Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Samalla tavalla kuin normaali kantasolujen erilaistumiseen, nykyinen syöpä kantasolujen (CSC) malli olettaa hierarkkisen organisaation ja peruuttamattomia erilaistumista kasvainkudoksessa. Näin ollen, CSCS tulisi sisältää vain pieni alijoukko kasvainsolujen, joka syöttää kasvaimen kasvua. Kuitenkin viime aikoina havainnot esiin epäilyksiä yleistä käyttökelpoisuutta CSC mallin ja pyydetty hienostuneisuus.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa analysoitiin CSC ominaisuuksia nisäkarsinooman saatujen solujen siirtogeenisistä (WAP-T) hiirissä. Olemme perustaneet erittäin tuumorigeenistä WAP-T-solulinjan (G-2-solut), joka näyttää varsi kaltaisia ​​piirteitä. G-2-solut, samoin kuin niiden klonaalisen johdannaiset, liittyvät läheisesti ensisijainen kasvaimia koskevat histologian ja geeniekspressioprofiilien, ja heijastavat heterogeenisyys koskien niiden erilaistumista toteaa. G-2 viljelmät käsittävät solupopulaatioiden selvä erilaistumiseen valtioissa tunnistetaan koekspressoimalla solun tukirangan proteiinien (sytokeratiineja ja vimentiinista), yhdistelmä solunpintamarkkereiden ja joukko transkriptiotekijöiden. Cellular osajoukot mukaan lajiteltuna ilmaisua CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1, ja Thy1 solunpintaproteiinit, tai metabolinen markkereita (esim ALDH aktiivisuus) ovat toimivaltaisia ​​liuottaa alkuperäiseen solukoostumuksesta. Kannan uudelleen tehokkuus suuresti vaihtelee yksittäisten alaryhmiä ja vaikuttaa vuorovaikutus vastaavien täydentävien G-2 solujen osajoukko. Tasapaino erilaistumista valtioiden säätelee osittain transkriptiotekijä Sox10, kuten ehtyminen Sox10 johti säätely ylöspäin Twist2 ja kasvattanut Thy1 ilmentävien solujen edustaa solujen itsestään uusiutuvien palautuvia, lähes mesenkymaaliset erilaistumisen tilassa .

Johtopäätökset /merkitys

G-2-solut muodostavat itsestään lisääntyvien syöpäsolun järjestelmän ylläpitämä bi- ja yksisuuntainen muuntaminen täydentävien solujen osajoukkoja. Työmme edistää nykyistä kiistanalainen keskustelua olemassaolosta ja luonteesta CSC ja luo perustan sisällyttäminen vaihtoehtoisia hypoteeseja osaksi CSC malliin.

Citation: Wegwitz F, Kluth MA, Manz C, Otto B, Gruner K, Heinleinin C, et ai. (2010) Kasvaimia synnyttävä WAP-T Mouse rintasyöpä Cells: A Model varten itsestään lisääntyvien homeostaattisina Cancer Cell System. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10,1371 /journal.pone.0012103

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2010 Hyväksytty: 14 heinäkuu 2010; Julkaistu: 11 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Wegwitz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Deutsche Forschungsgemeinschaft (De 212 /23-1-3 WD ja GT), Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund ”Tumorstammzellen”) WD ja GT, The VFK Krebsforschung gGmbH WD, ja Fonds der Chemischen Industrie . Heinrich-Pette-instituutti tukee taloudellisesti Freie und Hansestadt Hamburg ja Bundesministerium für Gesundheit. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

määritelmää Rollin Hotchkiss elävän aineen ”, kuten toistuvat tuotantoa tilattu heterogeenisuus” sovelletaan normaalia sekä kasvainkudoksen [1]. Solu heterogeenisyys havaittu monissa kiinteitä kasvaimia, toiminnalliset ja rakenteelliset taso tuo mieleen monimutkaiseen solujen järjestämisestä vastaavien normaalien kudosten. Tämä samankaltaisuus kasvaimen normaaliin kudokseen legitimoi virallisen hakemuksen periaatteiden ja käsitteiden kehitysbiologian syöpätutkimukseen. Malli syövän kantasoluja (CSCS) [2], [3] kuvataan kasvain kuin hierarkkisesti organisoitu kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja niiden eriytetty jälkeläiset. Kuten postulated CSC mallin, pienessä määrässä soluja ajaa kasvaimen kasvua ja vastaa kasvain uusiutumisen jälkeen näennäisesti onnistuneen hoidon. Nämä kasvainsolut, kutsutaan CSCS, kasvaimeen aloitetaan tai tuumorigeenisiä soluja, on tunnusomaista yhdistelmä määritellään toiminnallisesti yhteistä tai ainutlaatuista solun pinnalla liittyvä markkereita ja kyky luoda taudin tarvittaessa vastaanottajan hiirillä [4]. Toisin kuin satunnaismalli klonaalisen evoluution, joka ascribes kasvainsolu heterogeenisyys geneettisiä eroja kasvainsolun altaan [5], CSC malli oletetaan, että epigeneettisellä sijaan geneettisiä eroja erottaa tuumorigeenisia ulkopuolisten tuumorigeenisiä soluja, mikä tarjoaa perustan hierarkkinen sisäisiä suhteita tuumorisolupopulaatioon [6].

Viimeaikaiset havainnot että tuumorigeenisiä soluja voi käsittää merkittävän osa kasvain massa [7] kyseenalaistaa tiukasti hierarkkinen organisaatio kasvainkudoksen [8], ja melko kannattavat ”fenotyyppinen plastisuus” syöpäsoluja [9], ylläpitämä homeostaattiset mekanismien [10]. Siten CSCS ei ole ainutlaatuinen populaatio määritellään erillisten molekyylien ominaisuuksia, vaan yhdessä niiden eriytetty jälkeläiset muodostavat itsestään lisääntyvien ”kantasolu järjestelmä”, jossa solukoostumuksesta säädellään toisikseen eri erilaistumisen valtioiden [9]. Kasvaimet epiteelin alkuperä (karsinoomat) yleensä näyttää korkea histologinen heterogeenisyys heijastaa eri erilaistumista valtioiden yksittäisiä soluja. Perustuu kolmeen fenotyyppinen kriteereihin – cell polarisaatio, solu yhtenäisyyttä ja ekspressiokuviota sytoplasman väli hehkulampun (CIF) proteiineja – on ehdotettu määritellä neljä fenotyyppejä, jotka vaihtelevat puhtaasti epiteelin ja täysin mesenkymaaliset [11]. Näin ollen erilaistumisen tilasta yksittäisten solujen karsinoomat vastaa epiteelin, joka on mesenkymaaliset ja välissä fenotyyppi. Nämä eriyttäminen valtiot voidaan jakaa edelleen vakaa ja ohimeneviä alatyyppeihin, jotka yhdessä kootaan dynaaminen ”ekosysteemin”. Prosessi kutsutaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja sen vastine, kutsutaan mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) [12], [13], kuvaavat muuntaminen vastapäätä erilaistumisen toteaa. Nämä siirtymät on äskettäin liitetty soluun stemness havainto, että induktio EMT ihmisen rintaepiteelin soluviljelymalleissa luo solujen alijoukon, joka on hyvin rikastettu CSCS [14], [15]. Malli nousemassa näiden tutkimusten ehdottaa, että karsinoomien EMT ja MET osuus sukupolven osajoukko soluja, jotka ovat tasapainossa kasvain epiteelin osasto ja pystyvät uudistumaan koko tuumorisolupopulaatioon [9].

Siirtogeeniset ja hiirten tarjota syngeenisen (tai kongeeniset) malleja CSC tutkimukseen, koska ne mahdollistavat luomaan syöpätautien immunokompetenteissa eläimiä, jotka jäljittelevät vastaava ihmisen tilannetta, ja ovat lähde solulinjojen mahdollistaa tutkimusten CSC ominaisuuksia. Kuitenkin soveltuvuus hiirimalleissa on usein rajoittaa se, että vaikutukset onkogeenin ekspressiota, tai tappio tuumorisuppressorigeenin, on kohdistuu jo alkiovaiheessa aikana kudosten kehitystä, kun taas suurin osa ihmisen syövissä geneettisen muutokset johtavat syövän tapahtuu soluissa aikuisten kudoksissa. WAP-T siirtogeenisissä hiirissä [16] – [19], ovat osoittautuneet olevan käyttökelpoinen malli analysointia varten onkogeenin aiheuttaman rintarauhasen syövän synty aikuisilla hiirillä. Naisten WAP-T hiirillä aktivointi siirtogeenin, apinan virus 40 (SV40) varhaisen geenin alue reunustaa ~1.4 kb ylävirtaan geenin, joka koodaa hiiren heran hapan proteiini (WAP) [20], aloitetaan loppuvaiheessa raskaus rintaepiteelisolulinja (ME) solut yhtäpitävä endogeenisen

Wap

geeni [21]. Expression of SV40 varhaisen koodaavien geenien suuren T-antigeenin (LT) ja pieni t-antigeeni (st) ajaa rintarauhasen syövän synnyn matkimalla erilaisia ​​geneettisiä muutoksia yleisesti nähtävissä ihmisen rintakarsinoomissa, kuten kumoamisen pRB-ohjattu G1-tarkistuspisteen [ ,,,0],22], ja inaktivointi kasvaimen p53 [23]. Seurauksena SV40: n varhaisen geenin ilmentymisen, parous WAP-T hiiret kehittävät useita keuhkorakkuloiden leesioita – multifokaalinen intraepiteliaalinen neoplasia (MIN). Jotkut näistä fokaalimuutosten edelleen edetä invasiivisia, mutta harvoin metastaattisen nisäkarsinoomia [19]. Morfologisesti, kasvaimet kehittää WAP-T hiiret ovat adenokarsinoomat, jotka vaihtelevat hyvin huonosti eriytetty fenotyyppiin [16]. Tämän merkitystä mallia korostavat tiivis samankaltaisuus histologia hiiren kasvainten vastaavilla ihmisen kasvaimista [19].

Tässä tutkimuksessa kysyttiin WAP-T kasvaimet paremmin kuvata klassisen CSC mallia tai vaihtoehtoisilla olettamuksia. Huomasimme, että kasvaimia synnyttäviä solut ovat suhteellisen yleisiä WAP-T kasvaimet (enintään 1/10) ja pystyvät kerrata fenotyypin niiden primaarikasvainten jälkeen potilaalle tehdä siirrettäväksi hiirissä. Tutkia niiden tuumorigeenisia ominaisuuksia tarkemmin, loimme WAP-T-kasvain solulinja (G-2-solut). G-2-soluja, joilla on suuri tehokkuus muodostaa kasvaimia hiirissä, jotka geenin ilmentyminen ja fenotyyppianalyysejä liittyvät läheisesti ensisijainen kasvaimia. G-2 soluviljelmissä on ominaista pohjapinta /luminal geeniekspression allekirjoitus, heterogeenisyys erilaistumisen valtioiden ja läsnäolo täydentävät solun osajoukot, joka voidaan erottaa mukaan eroja ilmaisun tiettyjen stemness liittyvien solunpintamarkkereiden. Osoitamme, että tiukasti FACS-erotettu osajoukkoja G-2-solut ovat toimivaltaisia ​​liuottaa alkuperäiseen solukoostumuksesta soluviljelmän kun yksitellen viljellään. Tuloksemme kannattavat itsestään lisääntyvien homeostatic ”syöpäsolun järjestelmä”, jossa tasapaino perustuu toisikseen täydentävän solun osajoukot, niiden välinen vuorovaikutus ja transkription osaamista. Tukeakseen EMT-CSC malli [9], me tunnistettu G-2 kulttuuri itsestään uudistuva solujen populaatio ominaista ilmentyminen Thy1 ja näyttämään spontaani palautuminen lähes mesenkymaalisten erilaistumisen tilassa.

tulokset

WAP-T kasvaimet sisältävät suuren osuuden kasvaimia aiheuttavasta solujen

ratkaiseva kriteeri CSCS on niiden kyky aloittaa kasvaimen kasvua elinsiirron jälkeen sopiviin saajahiiret ja kerrata fenotyyppi alkuperäisen kasvain. Orthotopic elinsiirrot sarjalaimennettua WAP-T kasvainsoluja paljasti, että niinkin alhainen kuin 10

2 soluja hyvin kohtuullisesti erilaistunut (low-grade) kasvaimet, ja niinkin alhainen kuin 10

1 soluja huonosti eriytetty (korkealaatuisesta ) kasvaimet kykenivät indusoimaan nisäkarsinoomia hiirissä (kuvio 1A). Siirrettyjen kasvainten yleensä otettu fenotyypin vanhempien kasvaimia (kuvio 1 B). Kuitenkin solujen istuttamisen heikompilaatuisen kasvain joskus johti myös korkealaatuista kasvaimia. Kuten pauci-klonaalisuuden WAP-T kasvaimissa on ajoittain havaittu [17], uloskasvamisen soluja korkealaatuisesta tuumorisolun allas ei voida sulkea pois.

(A) Soluja korkealaatuisesta WAP-T kasvaimet ovat tuumorigeenisemmiksi kuin soluja huonolaatuisen kasvaimia. Sarjalaimennettua (10

1, 10

2, 10

3, 10

4) juuri eristettyjä WAP-T-kasvainsoluja ruiskutettiin vasempaan vatsan rintarauhasen, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) H B ja C: 200gm; D ja E: 20 um; F, G, H ja J: 100 um; K: 50 pm.

Koska perustava

Wap

geeniaktiivisuuteen on yhdistetty sitoutunut bipotent keuhkorakkuloiden esisolujen ja CD61

+ luminal vapaan progenitoreja, jotka ovat oletetuilla tavoitteita onkogeenin aktiivisuuden [24], teimme solulinjaan analyysin immunofluoresenssilla (IF) värjäytymistä luminaaliselle epiteelisolujen merkki keratiinin 18 (Krt18), pohjapinta /myoepithelial solumarkkerien keratiini 5 (Krt5) ja keratiini 14 (Krt14). Alussa kohdat suurin osa G-2 solut ilmensivät sekä Krt14 (kuvio 2G), ja Krt18 välituotetta hehkulangan proteiineja (kuvio 2H); kuitenkin tavallista kopolymeroimalla kumppani Krt14, The Krt5 proteiini, ei ollut havaittavissa spesifisen vasta-aineen (tuloksia ei ole esitetty). Myöhemmissä siirroissa hieman vaihtelua yksittäisten ekspressiotasot Krt14 ja Krt18 (tietoja ei näytetty) ja merkittävää vaihtelua määrän sytokeratiini-ilmentävien solujen vaihtelee 40-70% ei havaittu. Kuvio 2I esittää esimerkkinä FACS-pohjainen kvantitointi Krt18 ilmentymisen G-2-solujen passage 20, joka osoittaa siirtymistä mesenkymaalisten erilaistumisen tilassa. Siksi ilmaisun väli- hehkulangan proteiinin vimentiinista analysoitiin laajasti käytetty markkerina mesenkymaalisten solujen ja karsinoomasoluja siirtymävaiheessa välillä epiteeli- ja mesenkymaalisten erilaistumista todetaan [25], [26]. Riippumaton siirrostusjärjestysluku lähes kaikki G-2 solut ilmentävät vimentiinista, jolloin intensiteetti vimentiinista ilmaisun vaihtelee hajanaisena sytoplasman jakelu ja heikko rihmamaisia ​​rakenteita runsas filamenttiarkit (kuvio 2J-K osoittavat vimentiinista /SV40-LT ja vimentiinista /Krt18 co -staining at passage 10). Kuvio 2L esittää esimerkkinä FACS-pohjainen kvantitointi vimentiinista ilmentymisen G-2-solujen passage 20. SV40-LT ekspressiota havaittiin lähes aina myös soluissa voimakkaasti ilmentävät vimentiinista (kuvio 2J). Kuitenkin vain harvat solut puuttuu SV40-LT olivat aina läsnä G-2 viljelmät (kuvio 2J, leimattu nuolilla). Yhteenvetona, immunovärjäyksellä analyysi havaitsimme aluksi, että suurin osa G-2 solut tunnusomaista erilaistumisen, jolle on tunnusomaista koekspressio vimentiinista ja sytokeratiineja, toiseksi, että solujen lukumäärä, joilta puuttuu sytokeratiineja vaihtelee välillä kohtia, ja kolmanneksi, että vähäinen populaatio soluja, jotka ilmentävät sytokeratiineja mutta puuttuu kokonaan vimentiinista on aina läsnä.

Tällainen heterogeenisyys erilaistumiseen valtiot voivat heijastaa multiclonal alkuperä G-2 soluviljelmissä, sillä tämä kulttuuri oli peräisin koko kasvain. Käsitellä tätä mahdollisuutta, G-2-soluja kloonattiin pehmeässä agarissa, ja kymmenen pesäkettä laajennettiin stabiilit solulinjat. Visualisoituina IF-värjäys, G-2 cell kuvio sytokeratiini ilmentyminen oli toistettu G-2-soluista saatu klooneista (kuvio S1A-B; esitetty esimerkiksi klooneja G-2C9 ja G-2C11), vaikka mukaan qPCR-analyysi suhteelliset tasot

Krt14

ja

Krt18

geenin ilmentyminen vaihteli merkittävästi kloonien (Kuva S1C-D). Myös toisen klooneja, johdetaan agar kloonaamalla G-2C9 ja G-2C11 klooneja, 2-3 kertainen vaihtelu transkription

Krt14

ja

Krt18

geenien voitu osoittaa ( Kuvio S1E-F). Samanlainen vanhempien kulttuuriin, heterogeeninen ilmentyminen vimentiinista havaittiin G-2 solukloonien (kuvio S1G). Tämän vuoksi päättelemme, että läsnäolo solupopulaatioiden epiteelin mesenkymaaliset ja väli erilaistumista valtioiden on luontainen ominaisuus G-2 kulttuureissa.

b)

In vivo

.

Testasimme kasvain aloittamista potentiaalia G-2-soluissa potilaalle tehdä siirrettäväksi vasempaan vatsan maitorauhasen poikimattomia WAP-T saajahiiret. 10

6 G-2 solut nopeasti muodostunut palpoitavissa kasvaimia (high-grade adenokarsinooman) kaikissa saajahiiret (taulukko 1). Mitä vähemmän soluja me siirrettyjen pidempi oli lag aikana ja korkeampi sen vaihtelu (taulukko 1). Jopa 10 pistetään G-2 solut 10: 12 saajahiiret kasvaimen kasvulta havaittu (taulukko 1), mikä osoittaa korkean taajuuden tuumorigeenisiä soluja G-2 kulttuuriin. Immunovärjäys analyysi vimentiinista ja Krt8 /18 ilmentymisen G-2-soluista saatu kasvaimia (kuvio 3A) paljasti niiden lähellä yhdennäköisyys huonosti eriytetty (grade G3) WAP-T kasvaimet (kuvio 3B). Vaikka matala-asteista WAP-T kasvaimien vimentiinista värjäytyminen rajoittuu enimmäkseen välikalvoilla ja strooman lokero (kuvio 3C), vaihteleva ilmentyminen vimentiinista oli myös havaittavissa epiteelin osastoon (edustaja Krt8 /18) korkea-asteen WAP-T kasvaimet (kuvio 3B), mikä osoittaa välissä erilaistumisen tilasta kasvainsolujen G-2 johdettu ja laadukkaat WAP-T kasvaimia ja epiteelin erilaistumista tila kasvainsolujen heikompilaatuisen WAP-T kasvaimia. Co-värjäys vimentiinista ja SV40-LT (ilmentyminen SV40-LT rajoittuu kasvainsolujen) mahdollistaa erotella peruskudossolujen mesenkyymisolujen värvätään kasvaimia ja kasvaimen jotka ilmentävät mesenkymaaliset tai keskitason fenotyyppi. Transplantoiduissa G-2 kasvaimia (kuvio 4A) ja korkea-asteen WAP-T kasvaimia (kuvio 4B) havaitsimme lisäksi odotettavissa ilmentymisen vimentiinista peruskudoksen osastossa myös koekspressio vimentiinista ja SV40-LT yksittäisten kasvainten solut. Sitä vastoin matala-asteista WAP-T kasvaimia (kuvio 4C) vimentiinista ja SV40-LT ilmentyminen rajoittuu tukikudosten ja kasvaimen epiteelin osastoja, vastaavasti. Kasvaimet kasvanut istutetut G-2-solut (kuvio 5A) kertasi erityispiirteet korkealaatuisesta WAP-T kasvaimia (kuvio 5B), eli kohtalaisen suuri osa soluista koekspressoivat Krt14 ja Krt8 /18. Sitä vastoin matala-asteista WAP-T kasvaimien Krt8 /Krt18 ja Krt14 ovat usein ilmennetään rinnakkain (kuvio 5C).

(A-C) edustaja konfokaali kuvia kasvaimen kryoleikkeet G-2 cell -johdannainen kasvain (A), ja korkea-asteen (B) ja matala-asteista (C) endogeeninen WAP-T kasvain värjätään anti-vimentiinista (vihreä) ja anti-keratiini 8/18 (punainen) vasta-aineita. Tumat värjättiin DRAQ5 (sininen). Virran sisäkkeet käytetään näyttämään koekspressio vimentiinista ja keratiinin 8/18 in G-2 ja korkealaatuisesta WAP-T kasvaimia. Valkoiset Katkoviivat merkitsevät strooman rakenteita. Konfokaalinen 3D-pinot oli dekonvuloidaan käyttäen Huygens Essential -ohjelmisto ja rekonstruoitu kanssa Imaris ohjelmiston. Mitta-asteikko: pääkuvan: 30 pm; suurennus: 3 um.

(A-C) edustaja konfokaali kuvia kasvaimen kryoleikkeet G-2-soluista peräisin kasvain (A), joka on korkea-asteen (B) ja matalan luokka (C) endogeenisen WAP-T kasvaimen värjättiin anti-vimentiinista (vihreä) ja anti-SV40-LT (punainen) vasta-aineita. Tumat värjättiin DRAQ5 (sininen). Virran sisäkkeet käytetään näyttämään koekspressio vimentiinista ja SV40-LT G-2 ja korkealaatuisesta WAP-T kasvaimia. Valkoiset Katkoviivat merkitsevät strooman rakenteita. Konfokaalinen 3D-pinot oli dekonvuloidaan käyttäen Huygens Essential -ohjelmisto ja rekonstruoitu kanssa Imaris ohjelmiston. Mitta-asteikko: pääkuvan: 50 pm; suurennus: 6 mikrometriä.

(A-C) edustaja konfokaali kuvia kasvainta kryoleikkeet G-2-soluista peräisin kasvain (A), korkea-asteen (B) ja matalan grade (C) endogeeninen WAP-T kasvain värjätään anti-keratiini 8/18 (vihreä) ja anti-keratiini 14 (punainen) vasta-aineita. Tumat värjättiin DRAQ5 (sininen). Virran sisäkkeet käytetään näyttämään koekspressoimalla keratiini 8/18 ja keratiinin 14 G-2, korkea-asteen ja matala-asteista WAP-T kasvaimia. Konfokaalinen 3D-pinot oli dekonvuloidaan käyttäen Huygens Essential -ohjelmisto ja rekonstruoitu kanssa Imaris ohjelmiston. Mitta-asteikko: pääkuvan: 50 pm; suurennus: 6 um.

Lisäkokeessa, 10

6 G-2-soluja istutetaan villitys tyynyt kaksi ei-siirtogeenisen BALB /c-hiirissä. Molemmissa hiirillä suuri, kiinteät kasvaimet kasvoivat jälkeen 4-6 viikkoa. Mielenkiintoista on, että kasvainsolut olivat suurelta osin puuttuu epiteelin markkereita, EpCAM (kuvio S2A) ja sytokeratiineja (kuvio S2B, D), mutta ilmentyy voimakkaasti vimentiinista (kuvio S2B, C), mikä osoittaa, että ei-siirtogeenisissä hiirissä siirtymistä mesenkymaaliset tila on suosi, mahdollisesti seurauksena vuorovaikutuksesta isännän immuunijärjestelmää. Koska kasvainsolut edelleen ilmaista WAP-promoottori ohjaa SV40-LT (kuvio S2C), on todennäköistä, että mesenkymaaliset erilaistumista näissä soluissa oli epätäydellinen.

c) geeniekspressioprofilointi.

histomorphological samankaltaisuus G-2 cell istutetut ja WAP-T kasvaimia osoittaa, että nämä kasvaimet saattavat myös läheisesti molekyylitasolla. Perustuen vertailukelpoinen ilmaus CIF proteiinien, myös odottaa läheinen suhde G-2-soluille ja G-2 kasvaimia. Testata näitä oletuksia, suoritimme mikrosirujen ilme profilointia. Kokonais-RNA G-2, G-2C9 ja G-2C11-solut, kahdesta G-2 siirrettyjen kasvainten, samoin kuin neljän WAP-T-NP8 kasvaimet edustavat neljä histologista laadut (G1-G4) analysoitiin koskevasta Affymetrix microarray platform (MOE430 2,0). Soveltamalla kun merkitys kriteereitä corr. P-arvo (Benjamini-Hochberg) = 0,05, ja kertamuutos-sulku 3 tunnistimme 250 geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä soluviljelmissä ja kasvain näytteet (taulukko S1). Kiristys tilastolliset kriteerit on corr. P-arvo = 0,01, vain 24 geenit täyttänyt nämä tiukat kriteerit. 250 ilmentyvät eri geenit jatkotarkastellut EXPANDER ohjelman tunnistamiseksi yliedustettuna GO (geeni ontologian) luokkien ja TF (transkriptiotekijä) sitoutumiskohtiin niiden

cis

sääntelyvälineitä alueilla [27]. GO-rikastaminen analyysi yhdistettiin hierarkkinen klusterointi, ja tulokset on esitetty lämpökartassa kuvassa 6A. Huomattava määrä erilaisesti ilmaisi geenien putoaa luokkaan immuunipuolustuksen geenien, mikä osoittaa, että kasvaimia sisältävät tietyn ehdolliset immuunisolujen, joka puuttuu soluviljelmässä. Rikastamista liittyvistä geeneistä immuunitapahtumasarjat korreloi hyvin yliedustus sitoutumiskohtien Elf1, transkriptiotekijä ilmentyy runsaasti lymfoidisoluissa [28], että promoottori alueilla differentiaalisesti ilmentyvien geenien (P-arvo 0,001) . Toisaalta, soluviljelmä näytteet on tunnusomaista suurempi geenien ilmentymistä, jotka liittyvät transkription säätelyyn, esim.

Foxa2

,

FOXM1

,

Gata6

,

Hoxb2

,

JMJD2C

,

Ppargc1a

, ja

Tle1

, ja kehitys- prosesseja, esimerkiksi

BMP4

, joka on mukana erilaistumista mesenkyymisolujen. Tämä havainto voidaan selittää mukauttaminen transkription verkon ja signalointireittien solun viljelyolosuhteet. Yhdessä geenin ilmentymisen analyysi osoitti, että G-2-solut ja kasvaimia näyttää enemmän yhtäläisyyksiä kuin eroja niiden geeniekspression ohjelma; erot liittyvät lähinnä niiden erilaiset biologiset yhteydessä.

(A) 250 geenit ilmentyvät differentiaalisesti viljellyissä G-2-solut ja endogeenisen WAP-T tai G-2-soluista saatu kasvaimia (taulukko S1) käytettiin tuottamaan että karttaa. Rikastettua GO luokat näkyvät bar kaavioita vastaa suurempi tai pienempi ilmaistu geeni klustereita kunkin näytteen ryhmä. Värikoodaus ja korkeus baari edustaa tilastollista merkitystä (-log

10 (p-arvo)) on havaittu rikastuminen vastaavien GO luokkia. (B) Genes ominaista luminal-ER

+, luminal-ER

-, ja pohjapinta /myoepithelial soluja käytetään tuottamaan lämpöä karttoja. Geenien ilmentyminen, jotka saatiin soluviljelmästä (G-2, G-2C9 ja G-2C11-solut) ja kasvaimen näytteet (kaksi G-2 siirrettyjen kasvainten ja neljä WAP-T-NP8 kasvaimet edustavat neljä histologista laadut) käytettiin tähän analyysiin. Geenien ilmentyminen voimakkuudet on maitorauhasen on parous BALB /c hiirtä (50 päivän kuluttua vieroituksen) käytettiin referenssinä. Keskeiset geeniryppäät (

Krt14

,

Vim

,

Krt5

,

Krt18

, ja

Esr1

) on korostettu keltaisella laatikot . Ilmaisu arvot on värikoodattu: punainen – korkea ilmaisun, sininen – heikkoa ilmentymistä.

uskoi geeniekspressioanalyysissä pitäisi auttaa paikantamaan G-2 solujen rintarauhasen epiteelisolujen hierarkia. Käyttämällä luetteloa tunnusomaisen geenin luminal-ER

+, luminaalisen-ER

-, ja pohjapinta /myoepithelial soluihin [29] (taulukko S1), ja geeni-ilmentymisen profiili maitorauhasen on parous BALB /c-hiirestä (50 vuorokauden kuluttua vieroituksen) referenssinä, hierarkkinen klusterin analyysi paljasti jälleen samankaltaisuutta soluviljelmissä ja kasvain näytteet (kuvio 6B). Lisäksi monimutkainen transkription ohjelma käsittää monia geenejä kaikista kolmesta suvusta tuli ilmeiseksi. Erityisesti

Esr1

(koodaavan estrogeenireseptori alfa) on sisällä klusterin alassäädetty ”luminal-ER

+” geenejä,

Vim

(koodaavat vimentiinista) klusteriin ei-geenien,

Krt14

sijaitsee klusterin säädelty ”pohjapinta” geenejä, kun taas

Krt5

yhdessä useiden muiden geenien muodostaa klusterin alassäädetty ” pohjapinta ”geenejä, sopusoinnussa puuttuminen Krt5 ilmentymisen G-2 soluviljelmissä ja harvinainen esiintyminen Krt5-postive solujen WAP-T kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Tämän analyysin perusteella, voimme päätellä, että G-2 cell transcriptome todennäköisesti liittyy solujen sitoutunut luminaaliselle-ER

– erilaistumista. Nämä solut voivat olla kantasolujen luminal-ER

– soluja, mikä aikana sitoutuminen hävisi ilmaisun näkyvä merkkiaineiden, kuten

Esr1

ja

Krt5

– geenejä toiminnallisesti liittyvät luminaaliselle-ER

+ ja tyvisolulinjasta, ja tuli ikuistamat SV40 proteiineja. Kuitenkin lopulliseen selvittämiseen identiteettinsä vaatii lisätutkimuksia.

Stemness G-2-solut ja niiden klonaalisen johdannaiset

suuri Tuumorigeenisuustutkimuksissa G-2 soluissa sai meidät tutkimaan niiden CSC kiinteistöt Lisätietoja. Suoritimme useita standardin määrityksiä mittaamiseksi ilmaus joukko solunpintamarkkereiden, itseuudistumiseen, ja sukupolvi fenotyypiltään erilaisia ​​jälkeläisten (kollektiivisesti kutsutaan harvenneiden aktiivisuus), aktiivisuus aldehydidehydrogenaasit, ja pesäkkeitä muodostavien mahdollisten.

a) solunpintamarkkereiden.

Expression tiettyjä solun pinnan liittyviä proteiineja, kuten integriinit ja GPI-ankkuroituja proteiineja, on diagnostinen normaaleille maitorauhasen kantasolujen ja rintasyövän kantasoluja. FACS havaitsimme, että lähes kaikki G-2-solut ilmentävät stemness liittyviä markkereita CD29 (integriinin beeta 1) [30] (kuvio 7A) ja CD44 (hyaluronaattiin reseptori) [31] (kuvio 7B). Suuri osa G-2-solujen on positiivinen EpCAM (epiteelisolujen adheesiomolekyyli) [31], [32] (kuvio 7C, vasemmalla), joka on co-ilmaistaan ​​CD24a ja CD49f (integriinin alfa 6) proteiinit [30] , [33] – [35] (kuvio 7C, oikealla). Toinen maitorauhasen kantaisä liittyvä markkeri, CD61 (integriini beta 3) [36], havaittiin suuri osa G-2-soluja (kuvio 7D, vasemmalla) ja se on myös koekspressoitiin CD24a ja CD49f (kuvio 7D, oikealla) . Siksi me kollektiivisesti kutsutaan osa G-2-solut ilmensivät samanaikaisesti nämä solukalvon liittyvien proteiinien kuten CD24a

korkea osajoukko. Vaihtelut vaihtelevat -30%: sta ~90% absoluuttinen määrä soluja tässä alaryhmässä havaittiin emo G-2-solut ja kloonit (tuloksia ei esitetty). Seuraavaksi havaittiin, että vastine CD24a

korkea alaryhmä (Kuva 7E, vasemmalla) on ominaista ilmaus kantasolujen markkeri Sca1 [37] (Kuva 7E, oikealla). Yhdessä G-2 kulttuuri käsittää kaksi suurta erillistä subsets, CD24a

korkea /Sca1

alhainen ja CD24a

pieni /Sca1

korkea. SV40 siirtogeeni yhtä transkriptoidaan molemmissa alaryhmissä, mutta transkriptio Krt14 ja Krt18 geenit on suurempi CD24a

korkea /Sca1

pieni soluja (kuvio S3A, B). Olemme myös noudatettava qPCR analyysi että

Cd24a

,

Cd49f

ja

Sca1

geenit transkriptoidaan molemmissa alaryhmissä (kuvio S3C).

(A, B) edustaja FACS piste tontteja osoittavat ilmentymisen CD29 (A) ja CD44 (B) G-2 soluviljelmässä. (C) edustaja FACS piste tontteja osoittavat ilmentymisen EpCAM (C, vasen) viljellyissä G-2-solut ja jakelua CD24a ja CD49f (C, oikealla) sisällä EPCAM

korkealla solupopulaatio.