Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Useat jäsenet sinkkisormi proteiini perhe on hiljattain osoitettu olevan rooli syövän aloittamisen ja etenemiseen. Sinkki sormi proteiini 367 (

ZNF367

) kuuluu sinkkisormen proteiini perhe ja ilmaistaan ​​alkion tai sikiön erytroidisiin kudoksen mutta ei esiinny normaalissa aikuisen kudoksessa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Osoitamme, että

ZNF367

yliekspressoituu lisämunuaisen kuoren syöpä, pahanlaatuinen feokromosytooma /paragangliooma ja kilpirauhassyöpä verrattuna normaaliin kudokseen ja hyvänlaatuisia kasvaimia. Käyttäen sekä toiminnallisia Knockdown ja kohdunulkoinen yliekspressio useilla solulinjoilla, osoitamme, että

ZNF367

estää solujen lisääntymisen, invaasio, muuttoliike, ja tarttuvuus ekstrasellulaariproteiineista

in vitro

ja

in vivo

. Integroitu geeni ja microRNA ilmentymisen analyysit osoittivat käänteinen korrelaatio

ZNF367

ja miR-195 ilme. Lusiferaasimäärityksiä osoittivat, että miR-195 suoraan säätelee

ZNF367

ilmaisun ja että miR-195 säätelee solujen invaasiota. Lisäksi integriini alfa 3 (

ITGA3

) ilmentyminen säätelee

ZNF367

.

Johtopäätökset /merkitys

Meidän tulokset yhdessä viittaavat siihen, että

ZNF367

säätelee syövän etenemistä.

Citation: Jain M, Zhang L, Boufraqech M, Liu-Chittenden Y, Bussey K, Demeure MJ, et al. (2014)

ZNF367

Estää syövän eteneminen ja kuuluu osana miR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10,1371 /journal.pone.0101423

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 helmikuu 2014; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2014; Julkaistu: 21 heinäkuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee sisäiset tutkimusohjelman Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Jotkut yhteistyössä kirjoittajat ovat työsuhteessa kaupallinen yhtiö -SAIC Frederick INC, ei ole eturistiriitaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Tietomme biologinen tapahtumista, jotka estävät tai edistävät metastaattista leviämistä hormonaaliset syövät paikallisesti ja kaukaisiin kohtiin on rajoitettu [1]. Ymmärtäminen molekyyli- tapahtumiin osallisina syövän etenemisessä on merkittävä vaikutus tunnistaa tavoitteet terapeuttista hyötyä. Genominen, geneettiset ja epigeneettiset lähestymistapoja on käytetty muutosten tunnistamiseksi geeneissä /polkuja, transkriptiotekijöitä, tai geeni allekirjoitukset vertaamalla normaali, ensisijainen kasvaimia, ja /tai etäpesäkkeitä. Nämä analyysit eivät useinkaan erotettiin toisistaan ​​promoottorien, estäjiä tai matkustaja markkereita syövän taudin alkamisen ja etenemisen, ja harvoin määritellä erityinen mekanismi säädeltyyn geenin ilmentymisen.

Hormonaaliset syövät ovat kirjava joukko pahanlaatuisia kasvaimia, jotka näytteille koko kirjon biologisia käyttäytymisen pahanlaatuisia kasvaimia: veltto kasvu nopeasti etenevä syövät huono selviytymistä. Siten hormonaaliset syövät tarjoavat erinomaisen mallin tutkimiseen molekyylitason tekijöitä, jotka vaikuttavat syövän taudin alkamisen ja etenemisen. Tunnistaminen geneettisiä muutoksia Yhteistä näille monipuolisesti käyttäytyy hormonitoimintaa kasvaintyypeille on osoitettu olevan tärkeä rooli monissa eri ihmisen syövissä. Esimerkiksi

BRAF

mutaatiot ovat erittäin yleisiä kilpirauhassyöpä ja muiden syöpien, ja niihin liittyy enemmän aggressiivinen sairaus kilpirauhassyöpä [2], [3].

SDHB

mutaatiot alun perin tunnistettiin familiaalinen paragangliooma, mutta myöhemmin havaittiin olevan vallalla munuaisten syöpiin ja ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet, ja äskettäin aivolisäkkeen kasvaimet [2], [4], [5]. Siten löytää molekyylimuutokset liittyy hormonitoimintaa syöpään aloittamisen ja /tai eteneminen on todennäköisesti tärkeä rooli laajassa ryhmässä ihmisen syöpäsairauksia.

Tässä tutkimuksessa määritimme mekanismi geenien ilmentymisen sääntely ja toiminta on

ZNF367

eri hormonitoimintaa syövistä (papillaarinen kilpirauhassyöpä, lisämunuaiskuoren karsinooma, feokromosytooma /paragangliooma).

ZNF367

(tunnetaan myös nimellä

ZFF29

ja

CDC14B

) kuuluu sinkkisormen proteiini perhe, jossa on ainutlaatuinen Cys2His2 sinkki sormimotiivi, ilmaistaan ​​alkion tai sikiön erytroidaalisissa kudos, ja puuttuu muista normaalissa aikuisen kudoksessa [6], [7]. Viime aikoina useita sinkkisormen proteiinien on todettu väärin säädellystä syövän, toimimaan tuumorisuppressorien /promoottorit, ja aiheuttaa resistenssin kemoterapiaa [8] – [10]. Kuitenkin rooli

ZNF367

syövän ei ole tutkittu. Täällä me raportoimme että

ZNF367

yli-ilmennetään erilaisissa hormonitoimintaa syöpien ja että se estää

in vitro

ja

in vivo

kasvun, solujen invaasio, muuttoliike, ja tarttuvuus . Lisäksi

ZNF367

yliekspressio liittyy menetys miR-195 ilmaisua, joka välittömästi kohdistuu

ZNF367

. Lopuksi

ITGA3

on väheni

ZNF367

yliekspressio perustamisesta miR-195

ZNF367

–

ITGA3

akselilla, joka toimii estämään syövän etenemistä.

Methods

kudosnäytteitä ja eläinkokeissa

kudosnäytteitä hankittiin koskevasta Institutional Review Board-hyväksytty kliininen protokolla saatuaan kirjallinen lupa (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01005654) . Kudos kerättiin aikaan leikkauksen, ja ne välittömästi jäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Sadan ja viisi ihmisen lisämunuaiskuoreen (19 normaali lisämunuaisen kuorikerroksen, 79 aivokuoren adenoomia, 7 lisämunuaiskuoren karsinoomien), 47 kilpirauhaskudokseen (8 normaali, 39 papillaarinen kilpirauhassyöpä), ja 68 (19 normaali lisämunuaisytimessä, 28 hyvänlaatuinen, 21 pahanlaatuisia feokromosytooma /paragangliooma) kudosnäytteet käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki Diagnoosi vahvistettiin hormonitoimintaa patologi, ja kasvain näytteet varmistettiin sisältävän ≥ 80% kasvainsoluja /ytimeksi. Diagnoosi lisämunuaiskuoren syöpä ja pahanlaatuiset pheochromocytoma /paragangliooma perustui läsnäolosta brutto paikallisen invaasion ja /tai kaukana etäpesäke ja Weiss pisteet 3. lisämunuaiskuoren syöpä. Normaali lisämunuaisen kuoren ja ydin kerättiin terveiltä elinluovuttajat laserilla capture mikrodissektion alle Institutional Review Board-hyväksytty protokolla. Kaksi julkisesti saatavilla aineistoja genominlaajuisten geenin ilmentymisen analyysi lisämunuaiskuoren kasvainnäytteet käytettiin arvioimaan

ZNF367

mRNA-ekspressiota (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 ja https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).

The National Cancer Institute animal Care ja Käytä hyväksyi pöytäkirjojen eläinten hoito ja käsittely esillä tutkimus. Jokainen hiiri kokee merkittävästi poikkeava neurologisia oireita, verenvuoto kuristimia, heikentynyt liikkuvuus, nopea painon lasku, heikentäviä ripuli, karkea turkki, kyyryssä asento, hengitys työlästä, uneliaisuus, jatkuva recumbence, keltaisuus, anemia, itseaiheutettu trauma, tulee kuolemaisillaan tai muuten ei kykene saamaan ruokaa tai vettä, tai kasvain 2 cm tai enemmän halkaisijaltaan on heti eutanasia CO

2 kammiossa.

Solulinjat, soluviljelmässä reagenssit, siRNA, ja asennuspalveli- 195 transfektio

SW13 lisämunuaiskuoren karsinooma solulinja (ATCC, Rockville, MD) kasvatettiin ja ylläpidettiin DMEM täydennetty 1% insuliinin transferriiniä seleeniä (ITS, BD Biosciences, San Jose, CA) ja 2,5% Nu -Serum I (BD Biosciences) on vakio kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. BD140A lisämunuaiskuoren karsinooma solulinjaa toimitti ystävällisesti Dr. Kimberly Bussey (TGen, Pheonix, Arizona), ja se oli viljeltiin RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja 1 % L-glutamaattia. Ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän (TPC-1) solulinjaa ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty FBS: llä, penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), fungitsonia (250 ng /ml), TSH (10 IU /L ), ja insuliinia (10 ug /ml). Ihmisen alkion munuaissolut (HEK293-solut) pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% Pen-strep (Gibco, Grand Island, NY), ja 1% L-glutamaattia (Gibco). Kaikki solulinjat todennettu lyhyen tandem repeat profilointi 14. lokakuuta 2012.

ZNF367 siRNA: t (s46962, s46963) ja negatiivinen kontrolli siRNA (AM4613) käytettiin lopullisena pitoisuutena 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, CA). Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), käytettiin transfektion siRNA: iden. Kypsä miRNA esiaste, pre-miR-195, ja satunnainen järjestys pre-miR-negatiivinen kontrolli (Applied Biosystems), 5 nM transfektoitiin SW13-soluihin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sillä

ZNF367

yliekspressio HEK293-soluissa, soluja (8 x 10

5 kussakin 6 kaivo) transfektoitiin

ZNF367

cDNA rakentaa tai tyhjän vektorin (Origene, Rockville, MD ) käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssin (Invitrogen).

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosleikkeet de-paraffinized ja sitten nesteytyksestä käyttämällä ksyleeniä ja etanolia. Antigeeni haku on suoritettu käyttäen 10% sitraattipuskuria, pH 6,0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) painekattilassa 120 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Kudosleikkeet inkuboitiin 6% vetyperoksidia sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus 30 minuuttia (Dako, Carpinteria, CA), jota seurasi inkubointi seerumin tunnin ajan (Dako, Carpinteria, CA). Ensisijainen anti-ZNF367 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma, St. Louis, MO; HPA015785) 5 ug /ml laimennosta käytettiin yön yli 4 ° C: ssa. Anti-kani sekundääristä vasta-ainetta käytettiin (Dako Envision anti-kani, Carpinteria, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Osiot kehitettiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä DAB kuin (DAKO, Carpinteria, CA), ja ne vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Leikkeet dehydratoitiin ja asentaa vectamount kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Immunovärjäyksen of ZNF367 arvioitiin valomikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani), ja kuvat skannattiin 20X suurennus.

RNA: n valmistaminen käänteistranskriptio, ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia, mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Kokonais-RNA (200-500 ng) käänteiskopiointiin käyttäen High Capacity Käänteinen transkriptio cDNA kit, ja cDNA monistettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR-alukkeiden ja koettimien

ZNF367

(Hs00400665_m1),

ITGA3

(Hs01076873_m1), ja

GAPDH

(Hs_99999905_m1) saatiin Applied Biosystems.

Western blot

Lysaatit valmistettiin 1% SDS ja 10 mM Tris [pH 7,5] puskuri, ja Western blot suoritettiin 10% SDS-PAGE-geelissä. Ensisijainen kanin polyklonaalisia vasta-aineita, anti-ZNF367 (HPA015785, Sigma, MO) ja anti-ITGA3 (Sigma; SAB1100194) käytettiin 5 ug /ml ja 2 ug /ml, vastaavasti, ja anti-GAPDH (sc-32233; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) käytettiin 1:1,000 laimennus. Toissijainen anti-kani-vasta-ainetta käytettiin 1:5,000 laimennuksen (Cell Signaling, Danvers, MA).

Solujen lisääntyminen

Solut ympättiin konsentraatiolla 2000-solujen 96-kuoppaiselle levylle kuudessa rinnakkaisnäytettä. CyQuant ™ määritys (Invitrogen) käytettiin arvioimaan solujen määrä, mukaan valmistajan ohjeiden.

klonogeeninen määritys

HEK293-soluja (8 x 10

5) transfektoitiin tyhjän vektorin tai

ZNF367

rakentaa. 24 tunnin kuluttua solut trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen tiedotusvälineissä, ja laskettiin. Solut uudelleen siirrostettiin 6-kuoppaisiin levyihin 250, 500, ja 1000-soluihin. 10 päivän jälkeen, väliaine poistettiin kuopista ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Pesäkkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja värjättiin 2 ml kristalliviolettia 60 minuuttia ravistelutasolla. Levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä ja kuivattiin ilmassa, ja pesäkkeet valokuvattiin FluorChem Imager (San Jose, CA).

Solun invaasio ja migraatiokokeessa

Cellular hyökkäyksen ja muuttoliike arvioitiin käyttämällä BD BioCoat matrigeelin Invasion jaosto (BD Biosciences) mukaan valmistajan protokollaa. 1 x 10

5-solut ympättiin insertit (8-uM huokosia kokoinen polykarbonaatti kalvot) kanssa ja ilman ohut kerros matrigeelin tyvikalvon Matrix (BD Biosciences) turkki. Insertit pantiin pohjalle kuoppiin, 10% seerumia sisältävää kasvualustaa kemoattraktantti. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa. Solut, jotka tunkeutuneet matrigeelin matriisi tai jotka muuttivat huokosten läpi ilman matrigeelin matriisi alapintaan kalvon kiinnitettiin ja värjättiin Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ) ja laskettiin valomikroskoopilla neljässä eri aloilla Image J ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD).

Soluadheesioanalyysi

SW13-solut transfektoitiin

ZNF367

siRNA ja negatiivisen kontrollin. 120 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut trypsinoitiin, ja 1 x 10

5 solua maljattiin 48-kuoppaiselle levylle, joka sisältää viisi adheesiomolekyylien (fibronektiinin, Kollageeni I, kollageeni IV, laminiini I, ja fibrinogeeni), ja inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa 90 minuutin ajan mukaan valmistajan ohjeiden (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Kuopat pestiin kahdesti PBS: llä, ja 200 ui värjäys lisättiin ja inkuboitiin 10 minuuttia. Kuopat pestiin kahdesti deionisoidulla vedellä. Kuopat ilmakuivattiin, ja 200 ui uuttoliuoksen lisättiin ja inkuboitiin 10 minuuttia. Yhteensä 150 ui siirrettiin kustakin uutetaan näytteestä 96-kuoppalevylle, ja absorbanssi mitataan 560 nm: ssä SpectraMax M5e mikrolevylukijalla (Sunnyvale, CA).

Genominlaajuiset mRNA: n ekspression microarray

SW13-solut transfektoitiin

ZNF367

siRNA ja negatiivisen kontrollin kolmena kappaleena. Transfektion jälkeen kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) sarja, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA Käänteistransskription synteesi, vahvistus, pirstoutuminen, ja terminaali merkintöjä 150 ng kokonais-RNA: ta suoritettiin käyttäen GeneChip- WT Sense Target merkintöjen ja valvonnan reagenssit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Yhteensä 25 ng /ul: n cDNA hybridisoitui Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. Pathway analyysi suoritettiin käyttäen DAVID bioinformatiikan resurssit (https://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).

In silico

tunnistaminen mikroRNA kohdistaminen ZNF367

MiR tietokantoja (Target Scan (https://www.targetscan.org) ja mirDB (https://mirdb.org/miRDB/) käytettiin tunnistamaan microRNA, jotka voivat kohdistaa

ZNF367

. Candidate MikroRNA ennustettu kohdistaa

ZNF367

analysoitiin sitten sen määrittämiseksi, jos ne ilmentyvät differentiaalisesti lisämunuaiskuoren carcioma ja papillaarinen kilpirauhassyövän.

lusiferaasianalyysissä

Wild-type

ZNF367

3’UTR kloonattiin GoClone konstruktiin (kytkinlaitteet Genomics, Menlo Park, CA). mutantti konstrukti

ZNF367

3’UTR saatiin tuomalla mutaatio kolme ensimmäistä nukleotidia siementen alueen (143-150, GCTGCTA – CGAGCTA) mir-195. Villityypin

ZNF367

3’UTR tai mutantti

ZNF367

3’UTR ja tyhjän 3’UTR vektorin pre- miR-195 tai pre-NC oli transfektoida SW13 soluihin (kytkentälaitteet Genomics). Normalisoituminen menetelmä transfektion tehokkuutta lusiferaasireportterista määritys mukaan suosituksen kojeiston Genomics (Menlo Park, CA) tyhjällä vektorilla käytettiin positiivisena kontrollina transfektion. Tyhjät 3’UTR vektori sisältää konstitutiivisen promoottorin (löytyy kaikista UTR rakentaa) ja lusiferaasigeeniä (RenSP). Tämä rakenne toimi positiivisena kontrollina transfektion. Solut maljattiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin yhdessä 5 nM miR-195 tai negatiivinen kontrolli (Applied Biosystems), 0,12 gg vektoria (kytkentälaite Genomics), ja 0,75 ui Lipofectamine (Invitrogen). Luminesenssi luettiin 24 tunnin kuluttua kanssa valokytkin koejärjestelmässä käyttäen SpectraMax M5e mikrolevylukijalla.

In vivo

ksenografti määritys

Kateenkorvattomia nude naarashiirillä (viidestä kuusi viikkoa vanha, kehon paino: 20-22 g) saatiin Frederick National Laboratory for Cancer Research eläinten tilat (Frederick, MD). 48 tunnin jälkeen transfektion kanssa

ZNF367

siRNA ja negatiivinen kontrolli, kolme miljoonaa solua suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan DMEM: ää ja Matrigel (01:01), ja ne injektoitiin kylkeen kateenkorvattomiin nude-hiiriin .

Tilastolliset analyysit

Jatkuva data esitetään keskiarvo ± keskihajonta (SD) tai keskivirhettä (SEM). Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertaamaan nonparametric tietojen kolme tai useampia ryhmiä. Studentin t-testiä tai Mann-Whitney-testiä käytettiin vertaamaan eroja kahden ryhmän välillä parametristen ja nonparametric muuttujia, vastaavasti. Pearsonin korrelaatiota testiä käytettiin tunnistamaan korrelaatiot kahden ryhmän välillä.

p

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttäen Graph Pad Prism 5.0 tilastollisia ohjelmistoja.

Tulokset

ZNF367

yliekspressoituu syövän

ZNF367

sanoen yliekspressoitiin lisämunuaiskuoren karsinooma, papillaarinen kilpirauhassyöpä, ja pahanlaatuinen feokromosytooma /paragangliooma, verrattuna hyvänlaatuisia ja normaalin kudosnäytteiden kunkin kasvaimen tyyppi (p 0,05; kuvio 1). ZNF367 proteiinin ilmentyminen oli läsnä tumassa ja sytoplasmassa. Siellä oli vahvempi ZNF367 värjäytymistä tumassa kuin sytoplasmassa kussakin syövän näytteessä (lisämunuaisen kuoren syöpä, papillaarinen kilpirauhassyövän ja pahanlaatuinen feokromosytooma /paragangliooma). Vahvista kohonnut ilmentyminen

ZNF367

in lisämunuaiskuoren karsinooman suurempi näyte joukko, analysoimme ilmaisun profilointi tietoja julkisesti saatavilla aineistot talletetaan geenien ilmentyminen omnibus. Kahdessa riippumatonta genominlaajuisten geenien ilmentyminen aineistoja,

ZNF367

yliekspressoitiin lisämunuaiskuoren karsinooma verrattuna lisämunuaiskuoren adenooman ja normaali kudosnäytteistä (p 0,001; Kuva S1). Nämä havainnot viittaavat siihen, että

ZNF367

yli-ilmennetään erilaisia ​​syöpiä, joissa yhdenmukaisia ​​tuloksia eri analyysin ja genomista alustoja käytetään.

(A ja B) Expression taso normaalissa lisämunuaisen kuoren, hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren adenoomien ja lisämunuaiskuoren karsinoomien; (C ja D) normaali lisämunuaisytimessä, hyvän- ja pahanlaatuiset pheochromocytoma /paragangliooma kudosnäytteiden; ja (E ja F) normaali kilpirauhasen ja papillaarinen kilpirauhassyövän kudosnäytteitä. Y-akselin kummallakin kuvaaja prosenttiosuutta mRNA ilmaisun käyttäen 2

∧-ACt * 100% menetelmä ± SEM. * P 0,05, ** p 0,001, *** p 0,001 (Kruskal-Wallisin testi). Edustavia immunohistokemia kuvat ovat normaalista, hyvänlaatuinen, ja pahanlaatuinen kasvain näytteitä 20X suurennus.

ZNF367

estää solujen lisääntymisen, invaasio, muuttoliike, ja tarttuvuus

Koska

ZNF367

yliekspressoituu hormonitoimintaa syöpä, tutkimme sen vaikutus solujen lisääntymisen, invaasio, ja muuttoliike, tapahtumia, jotka ovat välttämättömiä syövän etenemisen.

ZNF367

ilmaistiin lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (SW13, BD140A), papillaarinen kilpirauhassyövän (TPC-1), ja HEK293 solulinjat. Siten käytimme molemmat

ZNF367

Knockdown ja yli-ilmentyminen lähestymistapoja määrittää vaikutus

ZNF367

soluproliferaation, invaasio, ja muuttoliike. SiRNA Knockdown saavuttaa jopa 80% knockdovvn ZNF367 mRNA ja proteiinin ilmentyminen verrattuna siRNA negatiiviseen kontrolliin (kuvio S2).

ZNF367

Knockdown vuonna SW13 soluissa, lisääntynyt solujen lisääntymistä (30-40% )

in vitro

ja (3,5-kertainen)

in vivo

(p 0,05; kuva 2).

ZNF367

Knockdown lisääntynyt solujen invaasiota ja muuttoliike (p 0,05, kuvio 3A). Koska dramaattinen vaikutus

ZNF367

solu- invaasion ja muuttoliike SW13 soluissa, vaikutus

ZNF367

Knockdown solu- invaasion ja muuttoliike arvioitiin myös BD140A, TPC-1, ja HEK293 solujen linjat. Knockdown oli samanlainen vaikutus solujen invaasio ja kulkeutumista BD140A, TPC-1, ja HEK293 solulinjoja (p 0,05, kuvio 3, B-D). Vaikutus

ZNF367

solujen kasvuun, invaasio, ja muuttoliike vahvisti myös yli-ilmentävät

ZNF367

HEK293-soluissa.

ZNF367

yliekspressio vähentynyt solujen invaasiota, muuttoliike, ja pesäkkeiden muodostumista verrattuna tyhjän vektorin ohjaus (kuvio 3E-G).

(A)

ZNF367

pudotus kasvaa solujen lisääntymistä . Y-akseli edustaa suhteellista loisteputki (RFU), ja X-akseli osoittaa päiviä transfektion jälkeen. * P 0,05 verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Virhe palkit kuvaavat ± SD. (B)

ZNF367

Knockdown parantaa kasvaimen kasvua in vivo. SW13-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin (n = 4) ja siRNA (n = 4) oikeaan ja vasempaan kylkeen kunkin hiiren. 48 tunnin kuluttua transfektion, 3 x 10

6 solua injektoitiin kateenkorvattomissa nude-hiirissä, ja kasvaimen kasvua mitattiin viikoittain. Y-akselilla on tuumorin tilavuus ja X-akseli viikot kasvaimen mittauksen jälkeen kylki injektion. * P 0,05 ja virhepalkit edustavat ± SD.

ZNF367

yliekspressio vähentää solujen invaasiota ja muuttoliike. (A) SW13, (B) BD104A, (C) TPC-1, ja (D) HEK293-solu- linjat. Transfektion jälkeen solut maljattiin sisällä Boyden kammion 48 tuntia. Solut värjättiin ja laskettiin 4 aloilla. Vasemmassa paneelissa esittää edustavat kuvan (12,5x) päässä siRNA knockdown ja negatiivisen kontrolliryhmiin. Oikeassa paneelissa ilmaisee määrän mittaamiseen hyökkäsi ja siirtynyt solujen Knockdown ja negatiivisen kontrollin. * P 0,05 ja virhepalkkeja osoittavat ± SD.

ZNF367

yliekspressio pienenee pesäkeluvussa, solu invaasio, ja muuttoliike HEK293-soluissa. (E) Western blot on

ZNF367

yliekspressio HEK293 ja SW13 soluja (tyhjä vektori, XL4). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (F) edustaja klonogeeniset kuva solujen ektooppiseen

ZNF367

ilmaisun ja sen vastaava valvonta (Tyhjä vektori, XL4). (G) Cellular hyökkäyksen ja muuttoliike väheni

ZNF367

yliekspressio HEK293-soluissa. Määrän mittaamiseen hyökkäsi ja muuttivat solua per ryhmä (HEK293-HEK293-Tyhjä vektori tai

ZNF367

) on edustettuna pylväskaavio oikealla paneelissa. (H) solunulkoiset proteiini kiinnitys SW13 solujen

ZNF367

knockdown. Solut transfektoitiin

ZNF367

siRNA ja negatiivinen kontrolli siRNA, ja maljattiin tarttuvuuden levyille ja inkuboitiin 90 minuuttia. Y-akseli edustaa absorbanssin 540 nM solujen kiinnittynyt kuhunkin proteiiniin. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. * P 0,05, *** p 0,001.

Koska soluinvaasion ja muuttoliike vaativat solujen adheesio solunulkoiseen matriksiin, arvioimme vaikutus

ZNF367

pudotus on soluadheesiota soluväliaineen proteiineihin. Löysimme lisääntynyt soluadheesiota, jossa

ZNF367

Knockdown, jotta Laminin I (kahdesta kolmeen kertaa korkea) ja fibrinogeeni (kolme-kuusi kertainen korkea) (p 0,05; kuvio 3H). Näiden proteiinien tiedetään toimivan parantaa solujen kiinnityksen tyvikalvon tai solun ulkopuolisen matriisin läpi integriinireseptorien, jotka mahdollistavat syöpäsolujen adheesion ja siirtoa.

ZNF367

säätelee ITGA3 ilmaisu

Olimme kiinnostuneita tunnistamaan geeni (t) ja polku (t) säätelee

ZNF367

, kun otetaan huomioon vaikutus

ZNF367

cellular invaasio, muuttoliike, ja tarttuvuus, ja koska se on transkriptiotekijä ennustetaan säädellä geeniekspressiota. Käyttämällä genominlaajuisten mRNA ilmentymisen analyysi transfektoiduissa soluissa

ZNF367

ja negatiivisen kontrollin siRNA tunnistimme kaksi kandidaattigeenit (

ITGA3,

serpin peptidaasi estäjä, alatyypin B (ovalbumiini), jäsen 9 [ ,,,0],

SERPINB9

]) mahdollisesti säätelevät

ZNF367

perustuu soveltamalla useita suodattimen kriteereitä (FDR 0,25, fold-muutos 1,5, yhteinen kaikille siRNA knockdown, ja vahva korrelaatio ilmentyminen ihmisen kasvainten näytteet) (kuvio S3).

ITGA3

valittiin lupaava ehdokas jatkotutkimuksiin, koska sillä on merkittävä rooli soluadheesion ja hyökkäyksen ja validoitiin voimistuvan jopa 2,5-kertaisesti

ZNF367

taintumisen (p 0,05; kuvio 4A) [11]. Lisäksi ITGA3 mRNA: n ekspressio oli korreloi käänteisesti ZNF367 mRNA: n ekspression ihmisen lisämunuaisen kuorikerroksen kasvainnäytteissä (r = – 0,37, p = 0,015; kuvio 4B). ITGA3 proteiinin ilmentyminen lisääntyi myös siRNA pudotus on

ZNF367

(kuvio 4C). Toisaalta, yliekspressio

ZNF367

alennetaan

ITGA3

ilmentymisen verrattuna tyhjän vektorin (kuvio 4D-E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että

ZNF367

säätelee soluadheesiota, invaasio, ja muuttoliike kautta vaikutus, ainakin osittain,

ITGA3

ilme.

(A)

ZNF367

knockdown ylössäätelee

ITGA3

ilmentymistä SW13 soluissa. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. (B) välinen korrelaatio

ITGA3

ja

ZNF367

mRNA: n ekspression lisämunuaisen kuorikerroksen kasvain näytteissä. X ja Y akselit esittävät log 2-muunnettuja arvoja. (C) Western blot määrällistä ITGA3 proteiinin ilmentymisen kanssa

ZNF367

knockdown. (D-E) ITGA3 lausekkeen ZNF367 yli-ilmentymisen. Virhe palkit kuvaavat ± SEM.

MiR-195 suoraan suunnattu

ZNF367

ja säätelee solujen invaasio

Ymmärtää mekanismia, jolla

ZNF367

ilmentyminen on väärin säädellystä syövän, me arveltu, että MikroRNA voivat olla vastuussa

ZNF367

yli-ilmentymisen. Kartoittaakseen MikroRNA jotka voivat kohdistaa

ZNF367

, me kysyi Target scan ja miRDB tietokantoja MikroRNA ennustettu kohdistaa

ZNF367

. Yhteensä 3 ulos 14 MikroRNA ennusti kohdistaa

ZNF367,

havaittiin ilmentyä erilailla lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (taulukko S1). Kuitenkin vain miR-195 oli merkittävästi korreloi käänteisesti

ZNF367

lauseke (r = -0,44, kuvio 5A).

(A) välinen korrelaatio miR-195 ja

ZNF367

ilmaus käytettäessä lisämunuaiskuoren kasvain. Pearsonin korrelaatiokerroin on merkitty r sen p-arvo. (B) Kohdunulkoinen yliekspressio ennalta miR-195 johtaa downregulation on

ZNF367

.

ZNF367

mRNA: n ekspression SW13 transfektoiduissa soluissa pre-miR-195 ja pre-negatiivinen kontrolli 5 nM: ssa 24 tuntia (esitetään kertamuutosta suhteessa ennalta negatiivinen kontrolli). Virhe palkit kuvaavat ± SEM. Oikea paneeli esittää Western blot ZNF367 proteiinin SW13 transfektoitujen solujen esi-miR-195 ja negatiivisen kontrollin. (C) Pre-miR-195 yliekspressio kasvaa hyökkäyksen SW13 soluissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Oikeassa paneelissa näkyy keskimääräinen lukumäärä hyökkäsi solujen Y-akselilla. (D)

ITGA3

mRNA ilmentyminen lisääntyy transfektion jälkeen miR-195 ja negatiivinen kontrolli on SW13 soluissa. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. (E) sitoutumiskohdan miR-195

ZNF367

3’UTR yhdessä mutantti rakentaa vuonna ennustettu siemenen alueelle. Oikeassa paneelissa, lusiferaasi määritys osoittaa laski luminesenssi SW13 soluissa kotransfektoitiin miR-195 ja negatiivisen kontrollin 5 nM, tyhjällä vektorilla, villityypin

ZNF367

3’UTR tai MUT –

ZNF367

3’UTR vektori (mutatoitu ensimmäisen kolmen nukleotidin siementen sekvenssi). Luminesenssi luettiin 24 tunnin kuluttua transfektion jälkeen. Y-akseli edustaa suhde

ZNF367

3’UTR tyhjän vektorin. * P-arvo 0,05 verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Virhepalkit edustavat ± SEM.

Sen tutkimiseksi, mikäli miR-195 säätelee

ZNF367

ilmaisu, solut transfektoitiin pre-miR-195 ja pre-negatiivinen kontrolli (pre-NC) , joka oli vähentynyt

ZNF367

mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 5B). Lisäksi yli-ilmentyminen miR-195 oli kohonnut

ITGA3

mRNA: n ilmentymisen (kaksi-kertainen) ja solujen invaasio verrattuna negatiiviseen kontrolliin (p 0,05; kuvio 5, C-D). Sen vahvistamiseksi, että

ZNF367

on välittömänä kohteena miR-195, suoritimme Lusiferaasimäärityksiä onko miR-195 sitoutuu 3’UTR

ZNF367

mRNA. Havaitsimme merkittävän vähentää lusiferaasiaktiivisuus miR-195 yliekspressio villityypin 3’UTR verrattuna negatiiviseen kontrolliin ja mutatoitu

ZNF367

3’UTR-transfektoiduissa soluissa (p 0,01, kuvio 5E). Siten nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-195 säätelee negatiivisesti ilmaus

ZNF367

suoraan kohdentamalla sen 3’UTR, mikä laski solujen invaasiota, dramaattisin vaikutus

ZNF367

että havaitsimme meidän toiminnallinen tutkimuksissa.

keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus luonnehtia toiminta

ZNF367

syövissä. Olemme havainneet, että

ZNF367

oli yli-ilmentynyt eri hormonaalisten syöpien (lisämunuaisen kuoren karsinooma, papillaarinen kilpirauhassyöpä, pahanlaatuinen feokromosytooma /paragangliooma) verrattuna hyvänlaatuisia ja tai normaalin kudoksen näytteissä. Toiminnallinen

in vitro

ja

in vivo

Knockdown ja yli-ilmentyminen tutkimukset osoittivat, että

ZNF367

säätelee solujen lisääntymistä, invaasiota, muuttoliike, ja pito. Käytimme genominlaajuisten geeniekspressioanalyysissä tunnistamiseksi kandidaattigeenejä joita säännellään

ZNF367

, ja tunnistimme

ITAG3

kuin geenin, joka todennäköisesti välittää vaikutus

ZNF367

on soluadheesiota, invaasio, ja muuttoliike. Lisäksi, in silico analyysi ihmisen kasvaimen näytteen genominlaajuisten geenin ilmentymisen analyysi osoitti, käänteinen suhde

ZNF367

ja

ITAG3

ilmaisua. Lopuksi osoitamme, että väärin säädellystä

ZNF367

ilmentyminen liittyi menetys miR-195 ilmentyminen Tuumorinäytteissä ja että tämä microRNA suoraan suunnattu

ZNF367

ja säätelee solujen invaasio, joka tarjoaa ymmärrystä mekanismi väärin säädellystä

ZNF367

ilme. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että on olemassa miR-195

ZNF367-ITAG3

akseli, joka säätelee hormonitoimintaa syövän etenemisessä.

Tämä on ensimmäinen tutkimus, luonnehtia ilmentymistä ja toimintaa

ZNF367

syövässä.

ZNF367

knockout hiirillä ei ole todettu merkittäviä poikkeavuuksia [12].