Krooninen sairaus

tiivistelmä

transkriptiotekijä FOXO3 on vakiintunut tuumorisuppressoriproteiinia joiden toiminta, vakauden ja lokalisointi säätelee fosforylaatio ja asetylointi. Edellinen tietojen laboratoriossamme osoitti monistettiin tromboksaani-A

2 signalointi liittyy huono ennusteita virtsarakon syöpäpotilailla ja yli-ilmentyminen tromboksaani-A

2 isoentsyymiselektiivisiä β-reseptori (TPβ), mutta ei TPα, aiheuttama pahanlaatuisiksi immortalisoitujen virtsarakon solujen

in vivo

. Tässä kuvaamme mekanismi TP välittämän modulaation FOXO3 toiminnan ja lokalisaation fosforylaation ja deasetylaatiolla rakkoon syöpäsolun malli.

In vitro

voitto ja tappio toiminto tutkimuksia ei-transformoiduissa solulinjoissa, urosta ja SV-HUC, paljasti knockdovvn FOXO3 ilmentymisen shRNA lisääntynyt solujen muuttoliikkeen ja invaasio, vaikka ulkoisesti yli-ilmentävät TPβ nostetaan pohjapinta fosforyloituu (p ) FOXO3-S294 tasoilla. Toisaalta yli-ilmentyminen ERK vastustuskykyisten, mutantti FOXO3 vähensi korotukset UMUC3 solumigraatioon ja invaasio, mukaan lukien välittämä TP agonisti (U46619). Lisäksi stimulaatio UMUC3 solujen U46619 lisääntynyt pFOXO3-S294 ilmentymisen, joka voi olla heikennetty käsittelemällä TP-antagonisti (PTXA

2) tai ERK-inhibiittoria (U0126). Aluksi U46619 aiheuttama ydinaseiden kertyminen pFOXO3-S294; kuitenkin pitkittynyt stimulaatio lisääntynyt FOXO3 sytoplasmisen lokalisointi. U46619 stimulaatio pieneni FOXO3 transkriptioaktiviteettia, mutta oli yhteydessä lisääntyneeseen ilmaisuna sen pro-selviytymisen tavoite, mangaani superoksididismutaasi. Tiedot osoittavat myös, että TP stimulaatio lisääntynyt ilmentyminen histonideasetylaasi, SIRT1, ja vastasi laski asetyloitu-FOXO3. Yhdessä tulokset viittaavat rooli TP signaloinnin säätelyssä FOXO3 aktiivisuuden välittämä osittain kautta fosforylaation ja deasetylaatiolla.

Citation: Sobolesky PM, Halushka PV, Garrett-Mayer E, Smith MT, Moussa O ( 2014) asetus kasvain vaimennin FOXO3 jonka tromboksaani-A

2 reseptorit uroteelisyöpä. PLoS ONE 9 (9): e107530. doi: 10,1371 /journal.pone.0107530

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 helmikuuta 2014; Hyväksytty: 19 elokuu 2014; Julkaistu: 09 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Sobolesky et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Imaging tilat tähän tutkimukseen tuettiin, osittain Cancer Center Support Grant P30 CA138313 että Hollingsin Cancer Center, MUSC. Tutkimushanke kuvattu oli osittain avustuksin RO1127905CA, UL1TR000062 ja UL1RR029882 National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on viides yleisin syöpä Yhdysvalloissa pinnallinen siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) on useimmin diagnosoitu muodossa [1]. TCC on korkea toistumisen määrä ja vaatii kalliita elinikäisen seurannat, mikä virtsarakon syöpä yksi kalleimmista syövät hoitoon yli potilaan elinaikana [2]. Ymmärtäminen mekanismeja onkogeenisen transformaation urothelial solujen on tärkeää tehokkaiden ja uusien hoitojen virtsarakon syöpään. Olemme aiemmin tunnistettu käänteinen yhdistyksen välillä tromboksaani nopaliinisyntaasin (TXS) ilmentyminen ja selviytymisen virtsarakon syöpäpotilailla, mikä viittaa rooli tromboksaani prostaglandiini (TP) signalointia urothelial kasvainprogression [3]. TXS on tärkeä entsyymi, joka katalysoi prostaglandiini H

2 tromboksaani

2 (TXA

2). TXA

2-ligandin puolestaan ​​aktivoi TP-reseptorin, edistävät solujen vaeltamiseen, lisääntymistä, ja invaasio, jotka ovat keskeisiä tunnusmerkkejä solutransformaatioon ja sairauden etenemisen [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet rooli TXA

2 signalointia kasvainten synnyssä ja pahanlaatuiset fenotyyppien eturauhasen [8] ja rintasyöpiä [9], [10].

Ihmisen TP-reseptorin geeni koodaa kaksi isoformia, TPα ja TPβ [11]. Molemmat isoformit ovat seitsemän transmembraanisen G-proteiiniin kytkeytyviä reseptoreita, jotka eroavat toisistaan ​​vain C-terminaalinen domeeni [12]. C-terminaalinen muutos sallii kunkin isoformin vuorovaikutuksessa sekä identtiset ja ainutlaatuinen signalointi välittäjäaineiden [13]. Expression of TP-reseptorin isoformia on kudosten ja solutyypin riippuvainen. Olemme aiemmin raportoitu TPβ yli-ilmentymisen virtsarakon syöpäpotilailla liittyi merkittävä lasku eloonjääminen [14]. Lisäksi, yliekspressio TPβ, mutta ei TPα, oli riittävä lisäämään maahanmuuttoa, invaasio, ja proliferaatiota sekä indusoida pahanlaatuinen transformaatio kuolemattomaksi ei-transformoitu urothelial solulinjassa [14]. Mekanismi muutoksen aiheuttama TPβ yli-ilmentymisen on tuntematon.

transkriptiotekijä forkhead box-O3 (FOXO3) säätelee keskeisten solujen selviytymisen prosesseja kuten oksidatiivisen stressin kestävyys, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin avulla sääntelyn sen kohdegeenien esim mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), p27

Kip1, Fas-ligandi (FasL), ja Bim [15], [16]. FOXO3 transkriptionaalinen aktiivisuus voidaan säännellä translaation jälkeisiä modifikaatioita (PTM), kuten asetylaatio ja fosforylaatio. Häiriöstä FOXO3 aktiivisuuden ja lokalisointi on liittynyt syövän taudin alkamisen ja etenemisen sekä kemoterapia-vastus [17], [18], [19]. Asetylaatio FOXO3 että histoni asetyyli transferaasi p300 on liitetty laski FOXO3 toimintaa, lisääntynyt soluliman lokalisointi, ja hajoaminen [20]. Deasetylointi NAD-riippuvainen deasetylaasin Sirtuin-1 (SIRT1) on osoitettu eri tavalla säädellä FOXO3 tavoitteet edistämällä transkriptio p27

Kip1 ja MnSOD, ja vähentää transkription Bim ja FasL [21]. Ekstrasellulaarisen signaali-säänneltyjen kinaasi 1 ja 2 (ERK1 /2) on osoitettu fosfory- FOXO3 at -S294, -S344, ja -S425, ja vaikuttaa negatiivisesti sen toiminta ja vakauden hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2) -välitteisen FOXO3 hajoaminen [ ,,,0],22]. Vaikka stimulaatio TPβ tiedetään aiheuttavan fosforylaation ja aktivaation ERK [23], [24], [25], meidän tietääksemme mikään tutkimus on tutkinut vaikutuksia TP signaloinnin FOXO3 modulaatiota.

Täällä tunnistettu FOXO3 alavirran kohde TP reseptorin reitin ja tutki kielteisiä vaikutuksia TP signaloinnin FOXO3 lokalisointi ja toiminta virtsarakon syövän solulinjaa UMUC3. Mielenkiintoista, yleinen FOXO3 transkriptionaalisen aktiivisuuden pienensi TP agonistin stimulaation mikä vähentää ilmentymä apoptoottista kohde, mutta tehostettu ilmentyminen rasitusvastusta tavoite. Samoin kuin aiemmissa tutkimuksissa [21], differentiaalinen ilmentyminen FOXO3 tavoitteita seuraavista TP agonistin stimulaation liittyi lisääntynyt SIRT1 ilme ja deacetylated FOXO3. Yhdessä tämä tutkimus valottaa mekanismi, jolla TP aiheuttama modulaatio FOXO3 aktiivisuuden kautta translaation jälkeisiä modifikaatioita myötävaikuttaa pahanlaatuiseen fenotyyppiin urothelial soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

urosta solulinja, jonka toimitti ystävällisesti Dr. Donald Sens (University of North Dakota, Grand Forks, ND) oli peräisin ihmisen normaalista urothelial solut ja kuolemattomiksi SV40 T-antigeeni [26]. Urosta soluja pidettiin 70:30 DMEM-elatusainetta (1 g /l glukoosia: 4,5 g /l glukoosia, Mediatech, VA, USA), 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Simian virus 40 kuolemattomiksi ihmisen uroepithelial (SV-HUC), transformoimattomina urothelial noomasolulinjasta Dr. Santhanam Swaminathan (University of Wisconsin, Kattava Cancer Center, Madison, WI) [27], [28], [29] ja soluja viljeltiin F12K Khaigns modifioitu alusta täydennettynä 10% FBS: ää, insuliinia, hydrokortisonia, ja transferriini. Virtsarakon syöpä solulinja UMUC3 saatiin American Type Culture Collection ja solut viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), joka sisälsi 10% FBS: ää. Jokainen liuos sisälsi 1% penisilliini /streptomysiiniä. Solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Vasta-aineet, reagenssit, ja plasmidit

Seuraavia vasta-aineita käytettiin mukaan valmistajien suositukset: pFOXO3-S294 , pc-Jun Ser63, c-Jun, Pakt Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ERK, p300, SIRT1, Bim, p27

Kip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), FOXO3, GFP (Santa Cruz), Lamin B1 (GeneTex, Irvine, CA, USA) MnSOD (EnzoLife Sciences, Ann Arbor, MI, USA), α-Tubulin (ABD Serotec, Raleigh, NC, USA), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA). TP erityisiä agonisti, U46619 ostettiin Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA). ERK1 /2-estäjä U0126 ostettiin Sigma-Aldrich. FHRE-luc plasmidi oli lahja Michael Greenberg (Addgene plasmidi # 1789 Cambridge, MA, USA). GFP-FOXO3

3 A (seriinit-294, -344 ja -425 substituoidut alaniineiksi) ja ohjaamaan pEGFP-C

2 plasmidi olivat lahjoja Mien-Chie Hung The University of Texas MD Anderson Cancer Center. GFP-TPβ plasmidi oli lahja Jean-Luc Parent yliopistosta Sherbrooke, Kanada.

Western blot-analyysi

Solut pestiin PBS: llä ja kerättiin RIPA puskuriin (Thermo Fisher Scientific ) täydennettynä Complete proteaasinestäjät Cocktail Tabletit ja PhosSTOP Fosfataasinestäjät Cocktail Tabletit (Roche Applied Science). Proteiinit denaturoitiin keittämällä Laemmli-puskurissa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja erotettiin 12% SDS-PAGE. Proteiinin siirto, nitroselluloosakalvolle blokattiin 5% maitoa 1 x TBST: ssä ja tutkittiin primaarisen vasta-aineen 5% BSA: ta 1 x TBST: ssä yli yön 4 ° C: ssa. Seuraavat primaarisen vasta-aineen inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin 1 x TBST: ssä ja inkuboitiin HRP-kytketty sekundaarinen vasta-aine (Cell Signaling Technology) 1 x TBST: ssä. Kalvot pestiin 5 x 5 min 1 x TBST: llä ja havaitseminen visualisoitiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Fisher Scientific). Western blotit kvantitoitiin käyttäen Image Studio Lite Ver. 3.1 seuraavat ohjelmistot ohjeita ja piirretyn GraphPad Prism 5.

transfektoinneilla ja stabiilien kloonien

Tuottaa vakaan FOXO3 pudotus klooneja, SV-HUC ja urosta solut transfektoitiin joko pRFP-C- RS ohjaus plasmidi, pRFP-C-salatut tai pRFP-c-shRNA kohteeseen FOXO3 plasmidi (Hush-29; Origene, Rockville, MD, USA) käyttäen FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Yksittäiset kloonit valittiin väliaineessa, joka sisälsi 2,5 ug /ml puromysiiniä (Invivogen, San Diego, CA, USA) ja pudotus analysoitiin immunoblottauksella käyttämällä FOXO3 spesifistä vasta-ainetta (H-144, SC-11351; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA). Transfektio GFP-TPβ osaksi SVHUC soluihin suoritettiin TurboFect transfektioreagenssin (Thermo Fisher Scientific), käyttäen suhdetta 1,5 ug DNA: ta ja 4 ui TurboFect. Urosta soluja (1 x 10

6) tehtiin elektroporaatio 3,5 ug GFP-TPβ käyttäen Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V ratkaisu laatikko (kissa #: VCA-1003, Lonza, Allendale, NJ, USA) ja Nucleofector 2b laite (Lonza) kanssa ennalta ohjelmoidun protokolla T-030. Neljä tuntia sen jälkeen, elektroporaatiota imettiin, korvattiin täydellinen media, ja inkuboidaan 37 ° C: ssa 5% CO

2. Transfektiotehokkuutta tarkastettiin 24 tunnin kuluttua elektroporaatio. Tuottavat vakaita GFP-FOXO3

3A ilmentävät UMUC3 klooneja,-soluja 6-kuoppalevyllä transfektoitiin käyttämällä 4 ui X-tremeGENE HP DNA transfektio Reagent (Roche Applied Science) ja 1,5 ug plasmidi-DNA: ta. Yksittäiset kloonit valittiin väliaineessa, joka sisälsi 500 ug /ml Geneticin’iä Valikoiva Antibiootti (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).

Cell migraatiokokeessa

BD Falcon soluviljelyinsertissä System sisältävien polyeteenitereftalaatti (PET) kalvot, 8 um huokosia (BD Biosciences, Rockville, MD, USA) käytettiin tässä määrityksessä. Insertit ennalta päällystettiin yön yli 5 ug /cm

2 fibronektiinin 4 ° C: ssa ja tasapainotettiin vedessä 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ennen käyttöä. Trypsinoitiin solut kerättiin, laskettiin ja 5 x 10

4 solut suspendoitiin uudelleen 250 ui seerumia. Yläkammion insertin täynnä solususpensiota, kun taas 750 ui alustaa, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin pohjasta hyvin. Urosta Solujen annettiin kulkeutua 16 tuntia kosteassa ympäristössä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Siirron jälkeen solut poistettiin ylemmältä pinnalta kalvon pyyhkimällä se kostealla pumpulipuikolla. Alapinnan kalvot värjättiin käyttäen Hema-3 Värjäys kit (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA). Kun värjäys oli valmis membraanit huuhdeltiin tislatussa vedessä yli tahrojen poisto ja kuivattiin ilmassa yön yli. Prosenttia kulkeutumista tai invaasio laskettiin laskemalla keskiarvon solujen lukumäärä tunkeutuneet 10 satunnaisesti näkökentät klo 40 x suurennus, jaettuna alueella mikroskoopin katsella kentän ja kerrotaan alueen Transvvell- insertin. Sitten jakaa aiemmin laskettu lukumäärä useissa solujen kylvetään ja lopuksi kerrotaan 100 saada prosenttiin. Tämä koe suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa kaksoiskappaleet.

Cell invaasiomääritys

BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto soluviljelyinsertissä System sisältää 8 um PET-kalvo (BD Biosciences) ohuella kerroksella MATRIGELiä tyvikalvon Matrix käytettiin tässä määrityksessä. Trypsinoitiin solut kerättiin, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen 5 x 10

4 solua /ml seerumittomassa alustassa. Yläkammioon sai 500 ui solususpensiota, kun taas 750 ui RPMI, jossa on 10% FBS: ää lisättiin hyvin. Solujen annettiin tunkeutua 16 tuntia kosteassa ympäristössä 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ennen kuin solun poistamista yläpinta kostealla pumpulipuikolla. Kalvot värjättiin Hema-3 -värjäyspakkausta (Thermo Fisher Scientific) ja prosenttia invaasio laskettiin kuvatulla solussa migraatiokokeessa osassa. Tämä koe suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa kaksoiskappaleet.

Dual lusiferaasianalyysissä

UMUC3-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 0,3 x 10

6 solua /kuoppa ja sitten lyhytaikaisesti transfektoitu sisällä 24 tuntia käyttäen X-tremeGENE HP DNA-transfektioreagenssia (Roche Applied Science) ja 4 ug: lla 3 x forkhead vaste-elementin (FHRE) reportteri-konstrukti (Addgene plasmidi # 1789) ja 0,1 ug pBind Renilla lusiferaasin kontrollivektori (Promega, Madison, WI, USA). Transfektoituja soluja inkuboitiin 24 tuntia kosteassa ympäristössä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sitten solut seerumia yli yön ja käsiteltiin joko vehikkelillä ohjaus (metyyliasetaatti, Sigma-Aldrich) tai 1 uM U46619 (Cayman Chemical) 30 tai 120 minuuttia. Käsittelyn jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kerätyistä Reporter Lysis Buffer (Promega). Luminesenssi mitattiin käyttäen Veritas Microplate luminometrillä (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA), 20 ui kutakin näytettä 10 sekunnin ajan kunkin injektion jälkeen 50 ui Luciferase Assay Reagent II sitten 50 ui Stop and Glow. Keskimääräinen Firefly lusiferaasiekspressio säädettiin kokonaisproteiinin ja kontrollivektorille Renilla lusiferaasiekspressio, ja sitten normalisoidaan vehikkelikontrollieläimiin. Tulokset edustavat keskiarvoa prosenttia aktiivisuutta kolmen erillisen kokeen suoritettiin kaksoiskappaleet, Student

t

-testi (*) P 0,05.

Nuclear /soluliman solufraktioinnin

UMUC3 soluja olivat ilman seerumia yli yön, sitten esikäsitelty 1 uM indometasiinia (Cayman Chemicals) 10 minuuttia vähentää endogeenisen TXA

2 signalointi. Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 1 uM U46619 5, 30 tai 120 minuuttia. Solut trypsinoitiin, kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä. Fraktiointi suoritettiin käyttäen Pierce NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) seuraten valmistajan protokollaa. Uutteet analysoitiin Western blot.

Immunosaostaminen

immunosaostus FOXO3 peräisin UMUC3 soluista suoritettiin käyttäen NHS-sidottu IP /Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific) seuraavien valmistajien protokollaa. Lyhyesti, UMUC3 solut kasvatettiin 80% konfluenssiin 10 cm: n maljoilla, ja sitten laitetaan seerumivapaassa 24 tuntia kosteassa ympäristössä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sitten soluja käsiteltiin joko vehikkelillä ohjaus (metyyliasetaatti, Sigma-Aldrich) tai 1 uM U46619 (Cayman Chemical) 30, 60 tai 120 minuuttia. Käsittelyn solut pestiin kerran PBS: llä (-Ca, -Mg) ja kerättiin jääkylmään IP lysis /pesupuskuri täydennetty proteaasinestäjä EDTA-vapaa cocktail ja PhosSTOP estäjä cocktail (Roche). Kerätty lysaattia sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi ja määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen BCA proteiinia iinianalyysikitissä (Thermo Fisher Scientific). NHS-aktivoitua magneettiset helmet vorteksoitiin ja 25 ui liete siirrettiin 1,5 ml: n putkille per IP reaktiota. Putket asetettiin magneetin ja varastointi liuos heitettiin pois, ja pestiin sitten jääkylmällä 1 mM HCI: a ja varovasti vorteksoidaan 5 sekuntia. Helmet kerättiin magneettisella seistä ja heitettiin pois supernatantti.

Vasta-aine-liuos valmistettiin laimentamalla kahden ug FOXO3 (Santa Cruz Biotechnology) ja negatiivinen kontrolli kaniinin immunoglobuliinin osa (kiinteän faasin imeytyy) (Dako, Carpinteria, CA , USA) lopulliseen konsentraatioon 2 ug vasta-ainetta 100 ul: aan 0,067 M boraattipuskuria. Lisättiin 100 ui valmistettua vasta-aineliuosta, että aktivoidut helmet, pyörresekoitettiin varovasti ja inkuboitiin pyörivällä alustalla 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktiot vorteksoitiin 10 minuutin välein inkubaation aikana sen varmistamiseksi, että helmet pysyi suspensiona. Helmet kerättiin ja supernatantti heitettiin pois. Pesty helmiä kahdesti eluoimispuskurilla pyöritetään putkia kunkin pesun poistamiseksi ei-kovalenttisesti sitoutunut vasta-aine. Sammutusta puskuria lisättiin helmiin ja inkuboitiin pyörivällä alustalla 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Helmet kerättiin magneettisen stand ja heitetään pois supernatantti. Valmistettiin ja lisättiin 0,5 ml: aan modifioitua boraattipuskuria kullekin IP ja sekoitettiin varovasti vortex, sitten helmet kerättiin magneettisen seistä ja heitettiin pois supernatantti. Reaktiot pestiin kahdesti IP lysis /pesupuskuria, sitten inkuboidaan kukin IP reaktio 100 ug lysaatti lopullisessa tilavuudessa 500 ui IP lysis /pesupuskuri täydennetty proteaasi- ja fosfa- cocktail-inhibiittorit yhdessä yössä (välillä 14-18 tuntia 4 ° C: rotaattorin. helmet vorteksoitiin 15 minuutin välein ensimmäisen tunnin aikana sen varmistamiseksi, että helmet jäi suspensioon. Kun antigeeni inkubaation jälkeen helmet otettiin talteen, pestiin kahdesti IP lysis /pesupuskuria ja sitten siirrettiin uuteen 1,5 ml: n putkeen. pesty helmiä ultrapuhdasta vettä (pH 7,0), sijoitettiin sitten magneetti- seistä ja heitettiin pois supernatantti. proteiinit eluoitiin helmistä, joilla on alhainen pH: n eluutiopuskurilla (pH 2,0) kaksi kertaa ja neutraloitiin Tris-HCI, pH 8,5. sitten eluoidut proteiinit analysoitiin Western blotilla .

tilastollinen

Jatkuva tuloksia verrattiin poikki olosuhteissa käyttäen kaksipuolista kahden otoksen Opiskelijan

t

-testissä. Kokeet, jotka sisältävät enemmän kuin kaksi muuttujaa verrattiin käyttämällä yksisuuntainen ANOVA seurasi kanssa Tukey post-hoc-testi. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

knockdovvn FOXO3 Korotukset urothelial Migration and Invasion

aiemmin raportoitu rooli TPβ reseptorin urothelial muuttoliike, invaasio, ja pahanlaatuisiksi [3], [14]. Alennettu FOXO3 ilmentymistä potilailla on myös ollut yhteydessä uroteelisyöpä invasiivisuus [30]. Sen määrittämiseksi, onko FOXO3 inaktivointi olisi riittävä indusoimaan pahanlaatuisen fenotyypin riippumaton TPβ, alhaisen endogeenisen TPβ ilmentävät urosta ja SVHUC solulinjoja (aikaisemmin määritetty [14]) transfektoitiin stabiilisti FOXO3 erityisiä shRNA (kuvio 1A). FOXO3-shRNA transfektoiduissa soluissa vähentää FOXO3 proteiinin ilmentyminen yli puolet verrattuna salattu (SCR) -shRNA havaittiin Western blot ja vahvistettu tutkimalla alavirran kohde MnSOD (kuvio 1A). Verrattuna scr-shRNA solujen pudotus on FOXO3 ilmaisun johti 39% ja 114%: n nousu muuttoliike, sekä 63% ja 18% lisäys hyökkäyksen SV-HUC ja urosta soluja, vastaavasti, (P 0,05, kuva 1B-C). Koska ei ole FOXO3 oli riittävä indusoimaan pahanlaatuisen fenotyypin kuolemattomaksi ei-transformoitujen urothelial soluissa, tutkimme vaikutus TPβ ilmentymisen vaikutus FOXO3 inaktivaatiota. SV-HUC ja urosta, jotka on transfektoitu TPβ näytetään 0,5-kertainen pohjapinta ilmentymisen aktiivinen pFOXO3-S294-proteiinia (kuvio 1 D-E).

(A) Western blot kokosolulysaateista SV -HUC ja urosta pysyvästi transfektoitujen solujen FOXO3-shRNA tai ohjaus salattu (scr-) shRNA immunoblot kokonaismäärän FOXO3 ja sen tiedetään alavirrassa oleva kohde MnSOD. a-tubuliinia levitettiin latauskontrollina. Blots esitetään edustavat kolme erillisiä kokeita ja luvut edustavat keskimäärin suhde FOXO3 a-tubuliinia. Tunnusluvut kvantifioitiin käyttäen Image Studio Lite Ver.3.1. SV-HUC ja urosta FOXO3 pudotus ja ohjaus kloonit ympättiin insertit päällystetty fibronektiinillä tai matrigeeliä ja annetaan siirtyä (B) tai hyökätä (C) 16 tuntia. Knockdovvn FOXO3 kasvoi SV-HUC ja urosta solumigraatio (39% ja 114%) ja hyökkäys (63% ja 18%, tässä järjestyksessä) verrattuna scr-shRNA. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta määritykset tehdään kaksoiskappaleet ja ilmoitetaan keskiarvona ± SEM. Merkitsevyys määritettiin kaksipuolinen kahden otoksen

t

-testi, (* = P 0,05, n = 3) verrattuna scr- valvontaa. (D) yli-ilmentyminen GFP merkitty TPβ in urosta ja SVHUC solut lisää pohjapinta pFOXO3-S294 lauseke (E) verrattuna vektorisäädön (n = 3). Numerot ovat keskimäärin suhde pFOXO3-S294 on FOXO3. Tunnusluvut kvantifioitiin käyttäen Image Studio Lite Ver.3.1. [AU] = mielivaltainen yksikköä.

Effects of TP Agonisti stimulaation FOXO3 fosforylaatio, lokalisointi, ja transkriptioaktiviteettia

Osoittaakseen TXA

2 signalointi osallistuu FOXO3 asetuksessa, fosforylaation asema FOXO3 ja sen tunnetun säädin ERK tutkittiin UMUC3 soluissa sen jälkeen, kun TP agonistin U46619 stimulaation (kuvio 2A). TP-agonisti-välitteisen fosforylaation ERK on T202 /Y204 oli merkittävästi lisääntynyt (~ 1-kertainen) 15 ja 30 minuutin stimulaation jälkeen (kuvio 2A ja C). Vastaavasti, merkittävän kasvun pFOXO3-S294 havaittiin 15 (5-kertainen), 30 (7-kertainen), ja 60 (3,5-kertainen) minuutin ajan TP-agonistin stimulaation (kuvio 2A-B). Hoito UMUC3 solujen kanssa TP-antagonisti pinaanista (PTXA

2) tai ERK-inhibiittoria (U0126) vaimensi U46619 välittämiä vaikutuksia aktivoidun ERK ja pFOXO3-S294 (kuvio 2D-I).

(A) UMUC3-soluja käsiteltiin 1 uM U46619 varten osoitetun kertaa. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella sekä täydellistä että fosforyloitu ERK ja FOXO3. GAPDH toimi latauskontrollina. Blotit määrällisesti ja tunnusluvut (B) pFOXO3-S294 on FOXO3 ja (C) pERKT202 /Y204 on ERK1 /2 piirrettiin käyttämällä GraphPad Prism 5. UMUC3 soluja esikäsitellään 15 minuuttia (D) 2 uM TP antagonisti pinaanista (PTXA

2) tai (G) 10 uM ERK-inhibiittoria (U0126) heikennetty aktivoinnin ERK ja fosforylaation FOXO3 hoidon jälkeen ja 1 uM U46619: ssa 30 minuuttia. Solulysaatit immunoblotattiin sekä täydellistä että fosforyloitu ERK ja FOXO3. a-Tubulin toimi latauskontrollina. Käyrät edustavat määrällisesti tunnusluvut (E ja I) pFOXO3-S294 on FOXO3 ja (F ja G) pERKT202 /Y204 on ERK1 /2 piirrettiin. Merkittävyys määritettiin kaikkien määrällisten blotit käyttäen toistuva toimenpide Yksisuuntainen ANOVA Tukey post hoc testi. P 0,05.

The effects of TP agonistin stimulaation FOXO3 transkriptioaktiviteettia tutkittiin kahden lusiferaasianalyysissä. UMUC3 solut transfektoitiin väliaikaisesti forkhead vaste-elementin (FHRE) tulikärpäsen lusiferaasi reportteri-konstrukti ja Renilla kontrollivektori, ennen käsittelyä ajoneuvoon tai TP-agonisti. FOXO3 transkriptionaalinen aktiivisuus väheni merkittävästi 36% ja 44% 30 ja 120 minuuttia, vastaavasti, seuraavat TP-agonistin stimulaation verrattuna vehikkelikontrolliin (kuvio 3A).

(A) UMUC3 soluja transfektoitiin ohimenevästi 3 x forkhead vaste-elementti (FHRE) reportterikonstruktio ja Renilla lusiferaasin kontrollivektorille käsiteltiin 1 uM U46619 30 tai 120 minuuttia ja alensivat FOXO3 transkriptioaktiivisuuden. Keskimääräinen Firefly lusiferaasiekspressio säädettiin kokonaisproteiinin ja kontrollivektorille Renilla lusiferaasiekspressio ennen normalisointia vehikkelikontrollieläimiin. Tulokset edustavat keskiarvoa prosenttia lusiferaasiaktiivisuus kolmen erillisen kokeen suoritettiin kaksoiskappaleet. * P 0,05, yksisuuntainen ANOVA Tukey post hoc testi. (B) UMUC3 soluja seerumia yli yön ja esikäsitellään 15 min. 1 uM indometasiinia ennen käsittelyä joko vehikkelillä tai 1 uM U46619 5, 30 tai 120 minuuttia. Solut altistettiin ydin- ja sytoplasman fraktiointi- ja proteiinit analysoitiin Western blotilla. α-Tubulin ja Lamin-B1 toimi lastaus säätimet sytoplasmista ja ydinvoiman jakeet, vastaavasti. (C) Densitometria of blotteja osoittaa pitkittyneen agonistin stimulaation lisääntynyt soluliman FOXO3 proteiinia ja lisääntynyt ydinvoiman pFOXO3 proteiineja verrattuna vehikkelikontrolleihin. Merkittävyys määritettiin kaikkien määrällisten blotit käyttäen toistuva toimenpide Yksisuuntainen ANOVA Tukey post hoc testi. P 0,05.

Perustuu fosforylaation kinetiikkaan FOXO3 selvitimme solujen jakautumista FOXO3 vuonna UMUC3 soluissa vehikkeliä tai TP agonisti 5, 30 tai 120 minuuttia. Nuclear ja sytoplasmaproteiinin fraktiot analysoitiin Western blot (kuvio 3B) ja bändi tiheydet kvantitoitiin käyttäen Image Studio Lite Ver 3.1 (kuvio 3C). UMUC3 stimuloitu TP agonistilla osoittivat aluksi laajentua ydin- FOXO3 johon liittyi myös lisääntyminen ydin- pFOXO3-Ser294 (kuvio 3C). Pitkäaikainen stimulaatio johti kokonaismäärä kasvaa merkittävästi FOXO3 sytoplasmassa (kuvio 3C).

TP stimulaatio lisää SIRT1 ilmaisua, deasetyloiminen FOXO3, ja vaikuttaa FOXO3 tavoite ilmaisuja

The effect of U46619 stimulaation on ekspressiotasot hyvin tunnettu FOXO3 tavoitteet p27

Kip1, MnSOD, ja Bim tutkittiin Western blot (kuvio 4A). UMUC3 stimuloitu U46619 30, 120 ja 240 minuuttia havaittiin vähentynyt p27

Kip1 ja Bim proteiineja, ja lisääntynyt MnSOD-proteiinin ilmentymistä (kuvio 4A). Koska ekspressiomalli FOXO3 tavoitteet muistutti kuvion havaittu yli-ilmentyminen histoni deacetyltransferase SIRT1 [21], tutkimme vaikutus U46619 stimulaation SIRT1 ilmentymisen. UMUC3 stimuloitu TP-agonistin näytetä lisääntyneen ilmentymisen SIRT1 ja vähentynyt ilmentyminen p300 verrattuna vehikkelikontrolliin (kuvio 4B-C). Sen määrittämiseksi, lisääntynyt SIRT1 ilmentymistä UMUC3 stimuloitu TP agonistilla vaikuttaa FOXO3 asetylaatio tila, FOXO3 immunosaostettiin UMUC3 soluista käsitelty joko ajoneuvon tai U46619, ja immunoblotattiin varten asetyloitu lysiinijäännöksissä. Stimulointi UMUC3 solujen U46619 120 ja 240 minuuttia näytetään 48% ja 70% vähennys asetyloitu FOXO3, vastaavasti (kuvio 4D-E).

(A) UMUC3 soluja vehikkeliä tai 1 uM U46619 varten 30, 120 ja 240 minuuttia. Solulysaatit kerättiin ja analysoitiin Western blot täydellistä FOXO3 ilmaisun ja loppupään tavoitteet p27

Kip1, MnSOD, ja Bim. (B) Proteiinin ilmentymistä p300 ja SIRT1 samassa solulysaateista. α-tubuliinin toimi latauskontrollina. (C) määrinä arvot blots kolmen itsenäisen kokeen piirretään. (*) Osoittaa p 0,05, yksisuuntainen ANOVA, verrattuna aika 0 kullekin Target suhteen. (D) Lisääntynyt SIRT1 ilmaisun välittämän U46619 vuonna UMUC3 soluissa vastasi vähentynyt asetyloitua FOXO3. Yhteensä FOXO3 immunosaostettiin seerumia UMUC3 soluja vehikkeliä tai 1 uM U46619 30, 120 tai 240 minuuttia. Eluoidut proteiinit analysoitiin Western blotilla vasta-aineiden asetyloitu lysiinitähteet ja FOXO3. Blots edustavat kolmen erillisen kokeen. Blotit määrällisesti ja tunnusluvut (E) asetyloitu-lysiiniä (asetyyli-K) FOXO3 piirrettiin. Merkitsevyys määritettiin käyttämällä toistuvia toimenpiteitä Yksisuuntainen ANOVA Tukey post hoc testi. P 0,05.

ERK kestävä mutaation FOXO3

3 A Alennettu TP agonistin välittämä Migration and Invasion

UMUC3 solut transfektoitiin stabiilisti GFP-vektorin tai mutantit GFP-FOXO3

3A-rakenne, jossa kaikki kolme ERK-fosforylaation tähteet korvataan alaniinitähteillä jäljitellä ei-fosforyloitu tai aktiivisessa tilassa (kuvio 5A). Sen määrittämiseksi, U46619 välittämän fosforylaation FOXO3 mukaan ERK vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasio, stabiilisti transfektoidut solut saivat siirtyä ja hyökätä stimulaation jälkeen ajoneuvon tai U46619. Ohjaus- GFP-vektorin soluihin johti 2-kertaiseen kasvuun solumigraatioon ja hyökkäyksen U46619 stimulaation verrattuna auton hallinnan taas ilmaus GFP-FOXO3

3 A proteiinia vähennetään U46619 välittämää muuttoliikettä ja invaasiota (kuva 5B-C) .

(A) GFP-FOXO3

3A tai EGFP-C

2 (Vector) transfektoitiin stabiilisti UMUC3 soluihin ja mutantti FOXO3 ilmentyminen vahvistettiin immunoblottauksella GFP. α-tubuliinin toimi latauskontrollina. Solut ympättiin inserttejä päällystetty fibronektiinin kulkeutumista tai Matrigel varten invaasio seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 1 uM U46619 ja laitetaan kuoppiin, jotka sisältävät täydellisen media 1 uM U46619. Solujen annettiin kulkeutua (B) 8 tuntia tai hyökätä (C) 16 tuntia. Merkittävyys määritettiin kaksipuolinen kahden otoksen

t

-testi, (* = P 0,05, n = 3) verrattuna GFP-vektorin ohjaus. (D) UMUC3 soluja esikäsiteltiin 10 uM U0126: ssa 15 minuuttia ennen stimulointia 1 uM U46619 ja annettiin kulkeutua 16 tuntia. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta määritykset tehdään kaksoiskappaleet ja ilmoitetaan keskiarvona ± SEM. Merkitsevyys määritettiin Yksisuuntainen ANOVA Tukey post hoc testi. P 0,05.

osoittavat lisäksi, että on tärkeää ERK signaloinnin TXA

2: n välittämien solun liikkuvuus, me esikäsitelty ERK estäjän U0126 (10 uM) 10 minuuttia ennen mittaamista vaikutus U46619 välittämän muuttoliikettä.