Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nykyinen potilaiden hoidosta diagnosoitu eturauhassyöpä (PCA) on hyvin tehokas; kuitenkin, kasvaimen uusiutumisen kanssa nipistämässä Kestää Eturauhassyöpä (CRPC) ja myöhemmin etäpesäkkeiden johtaa huonoon säilymiseen tulos viittaa siihen, että on olemassa pakottava tarve uusille mekanistinen käsitys kasvaimen uusiutumisen, mikä olisi kriittinen suunnittelussa Uusien hoitomuotojen. Toistumisen ja etäpesäke Eturauhassyövän ovat tiiviisti sidoksissa biologiaa eturauhassyövän kantasolujen tai syöpä-aloittavat solujen, joka muistuttaa hankinnan epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että EMT-tyypin solujen jakaa monia biologisia ominaisuuksia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että PCa solut EMT fenotyyppi näkyvissä Stern- kuten solujen ominaisuuksia ominaista lisääntynyt ilmentyminen Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B ja /tai Notch1, sopusoinnussa parannettu klonogeenisten ja pallo (prostasphere) -forming kyky ja tumorigenecity hiirillä, jotka oli liitetty vähentynyt ilmentyminen miR-200 ja /tai let-7 perhe. Käänteinen EMT uudelleen ilmentäminen miR-200 esti prostasphere muodostavaa kykyä EMT-tyypin solujen ja vähentää ilmentymistä Notch1 ja Lin28B. Down-regulation Lin28B kasvoi let-7 lauseke, joka oli yhdenmukainen tukahdutettu itseuudistumisen ominaisuus.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-200 ollut keskeinen rooli yhdistää ominaisuudet syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja EMT kaltainen solu allekirjoitusten PCA. Valikoiva poistaminen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja kääntämällä EMT fenotyyppi mesenkyymikasvaimia-epiteelikasvaimet Transition (MET) fenotyyppi käyttämällä uusia aineet olisivat käyttökelpoisia ehkäistäessä kasvaimen uusiutumisen etenkin poistamalla ne solut, jotka ovat ”Root Cause” kasvaimen kehityksen ja toistuminen.

Citation: Kong D, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Wang Z, Sethi S, et al. (2010) epiteelikasvaimet jotta mesenkymaalitransitioon Onko Mekanistisesti Liittyy Stem Cell allekirjoituksista eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10,1371 /journal.pone.0012445

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 06 elokuu 2010; Julkaistu: 27 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta National Cancer Institute, National Institutes of Health (NIH) (5R01CA083695-08 ja FHS) (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kehittyvät näyttöä viittaavat siihen, että suurin osa kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCA) voivat aiheutua syövän kantasoluja [1]. Syöpä kantasolut ovat soluja kasvain, joka on kapasiteettia itseuudistumisen ja kasvaimen aloittamista kapasiteettia, ja erilaistua heterogeenisen suvusta syöpäsolut käsittävät kasvain massa. Nämä kasvaimeen aloittamista solujen voisi tarjota säiliö soluja, jotka aiheuttavat kasvaimen uusiutumisen hoidon jälkeen. Wang et ai. ovat osoittaneet, että alkuperä PCa solujen on peräisin eriytetty luminaalisen epiteelin kantasolujen [2]. On kuitenkin suurempaan fenotyyppisten heterogeenisuus solujen PCA huolimatta erityisesti metastaasien. Etäpesäkkeitä sisältävät usein harvinaisia ​​solut, jotka ovat fenotyypiltään erilaistumaton [3], mikä viittaa siihen, että etäpesäkkeiden-aloitetaan solut voivat olla ainoastaan ​​solut, jotka ovat peräisin androgeenireseptorin-positiivisia onteloerityssolut. Vaikka alkuperä Eturauhassyövän soluja on täysin selvitetty, useat yhä enemmän todisteita viittaa siihen, että kasvaimeen aloittamista soluja tai syövän kantasolut on kriittinen rooli etenemisessä ja uusiutumisen PCa kastroida kestävä eturauhassyövän (CRPC) ja sen myöhemmissä etäpesäke.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että somaattisten solujen voidaan ohjelmoida osaksi alkion pluripotenttien kaltaisia ​​soluja koekspressoimalla pluripotenttisuuden kantasolujen markkereita, kuten Oct4, Sox2, Nanog ja Lin28 [4], [5], joka nostaa esiin mahdollisuuden, että yhdistetty ilmentyminen kantasolun liittyvien tekijöiden ja erityisen oncogenes voisi myös aiheuttaa eriyttämätön valtio syöpäsoluissa. Mielenkiintoista on, että solulinjat, jotka ovat peräisin ihmisen PCa näytteestä osoitti epiteelin fenotyyppi. Kuitenkin, kuolemattomaksi näiden solujen hTERT osoittivat ilmentymistä pluripotenttisuuden kantasolujen merkkiaineita, kuten Oct4, Nonag, ja Sox2 [6], jotka voivat liittyä sairauden etenemisen sillä yli-ilmentyminen Oct4, Sox2, Nanog ja c-myc on löydetty huonosti eriytetty kasvaimissa [7]. Jeter et ai. ovat osoittaneet, että knock-down of Nanog PCA soluissa merkittävästi vähentynyt pitkäaikainen klonogeeniset kasvua ja esti kasvaimen kasvua [8]. Oct4 on myös osoitettu olevan tärkeä rooli etenemistä PCa [9].

epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä prosessi morphogenesis alkionkehityksen aikana, mutta viime aikoina se on myös osallisena muuntaminen alkuvaiheessa kasvainten osaksi invasiivisia syöpäsairauksia [10]. Progression useimpien karsinoomien kohti maligniteetti liittyy menetys epiteelin erilaistumista ja kytkemällä kohti mesenkymaalisten fenotyyppi, johon liittyy lisääntynyt solun liikkuvuus ja invaasiota. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että EMT on kriittinen rooli, ei ainoastaan ​​kasvaimen etäpesäke, mutta myös kasvaimen uusiutumisen uskotaan olevan tiukasti sidoksissa biologia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja tai syövän aloittamista soluihin [11] – [13]. Kuitenkin mekanismit, joilla EMT solut tuottavat varsi kaltaisia ​​soluja on vielä selvittämättä. MikroRNA (miRNA) ovat nousemassa master sääntelyviranomaisten solujen erilaistumisen ja mukana hankinta EMT fenotyypin aikana syövän etenemistä [14]. Kaksi evoluution konservoitunut perheisiin miR-200 ja anna-7 on osoitettu säädellä erilaistumista prosessien kehityksen aikana. Mielenkiintoista on, että viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että miR-200 perheen ei ainoastaan ​​voisi säädellä prosessit EMT kohdistamalla E-box sitova proteiini ZEB1 ja ZEB2 [15], mutta liittyi myös varsi-tyyppisten solujen allekirjoituksia ekspressiota sääteleviä Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. Anna-7 perheen miRNA on osoitettu toimivan tuumorisuppressorina kohdistamalla Ras, suuren liikkuvuuden ryhmä A2 (HMGA2) ja c-myc, ja laski anna-7 ilmaisu on yhdistetty lisääntyneeseen tuumorigeenisyyteen ja huono potilaan ennustetta. Vielä tärkeämpää on, Anna-7 perheenjäsenet säännellä itseuudistumisen rintasyövän solujen [18], joka liittyy kantasolujen fenotyyppi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös dokumentoitu, että lin28B voisivat estää kertymistä kypsän let-7 [19], joka puolestaan ​​säätelee ”stemness” estämällä itseuudistumisen, solun ominaisuuksia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja liittyy kasvaimen uusiutumisen. Uusiutumisen PCa uskotaan vahvasti sidoksissa biologiaa eturauhassyövän kantasolujen tai syöpä-aloittamista solujen [11], [20], [21], kun taas yhä enemmän todisteita ovat osoittaneet, että soluja EMT aiheuttama eri tekijät ovat rikkaita lähde syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja [12], [13], [22], [23].

Näin ollen on tärkeää tunnistaa, mitkä tekijät voivat aiheuttaa EMT ja miten EMT solut voisi tulla resurssi syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, mikä edelleen korostaa mekanistinen merkitys tällaisten tekijöiden kohti kehittämään uusia ja kohdennettuja hoitoja CRPC. Tutkimukset ovat osoittaneet, että verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF), signalointi osallistuu EMT [24], [25]. Viime aikoina olemme ja muut ovat osoittaneet, että PDGF-D voi säädellä syöpäsoluinvaasiota ja angiogeneesin, mikä oli yhdenmukainen hankinta EMT fenotyypin [26] – [30]. Mielenkiintoista, lisääntynyt ilmentyminen PDGF-D on myös löydetty ihmisen PCa [31], mikä viittaa siihen, että PDGF-D voisi olla tärkeä rooli etenemistä ihmisen PCa myötävaikuttanut EMT-fenotyypin tai syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että PDGF-D yli-ilmentävien PC3-solut hankitaan EMT fenotyyppi ja yhteinen varsi-tyyppisten solujen ominaisuuksia ominaista lisääntynyt ilmentyminen kantasolujen markkereita, kuten Notch1, Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B, mikä oli yhdenmukainen tiiviimmän klonogeeniset, prostasphere muodostava kyky sekä lisääntynyt kasvainten muodostumiseen hiirissä. Samanaikaisesti löysimme ARCaP

M-solujen kanssa EMT fenotyyppi myös yhteinen kantasolujen kaltaisia ​​solu- allekirjoitusten ominaista lisääntynyt ilmentyminen transkriptiotekijän Notch1 ja parannettu klonogeeniset, prostasphere muodostava kyky verrattuna säätökennoja (ARCaP

E solut) epiteelin fenotyyppi. Nämä EMT-tyypin solujen osoitti myös vähentynyt ilmentyminen miR-200 tai anna-7, ja käänteinen EMT pakottamalla ilmentyminen miR-200 esti merkittävästi klonogeenisten ja prostasphere muodostava kyky, joka oli yhdenmukainen inhibition Notch1 ja Lin28B ilmaisun. Lisäksi knock-alas Lin28B selvästi lisääntynyt let-7 lauseke, mikä viittaa siihen, että miR-200 ja anna-7 voi toimia kohteena ehkäisemiseksi kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeiden PCA.

Tulokset

klonogeeninen kyky nostettiin PC3 PDGF-D ja ARCaP

M soluja, joilla on EMT fenotyyppi

tulokset Western blot-analyysi ja solujen morfologia sekä julkistetut tiedot ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen PDGF -D aiheuttama EMT fenotyypin PC3-soluissa [26], [28] (Fig. 1A), mikä vastasi korkeampi PDGF-D solulysaateista ja väliaine (CM) välillä PC3 PDGF-D soluissa verrattuna PC3 Neo solut (Fig. S1A ja S1B). ARCaP

M soluja, joilla mesenkymaaliset morfologia osoittivat lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten merkkiaineiden ja vähentynyt ilmentyminen epiteelisolujen markkereita verrattuna ARCaP

E solujen epiteelin fenotyyppi (Fig. 1 B). Sen määrittämiseksi, ovatko solut EMT fenotyyppi voisi olla kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet, suoritimme klonogeeniset määrityksessä. Huomasimme, että klonogeeniset kyky lisääntyi merkitsevästi PC3 PDGF-D soluissa verrattuna PC3 Neo-soluissa (kuvio. 1C, vasen paneeli). Kuva. 1C, oikea paneeli, ilmoitti lisäksi PC3 PDGF-D solut osoittivat 11-kertaiseen kasvuun pesäkemäärät suhteessa PC3 Neo soluihin. ARCaP

M solut näytetään myös lisääntynyt klonogeeniset kapasiteetti osoittaa 3-kertainen nousu pesäkemäärät verrattuna ARCaP

E soluja (Kuva. 1 D). Pehmeä agar määrityksessä, joka tunnetaan myös ankkurointi riippumattoman kasvun määrityksessä, suoritettiin. PC3 PDGF-D solut osoittivat dramaattisen kasvun klonogeeniset potentiaali verrattuna PC3 Neo soluihin (Fig. 1 E, vasen paneeli). Kuva. 1E, oikea paneeli, osoitti selvästi pesäkemäärät tuotetaan PC3 Neo ja PC3 PDGF-D solua mikroskooppinen kenttä (40 X). Nämä tulokset osoittivat kasvua klonogeeniset kyky EMT soluja.

(A) Valokuvia solujen osoitettiin: PC3 Neo soluilla pyöristetty epiteelisolujen muoto ja PC3 PDGF-D-solut osoittivat fibroblastisella-tyyppinen fenotyyppi (vasen paneeli , alkuperäinen suurennos, 200 X). Western blot-analyysi osoitti ilmentymistä transkription repressors liittyy EMT, ja mesenkymaalisten sekä epiteelin merkkiaineiden PC3 Neo ja PC3 PDGF-D-solut (oikea paneeli, kulku 10- 20). (B) Morfologia ARCaP

M ja ARCaP

E-solujen osoitettiin (vasen paneeli) .Western blot-analyysi osoitti, että lisääntynyt ZEB1, vimentiinistä ja Notch1 ilmaisun ja laski E-kadheriinin ilmentymisen ARCaP

M-solut verrattuna ARCaP

E (oikea paneeli). (C) ja (D) Valokuvia pesäkkeitä PC3 Neo ja PC3 PDGF-D tai ARCaP

M ja ARCaP

E näytettiin (vasen paneeli). Siirtomaa numerot laskettiin ja tulokset esitettiin suhteellisena pesäkemäärät PC3 Neo tai ARCaP

E suunniteltu 1 (oikea paneeli). (E) pesäkkeet kasvatetaan pehmeä agar valokuvattiin (vasen ruutu, baari, 200 m). Siirtomaa numerot laskettiin alle faasikontrastimikroskooppia. Tiedot esitettiin pesäkemäärät per kenttä (oikea paneeli). **, P 0,01 verrattuna Neo tai ARCaP

E soluja (N: PC3 Neo solut, D: PC3 PDGF-D solut, p10: passage 10, E-cad: E-kadheriinin).

kyky uusiutua lisääntyi EMT solut

edelleen selvittää solut EMT fenotyyppi voisi osoittaa kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet, testasimme palloja muodostavan (kutsutaan kuin prostasphere) kyky PC3 PDGF- D solut verrattuna PC3 Neo sekä ARCaP

M soluja verrattuna ARCaP

E soluja kasvatetaan suspensioviljelmissä, joka on

in vitro

mitta kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet. Olemme havainneet, että PC3 PDGF-D-soluja, osoittivat merkittävästi kasvanut kyky muodostaa prostaspheres suhteessa PC3 Neo-soluissa (kuvio. 2A ja 2B). Prostaspheres päässä PC3 Neo olivat alle 100 um, kun 6 päivää, kun taas 40% prostaspheres peräisin PC3 PDGF-D-soluja 100-200 um, 20% prostaspheres peräisin PC3 PDGF-D-solut olivat suurempia kuin 200 um (Fig. 2C). Jotta voitaisiin edelleen vahvistaa, onko prostaspheres jälkeläiset yksittäisten solujen sijaan aggregaattien useiden solujen prostaspheres (P1) kerättiin, ja solut maljattiin yksi solu per kuoppa 96-kuoppalevyllä ultra low kiinnitys. 12 päivän jälkeen, huomasimme, että yhdestä kahteen uutta prostaspheres kertyi yksittäisistä PC3 PDGF-D-solut, kun taas vain 20% yksittäisiä soluja PC3 Neo syntyy uusi prostaspheres (P2, Fig. 2D). ARCaP

M soluissa oli myös lisääntynyt prostasphere muodostava kapasiteetti (Fig. 2E ja 2F), mikä viittaa siihen, että solut EMT fenotyyppi ovat hankkineet kasvanut kyky uusiutua. Näiden tulosten perusteella, edelleen mekanistinen kokeet keskittyivät käyttäen PC3 PDGF-D solujen verrattuna PC3 Neo soluihin ja verrattiin ARCaP

M ja ARCaP

E soluja missä perusteltua.

(A) Prostaspheres alkaen PC3 Neo ja PC3 PDGF-D solut valokuvattiin ja esitetään (bar, 100 m). (B) numerot prostaspheres laskettiin mikroskoopilla. (C) Prostaspheres valokuvattiin ja koon prostaspheres halkaisijaltaan mitattiin käyttämällä ohjelmistoa kuva-analyysi ohjelmaa Scion Image. (D) prostaspheres (P1) kerättiin ja uudelleen maljattiin tiheydellä yksi solu per kuoppa 96-kuoppalevyllä ultra low kiinnitys. Sen jälkeen, kun 12 päivää inkuboinnin numerot prostaspheres (P2) laskettiin alla faasikontrastimikroskoopilla. (E) lukumäärät prostaspheres peräisin ARCaP

E ja ARCaP

M solut laskettiin mikroskoopilla. (F) Prostaspheres alkaen ARCaP

E ja ARCaP

M solut valokuvattiin ja esitetään (bar, 100 m). **, P 0,01 verrattuna Neo tai ARCaP

E soluja (Neo: PC3 Neo solut, PDGF-D: PC3 PDGF-D solut).

geeniekspressioprofilointi kantasolujen merkkiaineiden soluissa kanssa EMT fenotyyppi

Voit löytää säätelevien geenien ja ylläpitää kantasolujen fenotyyppi PC3 PDGF-D soluja, joilla on EMT allekirjoitusta, suoritimme microarray määrittää geeniekspressioprofilointi PC3 PDGF-D solujen verrattuna PC3 Neo solut. Huomasimme, että PC3 PDGF-D-solut osoittivat dramaattisia muutoksia geenien ilmentymisessä liittyy EMT fenotyyppiin (taulukko S1). Mielenkiintoista on, transkriptiotekijöiden Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B, joiden tiedetään olevan riittävän ohjelmoida hiiren tai ihmisen somaattisten solujen erilaistumaton, pluripotenttien kantasolujen, havaittiin merkittävästi lisääntynyt PC3 PDGF-D-soluja verrattuna PC3 Neo soluihin. Samanaikaisesti alavirtaan tavoitteet Näiden transkriptiotekijöiden kuten Zic2, Zic3, Sall2 ja Sall4 myös merkittävästi säädelty (taulukko S2). Edelleen vahvistavat tuloksia microarray geenin ilmentymisen analyysit, olemme tehneet reaaliaikainen RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi valituista geeneistä. Tulokset reaaliaikainen RT-PCR osoitti, 2 tuhatkertainen lisäys mRNA-tasojen näiden transkriptiotekijöiden ja niiden alavirran kohteiden PC3 PDGF-D-solut (Fig. 3A). Western blot-analyysi osoitti myös, että proteiini ilmaukset Sox2, Nanog, Stat3, Lin28B ja Oct4 olivat merkittävästi korkeammat PC3 PDGF-D soluissa verrattuna PC3 Neo solujen kulkua 10 läpikulun 20 (Fig. 3B).

(EN) geenien ilmentymistä mRNA tasot Oct4, Nanog, Sox perheen geenien ja Lin28B PC3 Neo ja PC3 PDGF-D solut määritettiin käyttämällä reaaliaikaista RT-PCR. (B) tulokset Western blot osoitti, että ilmaukset Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 ja Lin28B lisättiin merkittävästi PC3 PDGF-D soluissa. (C) Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA: n ilmentymisen TE, EZH2 ja Suz12a. Suhteellinen mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH. (D) tulokset Western blot osoitti, että ilmentyminen EZH2 oli merkittävästi lisääntynyt PC3 PDGF-D-soluissa. (E) mRNA tasot Notch signalointi tekijöitä PC3 Neo ja PC3 PDGF-D solut määritettiin käyttämällä reaaliaikaista RT-PCR. (F) tulokset Western blot osoitti, että ilmaukset Notch ja Notch ligandit lisättiin merkittävästi PC3 PDGF-D soluissa. GAPDH käytettiin Proteiinilisäyksen valvontaa. (N: PC3 Neo solut, D: PC3 PDGF-D solut, p10: passage 10).

Polycomb- ryhmän proteiinien tiedetään olevan osallisena säätelyssä geeni tukahduttamisen kautta kromatiinin muutoksia, mikä on välttämättömiä ylläpito alkion ja aikuisen kantasoluja [32], [33]. Polycomb- tukahduttavaa monimutkainen 2 (PRC2) sisältää Suz12, EZH2, TE ja RBAP alayksiköt ja toimintoja alkion ja aikuisen kantasoluja tukahduttamiseksi kehitykseen geenejä, jotka ensisijaisesti aktivoituvat erilaistumisen aikana. Lisäksi lisätutkimukset ovat osoittaneet, että PRC2 tavoite geenit ovat yhdessä käytössä kantasolu sääntelyviranomaisten kuten Oct4, Sox2 ja Nanog [34]. Aikana data-analyysi meidän microarray tietoja, huomasimme, että tasot EZH2 ja Suz12a mRNA nostettiin PC3 PDGF-D-soluja verrattuna PC3 Neo-soluja (taulukko S2), jotka vahvistettiin edelleen reaaliaikainen RT-PCR: llä (Fig. 3C). Lisäksi, proteiini tasot EZH2 oli merkittävästi säädellään ylöspäin PC3 PDGF-D-solujen suhteen PC3 Neo-soluissa (kuvio. 3D) ja nämä tulokset osoittavat selvästi, että EMT-tyypin ominaisuuksia PC3 PDGF-D-solut ovat sopusoinnussa allekirjoitukset kantasolujen tai syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

Notch signalointi on osoitettu olevan tärkeitä rooleja pluripotenttisuus ja kyky uusiutua sekä alkion ja aikuisen kantasoluja [35], [36]. Tulokset meidän microarray tiedot osoittivat, että mRNA tasot Notch, Notch ligandeja, delta-like, Jagged sekä Notch loppupään tavoitteita kuten Hes ja Hey olivat merkittävästi korkeammat PC3 PDGF-D solujen verrattuna PC3 Neo soluja (taulukko S2) . Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, 2-350-kertainen nousu mRNA-tasojen Notch signaloinnin geenien (kuvio. 3E), joka varmistettiin vielä Western blot -analyysillä, kuten on esitetty kuviossa. 3F. Samoin löysimme myös merkittävästi lisääntynyt taso Notch1 ilmaisun ARCaP

M soluja verrattuna ARCaP

E-soluissa (kuvio. 1 B, oikea paneeli).

MiR-200B ja miR-200c ilme sidoksissa syöpä kantasolujen allekirjoituksia EMT fenotyyppiin

Aiemmissa tutkimuksissa, löysimme merkittävä alas-säätely miR-200 perheen PC3 PDGF-D solujen EMT fenotyyppi [28], mikä vastasi meidän miRNA microarray data (Taulukko S3). Paljastaa, onko ilmaisuja miR-200 perhe liittyy kantasolujen allekirjoituksia, PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin miR-200a miR-200b ja miR-200c. Huomasimme, että transfektointi miR-200b ja miR-200C aiheuttama käänteinen EMT MET fenotyypin (Fig. 4A). Vielä tärkeämpää on, uudelleen ilmentäminen miR-200b ja miR-200C estivät merkittävästi prostasphere muodostava kyky PC3 PDGF-D-soluissa (kuvio. 4B). Lisäksi koko prostaspheres myös vähennetty PC3 PDGF-D transfektoitujen solujen miR-200B ja miR-200C verrattuna transfektiosta ohjaus miRNA (Fig. S2A ja S2B). Kuitenkin transfektio PC3 PDGF-D-solujen miR-200a ei ollut vaikutusta prostasphere muodostava kyky mutta kasvoi koko prostaspheres kontrolliin verrattuna (Fig. 4B, Fig. S2A ja Fig. S2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-200B ja miR-200C mutta ei miR-200a esti itsensä uusimisen PC3 PDGF-D soluissa ohjaamalla kohdegeenin ilmauksia miR-200b ja miR-200c. Näin ollen meidän arvioida ilmaus oletetun tavoitteet miR-200b ja miR-200c, kuten Notch1, Bmi1 ja lin28B PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin miR-200 perhe, koska miR-200b ja miR-200c on kolme tai yksi oletetun sitoutumiskohdat 3’UTR Lin28B, Bmi1 mRNA: ta (Fig. S3) ja Notch1 mRNA. MIR-200b ja miR-200c transfektion dramaattisesti vähentää ilmentymistä Notch1 ja lin28B, mutta ei vaikuttanut ekspressioon Bmi1 (Fig. 4C). Ilmentyminen ZEB1 havaittiin alassäädetty pakotetulla ilmentyminen miR-200b ja miR-200c (Fig. 4C), mikä oli sopusoinnussa käänteinen EMT fenotyypin (kuvio 4A). Olemme myös havainneet, että miR-200c ilmentymistä tukahdutettu ARCaP

M-soluissa verrattuna ARCaP

E-soluissa (kuvio. 4D). Lisäksi uudelleen ilmentäminen miR-200c ARCaP

M-solujen transfektiolla ennalta miR-200c esiasteiden lyhensi merkittävästi prostasphere muodostava kyky verrattuna transfektiosta ohjaus miRNA (Fig. 4E). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​alas-säätely Notch1 ilmaisun ja kääntyminen EMT fenotyypin kuin ominaista lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen ZEB1 sekä solujen morfologian muutokseen ARCaP

M transfektoitu ennalta miR-200c esiasteita (Fig. 4F ja Fig. 4G).

PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin pre-miR-200. 3 päivää transfektion jälkeen solut jaettiin ja transfektoitiin toistuvasti ennalta miR-200 joka 3-4 päivä 14 päivän ajan. (A) Valokuvia solut on esitetty: transfektio PC3 PDGF-D-solujen esi-miR-200 14 päivää, miR-200b ja miR-200c päinvastaiseksi EMT soluja MET solujen morfologia. (B) Soluja kerättiin sukupolven prostaspheres jälkeen 14 päivän transfektio ennalta miR-200. MiR-200B ja miR-200C vähensi prostaspheres. (C) Western blot, joka osoittaa, että Notch1, Lin28B ja ZEB1 ilmaisut olivat säädellä vähentävästi PC3 PDGF-D transfektoitujen solujen miR-200B ja miR-200c. (D) taso miR-200c merkittävästi vähentynyt ARCaP

M käyttämällä reaaliaikaista RT-PCR. (E) transfektio ennalta miR-200c 6 päivän jälkeen vähensi prostasphere muodostava kyky ARCaP

M-solut (Bar: 100 m). (F) Western blot osoitti, että uudelleen ilmentyminen miR-200c transfektoimalla ennalta miR-200c lisäsi E-kadheriinin ilmentymisen ja tukahdutettu ilmentyminen ZEB1 ja Notch1 in ARCaP

M-solut, jotka sopusoinnussa muutos mesenkymaaliset epiteelisolujen morfologian (G). *, P 0,05 verrattuna kontrolliin; **, P 0,01 verrattuna kontrolliin. (Con: ohjaus, 200a: pre-miR-200a, 200b: pre-miR-200b 200c: pre-miR-200c, E-cad: E-kadheriinin).

Down-regulation ja Notch1 by miR-200 on osittain vastuussa inhibition colonogenic ja prostasphere muodostava kyky PC3 PDGF-D-soluja

miR-200b ja miR-200c on yksi sitoutumiskohdat 3’UTR Notch1 (Fig. 5A). Sen määrittämiseksi, onko Notch1 on välittömänä kohteena miR-200b ja miR-200c, analysoitiin aktiivisuus 3 ’UTR: Notch1 PC3 Neo ja PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin 3’UTR Notch1 lusiferaasiplasmidin sekä PC3 PDGF -D-solut kotransfektoitiin 3’UTR Notch1 lusiferaasiplasmidin ja miR-200b tai miR-200c. Huomasimme, että aktiivisuus 3’UTR Notch1 lusiferaasin lisääntyi merkitsevästi PC3 PDGF-D soluissa verrattuna PC3 Neo solujen takia alhaisempi miR-200b ja miR-200c PC3 PDGF-D soluissa. Lisäksi uudelleen ilmentäminen miR-200b tai miR-200C vähentänyt dramaattisesti toimintaa 3’UTR Notch1 lusiferaasin PC3 PDGF-D-solut, kun taas uudelleen ilmentäminen miR-200a yhteen tukiasemaan siementen sekvenssin erilainen miR-200B ja miR-200C ei vaikuttanut toimintaan 3’UTR Notch1 lusiferaasin (Fig. 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-200B ja miR-200C säädellä Notch1 ilmentymistä sitoutumalla 3’UTR Notch1 mRNA. Sen määrittämiseksi, onko Notch1 tärkeä rooli ylläpitämisessä kantasoluja, käsittelimme PC3 PDGF-D solujen DAPT, joka on γ-sekretaasi, joka estää aktivointi Notch. Täyspitkä Notch1 on yleensä hyvin alhainen johtuen sen pilkkominen monien entsyymien näissä soluissa; Olemme kuitenkin havainneet, että ilmentyminen täyspitkän Notch1 oli hieman enemmän γ-sekretaasin käsitellyt solut. Olemme myös havainneet, että DAPT vähensi klonogeeniset kyky PC3 PDGF-D-soluissa (kuvio. 5C, ylempi paneeli), mikä oli yhdenmukainen Western blot tietoja, jotka osoittavat, että DAPT hoito esti aktiivinen muoto Notch1 (Fig. 5C, alempi paneeli). Lisäksi transfektoimalla Notch1 siRNA dramaattisesti tukahduttanut prostasphere muodostava kyky PC3 PDGF-D-soluissa (kuvio. 5D ja 5E), joka oli yhdenmukainen alas-säätely Notch1 proteiinin ilmentymisen (Fig. 5F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-200 välittämä säätely alaspäin Notch1 oli osittain vastuussa kyky uusiutua ja colonogenic kasvua EMT kaltaisia ​​soluja, joilla kantasolujen ominaisuuksia.

(A) Konservoituneisiin ennusti sitoutumiskohtia siemen sekvenssit miR-200b ja mir-200C 3’UTR on Notch1 mRNA. (B) MiR-200B ja miR-200C esti Notch1 3’UTR lusiferaasiaktiivisuus. **, P 0,01 verrattuna Neo kontrollisoluihin; #, P 0,01 verrattuna PDGF-D ohjaus soluissa. (C) DAPT hoitotulosten, γ-sekretaasi estäjä, vähensi klonogeeniset kyky PC3 PDGF-D soluja (ylempi kuva) .Western blot, joka osoittaa, että DAPT vähensi aktiivinen muoto Notch1 in annosriippuvaisesti (alempi kuva). (D) ja (E), joka osoittaa, että transfektio Notch1 siRNA jälkeen 9 päivää repressoi prostasphere muodostavan kapasiteetin PC3 PDGF-D-soluja (Bar: 100 um), joka on yhdenmukainen downregulation Notch1 ilmaisun (F). **, P 0,01 verrattuna kontrolliin. (Neo: PC3 Neo solut, PDGF-D: PC3 PDGF-D soluja, Con: ohjaus, 200a: pre-miR-200a, 200b: pre-miR-200b 200c: pre-miR-200c).

lin28B esti tuotannon let-7, säätelevä itseuudistumisen ohjaamalla ilmaus Sox2, Nanog ja Oct4

edellä esitetyt tulokset osoittivat, että miR-200B ja miR-200C esti lin28B ilme (Fig. 4C), jonka tiedetään sitoutuvan ensisijainen let-7 ja pre-anna-7 RNA: ta ja estää kertymistä kypsän let-7 miRNA [19]. Tulokset meidän miRNA microarray tiedot osoittivat, että kaikki jäsenet anna-7 perhe vähensi merkittävästi PC3 PDGF-D-solut (taulukko S3). Nämä tulokset vahvistettiin reaaliaikaisen RT-PCR-määrityksen (Fig. 6A). Knock-down of Lin28B siRNA voimakkaasti kasvanut kypsä let-7 ilmaisuja (Fig. 6B); viittaa lin28B säännelty kypsän let-7 ilmentymisen PC3 PDGF-D soluissa. On tunnettua, että let-7 perhe on kriittinen rooli säätelyssä itseuudistumisen alkion kantasolut ja rintasyövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja [18], [37]. Sen määrittämiseksi, onko let-7 voisi valvoa itse uusimisen PC3 PDGF-D soluja, suoritimme palloja muodostavan määrityksessä. Re-ilmentyminen valitun let-7 perhe kuten let-7a, let-7b, let-7d tai yhdistelmä antaa-7a, anna-7b ja anna -7d selvästi esti prostasphere muodostava ominaisuus (Fig. 6C ja 6D) ja samanaikaisesti pienentänyt prostaspheres (Fig. 6C, S4A ja S4b). Koska Lin28B estää kertymistä kypsän let-7 sitoutumalla esivuokrattu-7 RNA: ta ja siten estää käsittelyä ennen let-7 RNA, PC3 PDGF-D-solujen korkean tason Lin28B kotransfektoitiin ennalta kir- 7 ja Lin28B siRNA. Olemme havainneet, että prostasphere numerot solut ko-transfektoitiin pre-let-7 ja Lin28B siRNA olivat vähemmän kuin transfektion ennalta let-7 yksin (Fig. 6D); kuitenkin lukuun ottamatta anna-7d, ei ollut eroa prostasphere kooltaan ennalta let-7 yksin ja kotransfektioon ennalta let-7 ja Lin28B siRNA (Fig. 6C, S4A ja S4b). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​tietoja Western blot-analyysi osoittaa, että uudelleen ilmentymisen let-7 ehkäisi merkittävästi Sox2 ja Nanog ilmaisun PC3 PDGF-D transfektiolla ennalta let-7a, pre-let-7b tai yhteis- transfektio ennalta let-7a, pre-let-7b tai ennalta anna-7d kanssa Lin28B siRNA. Transfektio pre-let-7d yksin kykeni estämään ilmentymistä Lin28B ja Oct4 mutta oli marginaalinen vaikutus Sox2 ja Nanog ilmaisun (Fig. 6E).

(A) Tasot let-7 perheen PC3 Neo ja PC3 PDGF-D solut määritettiin käyttämällä reaaliaikaista RT-PCR. (B) Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään ilmentymisen let-7 PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin Lin28B siRNA varten 3 päivää. (C) mikrovalokuvia esittäen prostaspheres syntyvät PC3 PDGF-D transfektoitujen solujen esi-let-7 tai yhdistelmä ennalta let-7 ja Lin28B siRNA 14 päivän kuluttua transfektiosta (bar: 100 pm). (D) Solut kerättiin prostasphere muodostavien määrityksessä jälkeen 14 päivän transfektiota. Anna-7a, let-7b, anna-7d ja yhdistelmä Let-7a, let-7b, let-7d sekä kotransfektion let-7 ja Lin28B siRNA vähensi prostaspheres. (E) Tulokset Western blot osoitti ilmentymisen Lin28B, Sox2, Nanog, ja Oct4 PC3 PDGF-D-solut transfektoitiin pre-let-7 tai ko-transfektoitiin pre-let-7 ja Lin28B siRNA jälkeen 9 päivää transfektiota. *, P 0,05 verrattuna kontrolliin; **, P 0,01 verrattuna kontrolliin. (Con: ohjaus, joka on: pre-let-7a, Abd: yhdistelmä ennalta let-7a, pre-let-7a, pre-let-7d, al: yhdistelmä ennalta let-7a ja Lin28B siRNA, Lin28B- si: Lin28B siRNA, Neo: PC3 Neo solut, PDGF-D: PC3 PDGF-D solut).

Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B tarvittiin itseuudistumisen PC3 PDGF-D-solut

Olemme osoittaneet, että let-7 perheen säännelty itseuudistumiseen ja esti Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B ilmaisun PC3 PDGF-D solujen EMT fenotyyppi. Voidakseen arvioida mekanistinen yhteys näiden molekyylien (Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B) kanssa kyky uusiutua PC3 PDGF-D soluissa, me pudotti ilmaisua Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B siRNA transfektiolla käyttämällä Sox2 , Nanog, Oct4 ja Lin28B erityisiä siRNA. Huomasimme, että knock-alas Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B merkittävästi tukahdutettu prostasphere muodostava kyky (Fig. 7A). Lisäksi PC3 PDGF-D transfektoitujen solujen Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B siRNA osoitti merkittävästi lisääntynyt määrä prostaspheres pienemmissä (30-50 pm) verrattuna transfektoitu ohjaus siRNA samanaikainen vähentynyt määrä prostaspheres kanssa 50 pm halkaisijaltaan (Fig. 7B). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​proteiinin ilmentymisen tulokset esitetään kuviossa. 7C, mikä viittaa siihen, että Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B tarvitaan itseuudistumisen PC3 PDGF-D soluissa.

(A) Yksisolususpensiot PC3 PDGF-D transfektoitu Sox2, Nanog, Oct4 ja Lin28B siRNA ja inkuboitiin 24 h maljattiin ultra low tarttuva kuoppiin 6-kuoppalevylle 2000 solua /kuoppa. Jälkeen 3 päivää, numerot prostaspheres laskettiin mikroskoopilla. (C).