Krooninen sairaus

tiivistelmä

sialidaasi poistaa siaalihapon sialoglycoconjugates ja on ratkaiseva rooli monissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa. Erilaisia ​​ihmisen syövissä ilmaista epätavallisen korkealla solukalvon liittyvä sialidaasi isoform.Visualization of sialidaasia aktiivisuutta elävässä nisäkkään kudoksissa olisi hyötyä paitsi ymmärtämiseksi sialidaasi toimintoja mutta myös syövän diagnosointiin. Kuitenkin, koska entsyymiaktiivisuus nisäkkään sialidaasi on huomattavan heikko verrattuna sekä bakteerien ja virusten sialidases, on ollut vaikea havaita sialidaasia aktiivisuutta nisäkkäiden kudoksissa. Me syntetisoitu uutta benzothiazolylphenol-pohjainen siaalihapon johdannainen (BTP-Neu5Ac) kuin fluoresoivaa sialidaasi alustaan. BTP-Neu5Ac voi visualisoida sialidaasi toimintaa herkästi ja valikoivasti akuutissa rotan aivojen viipaleita. Syöpäsolut istutettu ortotooppisesti hiiren kaksoispisteet ja ihmisen paksusuolen syöpiin (vaiheet T3-T4) on myös selvästi havaittiin BTP-Neu5Ac. Tulokset viittaavat siihen, että BTP-Neu5Ac on käyttökelpoinen histokemiallista kuvantamiseen sialidaasi toimintaa.

Citation: Minami A, Otsubo T, Ieno D, Ikeda K, Kanazawa H, Shimizu K, et ai. (2014) visualisointi sialidaasi Activity nisäkäskudoksissa ja Cancer Detection kanssa Novel Loisteputki sialidaasi Alustan. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10,1371 /journal.pone.0081941

Editor: Alberto G. Passi, University of Insubria, Italia

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu: 10 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Minami et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) (KAKENHI; no. 24790080), The Sasakawa tieteellisen tutkimuksen Grant päässä Japanista Society ja The Naito Foundation Avustus edistäminen Specific Research Projects. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sialidaasi (EY 3.2.1.18) poistaa siaalihapon sialoglycoconjugates, kuten glykoproteiinien ja glykolipidit. Nisäkkäiden sialidaasi tiedetään 4 isoformeja (NEU1, NEU2, NEU3 ja NEU4) ja soittaa monia rooleja solujen toimintoja, kuten erilaistumista, kasvua, apoptoosin ja muuttoliike sekä selviytymistä ja syöpäsolujen lisääntymistä [1], [2]. Visualisointi yksityiskohtainen jakautuminen sialidaasia aktiivisuuden nisäkkään kudoksessa voi auttaa meitä ymmärtämään fysiologisia ja patologisia roolit sialidaasi. Lisäksi, koska ilmentymistaso NEU3, plasma kalvoon liittyvä sialidaasi, kasvaa huomattavasti eri ihmisen syövissä, kuten koolon-, munuais-, eturauhas- ja munasarjasyövät [1], [2], [3], havaitseminen kalvo sialidaasilla toimintaa elinkelpoisten syöpäkudoksessa ovat myös käyttökelpoisia syövän diagnosointiin ja reaaliaikainen seuranta syövän kirurgisen toimenpiteen aikana.

X-Neu5Ac (5-bromi-4-kloori-3-yyli-α-DN-asetyylineuramiinihapon happo) on laajalti käytetty keinotekoisia sialidaasi substraatti sytokemiallisten ja histokemiallista kuvantaminen sialidaasia toimintaa. Yhdiste X (5-bromi-4-kloori-3-hydroksi-) vapautetaan X-Neu5Ac sialidaasilla ja hapetetaan veteen liukenematonta näkyvissä indigo sininen. Parantaa spesifisyyden värjäystä, indigogenic substraatteja käytetään usein ekvimolaarinen K

3 [Fe (CN)

6] ja K

4 [Fe (CN)

6] määrän hapetuskatalysaattori. Kuitenkin herkkyys ei ole riittävä tarkkailla yksityiskohtainen jakautuminen sialidaasia aktiivisuutta nisäkkäiden kudoksissa [4]. Entsyymiaktiivisuus nisäkkään sialidaasi on huomattavan alhainen verrattuna bakteerien ja virusten [5], [6]. Herkkyyden lisäämiseksi X-Neu5Ac, herkistintä kuten Fast Red Violet LB (FRV LB) kuin kytkimen muodostaa atsoväriä käytetään X-Neu5Ac [6], [7], [8]. Koska kaksivaiheisessa reaktiossa tarvitaan värjäämällä FRV LB, epäspesifisen värjäytymisen aiheuttama herkistävä on välttämätöntä, ja on vaikea käyttää, erityisesti kliinisillä aloilla. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme kehittäneet uusia fluoresoivia sialidaasi substraatteja, benzothiazolylphenol-pohjainen siaalihapon johdannaiset (BTP-Neu5Ac), erittäin herkkä ja spesifinen visualisointi sialidaasia aktiivisuutta elävässä nisäkkään kudoksissa yksivaiheisella reaktiolla.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että BTP-Neu5Ac voi visualisoida sialidaasi toimintaa herkästi ja valikoivasti akuutissa rotan aivojen viipaleita. BTP-Neu5Ac voi myös selvästi havaita syöpäsoluja istutettu ortotooppisesti hiiren kaksoispisteet ja ihmisen paksusuolen syöpiin.

Materiaalit ja menetelmät

Synthetic menettelyjä

yhdisteiden synteesi on kuvattu yksityiskohtaisesti File S1.

Materiaalit

seuraavat tuotteet ostettiin myyjät ilmoitettu: sialidaasi alkaen

Arthrobacter ureafaciens

(AUSA, ilmennetty rekombinantti

Escherichia. coli

, Calbiochem, San Diego, CA, USA), X-Neu5Ac (Peptide Institute, Osaka, Japani), halotaani (Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japani), Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japani), penisilliiniä ja streptomysiiniä (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA), naudan sikiön seerumia (FBS, AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia), fykoerytriini (PE) konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) ja kanin anti-CD71 (transferriinireseptori) polyklonaalista vasta-ainetta (määritys Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA). Reagenssit, joita käytetään tekemään puskuriliuoksia ostettiin Wako Pure Chemical Industries.

Koe-eläimet

Rotat ja hiiret hankittiin Japan SLC (Hamamatsu, Japani). Heidän majoitettiin tavanomaisissa laboratorio-olosuhteissa (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% kosteus) ja oli käytettävissään vesijohtovettä ja ruokavalio

halun

. Valot olivat automaattisesti päälle klo 08:00 ja pois päältä klo 20.00. Kaikki kokeet suoritettiin noudattaen Japani farmakologinen Society opas hoitoon ja koe-eläinten käyttöä, ja pöytäkirjat ennalta hyväksynyt eläinten eettisen komitean yliopiston Shizuoka.

Spektrianalyysi

fluoresoiva spektrit 5 mM BTP2, BTP3 ja BTP4 keinotekoisessa aivo-selkäydinnesteessä (ACSF, pH 7,3, 200 ui), joka sisälsi 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 2,5 mM CaCI

2, 1,3 mM MgCI

2 , 1,0 mM NaH

2PO

4, 26,2 mM NaHCO

3 ja 11 mM D-glukoosia mitattiin mikrolevylukijalla, Infinite M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). Heräte spektrit hankittiin emissioaallonpituudet 518 nm BTP2, 526 nm BTP3 ja 542 nm BTP4. Emissiospektrit hankittiin viritysaallonpituuksia 370 nm BTP2, 372 nm BTP3 ja 374 nm BTP4. Fluoresenssi näkymät 5 mM BTP2, BTP3 ja BTP4 vuonna ACSF ja BTP2, BTP3 ja BTP4 suodatinpaperille oli kuvattu alla virityksen UV-valossa 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Ranska) digitaalikameralla, CX1 ( Ricoh, Tokio, Japani).

kvantitatiivinen analyysi sialidaasia toiminnan

AUSA (10

0-10

5.7 uU ml

-1: yksi yksikkö määriteltiin entsyymimäärä, joka katalysoi vapautumista 1 umol siaalihapon 1 min.) inkuboitiin 100 ul: ssa 100 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,3), joka sisälsi 10 uM BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac tai resorufiini -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan 96 syvennyksen mustia mikrolevylle (Corning, Corning, NY, USA). Reaktio lopetettiin lisäämällä 150 ui natriumkarbonaattia (500 mM, pH 10,7), kuhunkin kuoppaan. Fluoresenssin voimakkuus mitattiin mikrolevylukijalla (ex /em: 370 nm /518 nm BTP2, 372 nm /526 nm BTP3, 374 nm /542 nm BTP4 ja 570 nm /585 nm resorufiini).

havaitseminen sialidaasia toimintaa PVDF-kalvolle

AUSA (10

-1-10

4 uU) blotattiin polyvinylideeni (PVDF) kalvo käyttäen 96-kuoppaista dotblotter (ympyrä hyvin koko: 28,3 mm

2, Sanplatec, Osaka, Japani). Kukin kuoppa pestiin 100 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,3), ja sitten 50 ui 10 uM BTP4-Neu5Ac tai X-Neu5Ac natrium- fosfaattipuskurissa lisättiin. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 6 tunnin ajan, reaktio liuokset poistettiin, ja sitten PVDF-kalvoille havaittiin digitaalikameralla UV-valossa (365 nm) BTP4-Neu5Ac tai stereo mikroskoopilla SZX7 (Olympus, Tokio, Japani) alla näkyvän valon X-Neu5Ac.

kuvantaminen sialidaasia aktiivisuus aivojen viipaleita

Wistar (uros-, 7-10 viikkoa vanhoja, n = 3) nukutettiin halotaanilla ja kaula katkaistiin. Aivot kunkin rotan nopeasti talteen ja upotettiin jääkylmään ACSF tukahduttaa liiallinen hermosolujen heräte ja vaurioita. ACSF käytettiin tässä kokeessa jatkuvasti puhallettiin 95% O

2 ja 5% CO

2. Koronan Aivoviipaleiden (400 mikrometriä paksu) valmistettiin käyttämällä LinearSlicer PRO-7 (Dosaka EM, Kioto, Japani) jääkylmään ACSF. Akuutti aivojen viipaleita pidettiin ACSF huoneen lämpötilassa vähintään 60 minuutin ajan ja inkuboitiin sitten 400 ul: ACSF, joka sisälsi 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) tai BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) 27 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Inkubointi kammiot olivat jatkuvasti puhallettiin 95% O

2 ja 5% CO

2 aikana värjäystä. Viipaleet pestiin kolme kertaa ACSF ja siirrettiin Iwaki 3,5 mm lasi-annokset (Asahi Glass, Tokio, Japani) täytettiin ACSF. Fluoresenssi havaittiin käyttämällä IX71 fluoresenssimikroskooppia (virityssuodatinjärjestelmä /emissiosuotimen: BP330-385 /BA420 tai BP330-385 /BA510IF, Olympus). Taustaa taso fluoresenssin sialidaasia aktiivisuus kuvantaminen määritettiin inkuboimalla aivojen viipaleet ACSF ilman substraattia. Kaikissa havainnot kanssa fluoresenssimikroskoopilla, voitto on DP70 Digitaalinen mikroskooppi Camera (Olympus) asetettiin ei havaita taustafluoresenssi.

koko alueen kuvantaminen aivojen viipale, kuvat on otettu peräkkäin ja jokainen pala oli laatoitettu Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). Tarvittaessa sama käsittely suoritettiin seuraavassa kokeessa.

Sytotoksisuus

MDCK-solut altistettiin seerumitonta alustaa (SFM), joka sisälsi 10 tai 100 uM BTP-Neu5Ac tai BTP. Vapautetaan LDH mitattiin käyttäen kytketyssä entsymaattisessa määrityksessä (CytoTox-OneTM, Promega, WI, USA).

Hiiren paksusuolen tuumorin mallin

Hiiren Colon 26 NL-17 karsinooma soluja viljeltiin DMEM 10% FBS, 100 yksikköä ml

-1 penisilliiniä ja 100 ug ml

-1 streptomysiinillä 37 ° C: n läsnä ollessa 5% CO

2 kosteassa ilmakehässä. Paksusuolen syövän soluja istutettiin ortotooppisesti seuraavat protokolla, joka perustuu menetelmään raportoineet Takahashi

et al.

[9] BALB /cCrSlc hiirillä (uros, 6 viikkoa vanhat) pidettiin paastolla 12 tunnin ajan, ja sitten nukutettiin kloraalihydraatilla (400 mg kg

-1 ruumiinpainoa). Indusoimaan koliitti, hiiriin injektoitiin peräsuoleen 200 ui 0,1 M HCl: a, paksusuolen päällä 1,5 cm kaukana peräaukon kautta peräaukko. 10 minuutin kuluttua hiiriin injektoitiin peräsuoleen 200 ui 0,1 M KOH neutralointiin, jonka jälkeen injektio 400 ui PBS: ää. Kun 9 tuntia, hiiret nukutettiin uudelleen ja injektoidaan peräsuoleen 200 ul Colon26 NL-17-soluja (8 x 10

6 solua) suspendoitiin seerumittomalla DMEM samalla tavalla. Peräaukon välittömästi kiinnitetty pienellä Klemme 2 tuntia. At 1 (n = 3) tai 2 viikon ajan (n = 3), kun potilaalle tehdä kiinnittymisestä paksusuolensyöpä, kaksoispisteet kerättiin talteen intrakardiaa- perfuusion PBS poistamaan verta koko kehoon.

Ihmisen paksusuolisyövän yksilöitä

Kaksi kirurgisista näytteistä saatiin ihmisen koolonadenokarsinooma (UICC T luokitus T3 ja T4) ja värjättiin BTP4-Neu5Ac sisällä 2 tuntia leikkauksen jälkeen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Shizuoka General Hospital (Protocol 13-03-59) ja University of Shizuoka (Protocol 25-2) ja on linjassa ihmisoikeuksien julistuksen, Helsinki, 2002. Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumusta.

Detection paksusuolen syövän BTP4-Neu5Ac

hiiren ja ihmisen paksusuolen syövän kudoksia inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 100-200 uM BTP4-Neu5Ac, 37 ° C: ssa 60 min. PBS-pesun jälkeen fluoresenssi havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (virityssuodatin /emissiosuodatin: BP330-385 /BA420) tai IVIS Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Taustaa fluoresenssin taso määritettiin käyttämällä normaaleja kaksoispisteellä inkuboitiin PBS: ssä ilman BTP4-Neu5Ac.

Histopatologisten tahrat

Hiiren ja ihmisen kaksoispisteet että oli käytetty sialidaasia toiminnan kuvantamisen kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä . Sen jälkeen, kun upotettu parafiiniin, kudos leikattiin 4-7 um: n paksuisia leikkeitä ja värjättiin käyttäen kanin anti-CD71-vasta-ainetta primaarisena vasta-aineena, PE-konjugoitua vuohen anti-kani-lgG-vasta-ainetta sekundaarisena vasta-aineena ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani).

toistettavuus

Kaikki värjäykset toistettiin ainakin kahdesti ja toistettavuus varmistettiin.

tulokset ja keskustelu

malli uusien sialidaasi alustan histokemiallista kuvantamisen

visualisoimiseksi sialidaasia toimintaa kudoksen, aglykoni on sialidaasia alustan tulee olla veteen liukenematonta värjäys väriaine voidaan kiinnittää kudokseen . Koska fluorofori 4-metyyliumbelliferyyli-α-D-

N

-acetylneuraminic happo (4MU-Neu5Ac), joka on yleisesti käytetty keinotekoinen sialidaasi substraatin määrän entsyymiaktiivisuuden, on vesiliukoinen, 4MU-Neu5Ac ei ole sopivia histokemiallista kuvantamiseen sialidaasia toimintaa. Benzothiazolylphenol (BTP), veteen liukenematonta fluorofori, osoittaa voimakasta fluoresenssia kiinteässä kunnossa [10]. BTP-fluoresoivat koettimet on käytetty biologisia ja kemiallisia indikaattoreita [11], [12], [13]. Kun BTP johdannaiset, BTP2 [14], BTP3 [15] ja BTP4 [15], asetettiin keinotekoisesti aivo-selkäydinnesteessä (ACSF, pH 7,3), ne saostettiin pohjalle koeputkien (kuvio 1 A).

A Fluoresenssi näkymät BTP2, BTP3 ja BTP4 in ACSF (ylempi) ja suodatin paperit alle 365 nm UV-valossa (alempi) on esitetty. B-D, Viritysjärjestelmät (siniset pisteet ja viivat) ja päästöjen (punaiset pisteet ja viivat) spektrit BTP2 (B), BTP3 (C) ja BTP4 (D) mitattiin ACSF (pH 7,3). Sininen ja punainen luvut edustavat aallonpituus (nm) ruuhka fluoresenssin voimakkuus. Lyhenteet: rF, suhteellinen fluoresenssin voimakkuus.

BTP2, BTP3 ja BTP4 on eri päästö- ja heräte-spektrit (kuvio 1 B-D). Koska fluoresenssivärjäys väriaineita, joilla on erilaiset viritys- ja emissio spektrit on etulyöntiasema valikoima suodattimen asettaa ottamaan fluoresenssi kuvia, käytimme näitä kolmea BTP johdannaiset aglykoni on sialidaasi alustan.

hydrolyysi BTP-Neu5Ac sialidaasilla alkaen

Arthrobacter ureafaciens

syntetisoitiin BTP-pohjainen siaalihapon johdannaiset (BTP-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac ja BTP4-Neu5Ac, mukaan synteettistä kaaviota kuvion 2 . Nämä siaalihappoa johdannaiset olivat vesiliukoisia ja osoitti vähän fluoresenssia. Kun BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac ja BTP4-Neu5Ac inkuboitiin ACSF sisälsi 10

0-10

5.7 uU ml

-1 sialidaasi iältään

Arthrobacter ureafaciens

(AUSA) 37 ° C: ssa 60 min (pH 7,3), loisteputki intensiteettiä nostettiin suhteessa pitoisuus AUSA ja saavutti tasanteen suurilla pitoisuuksilla (Kuva 3 A-C). Ekstinktiokertoimet (M

-1 cm

-1) on BTP2, BTP3 ja BTP4 kloroformissa olivat 14970, 12440 ja 14350, vastaavasti. Nämä tulokset osoittivat, että BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac ja BTP4-Neu5Ac ovat hyödyllisiä määrällinen analyysi sialidaasi toimintaa.

Ehdot: (a) Amberlite IR-120 (H

+), kuivaa MeOH, yön yli, 92% saanto. (B) AcCl-AcOH, yhdessä yössä, kvant. (C) BTP2~4, NaH, THF-DMF, huoneenlämpötilassa yön yli. (D) NaOMe, kuivassa MeOH: ssa, 6 tuntia, huoneen lämpötilassa, sitten NaOH: lla aq., MeOH, huoneenlämpötila, 2 päivää.

A-D, Suhteellinen fluoresenssi-intensiteettejä suhteessa kasvoi kasvavia määriä AUSA 10 uM BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) ja BTP4-Neu5Ac (C), mutta ei 10 uM Res-Neu5Ac (D). Jokainen baari ja linja edustavat keskiarvoa ± SEM (N = 3). Fluoresenssivoimakkuuksien Kunkin mustan palkin asetettiin 10

5. Res: 10 uM resorufiini. E, AUSA blotattiin PVDF-kalvoille värjättiin 10pM BTP4-Neu5Ac tai X-Neu5Ac. PVDF-kalvot tutkitaan UV-valossa for BTP4-Neu5Ac tai näkyvän valon X-Neu5Ac. Sininen väri aiheuttaman värjäytymisen AUSA 100 uM X-Neu5Ac on esitetty oikealla puolella katkoviivalla.

resorufiinin on veteen liukenematon fluorofori, jonka molekyylipaino kooltaan samanlainen kuin BTP- Neu5Ac. Resorufiini-pohjainen glykosidaasilla substraatteja on käytetty sytokemiallisten värjäystä ja entsyymiaktiivisuuden mittaamista [16]. Kun kyseessä on siaalihapon johdannaisia, joilla resorufiini (Res-Neu5Ac), fluoresoiva intensiteetti ei merkittävästi muuttanut AUSA (yksisuuntainen ANOVA, kuvio 3 D). BTP-Neu5Ac olisi sopivampi kuin Res-Neu5Ac sopimaan reaktion taskuun sialidaasi.

AUSA blotattiin PVDF-kalvolle erilaisilla pitoisuuksilla värjättiin 10pM BTP4-Neu5Ac. Seurauksena havainto UV-valossa, loisteputki intensiteettiä voidaan muuttaa laajalla dynaamisella alueella (kuvio 3 E, ylempi). Herkkyys BTP4-Neu5Ac oli huomattavasti korkeampi kuin X-Neu5Ac (kuvio 3 E, alhaalla).

visualisointi sialidaasin vaikutusta rotalla akuutin aivoleikkeissä

visualisoida sialidaasia toimintaa rotan aivojen, akuutti aivojen viipaleita inkuboitiin ACSF (pH 7,3), joka sisälsi 1 mM BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac tai 1 mM BTP4-Neu5Ac 27 ° C: ssa 60 min. Inkubointi kammiot olivat jatkuvasti puhallettiin 95% O

2 ja 5% CO

2 aikana värjäys pitää siivu kunnossa terve. Pestiin ACSF, valkean aineen osoitti voimakasta fluoresenssia siivut värjättiin BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac ja BTP4-Neu5Ac (kuvio 4 A-C). Tämä tulos oli yhdenmukainen tulosten edellisen tutkimukset osoittavat, että valkean aineen nisäkkäiden aivoissa osoittaa intensiivistä sialidaasia aktiivisuutta käyttäen 4MU-Neu5Ac tai X-Neu5Ac kanssa FRV LB [8], [17].

A-C , sialidaasia aktiivisuus kuvantaa akuutti koronan viipaletta aikuisen rotan aivojen kanssa BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) ja BTP4-Neu5Ac (C) pH: ssa 7,3. Lyhenteet: cc, aivokurkiainen; ec, ulkoinen kapseli; fi, ripsien; hip, hippokampus; ic, sisäinen kapseli. D, Brain viipaleet värjättiin eri pitoisuuksia (1-1000 uM) BTP4-Neu5Ac. E, sialidaasia aktiivisuus kuvattiin 10pM BTP4-Neu5Ac tai 10pM BTP4-Neu5Ac sisälsi 1 mM DANA, joka on sialidaasi estäjä. Emissiosuodattimia jotka lähettävät edellä 420 ja 510 nm käytettiin A-D ja E, tässä järjestyksessä. Mittaviivat kussakin paneelissa edustaa 2 mm.

Koska BTP4 viritetään tehokkaammin magnetointi kaistanpäästösuodatin (330-385 nm) fluoresenssimikroskoopilla kuin BTP2 tai BTP3, kuvantaminen BTP4-Neu5Ac näytteillä voimakkain fluoresenssi näissä BTP-Neu5Ac sarjassa. Olemme myös analysoineet herkkyys ja spesifisyys BTP4-Neu5Ac kohti sialidaasi. Kun kyseessä on sialidaasia toiminnan kuvantamisen X-Neu5Ac ja FRV LB, korkea pitoisuus X-Neu5Ac, yleensä 1 mM, parantamiseksi tarvitaan herkkyyttä ja spesifisyyttä kohti nisäkkäiden sialidaasia aktiivisuus [7], [8]. Toisaalta, BTP4-Neu5Ac voi havaita sialidaasi toiminnan alhaisen substraatin pitoisuudet jopa alle 10 uM (kuvio 4 D). Kun 2,3-dehydro-2-deoksi-N-asetyylineuramiinihapon (DANA, 1 mM), joka on sialidaasia estäjä, levitettiin aikana värjäämällä BTP4-Neu5Ac, fluoresenssi huomattavasti heikennetty koko aivojen pinta-ala (kuvio 4 E). BTP-Neu5Ac on nimenomaan hydrolysoidaan sialidaasi, jolloin huomattava nousu fluoresenssin voimakkuus.

Koska BTP-Neu5Ac, hydrofiilinen alustan, täytetään solunulkoisessa tilassa hydrolysoitiin nisäkkäiden sialidaasi elävien kudosten fysiologisissa solunulkoisen olosuhteissa , sialidaasi olisi pilkkovat BTP-Neu5Ac lähinnä solun pinnalla. Solukalvon sialidaasi NEU3 hydrolysoitiin gangliosidin tehokkaasti ja alhaisen molekyylipainon substraattien, kuten 4MU-Neu5Ac hieman [18], [19]. Vaikka pH-optimi NEU3 on 3,8, NEU3 hydrolysoi gangliosidi on myös neutraalissa pH: ssa [19], [20]. Lysosomaalisen sialidaasi NEU1 myös raportoitu olevan läsnä solukalvojen ja hydroly- 4MU-Neu5Ac tehokkaasti [21], [22], [23]. Lisäksi, sytosolin sialidaasi NEU2 on kalvoon sitoutuneen muodon ja hydrolysoi 4MU-Neu5Ac [24]. Siksi, ei vain NEU3 vaan myös muita sialidaasi isotsyymejä olisivat mukana sialidaasia aktiivisuuden havaittu BTP-Neu5Ac.

Sytotoksisuusmääritvs of BTP-Neu5Ac ja BTP

sytotoksisuuden mittaukseen, MDCK-solut altistettiin BTP-Neu5Ac tai BTP 6 (tuloksia ei ole esitetty) tai 16 (kuvio 5) tunnin ajan. Seurauksena mittaus määristä laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumista soluista on vaurioitunut kalvo, mitään merkittävää sytotoksisuus havaittiin BTP-Neu5Ac ja BTP (yksisuuntainen ANOVA).

MDCK-solut altistettiin seerumin elatusaineessa (SFM), joka sisälsi 10 tai 100 uM BTP-Neu5Ac (A) tai BTP (B) 16 tunnin ajan, ja vapautetaan LDH mitattiin. LDH: n vapautuminen on esitetty suhteessa loppuun LDH: n vapautuminen (100%) käsittelemällä hajotuspuskuria.

Detection syöpäsolujen hiiren paksusuolen kudoksiin

Äskettäin tekniikka syövän kuvantaminen on eteni merkittävästi. Esimerkiksi Oku

et al.

Kehittäneet uuden positronisäteilijä-leimattua liposomin positroniemissiotomografia (PET) kuvan pieni aivosyöpä invasiivisesti reaaliajassa [25]. Urano

et al.

Kehittänyt syöpää kohdistaminen monoklonaalinen vasta konjugoitu pH-aktivoituva fluoresenssikoetinta varten

in vivo

kasvainten havaitseminen [26]. Erittäin herkkä ja spesifinen fluoresoiva syöpä koetin on etuja havaitsemiseksi pienten syöpien koska vähimmäiskoko kasvaimen havaitaan fluoresenssi endoskopialla (noin ~ 1 mm) on paljon pienempi kuin PET, tietokonetomografia (CT) ja magneettikuvaus ( MRI) (noin 5-20 mm) [27], [28]. Aiemmin havaita syöpien ja seuraavat nopeasti kovettuva niistä estää tehokkaasti ei ainoastaan ​​pahanlaatuinen muutos syöpiä, mutta myös distaalinen etäpesäke ja voimakkaasti lupaa parantaa ennustetta.

Koska paksusuolen syöpä on raportoitu olevan voimakas entsyymin aktiivisuutta plasmassa membrane- liittyvä sialidaasi [29], yritimme havaita paksusuolen syövän BTP4-Neu5Ac elävissä paksusuolen kudoksiin. Istutettiin ortotooppisesti kanssa Colon26 NL-17-solut, jotka ovat erittäin metastaattinen syöpäsolujen eristettiin hiiren paksusuolen adenokarsinooma 26. Kun 1 tai 2 viikkoa, paksusuolen kudokset otettiin talteen ja niitä inkuboitiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisälsi 100 uM BTP4- Neu5Ac. Voimakasta fluoresenssia havaittiin paksusuolessa istutettu Colon26 NL-17-soluissa, mutta ei tulehduksellinen tai normaali kaksoispisteet (kuvio 6 A-C, kuvio S1). Ottaa huomioon, että normaali paksusuolen kudos osoitti heikkoa fluoresenssia, fluoresenssi paksusuolen syöpä oli paljon voimakkaampaa kuin normaalissa kudoksessa (kuvio 6 D-F). Alueet osoittaa voimakasta fluoresenssia paksusuolessa istutettu Colon26 NL-17 soluihin vahvistettiin olevan syöpää immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 6 G). Siksi paksusuolen syövistä voitiin erottaa helposti normaalista kudoksesta käyttämällä BTP-Neu5Ac.

A Viikon kuluttua potilaalle tehdä paksusuolen kiinnittymisestä Colon26 NL-17 soluihin, elävät paksusuolen kudokset värjättiin BTP4-Neu5Ac. Nuolenkärki osoittaa syövän alueella. B ja C, tulehduksellinen (B) tai normaali (C) colons värjättiin myös BTP4-Neu5Ac. Vasen, keskimmäinen ja oikea paneelit paneelissa A-C esittävät Kirkas, yhdistettiin ja loisteputki näkymät, vastaavasti. D ja E, suurennetun kuvan syövän (D) ja normaali (E) alue värjättiin BTP4-Neu5Ac. F, tausta fluoresenssin taso paneelit D ja E esitetään. G, Immunohistokemiallinen värjäys (punainen fluoresenssi) käyttäen kanin anti-CD71-vasta-aine ja PE-konjugoitua vuohen anti-kani-lgG-vasta-aineella ja tumavärjäystä DAPI (sininen fluoresenssi) suoritettiin havaita paksusuolen syövän poikkileikkauksia hiiren paksusuolen kudoksiin, jotka olivat käytetään sialidaasia toiminnan kuvantamisen paneeleissa A ja D. Nuolet osoittavat alueet osoittavat voimakasta fluoresenssia läpilyöntikivun paneeli A ja D. Asteikkoviiva paneeli C edustaa 2,5 mm ja on yleinen paneeleissa A ja B Asteikkoviiva paneelissa F on 0,5 mm ja on yleistä paneelit D ja E. Asteikkoviiva paneelissa G edustaa 0,2 mm.

sialidaasi toiminta ilmaistaan ​​Colon26 NL-17 raportoitu olevan heikoimmat koolonadenokarsinooma 26 alilinjat kuten NL- 4, NL-17, NL-22 ja NL-44 [30]. Koska jopa Colon 26 NL-17 adenokarsinooma istutettu ortotooppisesti hiiren kaksoispisteet detektoitiin BTP-Neu5Ac selkeästi, BTP4-Neu5Ac olisi riittävän herkkiä syövän koetin.

havaitseminen syövän ihmisen paksusuolen kudoksiin

on raportoitu, että ekspressiotaso Neu3-mRNA: n ihmisen paksusuolen syöpä on 3-100-kertaa suurempi kuin normaalissa kudoksessa [29]. Siksi me myös yrittänyt havaita ihmisen paksusuolen syövän kanssa BTP4-Neu5Ac. Inkuboinnin jälkeen ihmisen paksusuolen syövän elävien kudosten luokiteltu T3 T luokittelu unionin International Cancer valvonta (UICC), sisältävään PBS 200 uM BTP4-Neu5Ac, voimakasta fluoresenssia havaittiin kasvain alueilla, mutta ei normaalissa alueilla (Kuvio 7 A-G). Alueet osoittavat voimakasta fluoresenssia ja ei-fluoresenssi varmistettiin olevan syövän ja normaaleissa kudoksissa, vastaavasti, käyttämällä hematoksyliini- eosiini-värjäyksen (kuvio 7 H ja I). Cancer luokiteltu T4 myös havaittu BTP4-Neu5Ac ihmisen paksusuolen kudokset (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka muita arviointi myrkyllisyyden tarvitaan, olisi mahdollista käyttää BTP4-Neu5Ac syövän havaitseminen ei vain patologinen tutkimus mutta myös invasiivisen diagnoosi.

A, A ihmisen paksusuolen syöpä näyte (alue mukana on valkoinen viiva ) saatiin kirurgisen syöpäkudoksessa (UICC T luokitus: T3). B-D, The paksusuolikudos värjättiin BTP4-Neu5Ac. B, C ja D esittävät valokuvaus-, yhdistettiin ja loisteputki kuvia, vastaavasti. E-G, laajentuneessa fluoresenssi kuvaa normaalin (E) ja syövän (F ja G) alueita hankittiin fluoresenssimikroskoopilla. H ja I, pitkittäinen siivu paksusuolikudos valmisteltiin pisteviivalla paneelissa B. Ei-fluoresenssi ja fluoresenssi alueiden paneeli C värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla ja ne esitetään paneelien H ja I, vastaavasti. Mittaviivat paneelissa B, E ja H edustavat 10 mm (yleinen paneeleissa B-D), 500 um (yleinen paneelit E-G) ja 250 um (yleinen paneelit H ja I), tässä järjestyksessä.

Johtopäätökset

Olemme kehittäneet uudenlaisia ​​loisteputki sialidaasi substraatit histokemiallisella sialidaasi toimintaa nisäkkäiden kudoksissa. Koska sialidaasi on ratkaiseva rooli monissa biologisia toimintoja kuten lysosomaalisissa hajoamista, immuunijärjestelmän ja hermoston toiminnot [2], [31], BTP-Neu5Ac on tehokas työkalu yksityiskohtaista tutkimusta sialidaasi toimintoja. Koska cytotoxicities läpilyöntikivun-Neu5Ac ja BTP oli huomaamaton, BTP-Neu5Ac voidaan käyttää biologisen määritys sialidaasi elävässä kudoksessa, esim. nopeutus kuvantaminen. Lopuksi, paksusuolen syövät detektoitiin BTP4-Neu5Ac elävässä kudoksessa, mikä viittaa siihen, että BTP-Neu5Ac olisivat myös käyttökelpoisia syövän koettimia.

tukeminen Information

Kuva S1.

havaitseminen paksusuolen syövän BTP4-Neu5Ac kahden viikon kuluttua implantaation syöpäsoluja. Kahden viikon kuluttua orthotopical kiinnittymisestä Colon26 NL-17 soluihin, hiiren kaksoispisteitä värjättiin BTP4-Neu5Ac. Tulehdus- tai normaali kaksoispisteet värjättiin myös BTP4-Neu5Ac. Vasen ja oikea paneeli näyttää fluoresoiva kuvat ja kirkkaat kentän yhdistettyjen kuvien loisteputki kuvia, vastaavasti. Scale palkki edustaa 5,0 mm.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0081941.s001

(TIF)

Tiedoston S1.

Synteettiset menettelyjä ja

1H spektrit uusia yhdisteitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0081941.s002

(PDF) B