Krooninen sairaus

tiivistelmä

FBP1, fruktoosi-1,6-bisphosphatase-1, joka on glukoneogeneesiä säätelyentsyymi, katalysoi fruktoosi-1, 6-bifosfaatin fruktoosi-6-fosfaatin epäorgaanista fosfaattia. Mekanismi, että se toimii antagonisoida glykolyysin ja sen epigeneettiseltä inaktivoidaan NF-kappaB-reitin mahasyövän on raportoitu. Kuitenkin sen rooli maksassa syövän synnyn edelleen tuntematon. Täällä, tutkimme ilmaisun ja DNA metylaatio FBP1 perusterveydenhuollossa HCC ja paksusuolen kasvain. FBP1 on lowly ilmaistu 80% (8/10) ihmisen maksasyövän, 66,7% (6/9) maksasyövän solulinjoja ja 100% (6/6) koolonsyöpäsolulinjoissa, mutta oli suurempi pariksi viereisen ei-kasvainkudoksia ja kuolemattomaksi normaali solulinjoissa, joka oli hyvin korreloi sen promoottorin metylaatiostatuksen. Metylointi edelleen havaittu ensisijainen HCCs, maha- ja paksusuolen kasvain kudosten, mutta mikään tai satunnaisesti pariksi viereisen ei-kasvainkudoksia. Yksityiskohtainen metyloituvuutta 29 CpG sivustoja yhdellä 327 emäsparin promoottorialueen bisulfiitti genomista sekvensointia vahvisti metylaatio. FBP1 hiljentäminen voitaisiin kääntää kemiallisen demetylaation käsittelemällä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (atsa), mikä osoittaa suoraan epigeneettiset hiljentäminen. Palauttaminen FBP1 ilmentyminen alhainen ilmaisi soluissa merkittävästi esti solun kasvua ja pesäkkeiden muodostuminen kyky indusoimalla G2-M-faasin solusyklin pysähtymiseen. Lisäksi havaitut vaikutukset samaan aikaan kasvu reaktiivisen hapen (ROS) tuotannossa. Yhteenvetona epigeneettiset inaktivaatio FBP1 on yleinen myös ihmisen maksan ja paksusuolen syöpä. FBP1 näyttää olevan toimiva tuumorisuppressori mukana maksan ja paksusuolen karsinogeneesin.

Citation: Chen M, Zhang J, Li N, Qian Z, Zhu M, Li Q, et ai. (2011) Promoottori hypermetylaation välittämä alassäätely FBP1 Human maksasyövän ja paksusuolen syövän. PLoS ONE 6 (10): e25564. doi: 10,1371 /journal.pone.0025564

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 05 syyskuu 2011; Julkaistu: 19 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Major Science and Technology Special Project Kiinan Yhdestoista viisivuotissuunnitelman (nro 2008ZX1002-004), Kiinan valtion Basic Research Foundation Grant (2007CB512904), Shanghai Sci ja Tech Research Program (08JC1403900), ja ohjelma erinomaisesta Medical Academic Leader of Shanghai (08GWD19). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on edelleen kolmanneksi yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti ja toiseksi yleisin maligniteetti Kiinassa. Molekyyli patogeneesi HCC edelleen suurelta osin tuntemattomia. On oletettu, että kehittymistä ja etenemistä HCC ovat seurausta kumulatiivisen geneettisen ja epigeneettiset tapahtumat. CpG hypermetylaation toimii vaihtoehtona mekanismi geenin toiminnan lopettamisesta, ja se on nyt tunnustettu tärkeä mekanismi aikana kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen, mukaan lukien maksasyöpä [1], [2]. On tärkeää ja kiehtova tunnistaa uusia geenejä vaiennetaan promoottori hypermetylaation maksasyöpää koska poikkeavasta tuumorisuppressorigeeniä (APT) hypermetylaation on sekä mekanismi ja biomarkkereiden kasvaimien synnyn [3].

FBP1, fruktoosi-1, 6-bisphosphatase 1, joka on glukoneogeneesiä säätelyentsyymi, katalysoi fruktoosi-1,6-bisfosfaatti- fruktoosiksi 6-fosfaatti ja epäorgaaninen fosfaatti. Fruktoosi-1,6- difosfataasi vajaukseen liittyy hypoglykemia ja metabolisen asidoosin. Kerrottiin [4], että FBP1 joka toimii antagonisoida Glykolyysivaiheen oli vaimentua läpi NF-kappaB reitin Ras-transformoitujen NIH3T3-solut. NF-kappaB toimintoja alavirtaan Ras edistää epigeneettisiä downregulation FBP1. NF-kappaB päinvastaiseksi promoottori metylaatio välittämän FBP1 downregulation. Lisäksi promoottori metylaatio FBP1 oli merkitystä mahasyövän, esimerkiksi sukupuoli, TNM vaiheissa ja eloonjäämisaste oli merkitsevästi yhteydessä FBP1 promoottori metylaatio. Lisäksi tutkittiin [5], että FBP1 promoottori metylaatio edistää vähentynyt ilmentyminen FBPase rintasyövässä. Kun ei-pahanlaatuisten ja pahanlaatuista kudosta näytettä samasta potilaasta verrattiin korrelaatio kasvua FBPase promoottorin metylaation ja vähennys FBPase mRNA-tasojen havaittiin. Ei kuitenkaan havainnot näkyvät FBP1 epigeneettiset inaktivaatioon maksassa karsinogeneesissä.

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), kemiallisesti reaktiivisia molekyylejä, jotka sisältävät happea, kuten happi-ionit ja peroksideja, ovat keskeisiä välittäjiä solujen oksidatiivista stressiä ja redox säätelyhäiriötä osallisina syövän taudin alkamisen ja etenemisen. Nyt on yleisesti hyväksytty, että konstitutiivisesti kohonneet solun oksidatiivisen stressin ja riippuvuutta mitogeenisesta ja antiapoptoottisia ROS-signalointi syöpäsoluissa ovat mukana syövän synnyn. Paradoksaalisesti lisäksi olla mukana proliferatiivisen, anti-apoptoottiset, metastasoitunut, ja angiogeenisen signalointi, ROS voi myös käyttää sytotoksisten ja proapoptoottiset toimintoja, jotka rajoittaisivat tuumorigeenisyyteen ja pahanlaatuisten etenemisen [6], [7]. FBP1 on monitoiminen proteiini, joka on lisäksi tehtävänsä glukoneogeneesiä, mukana ROS tuotanto hoidon jälkeen MMS tai kronologisesti vuotiaiden soluissa [8]. Koska FBP1 solujen hengissä MMS hoito paremmin ja jopa lisääntyä jälkeen pitkäaikaisen hoidon. Tämä voi olla seurausta siitä, että tuotannon ROS havaittu ΔFBP1 mutantti vastauksena alkylointiaineen methylmethane naatti (MMS) käsittely ja ikääntyminen. Puute FBP1 parantaa elossa vuotiaista solujen kokonaan keskipitkällä ja johti viivästynyt induktioon ROS tuotanto. Yliekspressio FBP1 vähensi kyky muodostaa pesäkkeitä jopa käsittelemättömiin viljelmiin, lyhentyä ja lisäsi induktio RNR2 promoottorin jälkeen MMS-hoidon.

Tässä me osoitimme, että FBP1 tehtiin promoottori CpG hypermetylaation liittyvän hiljentäminen ihmisen maksan ja paksusuolen syöpä. Analyysi maksan ja paksusuolen syövän solulinjoissa ja kudoksissa osoitti, että FBP1 hypermetylaation oli yleinen tapahtuma ihmisen maksan ja paksusuolen syöpä. Osoitimme myös, että FBP1 toimii TSG tukahduttaa syöpäsolujen kasvua induktion G2-M-faasin solusyklin pysähtymiseen ja kasvu ROS tasoilla. Epigeneettiset muutokset solujen redox homeostaasin ja ROS tasoilla vaikuttaa elinkelpoisuus kautta redox modulaatio mitokondrion läpäisevyyden siirtyminen pore avaaminen johtaa sytokromi C julkaisu, apoptosome kokoonpano ja aktivaatio pyöveli kaspaasien, joka tukee ROS-suunnattu syövän kemoterapeuttiset.

Materiaalit ja menetelmät

Cancer Cell Lines, primäärikasvain kudokset ja RNA /DNA Extraction

Yhdeksän ihmisen maksasyövän solulinjoja (HepG2, Hep3B, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H ja MHCC-97L) käytettiin HCCs analyysiä. Yksi ikuisti normaalin ihmisen maksan solulinjoja L02 käytettiin ”normaalia” säätimet HCCs analyysiä. Kuusi ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa (HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo ja RKO) käytettiin paksusuolensyöpä analyysiä ja ihmisen normaali aikuisen paksusuolen kudoksiin käytettiin ”normaalia” valvontaa. Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., USA). Ellei erikseen mainita, soluja viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95%: n kosteudessa. Farmakologisen demetylaatio, soluja käsiteltiin 5 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (atsa) (Sigma, St. Louis, Mo., USA) 3 peräkkäisenä päivänä. Viljelyväliaine vaihdettiin 24 tunnin välein. Vastaava pitoisuus ajoneuvon (DMSO) käytettiin kontrollina.

Ensisijainen HCCs saatiin maksasyövän potilaiden Huashan sairaalassa leikkauksen aikana; täsmäsi ei-kasvain näytteet maksasyövän potilaista saatiin myös vähintään 2 cm: n etäisyydellä kasvain. Ei-kasvain osat leikattiin pois jäädytettyjen kasvain lohkot ja valitun kasvain alueilla oli yli 80% tuumorisoluja, kuten varmistettiin histologisesti. Ihmisen mahalaukun, paksusuolen kasvain kudosten ja normaalin aikuisen paksusuolen kudokset toimittivat kiinalaisen lääketieteen sairaalassa Zhejiangin. Kaikki potilaat antoivat tietoon perustuva suostumus saamiseksi tutkimuksessa näytteet.

Yhteensä RNA ja genominen DNA uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA: n ja DNA-pitoisuudet määritettiin kvantitatiivisesti NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, Del., USA).

Real-Time RT-PCR

Käänteistranskriptioreaktio suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais- RNA High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia., USA). MRNA ekspressiotasot FBP1 määritettiin Real-Time RT-PCR: llä käyttäen SYBR Green Master Mix Kit ja ABI 7500 Real-Time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia., USA). Glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina RNA eheyden. Real-Time RT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena. Käytetyt alukkeet FBP1 olivat: FBP1-F 5′-ATCCCCTTGATGGATCTTCC-3 ’ja FBP1-R 5′-TCCAGCATGAAGCAGTTGAC-3’ (208 bp tuote).

bisulfiittikäsittelyn DNA: ta ja metylaatiospesifinen PCR

Perimän DNA oli bisulfiitti-käsitelty Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, Kalifornia., USA) protokollan mukaisesti tarjotaan. Metylaatiospesifinen PCR (MSP) suoritettiin 40 sykliä, joissa hehkutus lämpötila 60 ° C: ssa. Metylaatiospesifistä alukkeet olivat: FBP1-MF 5′-TGAAGATTTAAGTAGGCGGAGTC-3 ’ja FBP1-MR 5′-ATAAACACTAACCG CAAATACGAA-3′, ja unmethylation alukkeet olivat: FBP1-UF 5’-GAAGATTTAAGTA GGTGGA GTTGTG-3 ’ja FBP1 -UR 5’-CTAACAAAAAAACTAACAAACCAAC-3 ’.

bisulfiittimodifiointi genominen sekvensointi

bisulfiittimodifiointi-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin käyttäen bisulfiitin genomista sekvensointia (BGS) alukkeet, FBP1-BF: 5′-TGATTTTGGAGGAAATAGTTATAGTTTTT- 3 ’ja FBP1-BR: 5′-TAATACAACTAAACCAAACCAAAC-3’. PCR-tuotteet puhdistettiin Illustra GFX ™ PCR ja geelivyöhykkeestä puhdistustarvikepakkausta (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Ruotsi) ja kloonattiin pCR4-TOPO-vektoriin sekvensointia (Invitrogen). Ainakin neljä pesäkkeitä satunnaisesti valittu plasmidi uuttamalla ja sekvenssianalyysi käyttäen ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, että ABI 3100 sekvensseri (Applied Biosystems).

rakentaminen FBP1 ilmentävien Vector

FBP1 ilmentävät konstruoitiin kloonaamalla täyspitkä FBP1 avoimen lukukehyksen nisäkkään ekspressiovektoriin pcDNA3.1. Täyspitkän FBP1 avoin lukukehys monistettiin normaalista mahalaukun cDNA käyttäen hifi-PFU-DNA-polymeraasia (Invitrogen). Käytetyt alukkeet kloonaukseen olivat FBP1-CF: 5′-CGGAATTCCGATGGCTGACCAGGCGCCCTTCGA-3 ’ja FBP1-CR: 5′-GCAAGCTTCCTGGGCAGAGTGCTTCTCATACACC-3’ accomp- anied kaksinkertainen entsyymi leikkaa sivustoja EcoRI: llä ja HindIII: lla. Sekvenssi ja suunta insertin varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Colony muodostumisen määritys

Ihmisen maksan syöpäsolujen ohimenevästi transfektoitu pcDNA3.1 tyhjällä vektorilla tai pcDNA-FBP1 ilmentävällä vektorilla käytettiin yksikerroksista pesäkemuodostusta arvioimaan solujen kasvua in vitro. Soluja viljeltiin yön yli 12-kuoppalevylle (5 x 10

5 solua /kuoppa) ja transfektoitu pcDNA3.1 tyhjän vektorin tai pcDNA-FBP1 ilmentävällä vektorilla käyttämällä FuGENE 6 (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, transfektantit maljattiin uudelleen kolmena kappaleena ja viljeltiin 10~15 päivää täydellisessä DMEM-väliaineessa, joka sisälsi G418: aa (400 ug /ml). Elossa pesäkkeet värjättiin Gentian Violet jälkeen metanolia kiinnitys ja näkyviä pesäkkeitä (≥50 solut) laskettiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Cell Growth määritys

Solut kasvu määritettiin ei-radioaktiivista lisääntymisen määrityksessä perustuu kykyyn metabolisesti aktiivisten solujen muuntaa 3- (4,5- dimetyylitiatsol-2-yyli) -5 (3-carboxymethonyphenol) -2 – (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) osaksi formatsaanin. Elossa G418-valinnan jälkeen maljattiin uudelleen 96-kuoppalevylle, jossa eri solujen lukumäärä ja viljeltiin täydellisessä DMEM-väliaineessa, joka sisälsi G418: aa (400 ug /ml) vielä 72 tunnin ajan. Määrä formatsaanin mitattiin kuten yllä. Määrä formatsaanin mitattiin 490 nm: ssä absorbanssista tunnin kuluttua inkubaation CellTiter 96 vesikerros Ratkaisu Reagent seuraavia ohjeita.

Cell Cycle analyysi ja määritys ROS Production

Elossa G418-valinnan jälkeen käsiteltiin trypsiinillä, pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla-fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta. Pesun jälkeen pois etanolia, kiinteä soluja käsiteltiin 0,01% RNaasi (10 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja värjättiin sitten 0,05% propidiumjodidilla 20 minuuttia 4 ° C pimeässä. Solusyklin jakautumisen määritettiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) ja analysoitiin Modfit ohjelmisto (Phoenix, San Diego, CA, USA). Solut apoptoosin havaittiin kuin osa-G1 väestö häviämisen vuoksi hajanainen DNA.

ROS mitattiin käyttäen 2′-7′-Dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) (Invitrogen) kanssa virtaussytometrialla määritys kuten on kuvattu [9].

Tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Student

t

testiä käytettiin vertaamaan eroja FBP1 ilmentymisen vaikutuksesta pesäkkeiden muodostumisen ja solujen lisääntymistä. Kaikki tilastolliset laskelmat tehtiin käyttäen SPSS versio 11.0 for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Arvo

P

0,05 otettiin tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

alassäätely FBP1 ihmisen maksan ja muiden Digestive Syövät

ilmaus FBP1 dramaattisesti vaimentua 66,7% (6/9) ihmisen maksasyövän solulinjoja kuten HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H ja MHCC-97L (kuvio 1A) verrattuna ihmisen normaaliin maksasolut lo2. Samoin, downregualtion on FBP1 todettiin myös 100% (6/6) ihmisen paksusuolen syövän solulinjojen HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo ja RKO (kuvio 1A) verrattuna ihmisen normaalin aikuisen paksusuolen kudoksessa. Jotta tietää, onko downregulation FBP1 olisi johtuvan DNA: n metylaatio, ilmaus FBP1 ihmisen maksan ja paksusuolen syövän solulinjat ennen ja jälkeen Aza hoidon määritettiin Real-Time RT-PCR: llä. Ilmentyminen FBP1 merkittävästi yläreguloituja maksasyövän solulinjoissa HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H ja MHCC-97L (6/9, 66,7%) jälkeen atsa hoidon (kuvio 1 B) ja myös paksusuolen syöpäsolulinjoissa HT29, SW620, LoVo ja RKO (4/6, 66,7%) (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että FBP1 on todennäköisesti vaimentua kautta promoottorin hypermetylaatio ihmisen maksan ja paksusuolen syöpä.

(A) FBP1 ilmentyminen ihmisen maksan ja paksusuolen syövän solulinjat ja normaalit kontrollit määritettiin Real-Time RT-PCR: llä. GAPDH käytettiin normalisoimaan malli määrää. (B) Suhteellinen FBP1 ilmentyminen ennen ja jälkeen Aza hoidon määritettiin Real-Time RT-PCR: llä. GAPDH käytettiin normalisoimaan malli määrää. Se näkyi keskimäärin kertamuutoksia ± SD.

metylointi FBP1 Promoottori Human Liver ja koolonsyöpien

Itse yksi tyypillinen CpG Islands (CGI) havaittiin noin FBP1 eksoni 1 käyttämällä seuraavat kriteerit: GC-pitoisuus 55%, Obs CpG /Exp CpG 0,65, ja pituus 500 bp (kuvio 2A). Metylaatiostatuksen Tämän CGI ihmisen maksan ja paksusuolen syövän soluja määritettiin MSP. Kuten on esitetty kuviossa 2B, metylaatio FBP1 promoottorin havaita helposti maksasyövän solulinjoissa HepG2, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H ja MHCC-97L, ja ihmisen paksusuolen syöpä solulinjat HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo- ja RKO. Lisäksi BGS paljasti myös, että FBP1 promoottori oli raskaasti metyloitu HepG2, Huh7, BEL-7402 solut ja 8T kasvainkudoksen, eikä metylaatio dedtected vuonna 8N viereisen ei-kasvainkudoksessa (kuvio 2C).

(A ) Kaaviokuva rakenne FBP1 CGI, jossa eksonin 1 ja MSP ja BGS ilmoitetulla alueella. Jokainen lyhyt pystysuora viiva edustaa yhtä CpG-sivuston. Asema MSP-alukkeet merkitty nuolilla. Metylaatiostatuksen on FBP1 CGI analysoitiin MSP (B) ja BGS (C). MSP = Metylaatiospesifinen PCR; USP = Unmethylation-spesifinen PCR. Sillä BGS in (C), kukin ympyrä ilmaisee yhden CpG päällä ja ympyröitä täytetty mustalla edustavat metyloitu CpG sivustoja. Yksi rivi ympyröitä, edustaa yksi pesäke.

alassäätely ja Promoottori hypermetylaatiota FBP1 Human primaarikasvaimen kudokset

edelleen varmistamiseksi merkitystä FBP1 promoottorin CGI hypermetylaation välittämisessä sen hiljentämisen ihmisen maksan, mahalaukun ja paksusuolen syöpään, FBP1 ilmaisun ja promoottorin metylaatio ensisijainen maksasyövän, mahalaukun ja paksusuolen kasvaimen kudokset ja viereisen ei-kasvaimen kudokset analysoitiin Real-Time RT-PCR: llä ja MSP, vastaavasti. FBP1 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua 80% (8/10) ihmisen maksan tuumorikudoksissa, 100% (5/5), mahan ja 80% (4/5) paksusuolen kasvaimen kudokset (kuvio 3A) verrattuna viereisen ei-kasvainkudoksia . Lisäksi, promoottori metylaatio usein havaittu käyttäen MSP kasvaimen näytteissä, mutta ei ei-tuumorikudoksissa (kuvio 3B), mikä osoittaa, että downregulation FBP1 oli mukana karsinogeneesi ihmisen maksassa ja muissa ruoansulatuskanavan syöpiin.

( A): n ekspressio FBP1 maksassa, mahalaukun ja paksusuolen kasvaimen kudokset ja viereisen ei-tuumorikudoksissa määritettiin Real-Time RT-PCR: llä. 1~10 T /N: maksasyövän, 11-15 T /N: mahasyövän, 16~20 T /N: paksusuolensyöpä. (B) metylaatiostatuksen FBP1 promoottorin ensisijainen maksan, mahan ja paksusuolen kasvaimen kudokset ja viereisen ei-tuumorikudoksissa havaittiin MSP. Edustavia Tulokset on esitetty. 1~3 T /N: maksasyövän, 4~5 T /N: paksusuolensyöpä, 6~9 T /N: mahasyövässä. ”T” osoittaa kasvain kudosten ja ”N” edustaa viereisen ei-tuumorikudoksissa.

FBP1 Yliekspressio Alennettu Cancer Cell Colony Formation kyvyt ja esti kasvu Maksa ja koolonkarsinoomasoluissa

Ulkoisten FBP1 ilmentymisen kasvuun ihmisen maksan syöpäsolujen tutkittiin yksikerroksinen pesäkemuodostusta. Jotta voitaisiin edelleen tutkia mahdollista roolia FBP1 kasvaimen suppression, maksasyövän solut SMMC-7721 ja paksusuolen syövän SW480 transfektoitiin pcDNA-FBP1 ilmentävällä vektorilla ja solujen pesäkkeiden muodostumista kyky tutkittiin alla valinnan G418: aa. Verrattuna kontrolli transfektoitu tyhjällä vektorilla pcDNA3.1, syöpäsolut, jotka oli transfektoitu pcDNA-FBP1 ilmentävällä vektorilla osoitti laski pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että FBP1 voi olla rooli kasvaimen tukahduttaminen. Lisäksi FBP1 stabiili ekspressiotasot näissä soluissa, mukaan lukien SW480 ja SMMC-7721 vahvistettiin myös Real-Time RT-PCR: llä, kuten on esitetty kuviossa 4A.

(A) FBP1 ilmentymistaso transfektoiduissa SW480 ja SMMC- 7721 soluihin varmistettiin Real-Time RT-PCR. (B) vaikutus Kohdunulkoisten FBP1 ilmentymisen maksassa syöpäsolujen kasvua tutkittiin yksikerroksista pesäkemuodostusta. Skannattu pesäkkeiden muodostumista kuuden kuoppalevyillä on esitetty paneelin .. (C) kasvu maksan ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa (SW480 ja SMMC-7721) kanssa ja ilman FBP1 ilmentyminen määritettiin MTS-solujen kasvun määrityksessä. Stabiili ilmentyminen FBP1 tukahdutti kasvun maksan ja paksusuolen syöpäsoluissa. Tulokset on esitetty arvoina keskiarvo ± SD. P-arvot laskettiin käyttäen Studentin t-testiä (* p 0,05).

Kun pcDNA-FBP1 transfektoitiin SW480 ja SMMC-7721-solujen kasvua inhiboiva toiminta FBP1 näissä soluissa varmistettiin MTS solukasvumäärityksessä. PcDNA-FBP1 ilmentävät transfektoitiin näiden solujen kasvun nopeuden ihmisen maksan ja paksusuolen syövän soluissa, sen jälkeen FBP1 yli-ilmentyminen väheni dramaattisesti MTT solukasvumäärityksessä (p 0,05; kuvio 4C), kasvua suppressoiva vaikutus FBP1 on syöpäsoluja.

ektooppinen ilmentyminen FBP1 indusoiman G2-M-vaiheen pysähtymisen

määrittää molekyyli- mekanismin, jonka FBP1 tukahdutti pesäkkeiden muodostumisen ja solujen proliferaatiota, olemme tutkineet vaikutusta FBP1 solusyklin jakautuminen . Jälkeen propidiumjodidivärjäys, fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu analyysi FBP1 yli-ilmennetään SW480 ja SMMC-7721-soluissa paljasti, kasvusta määrän G2-M-vaiheen soluissa ja väheneminen määrä S-vaiheeseen soluja (kuvio 5A ja 5B).

solusyklin jakautuminen maksan ja paksusuolen syövän solulinja (SW480 ja SMMC-7721) kanssa ja ilman FBP1 ilmentyminen arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. (A) ja (B) edustaja fluoresenssin aktivoitujen solujen lajittelua analyysi syöpäsolujen transfektoitu tai ilman FBP1.

FBP1 yliekspressio solunsisäinen ROS Production

ROS: n tasot mitattiin syöpäsolut transfektoimattomia ja transfektoitu pcDNA-FBP1 ilmentävällä vektorilla. Eksogeeninen FBP1 ilmaisu selvästi lisääntynyt solunsisäinen ROS tasoilla SMMC-7721 ja SW480-soluissa (kuvio 6A ja 6B). Siksi FBP1 voisi lisätä ROS jotka aiheuttavat sytotoksisia ja proapoptoottiset toimintoja ja rajoittaa tuumorigeenisyyteen ja pahanlaatuisia etenemisen.

vaikutus Kohdunulkoisten FBP1 ilmaisun oksidatiivista stressiä määritettiin virtaussytometrialla määrityksessä kuvan (A) ja (B ). Vakaa solut värjättiin DCFH-DA, ja sitten redox-tila-solujen mitattiin virtaussytometrialla.

Keskustelu

enemmän ja enemmän uusia tuumorisuppressorigeeneille on todettu olevan inaktivoitu promoottoriaktivoinnilla hypermetylaation. Promoottori metylaatio ollen ehdotetaan tärkeä merkki tunnistamiseksi uusien tuumorisuppressorigeeneille. Nykyisessä tutkimuksessa, tunnistimme että FBP1 oli usein säädellä vähentävästi 66,7% HCC solulinjojen ja 100% koolonsyöpäsolulinjaa (kuvio 1A) ja 80% ensisijainen HCCs, 100% mahalaukun kasvaimet ja 80% koolontuumoreissa (kuva 3A). Hypermetylaation edelleen havaittiin 66,7%: HCC-solulinjoissa ja 100% koolonsyöpäsolulinjoissa (kuvio 2B), ja myös primaarisen kasvaimen kudoksissa (kuvio 3B). Sen sijaan, FBP1 hypermetylaation tuskin havaittiin normaalissa maksassa solulinjoissa ja satunnaisesti pariksi viereisen ei-tuumorikudoksissa, mikä viittaa siihen, on tärkeä rooli FBP1 patogeneesissä maksan ja muiden ruoansulatuskanavan syöpiin. Olemme lisäksi osoittaneet, että hoidon demetylaation reagenssin Aza yliaktiivista FBP1 ilmentymistä nöyrä ilmaistaan ​​syöpäsoluissa (kuvio 1 B) ja metylaatiostatuksen varmistettiin genomista sekvensoinnilla, mikä osoittaa, että DNA hypermetylaation välittämä FBP1 inaktivoitumista.

sairastavien dynamiikka geneettisten ja epigeneettiset geenien ovat hyvin erilaisia. Somaattisten geneettinen mutaatio johtaa lohkon tuotannon funktionaalisen proteiinin mutantti alleeli. Jos valikoivaa etu myönnetty soluun, solut laajentaa klonaalisesti aiheuttaa kasvain, jossa kaikki solut puuttuu kyky tuottaa proteiinia. Sen sijaan epigeneettiseltä välittämä geenien tapahtuu vähitellen. Se alkaa hienovarainen väheneminen transkriptio, edistää lasku suojan CpG saaren leviämisen reunustavien heterochromatin ja metylaation osaksi saaren. Tämä menetys johtaa vähitellen kasvaa yksittäisten CpG sivustoja, jotka vaihtelevat välillä kopiota samasta geenistä eri soluissa. Esimerkiksi korkeampi FBP1 havaittiin Huh7 ja HCC-LM3 solujen korkean metylaation taso promoottorialue (kuvio 1A ja 2B). Vaikka promoottori metylaatio usein inaktivoitu FBP1 ihmisen maksan ja paksusuolen syövän solulinjoissa, emme voi sulkea pois osallistumista muita mekanismeja vastuussa FBP1 downregulation, kuten vikoja histoni remodeling. Esimerkiksi Hep3B, Huh7, HCC-LM3, SW480 ja HCT116-solut, FBP1 promoottori epäonnistui täysin voimistuvan jälkeen Aza hoidon (kuvio 1 B).

Lisäksi palvelemaan uutena merkki määritellä uusia tuumorisuppressorigeeneille, promoottorin hypermetylaatio voidaan käyttää myös herkkänä markkerina syövän diagnoosissa ja prognoosissa ennustus [10], [11]. Valitettavasti puutteessa suuria määriä kasvain kudosten, emme voineet testata FBP1 metylaation runsas kudoksissa ja analysoida edelleen sen yhteyksiä kliinisiin ominaisuuksiin, kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen ja eloonjäämisaste. Meillä oli määrittää FBP1 ilmaisun ja metylaatiostatuksen vain 10 paria ensisijaisen HCCs, 5 paria mahakasvaimen kudosten ja 5 paria paksusuolen kasvaimen kudosten (kuvio 3), mikä viittaa siihen, että FBP1 toimii uutena tuumorisuppressori ehdokas vaimentua kautta promoottorin hypermetylaatio vuonna maksan ja paksusuolen syöpä. Tämä on myös ensimmäinen raportti osoittaa, että FBP1 on epigeneettiseltä vaiennetaan ihmisen maksan ja paksusuolen syövän syntymistä. Kun FBP1 promoottorin metylaation havaittiin korkealla taajuudella primäärikarsinoomaan kudoksissa, mutta ei ei-kasvain normaaleissa mahan kudoksissa, FBP1 promoottori metylaatio saattaa olla mahdollinen biomarkkeri syövän diagnosointiin.

Kuten on esitetty kuviossa 4, palauttaminen FBP1 ekspressio suppressoitui merkittävästi syöpäsolujen kasvua. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismia vastuussa FBP1 toimii tuumorisuppressorin on edelleen tuntematon. Se on todennettu [4], että FBP1 toiminnot suututtaa Glykolyysivaiheen. Kuten hyvin tiedetään, syöpäsolut on korkeampi aerobinen Glykolyysivaiheen, mutta ei oksidatiivinen fosforylaatio. Fruktoosi-1,6-bisfosfaatin on yksi tärkeitä välituotteita glykolyysissä ja sen taso on pääasiassa ohjataan fruktoosi-6-fosfaatti-kinaasin ja fruktoosi-1,6- bisphosphatase. Todettiin, että laktaatin jälkeen FBP1 ilmentyminen väheni merkittävästi, mikä osoittaa tukahduttaminen aerobisen glykolyysin mukaan FBP1. Sitä paitsi, solusyklin tarkastuspisteitä ovat tärkeitä valvontamekanismit että asianmukaisen toteuttamisen solusyklin tapahtumia. Kasvun suppressio aiheuttama ektooppinen FBP1 ilmentyminen näyttää johtuvan solusyklin pysähtymisen jälkeen numerot solut solukierron tukos (G2-M-vaiheen pysähtymisen) lisättiin sen jälkeen, kun FBP1 uudelleen ilmentyminen (kuvio 5).

Jo pitkään, ROS katsottiin onkogeenisiä, koska se on osallisena syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Pysyvät oksidatiivista stressiä on liittynyt rintasyöpä ja monet epiteelisyövissä kuten paksusuolen ja kaulan syöpiin [12]. Kuitenkin lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet aiheuttava osallistumista ROS muodostuminen sovittelu syöpäsolun indusoiman apoptoosin eri standardia kemoterapia-aineiden kuten paklitakselin, sisplatiini, bortetsomibin ja etoposidin. Merkillistä, on osoitettu, että sisplatiini apoptogenicity riippuu muodostumista ROS ja tapahtuu riippumaton tuman DNA vaurioita, mikä viittaa siihen, että apoptogenic oksidatiivista stressiä on ratkaiseva mekanismi sisplatiinin aiheuttama syöpä solukuolemaa [13]. Lisäksi aiheuttaa solusyklin pysähtyminen S-vaiheeseen, tärkeintä tässä tutkimuksessa, kasvua estävää vaikutusta FBP1 tuumorisuppressorina voi johtua myös tehostamalla tuotantoa solunsisäisten ROS (kuvio 6). Meidän havainnot olivat yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu tietoja [8] osoittaa fruktoosi-1,6-bisphosphatase välittää soluvasteita DNA-vaurioita ja ikääntymisen Saccharomyces cerevisiae. Mutta miten ROS käyttämään sytotoksista ja proapoptoottiset toimintoja, jotka rajoittaisivat tuumorigeenisyyteen ja pahanlaatuiset etenemistä, ehdotettiin, että muutokset solujen redox homeostaasin ja ROS tasoilla vaikuttaa elinkelpoisuus kautta redox modulaatio mitokondrion läpäisevyyden siirtyminen pore avaaminen johtaa sytokromi C julkaisu, apoptosome kokoonpano, ja aktivaatio pyöveli kaspaasien, jos solu ROS tasoilla saavuttavat tietyn kynnyksen ristiriidassa solun selviytymisen [7], [14].

Yhteenvetona olemme huomanneet, että FBP1 usein vähennetään promoottori hypermetylaation useimmissa maksan ja paksusuolen syöpäsolun linjat ja primaarikasvaimen kudoksiin. Meidän tulokset viittasivat siihen, että epigeneettisten inaktivointi FBP1 oli tärkeä tekijä ihmisen maksan ja paksusuolen karsinogeneesin. Olemme myös osoittaneet, että promoottori hypermetylaation välittämää vaiennettu FBP1 voitaisiin kumota farmakologinen demetylaation ja palauttaminen FBP1 tukahdutti kasvaimen solujen kasvua indusoivan G2-M-faasin solusyklin pysähtymiseen ja kasvu ROS sukupolvi. Siksi on arvokasta tutkia mahdollisesta soveltamisesta FBP1 kuin molekulaarinen merkkiaine havaitsemiseen ja hoitoon nämä syöpäsairauksia.

Kiitokset

Kiitos herra Wang Cheng pohdinnan auttamiseksi ja tekniset apua. Kiitämme myös Mr. Jiang Jiukun tarjota MHCC-97H ja MHCC-97L HCC solulinjojen ja Dr. Chen Qian tarjota ihmisen mahalaukun ja paksusuolen syöpä kudoksiin.