Krooninen sairaus

tiivistelmä

syljen proliinipitoinen peptidi 1932 Da osoitti annoksesta riippuvaa antagonistisia vaikutus sytosolin Ca

2+ mobilisointi aiheuttama progesteronia kielen levyepiteelikarsinoomasolu linja. Rakenne-aktiivisuus-tutkimukset osoittivat, että peptidin aktiivisuutta asuu C-pään alueen tunnettu proliini venyttää reunustaa emäksisiä tähteitä. Lisäksi puute aktiivisuus-retroinversopeptidillä analoginen ehdotti osallistumista stereospesifisten tunnustamista. Massaspektrometria-pohjainen haulikko analyysi yhdistettynä Western blotting testejä ja biokemiallisia tietoja, jotka on saatu Progesterone Receptor Membrane Komponentti 1 (PGRMC1) estäjä AG205, osoitti vahvaa näyttöä siitä, että p1932 suorittaa sen moduloivan toiminnan kautta vuorovaikutuksessa progesteronireseptorin PGRMC1, joka on pääasiallisesti ilmaistuna tässä solulinjassa ja selkeästi, on rooli progesteronin aiheuttama Ca

2+ vastausta. Siten, tuloksemme osoittavat p1932 kuin modulaattorin transduktion signaalireitin välittämän tämän proteiinin ja koska vakiintunut osallistumista PGRMC1 kasvainten synnyssä, korostaa mahdollisia terapeuttisia mahdollisuuksia p1932 hoitoon suun syöpä.

Citation: Palmerini CA, Mazzoni M, Radicioni G, Marzanon V, Granieri L, Iavarone F, et ai. (2016) antagonistinen vaikutus syljen proliini-Rich peptidin Sytosoliset Ca

2+ Liikkeelle indusoima Progesteroni Oral Squamous syöpäsoluja. PLoS ONE 11 (1): e0147925. doi: 10,1371 /journal.pone.0147925

Editor: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

vastaanotettu: 27 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 11 tammikuu 2016; Julkaistu: 27 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Palmerini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin. Tiedostot koskien laatinut massaspektrometrian tulokset raportoidaan käsikirjoitus on säilynyt meidän välineitä tallenteita.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Nando Peretti Foundation, Catholic University of Rome, Cagliarin yliopisto, MIUR ja Regione Sardegna mukaan ohjelmansa tieteellisen diffuusion. Teos tukivat myös FaReBio dQ 2012 CNR projekti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sylki on sekoitettu neste, jota erittyy suuria ja pieniä sylkirauhasten sijaitsevat suuontelon [1], ja se kohdistaa erilaisia ​​suojaavia ja ruoansulatustoiminnot [2]. Nämä toiminnot on yhdistetty sylki dynaaminen kokoonpano [3, 4] ja tästä syystä merkittäviä ponnisteluja on omistettu määritelmän syljen proteomiin [5], jossa on yli 2500 erilaista proteiinia jo tunnistettu [6]. Nämä voidaan jakaa erittämät proteiinit sylkirauhaset, jotka sisältävät 400-500 komponentit vastaa noin 90% koko syljen proteomin paino, ja proteiineja, jotka johtuvat muista lähteistä (yli 2000), joiden osuus on alle 10%.

proteiinit ja peptidit, jotka johtuvat sylkirauhasten eritystä ovat musiinit, α-amylaasit, histatins, statherin, PB peptidi, S-cystatins, lipaasit, rasva-kuljettaja (lipokaliini), ja runsaasti proliinia sisältävän proteiineja (Prps), jaettuna happamassa (aPRPs), perus (bPRPs) ja glykosyloituneen perus (gPRPs) [4]. Kohdentamisessa tiettyjä toimintoja erilaisia ​​komponentteja ja perheiden on vaativa, luultavasti siksi jokainen perhe kykenee useita ja integroituja toimintoja, ja koska syljen proteiinit ovat satunnaisesti hajallaan liuokseen [7-11].

bPRPs ekspressiotuote neljä usean alleelinen loci nimeltään PRB1-4, ovat hyvin heterogeeninen perheen peptidien johtuu laajasta polymorfismien, vaihtoehtoisen silmukoinnin ja translaation jälkeiset modifikaatiot. Erittymisen jälkeen, bPRPs osittain pilkotaan pienemmiksi peptideiksi vaihtelee 8-25 aminohappotähdettä eri eksogeenisten proteaasien [12]. Näillä peptideillä on erikoinen ensisijainen sekvenssit usein päällekkäin synnyttää laajan joukon vastaavia molekyylejä, joissakin tapauksissa vain eroavat yhdellä jäämiä.

Yksi näistä peptideistä (1932 Da, p1932) patentoitiin sen voimakas antiviraalinen [PCT /IB2012 /050415] ja se on äskettäin todettu sisäistää suun limakalvon soluista [13]. Useita kokeita suoritettiin, jotta voitaisiin arvioida biologisia vaikutuksia peptidin osoituksena sen vaikutusta kalsiumin homeostaasiin solujen sisällä. Modulaatio sytosolin Ca

2+ pitoisuus ([Ca

2 +]

c) on tärkeä tapahtuma esiintyy solussa koska Ca

2+ pitoisuus välittää monia biologisia tapahtumia, kuten solujen lisääntymisen , erilaistuminen, metabolia, lihasten supistumisen, apoptoosin ja immuunivastetta [14], samoin kuin eksosytoosia synaptisen rakkulat välittäjäaineiden vapautumista [15].

Kalsium homeostaasin nisäkässoluissa on monimutkainen ilmiö, ja tulokset alkaen tasapaino Endoplasmakalvosto kalsiumvarastot ja ionin vaihto solunulkoiseen. Progesteroni, kautta genomista ja ei-genomiset vaikutuksia, on tärkeä rooli kehitettäessä, kasvu ja ylläpito naisten lisääntymisterveyttä kudoksiin. Lisäksi, hormoni voi vaikuttaa fysiologian aivojen ja hermoston, joka perustuu sen toimintaa neurosteroidin vaikuttavat solujen eloonjäämistä ja kasvua [16, 17]. Modulointi kalsiumtasapainoa edistää progesteroni on yleensä säädellään kuin genomista mekanismeja, joihin liittyy erilaisia ​​reseptoreita progesteronin [18, 19]. Mielenkiintoista on, on huomattava, että hormoni on läsnä syljessä vapaassa muodossa [20].

Tässä me kuvaamme, että p1932 on antagonistinen vaikutus sytosolin Ca

2+ liikkeelle aiheuttama progesteronin ihmisen okasolusyöpä kielen masolulinjassa (PE /CA-PJ15). Lisäksi tarjoamme vahvaa näyttöä siitä, että säätelevä osa ja p1932 on käytössä kautta PGRMC1 reseptorin, kuten on esitetty vertailevalla proteiinin ekspression tutkimukset ja biokemiallisia tutkimuksia, kun läsnä on AG-205, joka on spesifinen inhibiittori PGRMC1 käyttää yksinään ja yhdessä p1932 . Nämä tulokset, korostavat uusia näkymiä yli toiminnalliset vaikutukset syljen proliinipitoinen peptidien syöpäsolujen järjestelmissä altistetaan erityisiin sukupuolihormonien.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

fosfaattipuskuria suolaliuosta (PBS) ja trypsiini-EDTA ovat tuotteita EuroClone (Padovan, Italia). Sikiön vasikan seerumia (FCS), antibiooteilla (penisilliini ja streptomysiini), L-glutamiinia, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(IMDM), Fura-2-AM: n (Fura 2-asetoksi-metyyli-esteri), dimetyylisulfoksidi (DMSO), KCI, MgCI

2, glukoosi, Hepes, NaCl, CaCl

2, EGTA (etyleeni glicol-bis (2-amino-etyylieetteri) -N, N, N ’, N’-tetra etikkahappo), progesteroni (P4), deoksikoolihappo, Nonidet P-40 (NP-40), EDTA: ta (2 – ({2 [bis (karboksimetyyli) amino] etyyli} (karboksimetyyli) amino) etikkahappo), Tween- 20 ja AG-205, hankittiin Sigmalta (Milano, Italia).

peptidit synteesi

P1932, RI-p1932 ja fragmentteja F (MER 1-8), C (MER 1- 17des Pro), E (MER 1-11), B (MER 1-17) ja D (MER 12-20) koottiin Applied Biosystem Peptide Synthesizer 433A (Foster City, CA, USA) on esiladattu proliini-2 -chlorotrityl-hartsilla (Novabiochem, Laufelfingen, CH) jälkeen Fmoc- (Na-9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli) protokolla vaiheittain kiinteän faasin peptidisynteesin [21]. Fmoc-aminohapot olivat Novabiochem.

Kaikki kytkennät tehtiin 5-kertaisen ylimäärän aktivoitua aminohappoa, kun läsnä on 10 ekvivalenttia N-etyylidi amiini, käyttäen N – [(dimetyyliamino) -1-H- 1, 2, 3-triatsoli [4, 5-β] pyridiini-1-yylimetyleeni] -N-metyylimetaaniaminiumista heksafluorifosfaatti-N-oksidi (HATU, PE Biosystems, Inc., Warrington, UK), kuten aktivoiva aine on karboksiryhmän. Lopussa peptidiketjun kokoonpano, peptidi pilkottiin hartsista käsittelemällä seoksella, jossa on 80% trifluorietikkahappoa, 5% vettä, 5% fenolia, 5% tioanisolia, 2,5% etaaniditioli ja 2,5% tri-isopropyylisilaani: ssa 3 tuntia (huoneen lämpötila), jossa suojaryhmien poistaminen sivu- ketjusta. Suodatuksen jälkeen hartsi, peptidi saostettiin kylmällä tert-butyylimetyylieetterillä. Sentrifugoinnin ja pesu tert-butyylimetyylieetterillä peptidi suspendoitiin 5%: ista etikkahappoa ja lyofilisoitiin. Analyyttinen ja semipreparatiivisella Käänteisfaasi korkean suorituskyvyn nestekromatografia (RP-HPLC) suoritettiin Tri Rotar-VI HPLC-järjestelmä, jossa on MD-910 monikanavainen ilmaisin analyysiä varten tai joiden Uvidec-100-VI muuttuvan UV-detektori preparatiivista tarkoitukseen (kaikki JASCO, Tokio, Japani). Analyyttinen RP-HPLC suoritettiin Jupiter 5 pm C18, 300 Å pylvääseen (150 x 4,6 mm, Phenomenex, Torrance CA, USA). Puolipreparatiivisella RP-HPLC suoritettiin Jupiter 10 um C18 300 A (250 x 21,2 mm, Phenomenex, Torrance CA, USA). Lineaarinen kaltevuudet asetonitriiliä vesipitoisessa 0,1% TFA: ta (v /v) käytettiin sidotun peptidin. MALDI-TOF massaspektrometria-analyysi tehtiin suoritettiin AUTOFLEX työasemalla (Bruker Daltonics, Bremen, DE) vahvistaa teoreettinen massa peptidin.

Human PE /CA-PJ15 solulinja

PE /CA-PJ15-soluilla (ECACC, 96121230, Porton Down, UK) [22], viljeltiin (37 ° C, 5% CO

2) IMDM väliaineessa, joka sisälsi 2 mM glutamiinia ja penisilliiniä /streptomysiiniä (100 U /ml kutakin ), johon oli lisätty 10% FCS: llä. Soluja jatkoviljeltiin joka neljäs päivää ennen tulossa täysin konfluentteja.

määritys sytosolin pitoisuuden Ca

2+

Fura-2 AM (2 ui 2 mM DMSO-liuoksesta) lisättiin 1 ml: PE /CA-PJ15 suspensiot (noin 10 x 10

6 solua), joka saadaan sen jälkeen, kun 0,05% trypsiiniä hoitoon ja inkuboitiin 60 min 37 ° C: ssa, pimeässä. Sitten solut otettiin talteen sentrifugoimalla 800 gx 10 min ja lopuksi suspendoitiin HBSS-puskuriin, pH 7,4 (140 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM MgCI

2, 1 mM CaCl

2, 5 mM glukoosi, 25 mM Hepes, säädetty pH 7,4) lopulliseen solukonsentraatioon 1 x 10

6 /ml.

alikvootti tätä suspensiota (1 ml), sentrifugoitiin sitten 800 g x 5 min, minkä jälkeen solut kerättiin ja suspendoitiin 3 ml: aan kalsiumia HBSS pH 7,4 (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCI

2, 5 mM glukoosi, 25 mM HEPES, 0,1 mM EGTA: ta) ennen fluorimetri- mittauksia. Fluoresenssi mitattiin Perkin-Elmer LS 50 B spectrophotofluorimeter varustettu kaksinkertainen magnetointilaitteisto (esim. 360 ja 380 nm, em. 510 nm). Viiltämällä leveydet asetettiin 1,5 nm viritykseen ja 3 nm emissio. Soluliman kalsiumin pitoisuudet ([Ca

2+] c laskettiin raportoitu [23].

proteomiikan analyysi progestiinireseptoreiden vuonna PJ15 soluissa

Proteiiniekstraktit saatiin solujen hajottaminen 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoksikoolihappo, 0,1% SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA pH 8, johon on lisätty proteaasi-inhibiittoreita (RIPA-puskuri). proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelissä ja, jälkeen kolloidinen Coomassie brilliant blue-värjäys, geeli bändit kohteisiin leikattiin, väri poistettiin 25 mM NH

4HCO

3 /ACN 1: 1 (v /v), kuivattu 100% ACN, pelkistetään 10 mM DTT: 25 mM NH

4HCO

3 ja alkyloitiin 55 mM IAA 25 mM NH

4HCO

3. Kun täydellinen elimistön kuivuminen, liuos, jossa oli 0,02 ug /ul trypsiinillä 25 mM NH

4HCO

3 lisättiin, ja proteiinit pilkottiin 37 ° C: ssa yön yli. reaktio pysäytettiin lisäämällä TFA: ta lopulliseen konsentraatioon 0,1%. supernatantit, jotka sisältävät trypsiinipeptidit kerättiin yhdessä peptidifragmenttien uutetaan geelistä 100% ACN /0.1% TFA vedessä 3: 2 (v /v). Trypsiinipeptidit analysoitiin nestekromatografia-sähkösumutusionisaatiota-tandem-massaspektrometrialla (LC-ESI-MS /MS) koskevasta Ultimate 3000 Micro HPLC-laitetta (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) varustettuna FLM-3000-Flow Hallinnoijamoduli suoraan kytketty LTQ Orbitrap XL hybridi FT massaspektrometriin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Käänteisfaasikromatografia suoritettiin Jupiter C18, 5 um, 300 Ä, 150 x 1,0 mm: n pylväs (Phenomenex, Torrance, CA, USA) ja 95 minuutin käyttöajan (gradientti 1,6-44% asetonitriiliä vedessä, jossa on 0,1% muurahaishappoa yli 60 min) virtausnopeudella 80 ul /min. Massaspektrometriset mittaukset suoritettiin positiivinen ioni tilassa kapillaarin lämpötila on 250 ° C, vaipan kaasun virtaus 40 mielivaltaisen kokonaisuuksia, lähde jännite 3,6 kV ja kapillaariputken jännite 48 V. Massaspektrit kerättiin FT-IT data riippuvainen skannaustila (MS skannaa 60000 of päätöslauselmaa Orbitrap ja MS /MS skannaa kolmesta voimakkain huiput ioniloukku). Proteiini tunnistuksiin saatiin upotetun ionin kirjanpito algoritmia (Sequest HT) ohjelmiston Proteome Discoverer (versio 1.4, Thermo) ja etsimällä ihmisen tietokanta (UniProtKB /Swiss-Prot Protein Tietopankki, vapauta 2013_09 18-Sep-13 sisältävä 540958 sekvenssin merkinnät; taksonomisessa rajoituksia: Homo sapiens, 20271 sekvenssi merkinnät). Hakuparametrit olivat 10 ppm toleranssi lähtöaineiden ionien ja 0,8 Da tuoteionia, 1 jäi pilkkominen, carbamydomethylation kysteiinin kiinteinä muuttaminen, hapettuminen metioniinin muuttuvina muutos ja vääriä positiivisia alle 5% laskettuna syötti tietokannasta haun.

progestiinireseptoriin western blotting

proteiinipitoisuus solu- lysaattia määritettiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Solukalvojen valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [24] pienin muutoksin. Solut homogenoitiin jääkylmässä homogenisointipuskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA), joka sisälsi 1% proteaasiestäjäseostabletit (Sigma-Aldrich) Douncen homogenisaattoria (30 lyöntiä). Homogenaattia sentrifugoitiin 10 min ajan 2000 g ja 4 ° C: ssa, mitä seurasi sentrifugointi supernatantin 100,000 g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa pelletoimiseksi solukalvojen, joka suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 8,0 , 1 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT, ja proteaasi-inhibiittorin cocktail). Proteiini kvantitointi suoritettiin käyttäen 2-D Quant Kit proteiinin iinianalyysikitissä (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi). Proteiinit ladattiin ja erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Blotit estetty blokkausliuosta (PBS, 0,1% Tween-20, 5% (w /v) rasvatonta kuivamaitoa), ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavien hiiren monoklonaalinen primaarinen vasta-aineita: anti-PGRMC1 (klooni C-3 , Santa Cruz, CA, USA), anti-nPR (klooni 2C11F11, Santa Cruz), anti-mPRα (klooni H-76, Santa Cruz) ja anti-β-Actin (klooni AC-15, Sigma). Membraanit pestiin perusteellisesti ja inkuboinnin jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) -leimattua vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-ainetta (Santa Cruz), kehitettiin ECL plus kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (GE Healthcare, UK).

Statistical analysoi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n) ja huomattavia määriä ryhmissä arvioitiin ANOVA ja post-hoc Scheffen testi. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

antagonistinen vaikutus p1932 peptidin P4 vaikutus

Patentoitu peptidi p1932 (NH

2-

1GPPPQGGNK

10PQGPPPPGKPQ-PCT /IB2012 /050415) on fragmentti johtuvat proteolyyttinen prosessointi proliinirikas proteiinien PRB1-L (UniProt /Swiss-Prot, P0428), PRB-2 (P02812), PRB1- M (Q86YA1) ja PRB2 (Q7M4Q5) [4]. Sekvenssi p1932 toistetaan neljä kertaa PRP1-L ja PRB2, ja kolme kertaa PRB1-M, jolloin sen keskimääräinen pitoisuus ihmisen syljessä noin 5-10 uM. Kuitenkin, kuten monille muillekin syljen peptidien täsmällistä roolia p1932 suun fysiologian ja patologian tällä hetkellä tiedetä. Tuoreessa olemme paljastaa kyky p1932 voidaan sisäistää soluissa suun limakalvon aikaa kulunut muutama minuutti, lisäksi osoitimme puute sytotoksisuuden jopa pitoisuuksilla selvästi kuin löytyy syljestä tämän peptidin [13] .

tässä työssä osoitamme ensimmäistä kertaa annoksesta riippuvaa vaikutusta p1932 on modulaatio sytosolin kalsiumin vapautumisen edistää progesteronin PE /CA-PJ15 solulinjassa.

Nämä solut, joita voidaan pitää mallina ihmisen suun syöpä solujen [25], oli tarkoituksella valittu tutkimaan mahdollisia vaikutuksia p1932 läsnäollessa progesteronireseptoreihin aikaisemmin yhdistetty ennustetekijöiden merkitystä yli pään ja kaulan alueen syöpä [26].

vaikutus P4 PE /CA-PJ15 solut tutkittiin käyttämällä hormoni kahden eri pitoisuuksilla (5 ja 10 uM), jotta voidaan tutkia mahdollisia annokseen liittyviä vaikutuksia. Progesteroni (P4) solujen käsittely suoritettiin ilman ekstrasellulaarisen kalsiumin, joka oli aiemmin poistettu 0,1 mM EGTA 0,1 mM. Muutaman sekunnin upon P4 hoitoa, kasvua [Ca

2 +]

c voitiin havaita sekä pitoisuuksilla (kuvio 1). A siten nopea kasvu viittaa siihen, nopean ei-genomisia vaikutus P4 [27], jotka voivat välittää eri luokkiin progesteronireseptoreihin, kuten klassisen ydin- progesteronireseptori (nPR) sen monomeerinen muoto (nPR-A), progesteronin reseptorin Membrane Components 1 (PGRMC1), ja kalvo Progesterone Receptor MPR [28].

kuviossa on tulosta tyypillisestä kokeesta. Solut suspendoitiin HBSS-puskuriin ilman kalsiumia. Sen jälkeen 250 sekunnin kalsiumia lisättiin saavuttaa pitoisuudet 1 mM. Koe toistettiin 10 kertaa ja samanlaista käyttäytymistä aina noudateta. Upotus: Maksimaalinen lisäys [Ca

2+] C, ilmoitetaan Δ [Ca

2+] c, lisäämisen jälkeen lisääntyviä määriä progesteronia. Esitetyt tulokset vastaavat keskiarvoja ± SEM 10 kokeissa. ANOVA. Vaikutukset, jotka johtuvat progesteronin Kalsiumin puuttuessa: p 0,0001, ja kun läsnä on 1 mM kalsium: ei merkittävä (ei esitetty upotus). Post-hoc: Scheffen testi p tasolla 0.05. Tähdet esitetty tilastollinen merkitsevyys.

[Ca

2 +]

c kasvu oli riippuvainen progesteroni keskittyminen ja upotetussa kuvion 1 vaikutuksista P4 [Ca

2 +]

c raportoidaan Δ [Ca

2 +]

c (nM). Tilastollinen analyysi vahvisti lisäävät annosten progesteronin on [Ca

2 +]

c kalsiumia vapaissa olosuhteissa (p 0,0001). Kun 1 mM Ca

2+ lisättiin keskipitkällä, lisäkorotukset [Ca

2 +]

c havaittiin (kuvio 1), sekä puuttuessa ja läsnä ollessa progesteronin kohti 42 ± 3 nM (10 määrityksen keskiarvo ± SEM). Tämä tulos osoittaa, että [Ca

2 +]

c muutoksia upon P4 ärsyke riippuvat ensisijaisesti vapauttamisesta Ca

2 + solunsisäisistä varastoista yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa [29]. Tältä osin lineaarista suhdetta havaittu [Ca

2 +]

c kasvua ja P4 annos, on todennäköisesti osoitus suora vaikutus, mikä sulkee pois epäspesifistä vaikutukset P4 solukalvojen että viime kädessä olisi johtaa solunsisäisen kalsiumin kasvaa [30]. Seuraavissa kokeissa p1932 peptidiä käytettiin alhaisemmalla pitoisuus (1700 nM) osalta todettua syljen (5-10 uM), ottaen huomioon, että fysiologisissa oloissa, eivät kaikki syljen osa p1932 peptidi on kosketuksissa limakalvon soluista samalla.

Syljen peptidi p1932 yksin (1700 nM) ei ollut vaikutusta [Ca

2 +]

c PE /CA-PJ15 soluja, joko ilman tai läsnäollessa Ca

2+ keskipitkällä. Kuitenkin, kun lisättiin 2 minuuttia ennen P4 hoidon kalsiumia olosuhteissa, p1932 täysin sammutettiin vaikutus progesteronin vaikutuksia (sekä 5 ja 10 uM pitoisuuksina) (kuvio 2, upotus). Lisäksi havaitsimme annoksesta riippuvainen vaikutus, kun p1932 syljen peptidiä testattiin eri pitoisuuksina 17-1700 nM (kuvio 3). Erityisesti kun progesteroni-välitteisen estäviä vaikutuksia (5-10 uM) oli tehokas lineaarinen korkein pitoisuus (1700 nM) käytetyn peptidin.

Kuviossa on tulosta tyypillisestä kokeesta. Solut suspendoitiin HBSS-puskuriin ilman kalsiumia. Peptidi (1700 nM) lisättiin kahden minuutin ennen progesteroni (10 uM). Sen jälkeen 250 s kalsiumia lisättiin saavuttaa pitoisuudet 1 mM. Upotus: Maksimaalinen lisäys [Ca

2 +]

c, ilmoitetaan Δ [Ca

2 +]

c, lisäämisen jälkeen lisääntyviä määriä progesteronia. Esitetyt tulokset vastaavat keskiarvoja ± SEM 10 kokeita ANOVA. Vaikutukset, jotka johtuvat progesteronin Kalsiumin puuttuessa: p 0,0001 ja, kun läsnä on 1 mM kalsium: ei merkittävä (ei esitetty upotus).

Post-hoc

: Scheffen testi p tasolla 0.05. Asteriskit esitetty tilastollisen merkitsevyyden.

jälkeen 120 sekunnin lisättäessä peptidin (17-1700 nM), progesteroni (10 uM [musta neliö] tai 5 uM [valkoiset neliöt)] on myös annosteltiin . Data (raportoitu Δ [Ca

2+] c) ilmoittavat keinot ± SEM 10 kokeita ANOVA. Progesteronin vaikutuksia: p 0,001 ja peptidin pitoisuus: p 0,001.

Jotta voidaan vahvistaa minimaalinen rakenteelliset vaatimukset ilmaista antagonistinen vaikutus, syntetisoimme erilaisia ​​fragmentteja p1932, ja suoritetaan kokeissa 1700 nM tutkia suhdetta fragmentin sekvenssien ja biologista aktiivisuutta. Fragments C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11), ja F (MER 1-8) osoitti huomattavan pienempi antagonistinen aktiivisuus verrattuna ehjän peptidiä (kuvio 4). Kääntäen, fragmentti B (MER 1-17), ja fragmentti D (MER 12-20), johti yhtä aktiivisia kuin p1932 peptidi. Mielenkiintoista on, että MER 1-17 des Pro-fragmentti, josta puuttuu yksi proliinitähde, ei ollut mitään inhibitorista vaikutusta osoittaa suurta spesifisyyttä oletetun molekyylitasolla p1932 [31]. Lopuksi retroinverso-(R. I.) muodossa p1932 testattaessa yli 17-1700 nM Pitoisuusalueen osoittanut mitään antagonistista vaikutusta (tietoja ei esitetä), mikä viittaa osallistuminen stereo-erityinen tunnustamisjärjestelmät. Nämä tulokset korostavat yhdistys C-terminaalisen osan peptidin, joka sisältää 12-GPPPPGKPQ-20 proliinipitoinen järjestyksessä, täysi estävä vaikutus [Ca

2 +]

c kasvua.

lisäyksen jälkeen joko peptidin tai sen fragmenttien eri pitoisuuksina (17-1700 nM), 5 uM progesteroni lisättiin myös kalsiumia kudosviljelyalustaan. Data (raportoitu Δ [Ca

2+] c), raportoivat keskiarvoja ± SEM 10 kokeita. ANOVA: Effects of peptidi: p 0,001 ja keskittymiskyvyn: p 0,001. Post-hoc: (scheffée p = 0,05). Homogeeninen peptidi osajoukot: 1. A (p1932), B (MER 1-17) ja D (MER 12-20); 2. C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11) ja F (MER 1-8).

Analyysi progesteronireseptorit

proteomiikan analyysi PJ15 solut tehtiin sen osoittamiseksi, että läsnä on kolme luokkaa oletettujen progestiinireseptoreiden kuvattu kirjallisuudessa: nPR, PGRMC1, ja mPRα. Solujen hajoamisen jälkeen, proteiinit erotettiin SDS-PAGE, jonka jälkeen ja proteiineja, joiden massat 21, 40 ja 100 kDa: n alueet analysoitiin LC-ESI-MS /MS: llä. Näissä olosuhteissa voimme tunnistaa vain PGRMC1 (taulukko 1) (21 kDa), kahtena kappaleena kokeissa. PGRMC1, mPRα ja nPR ilmentyminen arvioitiin myös Western blotting -analyysi, joka vahvisti, että PGRMC1 on suuri progesteronireseptorin ilmaistuna PE /CA PJ15 soluja. Western blot paljasti myös mPRα, vaikka vähemmässä määrin kuin PGRMC1 (kuvio 5), mikä vahvistaa edellisen samanaikainen immunosaostus arvioinnit viittaa siihen, että todennäköisesti PGRMC1 ja mPRα ovat toiminnallisesti liittyvät [32]. Sitä vastoin nPR reseptori ei tunnistettu suostumuksella tietoihin Lukits ja coll. saadaan samalla solulinjan (taulukko 1 ja kuvio 5) [26].

lueteltu ovat seuraavat proteiini parametrit: alfanumeeristen proteiinisekvenssin tunniste (liittymistä), proteiini tunniste merkkien nimeämiskäytäntöä (Entry nimi) , Gene nimi ja proteiinin nimi (Kuvaus) tarjoamat UniProtKB proteiini knowledgebase; laskettu molekyylipaino proteiinin kilo-Dalton yksikköä (MW), teoreettisesti laskettu isoelektrinen piste (cal. pl) ja proteiini määrä aminohappoja (# AAS); proteiini tunnistaminen n SEQUEST HT Score; prosenttiosuus proteiinisekvenssin joita tunnistetaan peptidit (Cov); useita peptidejä ainutlaatuinen proteiini (# Ainutlaatuinen Peptides); numero tunnistettu peptidien matching proteiinin (# Peptides); kokonaismäärä tunnistettu peptidisekvenssejä (peptidi spektri vastaa) (# PSMS) saatu kahdella eri kokeessa (Exp 1 ja Exp 2). Taulukossa on lueteltu PGRMC1 peptidien seuraavat parametrit: tunnistetut ami- hapan peptidisekvenssi; Veloittaa tila prekursori-ioni; teoreettinen protonoitu monoisotooppinen peptidin massa daltonia (MH +); massa-varaus-suhde (m /z) prekursori-ionin, ja daltonia; ero teoreettisen massan peptidin ja kokeellinen massa prekursori-ionin miljoonasosina (DM); retentioaika prekursori-ionin, minuutteina (R.T.); SEQUEST HT ristikorrelaatio pisteet kaikille ehdokas peptidien kysellä tietokannasta (Xcorr); määrä Missed Pilkkomiset.

PGRMC1, nPR ja mPRα proteiinien tasot paljastuu spesifisten vasta-aineiden PE /CA PJ15 solu-uutteet saatiin lysoimalla solut RIPA-puskurilla. Blot anti mPRα suoritettiin myös membraanivalmistetta. Proteiinit otteita HepG2 ja MCF7-solut analysoitiin positiivisina kontrolleina (PGRMC1: 21,67 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/O00264; nPR: 82,29 kDa isoformin A, 98.98 kDa isoformi B, http: //www. uniprot.org/uniprot/P06401; mPRα: 39,72 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/Q86WK9). Equal Proteiinilisäyksen (50 ug) vahvistettiin β-Actin ilme.

Koska korkea ilmentymisen PGRMC1 PE /CA PJ15 soluja, halusimme varmistaa sen rooli [Ca

2+] c lisääntyä progesteronin ärsyke käyttämällä erityisiä estäjä AG-205 yksin ja yhdessä p1932. AG-205 tiedetään sitoutuvan hemin sitoutumiskohtaan tämän proteiinin siten muuttaa sen spektroskooppiset ominaisuudet ja toiminnot [33]. PGRMC1 estäjä AG 205 (0,01-1,0 uM) tai p1932 peptidin (0,01-1,0 uM), otettiin käyttöön inkubointiaineeseen 50 sekuntia ennen progesteroni (5 tai 10 uM). Kun läsnä on AG-205 tai p1932-peptidin vaikutus P4 (5-10 uM) on Δ [Ca

2+] c oli tilastollisesti inhiboi annoksesta riippuvaisella tavalla, jolloin jäljittelemällä p1932 (kuvio 6a) . Sitten, AG-205 (0,01-1,0 uM) ja p1932 peptidi (0,01-1,0 uM) lisättiin samanaikaisesti keskipitkällä 50 sekuntia ennen progesteroni. Yhdistelmä kahden aineen samoilla annoksilla johti estävä vaikutus korkeampi progesteroni aktiivisuus, kuin mitä havaitaan yksittäisen AG-205 tai p1932 peptidi yksinään, mikä osoittaa, lisäaineen toiminta kaksi molekyyliä (kuvio 6b).

kokeet suoritettiin PE /CA PJ15 merkitty Fura-2 AM. 50 sekunnin kuluttua inkubointiaineeseen, P4 (5 uM, kuvio 6A; 10 uM, kuvio 6B) lisättiin ja kasvu sytosolin kalsiumin Δ [Ca

2+] c mitataan. PGRMC1 estäjä AG 205 (0,01-1,0 uM) ja /tai p1932 peptidi (0,01-1,0 uM), lisättiin keskipitkällä 50 sekuntia ennen 5 tai 10 uM progesteronia. Kun läsnä on AG205 tai p1932 peptidin vaikutus P4 (5-10 uM) on Δ [Ca

2+] c oli tilastollisesti inhiboi annoksesta riippuvaisella tavalla. Kun AG 205 (0,01-1,0 uM) ja p1932 peptidi (0,01-1,0 uM) lisättiin yhdessä, havaittiin estovaikutus oli korkeampi kuin käsitellyt näytteet kumpaakin annettaisiin erikseen. Kukin tiedot vastaavat keskiarvoa ± SEM kuudesta riippumatonta mittausta.

PGRMC1 reseptori sisältää N-terminaalisen transmembraanidomeenin (72-135 aa) ja syt-b5 tai hemi /steroidi sitova domeeni [ ,,,0],34]; vastaavia oikeuksia jaetaan sen homologin PGRMC2. Molemmat ilmennetään erilaisissa ihmisen kudoksissa, mukaan lukien sydän, maksa, ja istukka [35], ja yli-ilmennetään monissa syöpäsolutyyppien [36-38]. PGRMC1 sitoutuu P4 kanssa kohtalainen affiniteetti ja välittää P4 antimitoottisena ja antiapoptoottisia toimintaa. Se on lokalisoitu solukalvon sytoplasmaan ja ydinvoiman kalvot, mikä selittää sen mahdolliset osallistumista nopean ei-genomista progesteroni signaaleja. Äskettäin PGRMC1 todettiin tiukasti korreloi Sigma-2-reseptoreihin [39], huolimatta joitakin kiistanalaisia ​​tuloksia [40].

mPRs (MW 40 kDa) on ensiksi eristettiin meritaimenta [41] ja edustaa vähintään viisi alatyyppiä eli α, β, γ, δ ja ε liittyvät tiukasti Progestiinipohjaisia ​​ja adiponektiini-Q-reseptori (PAQR) perhe [42]. Niiden tehokas läsnäolo ja luonnon progestiinireseptoreiden on perustettu vuosien jälkeen keskustelun [43]. Nämä reseptorit ovat suuri affiniteetti P4 (Kd 5 nM) ja saattaa välittää nopeaa reagointia niin ollen kytketty suoraan G-proteiinit [32, 44]. Sekä PGRMC1 ja mPRα reseptorit pystyvät nopeasti vastata P4 ärsyke, ja näin ollen määrittää kasvua [Ca

2 +]

c iältään endoplasmic myymälöissä [45, 46]. Ottaen huomioon, miten nämä proteiinit vuorovaikutus [30], on mahdollista, että ne edustavat mole- tavoitteet p1932.

rakenteelliset piirteet p1932 viittaavat vahvasti siihen, tämä peptidi mahdollisena interaktoreiden on Proline-Rich Recognition Domains (PRDs) , ja erityisesti SH3 domeenit [46, 47]. Saavuttaakseen välinen sitoutuminen runsaasti proliinia sekvenssin ja SH3 domeeni, -PxxP- ydin on oltava läsnä ligandin sekvenssi. Lisäksi emäksinen tähde, joka reunustaa -PxxP- ydin on tärkeä määriteltäessä vuorovaikutuksen spesifisyyden määrittämiseksi kahden kanonisen konsensussekvenssien: Luokka I -PxxPxx (R /K) ja luokan II – (R /K) xPxxP- [48 ]. Läsnäolo kolme -PxxP- konsensus ydintä, ja lisäksi kun läsnä on luokan II motiivin C-terminaalinen alue p1932 (NH

2-

1GPPPQGGNKP

10QGPPPPGKPQ), jossa sijaitsee estävä aktiivisuus, voimakkaasti tukevat olettamusta, että p1932 voidaan kohdistaa SH3 verkkotunnuksia. NPR tiedetään olevan vuorovaikutuksessa c-Src: n SH3 domain kautta proliini-rikas alue [49], mutta puute tämän reseptorin PJ15 soluissa, kuten johtui proteomic ja western-blot-analyysit, sääntöihin tätä mekanismia. PGRMC1 reseptori on sen sijaan hyvin ilmaistaan ​​tässä solulinjassa, mikä viittaa siihen, se on todellinen reseptori reagoi P4 ärsykkeiden PJ15 soluissa. Transmembraaninen alue PGRMC1 hallussaan oletetun SH3 tavoite konsensussekvenssejä Crk /Grb2 /Abl: n ja Src-kinaasien, kun hemi sitova domeeni sisältää konsensussekvenssin Lck /Abl-P tyrosiinikinaasit ja ERK1 [47], kuten myös ennustettu, että