Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

virtsarakon syöpä on usein seurausta altistumisesta kemiallisille syöpää aiheuttaville aineille, kuten tupakointi . Koska histologiset samankaltaisuuden, kemikaalien aiheuttamien jyrsijä syövän mallia laajalti käytetty ihmisen virtsarakon syövän tutkimuksiin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että nikotiiniamidi, vesiliukoinen vitamiini B3, voi olla avainasemassa syövän ehkäisyyn kautta toimintaansa solujen korjaus. Tähän mennessä todisteita kohti tunnistaa geneettisiä muutoksia nikotiiniamidin syövän ehkäisyyn ei ole säädetty. Täällä me etsiä molekyylitason allekirjoitusten syövän ennaltaehkäisyä nikotiiniamidi käyttäen N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) -nitrosamine (BBN) aiheuttaman virtsarakon syöpä hiirissä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Via mikrosirujen geeniekspressioprofilointi 20 hiirtä ja 233 ihmisen virtsarakkonäytteet, suoritimme erilaisia ​​tilastollisia analyysejä ja immunohistokemiallisella värjäyksellä vahvistettavaksi. Ilmaisu kuviot 893 liittyvien geenien nikotiiniamidi aktiivisuutta syövän ehkäisyyn tunnistettiin microarray data-analyysi. Gene verkosto analysoi näistä 893 geenien paljasti, että

Myc

ja siihen liittyvät geenit voivat olla tärkein säätelijä virtsarakon syövän ehkäisyyn, ja geenin ilmentyminen allekirjoitus korreloivat hyvin proteiinin ilmentymisen tietoja. Vertailu geenin ilmentymisen ihmisen ja hiiren välillä paljasti, että BBN-indusoidun hiiren virtsarakon syöpien esillä geeniekspressioprofiilit, jotka olivat samanlaisia ​​kuin invasiivisen ihmisen virtsarakon syöpien kuin kuin ei-invasiivisen ihmisen virtsarakon syöpien.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus osoittaa, että nikotiiniamidi tärkeä rooli chemo-ennaltaehkäiseviä ja terapeuttisen aineen virtsarakon syöpä sääntelyn

Myc

onkogeenisia allekirjoitus. Nikotiiniamidi voi edustaa lupaava hoitomuoto potilaille, joilla on lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä.

Citation: Kim SK, Yun SJ, Kim J, Lee OJ, Bae SC, Kim WJ (2011) tunnistaminen Gene Expression Allekirjoitus Moduloitu jonka Nicotinamide on hiiri virtsarakon syövän Model. PLoS ONE 6 (10): e26131. doi: 10,1371 /journal.pone.0026131

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 20 syyskuu 2011; Julkaistu: 10 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (2011-0001042 ja R16-2003-002-01001-02006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Monet virtsarakon syöpiä voidaan liittää kemiallisen karsinogeeneja, ja Länsi-populaatioiden noin kolmasosa puolet virtsarakon syöpien liittyvät tupakoinnin [1], [2]. Vaikka aiheuttava aine tupakansavun ei ole vielä tunnistettu, α- ja β-naftyyliamiini epäillään aineita. Kuten otaksuttu karsinogeeneja virtsarakon syövän, aromaattiset amiinit, kuten β-naftyyliamiini, 4-aminobifenyylin, bentsidiinin, ja 2-amino-1-naftoli osuus voi olla jopa 20 30% virtsarakon syövän tapauksissa [3], [4]. On olemassa kaksi ensisijaista kemiallisesti indusoidun malleja virtsarakon syövän jyrsijöillä, jotka on indusoitu antamalla N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) -nitrosamine (BBN) joko hiirillä tai rotilla [5], [6]. Tuloksena kasvaimet ovat histologisesti samanlaisia ​​kuin ihmisten sairauksien, ja ne ilmenevät kahdella eri karsinogeeninen reittejä; nimittäin, ei-lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) rotilla ja lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) hiirissä [7], [8]. Koska ihmisen virtsarakon syöpä on usein seurausta altistumisesta kemiallisille syöpää nämä jyrsijöiden ovat hyödyllisiä ymmärtämään ihmisen virtsarakon syövän. Williams et al havainnollistettu yleistä geeniekspressioprofiilit jyrsijöiden kasvaimia ja toimittanut luettelon geenejä, jotka ovat mahdollisia ehdokkaita ajo virtsarakon syövän kehittymisen ja etenemisen. [9]

Nikotiinihappo on vesiliukoinen vitamiini, joka kuuluu B-vitamiinia perhe. Se on monissa eläinten ja kasvien kudoksia, ja on hyperlipidemian vastaiset aktiivisuutta. Kehossa nikotiinihappo muuntuu aktiiviseen muotoon nikotiiniamidi, joka on osa coenzymes nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD) ja sen fosfaattimuotojen, NADP. Nämä coenzymes tärkeä rooli kudosten hengitystä ja glykogeenin, lipidejä, aminohappoa, proteiinia, ja puriinimetabolia. Nykyinen tutkimus osoittaa, että nikotiiniamidi, tai B3-vitamiini, voivat olla avainasemassa syövän ehkäisyyn kautta toimintaansa solujen korjaus. Johtavat tutkijat opiskelu nikotiiniamidi ravitsemus uskovat vitamiini lupaava hoitoon ja jopa estää syöpää. Myron et al osoittivat, että solut köyhdytetty nikotiiniamidi kehittyä syöpä kymmenen kertaa nopeammin kuin vastaanottava riittäviä määriä vitamiinin [10]. Ruokavalio on tärkeä tekijä esiintyvyys virtsarakon syövän, jossa sekä hyödyllistä haitallisten komponenttien ja nikotiiniamidi on yksi hyödyllisiä komponentteja. Vaikka optimaalisen annoksen nikotiiniamidia edelleen määrittelemätön, nikotiiniamidi on myös lupaava kemoterapian lisänä, koska sen suhde tuumorinekroosi (tappaminen) tekijä, suhteellisen uusi tekijä, joka valikoivasti tappaa syöpäsoluja [11], [12], [13] . Nykyisessä tutkimuksessa olemme pyrkineet geneettisen allekirjoitukset nikotiiniamidi syövän ehkäisyyn käyttäen BBN aiheuttama hiiren virtsarakon syöpä malli, ja tutki mahdolliset tehoa nikotiiniamidi hoidon virtsarakon syöpäpotilailla.

Materiaalit ja menetelmät

hiiri kudosnäytteitä

Eläinkokeissa tehtiin suuntaviivojen mukaisesti, että institutionaalisten Animal Care komitean Chungbuk National University (hyväksyntänumeroineen: CBNUA-030-0901-02). Nainen C3H /He-hiiret hankittiin Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japani) 6 viikon iässä ja sijoitettiin häkkeihin (viisi häkkiä kohden). Eläimiä pidettiin valaistu huoneessa 12 tuntia joka päivä, pidettiin 23 ± 2 ° C ja 55% ± 5%: n kosteudessa. BBN saatiin Tokyo Kasei Kogyo Co. (Tokio, Japani), ja nikotiiniamidi ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BBN laimennettiin vesijohtovedellä siten, että lopullinen pitoisuus on 0,05%. Analyysiä ennaltaehkäisevän vaikutusten nikotiiniamidi, juomavettä täydennettiin 0,1%, 0,25%, 0,5% tai 1% nikotiiniamidi tai ilman 0,05% BBN: 20 viikon ajan. Kaikki hiiret saivat ensimmäisen hoidon 7 viikon iässä, ja tapettiin 20 viikkoa ensimmäisen käsittelyn jälkeen. Ruumiinavauksessa virtsarakot hiirten olivat liian normaalilla suolaliuoksella ja sitten poistettiin, ja alle korkean intensiteetin valon tutkittiin vakavat vauriot. Tarkastuksen jälkeen kaikki rakot jäädytettiin histopatologinen tutkimus ja myöhemmät molekyylitason määrityksiä. Osa kussakin kudoksessa vahvistettiin ja käsitellään rutiini parafiiniupotusta, leikattiin 5 um kohdat, ja asennettu hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys histopatologian. Rakkokasvaimista luokiteltiin NMIBC ja MIBC perustuu laajuudesta hyökkäyksen lihakseen.

RNA, microarray kokeiluja, ja tietojenkäsittely

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Life Technologies, NY), mukaisesti valmistajan protokollaa. Laatu ja luotettavuus RNA varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja etidiumbromidivärjäyksellä, jonka jälkeen silmämääräinen tarkastus ultraviolettivalossa. Viisisataa nanogrammaa kokonais- RNA: ta käytettiin merkintää ja hybridisaatio, mukaan valmistajan protokollia (Illumina Mouse-6 BeadChips, versio 1.0). Arrays skannattiin kanssa Illumina Helmi Array Reader confocal skanneri (BeadStation 500GXDW; Illumina, Inc., San Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Skannauksen jälkeen microarray data suodatettu tunnistus

P

-arvo (

P

0,05), joka tarjosi Genome Studio

TM ohjelmisto (Illumina, Inc., San Diego , CA) ja normalisoitiin käyttämällä quantile normalisointi R kieliympäristössä (versio 2.10.0, saatavilla osoitteessa https://www.r-project.org/). Mitatut geenien ilmentyminen arvot log2 muunnetaan ja mediaani-keskitetty poikki geenien ja näytteitä. Täydellinen microarray datasarja on saatavilla National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) julkisessa tietokannassa alle datasarjan hakunumero GSE21636. Kaikki microarray data on vähimmäismäärä tietoa Microarray Experiment (MIAME) -yhteensopiva.

Ihmisen virtsarakon syöpä mikrosiruja

vertaileva analyysi hiiren ja ihmisen syövän, käytimme aiemmin julkaistu tietokokonaisuus ihmisen virtsarakon syöpä mikrosirut (korea kohortti), GSE13507, NCBI GEO julkista tietokantaa [14]. Aineisto joukko koostui 165 ensisijainen virtsarakon syöpä näytettä (103 NMIBCs ja 62 MIBCs), 58 näytettä histologisesti normaalin näköinen ympäröiviin kudoksiin, ja 10 normaali virtsarakon limakalvon välillä, joilla on hyvänlaatuinen sairauksia. Nämä geenien ilmentyminen tietoja muodostettiin Illumina HumanWG-6 BeadChips (versio 2). Lisätietoja validointi, myös käytetty toisen ihmisen virtsarakon syöpä aineisto (Spanish kohortti, Affymetrix U133A GeneChip), joka koostui 24 NMIBCs, 66 MIBCs, ja 38 normaali virtsarakon limakalvon [15].

Reaaliaikainen käänteiskopioijaentsyymi polymeraasia ketjureaktio (RT-PCR) analyysi

RT-PCR suoritettiin käyttäen Rotor Gene 6000 PCR -järjestelmää (Corbett Research, Mortlakessa, Australia). RT-PCR-reaktioissa mikro-reaktioputkille (Corbett Research) sisälsi alukkeita ja SYBR Premix EX Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japani). Spektritiedot otettiin kiinni ja analysoitiin Roottorin Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research). Geenien ilmentyminen normalisoitiin

GAPDH

ilmentymistä.

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet hiiren normaalin ja kasvaimen rakot. Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta anti-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) ja anti-Pmp22 (Abcam, UK). Automaattiseen värjäys, Benchmark XT Autostaineriin (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) käytettiin. Värjäyksen jälkeen arvioimme sekä värjäyksen intensiteetti ja osuus värjättyä epiteelisolujen. Värjäytymisintensiteettiä luokiteltiin seuraavasti: 1, heikko; 2, kohtalainen; ja 3, vahva. Osuus positiivisten solujen ilmaistaan ​​prosentteina kokonaismäärästä epiteelisolujen tutkittiin, ja merkitään yhteen viidestä luokkaan: 0, 5%; 1, 5-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; ja 4, 75%. Pistemäärät positiivisten solujen prosenttiosuuden ja värjäytymisen intensiteetti oli kerrottu yhdessä tuottavat immunoreaktiivisuus pisteet (IS) kunkin näytteen. IS Myc ja Pmp22 mitattiin tumassa ja sytoplasmassa, vastaavasti. Kukin näyte tutkittiin ja arvostellaan erikseen kolmella tutkijat, ja poikkeava tulokset keskusteltiin kunnes päästiin.

Western blot-analyysi

Huuhtelun jälkeen tislattuun veteen, näytteet lasiputki, joka sisältää 1 ml soluhajotuspuskurin homogenisoitiin mekaanisesti kudoshomogenisaattorilla. Homogenaatti siirrettiin 1,5 ml: n putkeen ja sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ylempi vesipitoinen faasi heitettiin pois, ja sekoitettiin 2UL ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 200 ui proteiini analyysin puskuria. Kun oli inkuboitu 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, näytteet sentrifugoitiin 14000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ylempi vesipitoinen faasi siirrettiin uuteen putkeen ja säilytetään -80 ° C: ssa käyttöön asti. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Jokainen näyte (70 ug) ladattiin 10% (paino per tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia geelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridia kalvo (GE Healthcare, San Antonio, TX). Western blotit analysoitiin vasta-aineita Pmp22 (Abcam, Cambridge, UK) ja Myc (elinikä BioSciences, Seattle, WA).

Tilastollinen

Jos haluat vertailla molekyylitason ominaisuudet eri hiiren ryhmien suoritimme hierarkkisen klusterointi analyysi. Hierarkkinen klusterointialgoritmi käyttäen keskitetty korrelaatiokertoimen mittana samankaltaisuuden ja keskimääräinen sidos klusterointi, sovellettiin kuvatulla Eisen et al [16]. Olemme tunnistettu geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kahden ryhmän välillä käyttäen random-varianssi kahden otoksen t-testiä [17]. Geenit katsottiin olevan tilastollisesti merkittäviä eroja ilmaisun jos P-arvo oli alle 0,001. Olemme myös suorittaa globaali testi, onko ilmaisun profiilit erosivat luokkien välillä suorittamalla permutaatiot. Kunkin permutaatio,

P

-arvot olivat uudelleen laskea ja määrä geenejä merkitsevä 0,001 tasolla todettiin. Osuus permutaatioista jotka johtivat vähintään yhtä monia merkittäviä geenejä kuin varsinainen data otettiin merkitsevyystaso globaalin testin. Samalla kun saadaan eri tavalla ilmaisua geenejä, valitsimme geenit, jotka oli 1,2-kertainen tai enemmän erotus tarkoittaa ilmaus arvojen kaksi ryhmää.

tutkia suhteita tuumorigeenisen geenien vastanneista nikotiiniamidi, tutkimme toiminnallinen yhdistysten kesken geeneissä ja syntyy geeni verkkojen mukaan, onko heillä oli enemmän toisiinsa geenejä kuin odottaisi tapahtuvan sattumalta. Merkitys kunkin verkon arvioitiin käyttäen pisteytysjärjestelmää antamat Ingenuity Pathway Analysis Tool (versio 7.5). Tulokset määritettiin useissa differentiaalisesti ilmentyvien geenien kussakin verkkojen ja vahvuus yhdistysten kesken verkon jäsenille.

Keinona verrataan geeniekspressiomalleja ihmisen ja hiiren välillä näytteiden microarray data hiiren mallien yhdistettiin tiedoilla joukko ihmisen virtsarakon syöpään HomoloGene (NCBI), järjestelmä havaitsemiseen homologien geenien useita eukaryoottisissa genomien [18]. Ennen integrointi kaksi tiedostoa, ekspressiotasot kunkin geenin kukin tietokokonaisuus standardoitu itsenäisesti keskimääräistä nolla ja keskihajonta 1. ennustaa hiirimalleihin ihmisen kudoksia, haimme neljä erilaista ennustemallit: yhdiste kovariaattina ennustaja [19], lineaarinen syrjivä analyysi [20], lähin centroid luokittelu [20], ja tukivektorikoneet [21]. Malleja sisällytetty geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kahden luokan käyttämällä kahden otoksen t-testiä. Geenit, katsottiin olevan tilastollisesti merkitseviä eroja ilmentymisessä jos

P

-arvo oli vähemmän kuin 0,001. Olemme arvioineet ennustevirhe kunkin mallin avulla leave-one-out ristivalidointi (LOOCV), kuten on kuvattu Simon et al [22]. Kunkin LOOCV training set koko mallirakennus menettely toistettiin, kuten geeni valintaprosessia. Cross-lajit ennustus menettely suoritettiin BRB ArrayTools (versio 3.8.0).

Tulokset

tehoa nikotiiniamidi suojaavana aineena BBN aiheuttama hiiren virtsarakon syöpien

tutkimiseksi vaikutuksen nikotiiniamidi kasvaimen muodostumiseen BBN aiheuttaman virtsarakon syöpä malli, hiiret saivat 0,05% BBN: ää yksin tai BBN sekä kasvavien konsentraatioiden nikotiiniamidi niiden juomavedessä 20 viikkoa (kuvio 1A). Huomattavasti, nikotiiniamidi lisäravinteiden esti kasvaimen muodostumisen. Lisäravinteen 0,5% nikotiiniamidi vähensi kasvaimen muodostumisen suhde 100%: sta 74%, ja 1% nikotiiniamidi vähensi suhde entisestään, 52% (kuvio 1 B). Histologinen analyysi rakkokasvaimista Eri hoitoryhmissä osoitti, että kehitys MIBC inhiboitui merkittävästi by nikotiiniamidi. Käsittely 0,1% nikotiiniamidi vähensi MIBC 88-42%, ja 1% nikotiiniamidi vähensi entisestään, 12% (kuvio 1 B), joka osoitti, että nikotiiniamidi estää voimakkaasti virtsarakon syövän etenemiseen. Kasvaimen tilavuus myös huomattavasti pienentää nikotiiniamidi. Useimmat BBN-käsitellyillä hiirillä kehittyi suuria kasvaimia (keskimääräinen koko, 129 mm

3). Hoitojen lisääminen nikotiiniamidi vähensi merkitsevästi kasvaimen keskimääräinen koko (99-18 mm

3, kun 0,1-1% nikotiiniamidi hoidettiin, kuvio 1C). Nämä tulokset osoittivat, että nikotiiniamidi estää tehokkaasti kasvaimen muodostumisen ja estää kasvaimen kasvua ja etenemistä MIBC.

(A) Kokeellinen protokolla analysointiin ennaltaehkäisevää vaikutusta NC. Hiiriä käsiteltiin BBN yksin tai yhdessä osoitettujen määrien NC 20 viikkoa. ”N” osoittaa, kuinka monta hiirtä kussakin ryhmässä. Annos 0,1%: NC juomavedessä vastaa suurin piirtein 100 mg /kg /vrk. (B) Yhteenveto ilmaantuvuuden kasvaimen muodostumisen, ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC), ja lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) kussakin testiryhmässä. Numero Kunkin pylvään yläpuolella osoittaa, kuinka monta hiirtä kussakin histologisia luokassa. (C) rasiakuvaajan verrataan kasvainten hoitoryhmissä.

P

-arvot saatiin kaksi otoksen t-testien välillä G1 ja muut ryhmät.

Differential geeniekspressiomalleja joukossa koeryhmään

Luonnehtia geeniekspressiomalleja nikotiiniamidin syövän ehkäisyyn, me satunnaisesti valita 20 hiirtä rakot ja suorittivat geeniekspressioprofilointi; viisi BBN aiheuttama hiiren rakkokasvaimista (MIBCs ryhmästä G1, kuvio 1A), viisi ei-kasvain rakot käsitelty BBN ja nikotiiniamidi (normaali näytteitä ryhmän G5, kuvio 1A), viisi normaali rakot käsiteltiin 1% nikotiiniamidi (Group G6 kuviossa 1A), ja viisi normaalia rakot ilman hoitoa (ryhmä G7 kuviossa 1A). 5 Kunkin ryhmän näytemäärän olivat histologisesti identtisiä keskenään. Ensin levitetään hierarkkinen klusterointi analyysi geeniekspressiomalleja arvioida molekyyli- ominaisuuksia eri koeryhmään. Kuten odotettua, hierarkkinen ryhmittely analyysi geenien ilmentyminen tietoja kaikista kudoksista saatiin kolme suurta klustereita, joista toinen edustaa normaalissa virtsarakossa ryhmä, toinen edustaa BBN-indusoidun hiiren virtsarakkokasvain ryhmä, ja kolmasosa edustaa BBN + nikotiiniamidi-käsitellyn ei-tuumorigeenisiä virtsarakon ryhmä (kuva S1). Siten geeniekspressiomalleja heijastaa molekyylirakenne ovat helposti erotettavissa välillä rakkokasvaimista ja ei-tuumorikudoksissa.

vieressä pyritään tunnistamaan geenin sarjaa, jotka ilmentyvät eri yksi kolmesta eri ryhmiin. Ennen analyysin normaali rakot käsiteltiin nikotinamidi suljettiin, koska ei ollut histopatologisia tai molekyylitason eroja normaalin ja nikotiiniamidi-käsiteltyjen virtsarakon (kuva S1). Käytimme Venn-kaavio verrataan kahta geenin listoja valita geeniekspressiomalleja yhteisiä syövän synnyn ja syövän ehkäisyyn. Ensin tuotetaan kaksi erilaista geeniä luettelot soveltamalla kahden otoksen t-testi (kuvio 2A,

P

0,001). Gene lista A edustaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä normaalissa virtsarakossa ja BBN aiheuttama kasvain ryhmiä, ja geeni luettelossa B edustaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä BBN- ja BBN + nikotiiniamidi hoidetuissa ryhmissä. Verrattaessa kahta geeniä luettelot, kolme erilaista kuvioita havaittiin A ei B (3344 geenit), A ja B (893 geenit), ja B A (1115 geenejä) (kuvio 2B). Geenit A ei B-luokan osoitti BBN aiheuttama kasvain ilmentymistä malleja, kun taas geenien B ei A-ura näy ilmentymiskuviot geenien vastasi nikotiiniamidi. Geenit A- ja B-luokan näytteillä sekä BBN aiheuttama tuumorigeenisia sekä nikotiiniamidi-reagoiva ekspressiokuvioita. Nämä tulokset merkitsivät, että 893 geenejä A- ja B-luokan olivat yhteisiä sekä syövän synnyn aiheuttama BBN ja syövän ehkäisyyn aiheuttamien nikotiiniamidi.

(A) Venn-kaavio geenit valitaan kahden otoksen t-testi hiirimallissa. Violetti ympyrä (geeni luettelo A) edustaa geenit ilmentyvät differentiaalisesti normaalin virtsarakon kudosten ja N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) -nitrosamine (BBN) aiheuttaman virtsarakon kasvaimet. Sininen ympyrä (geeni lista B) edustaa geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä BBN aiheuttaman virtsarakon kasvaimia ja BBN + nikotiiniamidi (NC) käsitellään ei-kasvainkudoksia. Käytimme cut-off

P

-arvo on alle 0,001 valita geenejä, joiden ilmentyminen oli merkitsevästi erilainen näiden kahden ryhmän välillä. (B) Expression malleja valittujen geenien Venn-kaavio. Niistä geenit A ei B-luokan, 1525 geenit (45,6%) osoitti ylös-alas kuvioita ja 1819 geenit (54,4%) osoitti alas-up kuvioita normaalissa ja BBN aiheuttama syöpä. A- ja B-luokan, 290 geenit (32,5%) ja 603 geenit (67,5%) edusti alas-ylös-alas kuvioita ja ylös-alas-ylös malleja, vastaavasti, normaalissa, BBN aiheuttama syöpä, ja BBN + NC käsitelty virtsarakon ryhmiä. B ei A-ura, 606 geenit (54,3%) näkyy alas-ylös kuvioita ja 509 geenit (45,7%) osoitti ylös-alas kuvioita BBN aiheuttama syöpä ja BBN + NC-käsiteltyjen virtsarakon ryhmissä. Tiedot esitetään matriisimuodossa, jossa rivit edustavat yksittäisiä geenejä ja pylväät edustavat kukin kudosta. Punainen ja vihreä väri heijastaa korkean ja matalan ekspressiotasot, vastaavasti.

Biologiset oivallusta geeniekspressiomalleja syövän ehkäisyyn

tunnistamiseksi vallitseva signalointi verkot toimivat ehkäisyssä virtsarakon syöpää nikotiiniamidi, geeni verkko analyysi 893 geenien syövän ehkäisyyn allekirjoituksen (kuva 2) suoritettiin käyttäen Ingenuity

TM Pathways Analysis ohjelmisto. Niistä 893 geenit, 477 kartoitettiin geenien verkkoihin määritelty tämän työkalun. Tämä analyysi paljasti useita oletettuja verkkojen ja niihin liittyvien toiminnallisten luokkien. 10 oletetun verkkojen kanssa korkeimmat pisteet on lueteltu taulukossa S1 ja niihin liittyvät toiminnot on esitetty kuviossa S2.

Kuten odotettua, liittyvien geenien karsinogeneesissä liittyviä toimintoja, kuten solun kasvua ja lisääntymistä, syöpää, solukuolemaa ja DNA-replikaatio ja -korjaus rikastui, joka tarjoaa luottamus tuloksia. Olemme myös havainneet, että geenit osallistuvat tulehdusvasteeseen, soluvälitteisen immuunivasteen, tarttuva tauti, tulehduksellinen sairaus, ja immunologinen sairaus oli myös läsnä merkittävä määrä. Mielenkiintoista, merkittävä runsaasti geenien liikuntaelinten /lihasten järjestelmän kehittäminen ja häiriöt havaittiin (kuva S2).

tutkiminen rikastetun geenien paljasti useita tärkeitä signalointi verkot (taulukko S1), Silmiinpistävin joista osoittivat hallitseva aktivointi

Myc

yksi onkogeenisten allekirjoitusten (kuvio 3).

Myc

muodostettu ensisijainen napa geenin verkon, jolla on korkein yhteyden muuhun geenien verkkoon, mikä viittaa siihen, että

Myc

voisi olla kriittinen molekyyli tekijä sekä karsinogeneesiä indusoi BBN ja syövän ehkäisyä aiheuttama nikotiiniamidi. Monet satelliitin geenien liitetty

Myc

(eli

MSH6

[

MSH6

],

MetAP2

[

MetAP2

]

LMNB1

[

Lmnb1

],

HK2

[

HK2

],

PPAT

[

Ppat

],

PGK1-

[

PGK1-

],

CCT2

[

Cct2

], ja

PMP22

[

Pmp22

]) (kuva 3) osallistuvat kasvainten synnyssä, solujen lisääntymisen, solujen kasvuun, tai apoptoosin, jotka vastaavat parhaiten tunnettu toimintaa

Myc

. Nämä havainnot vahvasti osoittivat, että onkogeenisiä funktio

Myc

ja siihen liittyviä geenejä voidaan säädellä nikotiiniamidi ehkäisevänä hoitona virtsarakon syövän syntymistä.

Up ja alas geenien hiiren virtsarakon syövät ovat merkitty punainen ja vihreä, vastaavasti. Intensiteetti väri on osoitus aste ali- tai ilmaisua. Geenit ilman korostetun väri eivät kuulu etenemistä allekirjoituksen mutta liittyvät säännellyn geenejä. Jokainen viiva ja nuoli edustaa toiminnallinen ja fyysinen vuorovaikutus geenien ja suunta asetuksen raportoitu kirjallisuudessa.

validointi

Myc

allekirjoitus syövän ennaltaehkäisy nikotiiniamidi

validoida hiljattain tunnistettu geenien ilmentyminen allekirjoitus syövän ennaltaehkäisyä nikotiiniamidi, me lisäksi suorittaa geenien ilmentyminen ja proteiinin ilmentyminen analysoidaan. Niistä geenit

Myc

allekirjoitus tunnistetaan geeni verkko-analyysillä (kuvio 3),

Myc

ensisijaisena navan onkogeenin ja

Pmp22

kasvain tukahdutetaan geenin, joka on voimakkain signaali voimakkuus valittiin validointi, ja tulokset on esitetty taulukossa 1 ja kuvassa 4.

Reaaliaikainen RT-PCR (RT-PCR) analyysi suoritettiin

Myc

(A) ja

Pmp22

(B). Erot (

P

arvot) välinen hiiren ryhmien saatiin kahden otoksen t-testiä. Y-akseli osoittaa (lauseke suhde kunkin geenin /

GAPDH

) x 1000. Immunohistokemiallinen analyysi Myc (C) ja Pmp22 (D) suoritettiin vahvistamaan proteiinin ekspressiotasoja. Detection of Myc (E) ja Pmp22 (F) proteiinin ilmentyminen määritettiin myös Western blot -analyysillä.

Ensin suoritettiin geenin ilmentymisen analyysi RT-PCR: llä. Ilmaisu tasot

Myc

in BBN aiheuttaman virtsarakon syöpä ryhmä olivat huomattavasti normaalia suurempi tai BBN + nikotiiniamidi-käsiteltyjen ryhmien (

P

0,001 ja P = 0,02 kahdella otoksen t- testi vastaavasti, kuvio 4, A). Toisaalta, ilmentymisen tasot

Pmp22

in BBN aiheuttaman virtsarakon syöpä ryhmä oli merkittävästi vähentynyt verrattuna normaaliin tai BBN + nikotiiniamidi-käsiteltyjen ryhmien (

P

= 0,02 ja P = 0.03 kahden otoksen t-testi vastaavasti, kuvio 4, B).

Voit selvittää geenien ilmentymisen allekirjoitus tunnistimme samaa mieltä proteiinin ekspressiotasoja, immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin. Havaitsimme, että Myc oli hyvin ilmaistu sytoplasmassa normaalin hiiren uroteelin soluissa, mutta ei ilmaistu tumaan. Myc pääasiassa tumassa kasvaimen solujen BBN-indusoidun hiiren virtsarakon kasvain. Sekä ydin- ja sytoplasminen jakautuminen Myc havaittiin; kuitenkin määrä Myc-positiivisten tumien hiiren uroteelin käsitelty BBN ja nikotiiniamidi oli merkitsevästi pienempi kuin BBN aiheuttaman virtsarakon kasvain, ja sytoplasmista värjäytymisintensiteettiä Myc kummassakaan BBN ryhmässä oli heikompi kuin normaalissa uroteeliin (kuva 4, C ja taulukko 1). Olemme myös havainneet, että Pmp22 jaettiin sytoplasmassa normaalin hiiren uroteeliin, vaikkei ollut mitään todisteita joko sytoplasmista tai ydinaseiden ilmentymisen Pmp22 että BBN aiheuttama hiiren virtsarakon kasvain. Vuonna BBN + nikotiiniamidi saaneista uroteeliin, sytoplasmista Pmp22 ilmentyminen havaittiin; kuitenkin, taso Pmp22 ilmentyminen väheni suhteessa, että normaalissa uroteeliin (kuvio 4, D ja taulukko 1).

esiintynyt myös western blotit Myc ja Pmp22 tiukasti tarkistaa meidän geeniekspressioprofilointi analyysi. On western blot-analyysi, Myc oli hyvin ilmaistu BBN aiheuttama hiiren virtsarakon kasvain ryhmässä verrattuna normaaliin ja BBN + nikotiiniamidi-käsitellyn ei-tuumorigeenisiä virtsarakko ryhmä, mutta Myc ilmaisu ei havaittu eroa normaalin ja BBN + nicotinamide- käsitelty ei-tuumorigeenisiä virtsarakon ryhmä. Toisaalta, Pmp22 ekspressiotaso normaaleissa virtsarakossa ryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin BBN aiheuttama hiiren virtsarakon kasvain ryhmä. Vaikka Pmp22 ilmentyminen havaittiin BBN + nikotiiniamidi-käsitellyn ei-tuumorigeenisiä virtsarakon ryhmä, taso Pmp22 ilmentyminen väheni suhteessa, että normaali. Nämä tulokset osoittivat, että muutokset proteiinin ilmentymisen tasot

Myc

ja siihen liittyvät geenit sopivat hyvin muutoksia geeni-ilmentymisen tasoja paljasti microarray-analyysillä. Tulokset myös vahvaa näyttöä luotettavuuden geenin ilmentymisen allekirjoituksen tunniste.

vertailu geenin ilmentymisen ihmisen ja hiiren välillä virtsarakon syöpien

Koska kolme erillistä alaryhmää hiiren kokeellisessa mallissa, me tutkittiin, kuinka hyvin nämä mallit kerrata ihmisen virtsarakon syövän fenotyyppejä määrittelemien geeniekspressiomalleja. Koska kahta erilaista microarray alustoille käytettiin tutkimaan hiiren ja ihmisen virtsarakon syöpä (korea kohortti), valitsimme homologiset geenit, jotka olivat läsnä molemmissa mikrosiruja käyttäen HomoloGene, joka toimitti tietoja homologisia hiiren ja ihmisen geenit. Yhteensä 11565 oli läsnä homologisia geenejä sekä mikrosiruja. Hierarkkinen ryhmittely analyysi integroidun datan, kolme alaryhmää hyvin erillään toisistaan ​​(kuvio 5). Lukuun ottamatta vain yhdellä hiiren näyte, geeni-ilmentymisen kuviot virtsarakon normaaleilla hiirillä ja BBN + nikotiiniamidi-käsitellyissä hiirissä olivat hyvin samanlaisia ​​kuin normaalin limakalvon tai limakalvolle ympäröivän (vieressä) syövät ihmisen (klusteri I kuviossa 5). Sitä vastoin ilmaus kuviot hiiren virtsarakon syöpien päässä BBN aiheuttama kasvain ryhmä olivat hyvin samanlaisia ​​kuin MIBCs ihmisillä (cluster III kuviossa 5).

Genes ilme arvoja, jotka oli keskihajonta vähintään 0,9 valittiin hierarkkinen analyysiä (1059 geenin ominaisuuksia). Punainen ja vihreä väri heijastaa korkean ja matalan ekspressiotasot, vastaavasti. BBN, NC, NMIBC, ja MIBC osoittavat N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) -nitrosamine, nikotiiniamidi, ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä, ja lihasten invasiivisia virtsarakon syövän, vastaavasti.

seuraava sovelletaan ohjattu oppiminen menetelmiä validoimiseksi valvomatta klusterianalyysillä. Käytimme neljä itsenäistä ennuste menetelmiä mitkä hiiren malleissa saattaa parhaiten jäljittelevät ihmisen fenotyypit. Käytimme geenien ilmentymisen aineistoja kahdesta alaluokkaa ihmisen rakkojen kouluttaa ennusteen menetelmiä (normaali vs. MIBC, NMIBC vs. MIBC, ja Normaali vs. NMIBC). Kaikki ennustus menetelmät ennusti, että suurin osa normaalia ja BBN + nikotiiniamidi-käsiteltyjen hiiren rakot ovat suhteellisen lähellä normaalia limakalvon tai limakalvolle ympäröivä (vieressä) syöpiä ihmisen, kun taas BBN aiheuttama hiiren virtsarakon syövät ovat melko samanlaisia ​​MIBC ihmisen (taulukko 2) . Lisäksi, kun käytetään ennustaminen menetelmiä koulutettu NMIBCs ja MIBCs, havaitsimme, että kaikki BBN-indusoidun hiiren virtsarakon syöpiä ennustettu MIBC (taulukko 2). Lisäksi sovellettaessa ennustaminen menetelmiä koulutettu normaali ja NMIBCs, useimmat BBN + nikotiiniamidi-käsitellyn hiiren rakot olivat suhteellisen lähellä normaalia limakalvon tai limakalvolle ympäröivä (vieressä) syövät ihmisen (taulukko 2).