Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli valaista kliinistä merkitystä anaplastinen lymfooma kinaasin (

ALK

) uudelleenjärjestelystä valittu kehittynyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) , vertaamaan soveltaminen eri ALK havaitsemismenetelmiä, ja erityisesti arvioida mahdollista yhteyttä välillä ALK ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin in crizotinib saaneilla potilailla.

Methods

ALK tila arvioitiin loisteputki

in situ

-hybridisaatio (FISH), immunohistokemia (IHC) ja kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) in 173 valittu kehittynyt pienisoluista keuhkosyöpää. Ennusteeseen viittaavia tietoja, genotyyppi tila ja selviytymisen tulokset analysoitiin. Lisäksi yhdistys ALK ilmaisun kanssa kliinisiä tuloksia arvioitiin ALK FISH-positiivisia crizotinib saaneista potilaista lukien kaksi potilasta samanaikaisen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (

EGFR

) mutaatio.

Tulokset

positiivisuus havaitsemismäärä ALK uudelleenjärjestely FISH, IHC ja qRT-PCR oli 35,5% (59/166), 35,7% (61/171), ja 27,9% (34/122), tässä järjestyksessä.

ALK

uudelleenjärjestely havaittiin etupäässä nuorilla potilailla, ei koskaan tai valon tupakoitsijoita, ja adenokarsinoomat, erityisesti sinettisormus solujen ominaisuuksia ja huono erilaistumista. Mediaani ilman taudin etenemistä (PFS) on crizotinib saaneilla potilailla oli 7,6 kuukautta. Yleinen (OS) näistä potilaista oli enää verrattiin crizotinib-naiivi tai villityypin ikäluokat, mutta ei ollut merkittävää eroa OS verrattuna potilaisiin, joilla

EGFR

mutaatio. ALK ilme ei liittävät PFS; mutta, kun ALK ilmentyminen analysoitiin dikotomisen muuttuja, kohtalainen ja vahva ALK ilme oli pienentynyt kuolemanriski (

P

= 0,026). Kaksi potilasta, joilla on samanaikaisia ​​

EGFR

ja

ALK

muutoksia osoitti eron ALK ilmaisun, vastauksena EGFR ja ALK estäjien, ja kokonaiseloonjääminen.

Johtopäätökset

valikoiva rikastaminen mukaan viittaavia tekijöitä NSCLC potilaat voisivat suuresti parantaa positiivisuus havaitsemismäärä

ALK

uudelleenjärjestely ALK-täsmähoitoihin. IHC voisi tarjota enemmän johtolankoja kliinisen tutkimuksen suunnittelu ja terapeuttisia strategioita ALK-positiivisten pienisoluista keuhkosyöpää, jossa potilaiden kaksinkertainen geneettinen poikkeavuus

ALK

ja

EGFR

.

Citation: Zhang NN, Liu YT, Ma L, Wang L, Hao XZ, Yuan Z, et al. (2014) Molecular Detection ja kliininen merkitys

ALK

uudelleenjärjestelystä Valitut Advanced Non-pienisoluinen keuhkosyöpä: ALK Expression Tarjoaa Oivalluksia ALK Kohdennettu Therapy. PLoS ONE 9 (1): e84501. doi: 10,1371 /journal.pone.0084501

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 27 elokuu 2013; Hyväksytty: 14 marraskuu 2013; Julkaistu: 03 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus: Tutkimus tukee osittain avustusta Research Special Fund for Public Welfare Industry of Health (+200.902.002-1), National Science and Technology Major Project (2008ZX09312, 2012ZX09303012), National High Technology Research ja kehittämisohjelma Kiina (2011AA02A110), Pekingin Kunnan Science and Technology komission (Z121107005112005, Z121102009212055), erityisiä varoja Keski Health Authority (B2009B124) ja Major tutkimusohjelma of Cancer Institute ja sairaalan Kiinan Academy of Medical Sciences (LC2012A18). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Edistyminen molekyylitekniikkaa antaa paremman tunnistamista ja ymmärtämistä molekyylitason markkereita, jotka voivat olla ennusteen arvioinnissa ja voi ajaa terapeuttinen päätöksenteko ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Viime vuosikymmenen aikana, alaryhmä NSCLC potilaiden epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (

EGFR

) mutaatio on herättänyt paljon huomiota, koska korkean vastausprosentit EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) [1]. Vuonna 2007 fuusio geeni anaplastinen lymfooma kinaasin (

ALK

) kanssa piikkinahkaisten mikrotubuluksiin liittyvä proteiini, kuten 4 (

EML4

) NSCLC ensin tunnistettiin Soda

et al

. [2], ja pian tuli uusi molekyylikohteena keuhkosyövän hoitoon. Onnistuneita kokemuksia EGFR täsmähoitoihin ovat tarjonneet viitemallina nopeasti tutkimuksen etenemisestä

ALK

uudelleenjärjestelyn. Crizotinib (ALK /MET /ROS1 estäjä) oli ensimmäinen kliinisesti saatavissa aine, joka osoitti huomattavaa antituumorivaikutus in ALK-positiivisten kehittynyt pienisoluista keuhkosyöpää. Äskettäin valinta potilaille, joilla ALK uudelleenjärjestely varten crizotinib hoitoon on tullut standardi Yhdysvalloissa, Euroopan unioni, Kiina, Japani ja muut maat. Vielä tärkeämpää on, muut ALK estäjien peräkkäin tuli kliinisissä kokeissa [3] ja lupaava toteuttaa uuden sivun genotyypin perustuva lääkekehitys keuhkosyöpä.

taajuus

ALK

uudelleenjärjestelyn alueet 3%: sta 7%: in valitsematta pienisoluista keuhkosyöpää, joka saattaa nousta 13% ~ 18%, jos potilas väestölle valitaan mukaan tiettyjä ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia, erityisesti nuorilla, ei-tai valon tupakoitsijoille adenokarsinooma [4], [5 ], [6], [7], [8], [9]. Lisäksi

ALK

uudelleenjärjestely oli sulkevat toisensa pois

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita. Kuitenkin edellä mainitut ominaisuudet eivät yhteisiä kaikille

ALK

uudelleenjärjestelyn harjoittajille.

ALK

fuusio on löydetty myös vanhemmilla potilailla, tupakoitsijoita [4], potilailla, joilla on

EGFR

mutaatio [10], [11], [12] ja ei-adenokarsinooma histologinen alatyyppi, kuten kuten adenosquamous karsinooma ja suuri cell carcinoma [3], [13]. Siksi ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ovat riittämättömiä seulontaan potilaille ja molekyylitestauksella on tarpeen määrittää ALK asema [14].

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR), immunohistokemia (IHC) ja fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) ovat nykyiset menetelmät valinta ALK testaus. Kuitenkin jokainen menetelmällä on erityisiä etuja ja haittoja. Ei ole hyväksyttyä yksimielisyys, mikä menetelmä on parempi. QRT-PCR voi havaita

ALK

uudelleenjärjestely mRNA tasolla ja määritellään sekä

ALK

fuusiokumppanin ja fuusio variantti, mutta se tarvitsee laadukasta RNA eikä voi havaita tuntemattomia

ALK

uudelleenjärjestelyt. Lisäksi on olemassa useita

EML4-ALK

variantit ja ei

EML4-AL

K fuusioiden NSCLC [15]. Siksi qRT-PCR ei ole laajalti käytössä havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelyn. FISH on nykyinen standardi tapa havaita

ALK

uudelleenjärjestely, koska se voi havaita käännellen ja translokaation riippumatta

EML4-ALK

geenin fuusio varianttien ja muiden fuusiokumppaneita. Mikä tärkeintä, kaikki kliiniset kokeet, jotka osoittivat tehokkuutta crizotinib varten

ALK

positiivisten pienisoluista keuhkosyöpää perustuivat Vysis /Abbot ALK break-toisistaan ​​FISH määrityksessä. Kuitenkin FISH on kallista, aikaa vievää ja vaikea tulkita. Joten FISH välttämättä ole käytännöllisiä seulomiseksi jokaisen NSCLC potilaalle. IHC on nopeampi, taloudellisempi ja laajasti saatavilla. Lisäksi IHC uusilla vasta-aineilla ja muutettu protokollia on laajentanut huollettavia alue ALK testaus. Useat julkaistut suositukset [16], [17] viittasi siihen, että ALK FISH-analyysi voidaan suorittaa ainoastaan ​​IHC-positiivisia tapauksia. Kuitenkin standardi IHC protokollia ja pisteytys kriteerit puuttuvat, ja korrelaatio ALK ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin ei ole vahvistettu oikeellisuuden IHC.

Siksi tässä tutkimuksessa kerättyjä näytteitä alussa seulonta potilaiden crizotinib kliinisissä tutkimuksissa (PROFILE 1005 tai PROFILE 1014) ja arvioitiin ALK tila käytetään kalojen, IHC ja qRT-PCR. Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ja kliinisiin tuloksiin mukaan genotyyppispesifinen ja hoito-ohjelmia analysoitiin, jonka tarkoituksena on valaista kliinistä merkitystä

ALK

uudelleenjärjestelyn valikoiduilla kehittynyt pienisoluista keuhkosyöpää. Lisäksi vertasimme soveltaminen eri ALK havaitsemismenetelmiä ja erityisesti arvioida mahdollista yhteyttä välillä ALK ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin in ALK FISH-positiivisia crizotinib saaneista potilaista.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus Väestö ja Tiedonkeruu

Näytteet kerättiin 173 kehittynyt nonsquamous NSCLC potilaat, jotka olivat jolla pyritään käynnissä ALK seulonta crizotinib kliinisissä tutkimuksissa (PROFILE 1005 tai PROFILE 1014) tammikuussa 2011 lokakuuhun 2012. Kaikki potilaat saivat hoitoa tai konsultaatiota Cancer Institute ja sairaalan, kiina Academy of Medical Sciences ja Pekingin unionin Medical College ja allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus tulevia molekyylitason analyysi. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Boards Kiinan Academy of Medical Sciences Cancer Institute ja sairaalan.

Medical kirjaa kaikki potilaat tarkistettiin kerätä demografisia, kliinisiä ja patologinen tietoa. Histologia tarkasteli perusteiden Maailman terveysjärjestön luokitus keuhkotuumoreiden [18] ja IASLC /ATS /ERS monitieteinen luokittelu keuhkoadenokarsinooma [19]. Me kirjataan

EGFR

mutaatio potilaan asemaan, joka oli määritetty käyttämällä kaksisuuntaista sekvensointia menetelmä

EGFR

eksonit 18 ja 21 Tutkimme myös hoidon rykmenttiä ja kliinisiä tuloksia. Etenemisestä vapaa elinaika (PFS) laskettiin aloittamisesta crizotinib on dokumentoitu etenevä sairaus (PD) tai kuolema mistä tahansa syystä. Jotta paremmin valaista vaikutteita genotyyppispesifinen ja hoito-potilaiden eloonjäämiseen (OS), kahden tyyppisiä OS analysoitiin. OS1 ja OS2 olivat vastaavasti määriteltiin aika alustavan diagnoosin NSCLC ja allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen kuolema mistä tahansa syystä. OS 1 oli kattava mutta enemmän vaikutteita aikaisempi hoito. OS2 oli tarkempia selventää vaikutuksia crizotinib hoidossa

ALK

-positiivinen kehittynyt NSCLC.

ALK Test

Näytteet testattiin IHC, FISH ja qRT-PCR. FISH suoritettiin FDA hyväksyi ALK koetinpakkauksen (Vysis LSI ALK dual-väri, break-toisistaan ​​uudelleenjärjestely koetin, Abbott Molecular, Abbott Park, IL) ja analysoinut kitin ohjeita. ALK IHC suoritettiin protokollien mukaisesti, jonka vasta-aine (D5F3, Cell Signaling Technology) valmistajan. Aikaisempien tutkimusten [20], [21], IHC tulokset pisteytettiin 0, kun mitään erityistä värjäytymistä näkyi sisällä kasvain; 1+, heikko värjäytyminen intensiteettiä yli 10% kasvainsoluja ilman taustavärjäyksen; 2+, kohtalainen värjäytyminen intensiteetti; 3+, voimakas värjäytyminen intensiteettiä. Tapauksissa riittävän kudosten uutettiin kokonais-RNA: formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE näytteitä) käyttämällä RNeasy FFPE (Qiagen, Saksa). Havaitsemiseksi EML4-ALK, mRNA käänteiskopioidaan cDNA: ksi ja qRT-PCR suoritettiin kaupallisella EML4-ALK-kittiä (Amoydx, Kiina), mukaan lukien yhdeksän tunnettuja variantteja (A20, E13, A20, E6a /6b; A20 , E20, A20, E15, A20, E14, A20, E18, A20, E2, A20, E17, A20.) ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA).

tilastollinen analyysi

Pearson’in neliö -testi, Fisherin testiä tai Kruskal-Wallisin testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin muuttujien tarvittaessa. Kaplan-Meier lähestymistapaa käytettiin arvioitaessa PFS ja OS, ja ero ryhmien välillä vertailtiin log-rank-testi. Riskisuhde (HR) arvioitiin suhteellinen vaaroja regression 95%: Wald luottamusväli (95% CI). Tietojen analysointi tehtiin SAS versiossa 9,2, tilastollista merkittävyyttä määriteltiin kaksipuolisen

P

-arvo 0,05.

Tulokset

ALK Detection Tulokset

sata ja kolmekymmentäkaksi toistoleikattiin ja neljäkymmentäyksi koepala näytteet analysoitiin sekä IHC ja FISH; ei kuitenkaan ole tulkittavissa IHC tuloksia saatiin kaksi potilasta eikä tulkittavissa FISH tulokset seitsemälle potilaalle. QRT-PCR onnistuneesti suoritettiin 122 yksilöitä. ALK muutos todettiin 35,5% (59/166), 35,7% (61/171), ja 27,9% (34/122) näytteiden FISH, IHC, ja qRT-PCR, vastaavasti. Yksityiskohdat tunnistamisen tulosten mukaan kolme menetelmää on yhteenveto taulukossa 1.

Potilaiden ominaisuudet ja Kliiniset tulokset mukaan Molecular Alatyypit

Niistä 166 kehittynyt pienisoluista keuhkosyöpää, jotka olivat läpäisseet ALK seulonta FISH, 59 harboured

ALK

uudelleenjärjestely mukaan lukien kaksi (3,4%, 2/59) potilailla, joilla on samanaikainen

EGFR

mutaatio, 20 osoitti

EGFR

mutaatio, 87 olivat villityypin kanssa

ALK

-negatiivinen ja

EGFR

-negatiivinen tai

EGFR

-unknown (villityypin kohortti, WT). Potilaat todennäköisimmin satamaan

ALK

uudelleenjärjestely olivat nuoria, ei koskaan tai kevyt tupakoitsijoita huonosti eriytetty adenokarsinooma, erityisesti sinettisormus solujen ominaisuuksia, vertaamalla

EGFR

mutaatio tai villityypin kohortti (taulukko 2 ). Kaksi potilasta, joilla on samanaikaisia ​​

ALK

uudelleenjärjestelyn ja

EGFR

mutaatio analysoitiin erikseen vähäisen esiintyvyyden.

59 potilaalla on FISH-positiivisia

ALK

uudelleenjärjestely, 45 sai crizotinib faasin II kliinisessä tutkimuksessa (PROFILE 1005), 8, otettiin vaiheen III kliinisessä tutkimuksessa (PROFILE 1014) ja 6 eivät ole osallistuneet kutakin kliinistä tutkimusta. Koska crossover vaikutuksen pemetreksediä ja crizotinib vaiheessa III kliinisessä tutkimuksessa, kahdeksan potilasta suljettiin hengissä analyysiä. Toinen 158 potilasta ryhmiteltiin neljään tyyppiin:

ALK

positiivinen crizotinib saaneilla (n = 45),

ALK

positiivinen crizotinib-naiivi (n = 6),

EGFR

mutaation TKI-käsiteltyjen (n = 20) ja villin tyypin (n = 87). Lähtötilanteen ominaisuudet, kliiniset hoidot ja tuloksia esitetään taulukossa 3.

ALK

positiivisten ryhmä osoitti dramaattisesti nuorempi ikäjakauma kuin mikään muu ryhmä, sai enemmän rivejä hoidon kuin

EGFR

mutaatio ryhmä (mediaani, 2,9

vs.

1,8;

P

= 0,025) ja oli enemmän potilasta sai pemetreksediä kemoterapiaa kuin villin tyypin ryhmä (

P

= 0,020).

ALK

positiivisten potilaiden kanssa ja ilman crizotinib hoitoa ollut tilastollisesti merkittävää eroa molempien OS1 (mediaani, 39,7

vs.

8,8 kuukautta,

P

= 0,003) ja OS2 ( mediaani, 22,0

vs.

1,8 kuukautta,

P

0,001). Ei ollut merkittävää eroa

ALK

positiivisten kanssa crizotinib hoidetussa ryhmässä ja

EGFR

mutaation TKI-hoidetussa ryhmässä sekä OS1 ja OS2 (

P

= 0,249 ja

P

= 0,896, tässä järjestyksessä). Lisäksi

ALK

positiivisten kanssa crizotinib hoidetuilla potilailla oli pidempi OS2 kuin villikannan potilailla (mediaani, 22,0

vs.

14,2 kuukautta,

P

= 0,014), mutta ei ollut merkittävää eroa OS1 näiden kahden ikäryhmät (39,7

vs.

38,7 koit,

P

= 0,294) (kuvio 1).

A, B, C, kokonaiselinaika laskettu diagnoosista (OS1); D, E, F, eloonjäämiseen laskettuna allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus näytöksessä aika (OS2). WT: potilaalla on ALK negatiivinen ja EGFR-negatiivinen tai EGFR-tuntematon;