma, joka johtuu epiteelisolujen on yleensä luokiteltu pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Koska yleisin keuhkosyövän, NSCLC aiheuttaa 84% arvioidusta tapauksissa kaksi suurta alatyyppiä: adenokarsinooma ja okasolusyöpä [1]. Tällä hetkellä patogeneesi ja kehittäminen keuhkosyövän ei ole selvästi määritelty. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että ionikanavia on merkittävä rooli syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota, ja ajo syövän etenemistä kaikissa eri vaiheissa [2, 3].

lonikanavat ovat vedellä täytetty huokoset ja transmembraaniproteiineja läsnä kaikissa elävissä soluissa, jotka osallistuvat erilaisiin fysiologisiin toimintaan kiinteästi excitability, supistuminen, eritys, solusyklin ja metastasoituneen cascades [4, 5]. Normaali ilmaus ionikanavia on ratkaisevan tärkeää ylläpitää Ca

2 + ja kudosten homeostaasin aikana solujen lisääntymistä ja erilaistumista kautta säätelevät solujen ionivirroista, säätelevät solujen määrän, ja tuottaa kalvojännite [6, 7]. Kloridikanavia ovat tärkeitä monille biologisten prosessien kuten epiteelin kuljetusta varten ionivirroista, soluvolyymiä sääntely, erilaistuminen ja apoptoosin [8, 9]. Vakaa ja jatkuva solujen määrä ja ioni homeostaasin aikana solujen lisääntymistä ja erilaistumista ovat ehdottoman välttämättömiä solujen toimintaa ja selviytymistä [10, 11]. Kloridi vuon kautta kloridikanavia vastauksena solun turvotus on yksi kriittisistä mekanismeja, joilla solut palauttaa niiden tilavuus seuraavat osmoottisen häiriöt ja stressin aiheuttama voimakas metabolisen toiminnan tuloksena vedestä, nonelectrolyte ja ioninvaihto klo epiteelipinnoilla [12-14]. Häiriöstä ionikanavan ilmaisun tulee epigeneettiseltä epänormaali metastaattisessa syöpäsoluissa [15-17]. Esimerkiksi säätelyä kloridi solunsisäisten kanavan 1 (CLlC1) on mukana paksusuolensyöpä solumigraatioon ja invaasion kautta välittävä sääntelyn määrän pienenemistä (RVD) mekanismi [18]; ja yli-ilmentyminen kloridi kanava3 (ClC3) osallistuu useisiin ihmisen karsinoomien, kuten gliooma, keuhko-, rinta- ja kohdunkaulan kasvaimet [19]. On myös raportoitu, että nousu solunsisäisen kalsiumin aikana tapahtuneet hypotoninen haaste liittyy RVD ja mukana syöpä apoptoosin, mikä viittaa vuorovaikutusta kalsiumtasapainoa ja tilavuuden homeostaasin [20, 21].

Ca

2 + aktivoitujen CI

– kanavaa (CaCCs) ovat merkittäviä säätelijöitä epiteelin eritystä ja solujen tilavuuden säätely [22, 23]. TMEM16A, joka tunnetaan myös nimellä DOG1, ORAOV2 tai TAOS-2, on tunnistettu hengitystie-epiteelin solujen bona fide CACC, joka välittää endogeenisen Ca

2 + aktivoitujen kloridi nykyisen [24-26]. TMEM16A on myös nimitystä anoctamin 1 (ANO1), koska sen anionin selektiivisyyden ja kahdeksan (MMA) transmembraanisen segmentit [25].

ANO1 /TMEM16A

geeni lokalisoitu 11q13, yksi useimmin monistettu alueet ihmisen syövissä [27, 28], ja niihin, joilla on huono ennuste [29]. Se on äskettäin osoitettu, että ANO1 /TMEM16A monistetaan tai yli-ilmentyy useissa ihmisen syövissä, kuten maha-suolikanavan strooman tuumorit (GIST), eturauhasen syöpä, pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC), rintasyöpä ja paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja [27, 30- 33]. ANO1 yli-ilmentyminen on myös korreloitu huonoon ennusteeseen HNSCC ja rintasyöpäpotilaiden [30, 34], ja farmakologinen inhibitio CACC ANO1 aktiivisuuden CaCCinh-A01 ja T16Ainh-A01 voi estää syöpäsolujen proliferaatiota [32, 35, 36]. Vaikka syy korkean ilmentymisen ANO1 kasvaimissa on epäselvä, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ANO1 on mukana onkogeeninen signaloinnin aktivoimalla EGFR ja CaMK väyliä edistää solusyklin ja syövän etenemistä [30, 37]. On raportoitu, että ANO1-vuorovaikutuksessa proteiinien, kuten signalointi /rakennustelineet aktiini-velvoitteilla proteiinien esriinin, radixin, moesiini, ja RhoA voivat osallistua sääntelyn ANO1 toiminto [38, 39]. Viime aikoina, ANO1 ja EGFR löytyy muodostamaan toimivan kompleksin, joka säätelee HNSCC solujen proliferaatiota [40]. Kuitenkin myös ANO1 /TMEM16A on rooli kasvaimen synnyssä keuhkosyöpään on tuntematon.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CACC ANO1 on erittäin yliaktiivista ihmisen keuhkosyövän kudoksia. ANO1 kiihdytyssäätely vahvistettiin eri ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Knockdovvn ANO1 ilmentymisen lyhyt hiusneula-RNA esti solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion keuhko- syöpäsoluja GLC82 ja NCI-H520. Esto ANO1 myös tukahdutti kasvaimen kasvua nude-hiirissä implantoitu vakaa transfektoitujen GLC82 soluja. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy todisteita siitä, että kalvo ANO1 proteiini voi toimia mahdollisena biomarkkerina ja tavoitteeksi diagnosoinnin ja hoidon keuhkosyöpään.

Methods

Soluviljely

Normaali keuhko solulinja 2BS , keuhkosyövän solulinjat A549 ja H1299 olivat lahja tri Hongti Jia laitoksella biokemian ja molekyylibiologian, Peking University Health Science Center. A549 ja H1299-solut alun perin saatu American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). 2BS solut alun perin saatu National Institute of Biological Products (Beijing, Kiina). Keuhkosyöpä solulinjoja GLC82 ja Calu-3 adenokarsinooma ja NCI-H520 okasolusyöpään saatiin American Type Culture Collection (ATCC). 2BS Soluja viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen, Carlsbad, USA), ja muut solulinjat kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen). Väliaine täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Kaikki solut ylläpidettiin alustassa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

shRNA transfektiot ja stabiilien solulinjojen

ANO1 shRNAs ja salattu shRNA plasmidit rakentama GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kiina). ShRNAs kloonattiin BamHI- ja Hindlll-kohtiin pGCsi-U6 /Neo /GFP vecor, ja silmukka sekvenssin TTCAAGAGA käytettiin. Kohdesekvenssi kolmeen ANO1 shRNAs olivat seuraavat: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA; shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT; shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. Salattu sekvenssi oli CGAGTGGTCTAGTTGAGAA. Transfektiota, 8 ug DNA: ta kohti käytettiin 60 mm: n levyä, joissa Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden ja transfektio väliaine korvattiin elatusaineella 4 tunnin transfektion jälkeen. Kaikki myöhemmät kokeet suoritettiin 48-72 h transfektion jälkeen ja toistettiin kolme kertaa. Tuottamaan vakaa GLC82 joka ilmentää ANO1 shRNA, transfektoidut solut valittiin alle 800 ug /ml G418.

immunohistokemiallinen värjäys

Kirurgisesti resektoitiin ihmisen syövän kudosnäytteiden koostuu 44 tapausta keuhkojen adenokarsinooma ja 40 tapauksia okasolusyöpä keuhkosyöpä saatiin jälkikäteen Pekingin yliopiston kolmas sairaala. Kudosnäytteet täysin de-tunnistettava ennen pääsyä meille ja kaikki potilaat ilmoitettiin ja suostumuksensa käyttöön niiden poistetun kudoksen tulevalle tutkimukselle. Kudoksen leikkeitä inkuboitiin 60 ° C: ssa kuivassa kammiossa tunti ennen de-paraffinized ksyleenissä kolme kertaa ja sammutettua luokiteltujen sarjojen läpi etanolia. Käsitelty 3% vetyperoksidia 10 minuuttia, kudokset sitten keitettiin 10 mM sitraattiin antigeeni hakuun (pH 6,0) 20 minuutin ajan käyttäen mikroaaltouunia. Immunohistokemiallista (IHC) värjäys suoritettiin inkuboimalla kudoksia ensisijaisen vasta-aineen ANO1 (1: 100; ab53212, Abcam) 4 ° C: ssa yön yli. Inkuboinnin jälkeen kudokset vuohen anti-kaniini-IgG-HRP: ssa 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, DAB-kromogeenin järjestelmää käytettiin visualisointiin. Pistemäärät lasketaan kertomalla intensiteetti (kokonaisluku välillä 0 ja 3).

Western blot-analyysi

Solut pestiin kolme kertaa jääkylmässä fosfaattipuskuriliuosta ja lyysattiin RIPA-puskurilla ja 1 X pysäyttää fosfataasi ja proteaasi-inhibiittorin cocktailit (Pierce, Rockford, IL). Näytteet kvantifioitiin käyttäen BCA-proteiinin määrityskittiä (Thermo Scientific, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) erotettiin käyttäen PAGE (8%) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Sen jälkeen blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), joka sisälsi 5% maitoa, Blottauskalvoa inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin anti-ANO1 (1: 1000, Abcam) ja kanin anti -β-aktiini (1: 500; Santa Cruz, CA). Kaivoa inkuboitiin anti-kani-IgG-HRP sekundäärisellä vasta-aineella (1: 5000, Santa Cruz) tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja visualisoitiin käyttäen Immobilon Western HRP Substrate.

CCK8 soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen mitattiin Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japani). 500 solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppaisille levyille. 10 ui Cell Counting Kit-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan 24, 48, 72 ja 96 tunnin kuluttua kylvetään. Sitten 96-kuoppaisia ​​levyjä inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa, ennen kuin optinen tiheys (OD) mitattiin 450 nm: ssä mikrolevylukijalla.

Pesäkkeenmuodostusta määritys viljelmän

pesäkkeenmuodostus viljelmässä, transfektoidut solut (käsitelty 800 ug /ml G418: aa ja 2 päivää sen jälkeen, kun 48 tunnin transfektion) maljattiin 200 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia 12-15 päivä. Jäljellä olevat pesäkkeet värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin, ja kuvat otettiin värjäyksen jälkeen.

Soft agar pesäkemuodostusta

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä pehmeällä agarilla tehtiin 6- kuoppalevylle. Pohjakerros on valmistettu sekoittamalla 1,2% agaroosia (Invitrogen) ja vastaavan määrän 2 x väliainetta, jossa 20% FBS: ää. Sitten solut kustakin ryhmästä otettiin talteen ja suspendoitiin väliaineessa, joka sisälsi 0,4% agaroosia ja päällystetty alustan päälle kerros kolmena kappaleena tiheydellä 3000 solua per kuoppa. 30 päivän jälkeen kloonit havaittiin ilmeisesti ja solut jäässä neljä tuntia, ja värjätään 0,02% kristalliviolettia. Kuvat on otettu värjäyksen jälkeen.

Haavan paranemista määrityksessä

mittaamiseksi siirtymisen aktiivisuutta, solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille, kasvatettiin 90% konfluenssiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Sitten solut nälkään muuttamalla väliaineen seerumittomalle RPMI-1640 ja viljeltiin 24 tuntia. Solut kaavittiin 100 pl muovi pipetinkärjet ja pestään fosfaattipuskuriliuoksella. Kuvat kerättiin 24 tunnin välein, jonka käänteisen vaihekontrastimikroskoopilla (Olympus, suurennus: 10 x). Suhde jäljellä haavan alueella laskettiin suhteessa alkuperäiseen haava-alueen ja normalisoitiin salattu shRNA ryhmä tai DMSO ryhmä.

Transwell määrityksessä

Cell invaasio aktiivisuus arvioitiin 8,0 um huokoskoko transwell 24-insert levyn kammioihin (Corning, Acton, MA, USA) päällystetty BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Sen jälkeen kun esi-ravinnotta 24 tunnin ajan viljelemällä seerumivapaassa väliaineessa, 3X10

4 (NCI-H520), tai 5×10

4 (GLC82) solua per kuoppa maljattiin yläkammiot seerumittomalla väliaineella ja inkuboitiin 48 (NCI-H520) tai 72 (GLC82) tuntia. Alakammioissa täytettiin 10% naudan sikiön seerumia väliaineessa. Jälkeen pyyhkimällä solut pois yläpuolelta ylemmän kammion, alemman puoleinen kammio kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI; Sigma). Kuvat valokuvattiin mikroskoopilla. DAPI värjäytyminen alue alemmassa kammiossa normalisoitiin salattu shRNA ryhmään tai DMSO ryhmä, joka osoittaa sen suhteellinen invasiivisuus.

In vivo

ksenograftin kasvaimen kasvua

Ostettu osastolta of Laboratory Animal Science Pekingin yliopiston Health Science Center, 5 viikkoa vanhoja Balb /c nu /nu-hiiriä karanteenissa 1 viikko ennen niiden käyttöä tutkimuksessa. Eläimet (8 eläintä häkkiä kohti) pidettiin microisolat vapaa pääsy normaalia jyrsijöiden ruokaa ja vettä lämpötilavalvotuissa olosuhteissa (23 ± 2 ° C) 70%: n kosteudessa. [33] Eläimet ylläpidettiin käänteistä 12 h /12 h valo /pimeä sykli (valot päälle klo 07:00). Eläin koemenettelyn oli hyväksynyt eläinten käytön ja hoidon komitean Pekingin yliopiston ja olivat yhdenmukaisia ​​eettiset ohjeet. GLC82 vakaa soluja (1 x 10

7 solua per hiiri) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). GLC82 solut transfektoitiin salattu shRNA, ANO1 shRNA1 ja ANO1 shRNA2, vastaavasti, ja valitaan G418 kaksi viikkoa ennen käyttöä. GLC82 solut ympättiin hypodermisesti oikeaan forelimbs nude-hiirissä, ja kussakin ryhmässä kahdeksan eläintä käytettiin. 7. päivänä injektion jälkeen, kasvaimen kokoa mitattiin välein 2-4 päivää ajaksi 2 viikkoa ja laskea (L x W

2) /2 (L ja W edustaa pisin pitkittäiset ja poikittaiset halkaisija, vastaavasti ). Päätepisteen Kokeiden oli 19. päivänä injektion GLC82 solujen varmistaa, että syöpäkasvain ei merkittävästi häiritse normaalia kehon toimintoja hiirten tai aiheuttaa kipua. Hiiret lopetettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti pentobarbitaalia (120 mg /kg) yhdistettynä 0,25% lidokaiinia ennen tuumorit poistettiin. Edustavia kuvia saatiin ennen kasvaimet punnittiin elektronisella tasapaino.

Tilastollinen

GraphPad Prism 5 käytettiin tietojen analysointiin. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. Opiskelijan

t

-testiä käytettiin data-analyysi solun kokeissa kahden ryhmän välillä. ANOVA-levitettiin analysoida proteiinin tasot ANO1 useissa solulinjoissa, ja verrata ero kasvaimen kasvua. Analysoitaessa ihmisen patologisen kudoksen kokoelmia, Chi-neliö testi suoritettiin. Arvo

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

yli-ilmentyminen ANO1 ihmisen keuhkojen adenokarsinooman kudoksia

Tutkia ilmentymistaso kalsiumin aktivoimien kloridikanava ANO1 proteiineja, käytimme ANO1 vasta-immunohistokemiallista värjäystä ja havaitaan ANO1 ilmentyminen keuhkoissa patologisissa kudosnäytteiden 84 potilaalla. Kuten on esitetty kuviossa 1, ANO1 proteiini ilmentyy suuresti keuhkon adenokarsinooma-, kun taas kudoksissa hyvänlaatuisesta keuhkorakkuloihin vieressä syöpä ja okasolusyöpä oli negatiivinen värjäys ANO1. Analyysi immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että ANO1 proteiinin ekspressio oli positiivinen 34 44 (77,3%) ihmisen keuhkojen adenokarsinooma kudosnäytteistä (taulukko 1). In kudosnäytteiden okasolusyöpä keuhkosyöpä, 6 40 (15%) värjättiin ANO1 positiivinen. Nämä tulokset osoittavat, että ANO1 proteiinin yli-ilmentyy tuumorigeneesiin ihmisen keuhkosyövän ja erityisesti keuhkojen adenokarsinooma.

(A) hyvänlaatuinen keuhkorakkuloihin vieressä karsinooma, joka esittää negatiivista ANO1 värjäytymistä. (B) Okasolusyöpä keuhkosyöpä osoittaa negatiivista ANO1 värjäystä. (C) Ihmisen keuhkoadenokarsinooma syöpäkudoksessa osoittaa ANO1 värjäytymistä (ruskea väri) neoplastisten epiteelin. Mittakaavapalkki osoittaa 50 pm.

lisääntymisen merkkejä ANO1 ilmentymistä ihmisen keuhkosyövän solulinjat

Käyttämällä Immunohistokemian alkuperäistä havainto osoitti, että ANO1 yliekspressoitui ihmisen keuhkosyövän kudoksissa etenkin adenokarsinooma. Vahvista immunohistokemiallinen havainnon ja määrittää, onko ANO1 on myös ylösajettu eri patologisten keuhkosyöpään solulinjat, valitsimme ja testattiin 6 eri solulinjoja, jotka sisältävät 2BS solujen normaalia ihmisen keuhkojen solulinja, GLC82 ja Calu-3-solujen adenokarsinooma , NCI-H520-soluissa okasolusyöpään, ja A549 ja H1299 solujen vahvistamattomien keuhkosyövän (kuvio 2). Proteiinit uutetaan 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 tai H1299-solut erotettiin geelielektroforeesilla denaturoivissa olosuhteissa ja tutkittiin ANO1 spesifistä vasta-ainetta. Kuten esitetään alemmassa paneelissa kuvion 2, kvantitatiivinen analyysi ANO1 ekspressiotaso osoitti korkeus noin 2,8-kertaisesti NCI-H520, 6,9-kertaisesti GLC82, 6,3-kertaisesti Calu-3, 3,1-kertaiseksi A549 ja 8,0 kertainen in H1299 verrattuna normaalin keuhkokudoksen 2BS soluissa. Kasvu GLC82, Calu-3 ja H1299-solut oli tilastollisesti merkitsevä, mutta ei NCI-H520 ja A549-solut (P = 0,149 ja P = 0,238, vastaavasti), vaikka oli suuntaus kasvu ANO1 ilmaisua. Tämä tulos on sopusoinnussa immunohistokemiallinen analyysi keuhkosyövän kudosten saatiin potilailta (taulukko 1), mikä vahvistaa, että ANO1 ilmentyminen on suurempi keuhkoadenokarsinooma GLC 82 soluja kuin squamous carcinoma HCl:-H520-soluissa. GLC82 ja NCI-H520-soluja, jotka oli erilaiset ekspressiotasot ANO1 proteiinien valittiin lisätutkimuksiin.

Ylälevy: tyypillinen Western blot kuvat ANO1 sen erilaisissa keuhko- solulinjoissa. Pohjalevy: tilastollinen analyysi pylväsdiagrammi (n = 3) ja ANO1 suhteelliset tasot NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 ja H1299 solulinjoissa (verrattuna normaaliin 2BS solut). Ilmentyminen ANO1 normalisoitiin ilmentymisen taso β-Actin. ANO1 merkittävästi yli-ilmennetään GLC82, Calu-3 ja H1299 solulinjoissa. Tilastollinen merkitys ANOVA annetaan *

p

0,05; **

p

0,01 ja ***

p

0,001. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± sem

esto GLC82 ja NCI-H520-solujen lisääntymisen hiljentämällä ANO1

arvioimiseksi biologisen roolin ANO1 keuhkosyövän solujen lisääntymisen, käytimme shRNAs että pudotus ilmaisun ANO1 erilaisissa solulinjoissa. Tehokkuutta kolme shRNAs arvioitiin Western blot GLC82 ja NCI-H520 keuhkosyövän soluja. Verrattuna transfektion salatun shRNA, ANO1 shRNA1 transfektio oli tehokkain vaientaa endogeenisen ilmentymisen ANO1 proteiinien sekä GLC82 ja NCI-H520-soluissa (kuvio 3A), ja näin ollen sitä on käytetty, loput kokeet.

(A) RNAi knockdovvn ANO1 proteiinin ilmentymisen ANO1 ilmentävien solujen osoitettiin Western blot kuvia. Kalvon proteiinit uutetaan GLC82 ja NCI-H520-soluissa 3. päivänä transfektion jälkeen eri ANO1 shRNAs (shRNA1, shRNA2 ja shRNA3) immunoblotattiin ANO1 vasta-aineella. ANO1 shRNA1 osoitti tehokkainta estoa ANO1 ilmentymisen, verrattuna kahteen muuhun shRNAs ja salattu shRNA. (B) GLC82 tai NCI-H520 soluproliferaatiota arvioitiin CCK8 perustuva määritys solunulkoiseen supistuvat WST8 NADH tuotetaan mitokondrioissa. Mikrolevynlukijaa käyttäen, solujen määrä kvantifioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä. Transfektio ANO1 shRNA1 johtanut merkittävään inhibitioon GLC82 ja NCI-H529 solujen elinkykyä in time-riippuvaisella tavalla verrattuna käsiteltyjen solujen salattu shRNA (n = 6). (C) Cell proliferaatiota karsinoomasoluja arvioitiin pesäkkeen muodostumista määrityksessä viljelmässä, kun läsnä on ANO1 shRNA1. Kvantitatiivinen analyysi ANO1 hiljentäminen ryhmä osoitti vähemmän pesäkkeitä genesis verrattuna salattu shRNA ryhmä (n = 3). Edustavia kuvat osoittivat alla pylväsdiagrammein. (D) RNAi on ANO1 estää kyky muodostaa klooneja GLC82 solujen pehmeässä agarissa (n = 3). NCI-H520 ei muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Tilastollinen merkitys Studentin

t

-testi on merkitty *

p

0,05; **

p

0,01 ja ***

p

0,001. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m.

määrittämiseksi elinkelpoisuuden ja leviämisen, me suorittaa solujen lisääntymisen CCK8 määrityksessä käytetään GLC82 ja NCI-H520-soluissa. Kuten kuviossa 3B, hiljentäminen ANO1 merkittävästi hidastanut kasvua keuhkoadenokarsinooma GCL82 ja keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä NCI-H520-soluissa. Leviämisen GLC82 solujen estyi ajasta riippuva tavalla 89,1% päivänä 2, 81,6% päivänä 3-75,0% päivänä 4. leviämisen NCI-H520-soluissa oli myös estetty 89,0% päivänä 2, 75,3% päivänä 3-71,7% päivänä 4. edelleen nämä tulokset vahvistava, käytimme kaksi määrityksissä pesäkemuodostuksen sekä viljelymaljalle ja pehmeä agar. Kuten on esitetty kuviossa 3C, hiljentäminen ANO1 pienensi 36,2% pesäkkeenmuodostusta GLC82 soluja ja 30,7% pesäkkeenmuodostusta NCI-H520-soluissa, verrattuna salattu shRNA valvontaa. Edelleen vahvistaa vaikutuksen hiljentäminen ANO1 proliferaatioon, käytimme pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, joka valvoo kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun. GLC82 solut voisivat muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa kolmenkymmenen päivän mutta NCI-H520-solut eivät muodosta pesäkkeitä. Kuten on esitetty kuviossa 3D, leviämisen GLC82 käsiteltyjen solujen ANO1 shRNA oli esti merkittävästi verrattuna salattu shRNA ryhmä. Nämä tulokset osoittavat, että hiljentäminen endogeeninen ANO1 voi estää leviämisen GLC82 ja NCI-H520 keuhko- syöpäsoluja.

vähentäminen GLC82 ja NCI-H520 solumigraation ja hyökkäystä hiljentäminen ANO1

Tutkiakseen siirtymisen keuhkosyövän soluista, käytimme arpeutumisprosessit määritys, joka arvioi haavan sulkeutumisen. Kaksi päivää transfektion jälkeen, solut istutettiin kuuden kuoppalevyllä, kunnes 90% konfluentteja ennen ravinnotta 24 tunnin ajan. Solu kerros varovasti haavoittunut steriili vihjeitä, inkuboitiin seerumivapaassa. Kuten on esitetty kuviossa 4A ja 4B, transfektoimalla GLC82 keuhkosyöpä solut ANO1 shRNA inhiboi haavan täyte noin 66,8% 24 h 67,5% 48 h ja 74,3% 72 h, verrattuna salattu shRNA. NCI-H520 keuhkosyövän soluja (kuvio 4C ja 4D), haavan paranemista in ANO1 pudotus ryhmässä oli vain noin 29,1%: iin 24 h ja 27,6% 48 h verrattuna salattu shRNA kontrolliryhmään. Tällä 48 h, haavan paranemista oli lähes täydellinen salattu shRNA kontrolliryhmään. Nämä tulokset osoittavat, että endogeeninen ANO1 edistää kasvaimen solujen vaeltaminen, ja hiljentäminen ANO1 estää migraation keuhkosyövän soluja.

muutto GLC82 ja NCI-H520-soluissa, jotka on transfektoitu ANO1 shRNA1 tai salattu shRNA arvioitiin haavan paranemista määritys . Kaksi päivää transfektion jälkeen, solut istutettiin kuuden kuoppalevyllä, kunnes 90% konfluentteja ja sitten nälässä 24 tuntia. Solu kerros varovasti haavoittunut steriili vihjeitä, ja inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa. (A) Helotaustanäkymä kuvat haavan ajankohtina 0 h, 24 h, 48 h ja 72 h (GLC82) on esitetty pieni suurennus. (B) kvantifiointi muutokseen haavan paranemista GLC82 solujen näkyy viivakaavio ja normalisoidaan salattu shRNA ryhmään. (C) Kuvat NCI-H520 haavan paranemista kokeilu 0 h, 24 h ja 48 h esiteltiin. (D) Viivadiagrammi NCI-H520-soluissa osoittaa, solujen vaeltaminen, joka inhiboitui ANO1 shRNA1 pudotus (n = 3). Tilastollinen merkitys (Opiskelijan

t

-testi) on merkitty *

p

0,05; **

p

0,01 ja ***

p

0,001. Kaikki tiedot näytetään keskimääräisenä ± s.e.m.

uhkaavimpien piirre pahanlaatuisuuden keuhkosyöpä on mahdollisuus hyökkäyksen ja etäpesäkkeitä. Edelleen tutkia hiljentäminen ANO1 vaikuttaa myös solujen invaasiota, käytimme Transvvell- määrityksessä. Kaksi päivää transfektion jälkeen ANO1 shRNA1 tai salattu shRNA, GLC82 ja NCI-H520-soluja ilman ravintoa 24 tuntia, ennen kuin inkuboitiin vielä ylemmässä kammiossa. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin NCI-H520-soluja tai 72 tunnin inkubaation GLC82 soluja, valtaavat alempaan kammioon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin DAPI. Kuten kuviossa 5, hyökkäyksen mahdollisuudet kasvainsolujen dramaattisesti tukahdutti ANO1 pudotus. Alalla ANO1 vaiennettu GLC82 solut, jotka kävivät läpi ylemmän kammion oli vain 4,0% sekoitetun shRNA ryhmä (kuvio 5A ja 5B). Kuten kuviossa 5C ja 5D, suhteellinen transwell alueen ANO1 pudotus NCI-H520-soluissa oli 12,2%, verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu salattu shRNA. Nämä tulokset osoittavat, että hiljentäminen ANO1 estää migraation ja invaasion keuhkosyöpään GLC82 ja NCI-H520-soluissa.

GLC82 ja NCI-H520-soluja ilman ravintoa 24 tuntia ennen inkuboitiin ylemmässä kammiossa matrigeelin transwell suodattimia. 48 tunnin jälkeen (NCI-H520) tai 72 tuntia (GLC82), solut valtaavat alempaan kammioon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin DAPI. (A) Kuvat edustavat mikroskooppikentäs- hyökkääviä GLC82 soluja. (B) toinen invasiivisuus ilmentävien solujen ANO1 shRNA 1 tai salattu shRNA kvantitoitiin värjätään alueen tunkeutuvat GLC82 soluja. Invaasio alue normalisoidaan salattu shRNA ryhmään. (C) edustaja kuvia NCI-H520-soluissa tunkeutuneet kautta Matrigeliä transwell suodattimia. (D) Bar chat NCI-H520-soluissa osoittaa lasku solun hyökkäystä ANO1 shRNA1 taintumisen (n = 3). Tilastollinen merkitys Studentin

t

-testi on merkitty *

p

0,05; **

p

0,01 ja ***

p

0,001. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± sem

vastustamisesta ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä ANO1 Knockdown

vaikutuksen tutkimiseksi ANO1 knockdown kasvuun ksenograftin kasvaimen

in vivo

, kolme ryhmää GLC82 solut yksitellen transfektoitu ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 ja salattu shRNAs, ja niiden knockdown tehokkuus varmistettiin western blot ennen injektiota varten muodostumista -tuumoriksenografti hiirillä (kuvio 6A). Olemme injektoitiin 10

7 GLC82 solua per hiiri oikealle forelimbs 5 viikon ikäisille nude-hiirissä neljä ryhmien muodostumisen -tuumoriksenografti. Kasvaimien koko mitattiin ensin 7 päivää injektion jälkeen (kuten päivä 0). Kuten kuviossa 6B ja 6C, ANO1 hiljentäminen johti merkittävään vähentämiseen kasvaimen kasvua 68,8% vuonna shRNA1 ryhmässä ja 42,1% vuonna shRNA2 ryhmässä, vastaavasti, verrattuna salattu ryhmän tarkkailuun päivä 12. Päivänä 12, kasvaimet poistettiin hiiristä ja painotetaan. Merkittävä väheneminen kasvaimen painoa ANO1 shRNA ryhmissä havaittiin (kuvio 6D ja 6E). Kuten kontrolliin verrattuna salattu shRNA, kasvaimen keskimääräinen paino ANO1 shRNA1 ja shRNA2 ryhmät oli noin 38,7% ja 70,1%, vastaavasti (kuvio 6D ja 6E). Lisäksi immunohistokemiallisella värjäyksellä ANO1 vierassiirrekokeissa kasvaimen vahvisti, että vähentäminen ANO1 proteiinin ekspressiotasoja oli yhdenmukainen tuumorin tilavuuden ryhmissä käsiteltiin ANO1 shRNAs eri teho ja kontrolliryhmän (kuvio 6F ja 6G). Nämä tulokset osoittavat, että ANO1 hiljentäminen ei ainoastaan ​​estää migraation ja invaasion keuhkosyövän soluja, mutta myös merkittävästi estää kasvaimen kasvua.

Normaali GLC82 soluja tai pysyvän GLC82 solut, jotka ilmentävät ANO1 shRNA 1, ANO1 shRNA 2 ja salattu shRNA inokuloitiin hypodermisesti oikeaan forelimbs 5-viikkoisen naaras-nude-hiiriin (1×107 solua per hiiri). (A) Western-analyysi Knockdown tehokkuutta villityypin GLC82 solut ja GLC82 solujen vakaa ilmentävät salattu shRNA, ANO1 shRNA 1 ja ANO1 shRNA 2 (B) edustaja kuva nude-hiirten kuljettaa GLC82 istutettu kasvaimia neljään ryhmään: tyhjä ryhmä (n = 7), salattu shRNA ryhmä (n = 8), ANO1 shRNA1 ryhmä (n = 8) ja ANO1 shRNA2 ryhmä (n = 8). (C) Kasvaimen koko mitattiin välein 2-4 päivää, jonka mikrometrillä aikana kehitystä, koska seitsemäs päivä injektion jälkeen. Kasvainten kasvua ilmentävien ANO1 shRNA1 ja ANO1 shRNA2 estyi merkittävästi ajasta riippuvalla tavalla, kun salattu shRNA ryhmä. (D) edustaja kuva kasvainten poimittu hiiristä 12. päivänä sukupolvi. (E) Kasvaimet punnittiin ja analysoitiin kirurgisen poiston jälkeen. Vertaamalla salattu shRNA kasvaimia, ANO1 shRNAs kasvaimet olivat kevyempiä. Tilastollinen merkitys (ANOVA) merkitään *

p

0,05; **

p

0,01 ja ***

p

0,001. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. (F) edustaja kuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä ANO1 ilmaisun vierassiirrekokeissa tuumorikudoksissa. (G) analyysi ANO1 ilmaisun vierassiirrekokeissa tuumorikudoksissa tehtiin pisteyttämällä 0-3 voimakkuuden mukaan ja alue värjäystä.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, Ca

2 + aktivoitujen CI

– kanava (CACC) ANO1 tai TMEM16A, alunperin tunnistettu hengitysteiden epiteelisolujen, on mukana etenemistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, joka on tyypillinen epiteelin keuhkojen syöpä.

tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ANO1 on erittäin yli-ilmentynyt useissa keuhkosyövän solulinjat ja ihmisen adenokarsinooman kudosnäytteistä. Hiljentäminen ANO1 tukahduttaa solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio, ja kasvu istutettu kasvaimia.