Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että androgeenipuutteen terapia (ADT) eturauhassyövässä, vaikka aluksi tehokasta, saa aikaan muutoksia kasvaimen kinome, joka myöhemmin edistää kehitystä kastraation vastustuskykyisten (CR) sairaus. Tunnustavat korrelaatio kasvaimen hypoksia ja huonon ennusteen eturauhassyövän, olemme edelleen arveltu, että tällaiset muutokset saattavat vaikuttaa hypoksia. Mikrosiruja 144 kinaasin peptidisubstraateilla sovellettiin analysoimaan CWR22 eturauhasen -ksenograftia näytteitä ADT-naiiveja, androgeeni-riistää (AD), pitkäaikainen AD (ADL), ja CR taudin vaiheissa. Vaikutus hypoksia arvioitiin sovittamalla ksenograftissa kinaasiaktiivisuutta profiilien kanssa hankittu hypoksinen ja normoxic eturauhaskarsinoomasolulinjaa kulttuureissa, kun taas kliininen merkitys arvioitiin analysoimalla eturauhasen kasvain näytteitä potilaista, joilla on paikallisesti edennyt sairaus, joko ADT-naiivi tai aikaisin CR tauti vaiheissa. Käyttämällä tätä uutta peptidisubstraattia microarray menetelmän me paljastui korkea kinaasiaktiivisuuden välittämän signaalin anturin ja aktivaattori transkription 5A (STAT5A) CR eturauhassyöpää. Lisäksi olemme paljastui korkea STAT5A kinaasiaktiivisuutta jo taantumassa ADL ksenografteissa, ennen uudistetun CR kasvu näkyi. Lopuksi, koska lisääntynyt STAT5A kinaasiaktiivisuutta myös havaittiin jälkeen altistamalla eturauhaskarsinoomasolua solujen hypoksia, ehdotamme pitkäaikainen ADT aiheuttavan kasvaimen hypoksia ja stimuloivat STAT5A kinaasiaktiivisuutta, myöhemmin johtaa uudistetun CR kasvaimen kasvua. Näin ollen tutkimuksessa havaittiin STAT5A ehdokkaaksi tutkittava tarkemmin sen potentiaali merkki edenneen eturauhassyövän ja mahdollisimman terapeuttinen kohdeproteiiniin.

Citation: Roe K, Bratland Å, Vlatkovic L, Ragnum HB, Saelen MG, Olsen DR, et al. (2013) Hypoksinen Kasvain kinaasisignaloinnin Tukena STAT5A in Development of kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (5): e63723. doi: 10,1371 /journal.pone.0063723

Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Ranska

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2012 Hyväksytty: 11 huhtikuu 2013; Julkaistu: 10 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Roe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kaakkois-Norja terveydenhuoltopiirin myöntää 2009070 ja 2012002 (KR), avustukset Division of Medicine, Akershusin yliopistollisen sairaalan ja Euroopan unionin 7. puiteohjelma apurahan 222741- METOXIA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ensimmäinen kasvu pahanlaatuisen eturauhasen kasvain stimuloi androgeenit [1], ja standardi ensilinjan hoitoon potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä sisältää androgeenipuutteen terapia (ADT) [2]. Vaikka aluksi tehokasta, kasvaimia väistämättä toistuisi kastraatiotasolle kestävä (CR) tilaan. Metastaattinen, CR eturauhassyöpä on jäljellä eniten levoton näkökohta eturauhassyövän hallintaan, uhmaten pitkittyneen hoidon vaikutuksia. Näin ollen parannettu ymmärrystä kantavista voimista CR eturauhassyöpä on perusteltua mahdollistaa kehittämisen tehokkaampia hoidon strategioita tässä potilasryhmässä.

Hypoksia on yhteinen microenvironmental tekijä kiinteiden kasvainten, edistää kasvaimen kasvua sekä angiogeneesi, etäpesäke, ja hoito vastus [3], [4]. Eturauhasen syöpä, kasvain hypoksia on todellakin korreloi huonoon ennusteeseen [5] – [7], vaikka skeptisismi jää sen aseman ja rutiinia kliinistä merkitystä.

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että hypoksia lisää aktiivisuutta ja herkkyys androgeenireseptorin [8], joka monissa CR kasvaimet voivat johtaa valikoima sovitettu fenotyyppien [9].

on jo vuosia ollut tunnettua, että taudin etenemistä ja hoidon kehittämiseen resistenssin syövän ovat yleensä tunnusomaista muuttunut ilmentyminen ja toiminta keskeisten välittäjien solun signaalitransduktion, säätelyyn kuten leviämisen, invaasio, ja angiogeneesi [10]. Merkitys ja mahdollinen käyttö tällaisista muutoksista parantaa syövän hoitoon katsotaan yhä useammin, erityisesti koska poikkeava proteiinikinaaseiksi pelaavat merkittävä rooli pahanlaatuinen kasvain etenemisen [11] – [13]. Ihmisen kinome (kaikki kinaasien), noin puolet tyrosiinikinaasin täydennys on osallisena syövässä [14]. Tunnistaminen poikkeavasta tyrosiinikinaasien onkin tullut houkutteleva lähestymistapa pyrkimys parantaa havaitsemista taudin aggressiivisuus ja uusia terapeuttisia kohteita.

Oletimme, että ADT eturauhassyövässä, vaikka aluksi tehokasta, saa aikaan muutoksia aktiivisuuden kasvain kinome joka myöhemmin johtaa uusittava, CR kasvaimen kasvua. Tarkastelemaan tätä hypoteesia, mikrosiruja kinaasipus- peptidisubstraatteja, lähinnä edustaa tyrosiiniryhmää, sovellettiin analysoimaan näytteet peräisin

in vivo

prekliinisissä eturauhassyöpämallin heijastaa eri vaiheissa kehittämisessä CR tauti. Vaikutus hypoksia arvioitiin sovittamalla tämän mallin kinaasiaktiivisuutta profiilien kanssa tuotetaan hypoksinen ja normoxic eturauhassyöpä soluviljelmissä. Kliinistä merkitystä arvioitiin analysoimalla eturauhasen kasvain näytteitä potilaista, joilla on paikallisesti edennyt sairaus, joko ADT-naiivi tai aikaisin CR taudin vaiheessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymien eläinten hoidon ja käytön komitea osastolla Comparative Medicine, Oslon yliopistollisessa sairaalassa (Luvan numero: 32-1984), noudattaen ohjeet eläinten hyvinvointiin Norja kansallisen komitean eläinkokeet . Kliinisen tutkimuksen pöytäkirja hyväksyttiin alueneuvoston Lääketieteen ja Health Research Ethics (REC Kaakkois, Luvan numero: S-08607b) ja oli mukaisesti Helsingin julistuksen. Kirjallinen suostumus vaadittiin osallistumista.

Prekliiniset Kasvainmalli

Tissue fragmentteja (~ 2 x 2 x 2 mm

3) ihmisen, androgen-herkkien CWR22 eturauhasen -ksenograftia [ ,,,0],15] olivat ihon alle (sc) istutettuna yhteen kylkeen mies, BALB /c-nude-hiiriin (30-35 g, ikä 6-8 viikkoa), yhdessä 12,5 mg depotmuotoisen testosteronia pelletti (Innovative Research of America, Sarasota, FL ).

aikana kehitys CR taudin seuraava ADT on esitetty kuviossa 1A, käyttäen prekliinisen mallia saada eri sairauden vaiheissa. Ensinnäkin, ksenografteissa edustavat ADT-naiivia tauti rekrytoitiin kun niiden lyhin halkaisija saavutti 8 mm. Toiseksi, ADT suoritettiin kun lyhin ksenograftissa halkaisija saavutti 12 mm, kirurginen kastraatio ja samanaikaista keskeyttämistä altistuminen testosteroni pelletti. Androgeenista riistää (AD) -ksenografteja rekrytoitiin kun niiden halkaisija pienennettiin 8 mm (noin 1 kuukausi kastraation jälkeen). Kolmanneksi pitkäaikainen AD (ADL) ksenograftit rekrytoitiin kun niiden halkaisija pienennettiin 4 mm (noin 4 kuukautta kastraation jälkeen). Viime, CR ksenografteissa jossa uusi kasvu oli mukana kun niiden halkaisija saavutti 8 mm, on 5,4 ± 0,4 kuukautta jälkeen kastraation. Vieraslajisiirteen halkaisijat mitattiin kaliiperin kahdesti viikossa alkaen istutusta asti kastraatio ja kerran viikossa sen jälkeen kastraation loppuun kokeen.

(A) -ksenografti halkaisijat ajan funktiona siirryttäessä androgeenipuutteen terapia (ADT) – naiivi kautta androgeeni riistää (AD) ja pitkän aikavälin AD (ADL), jotta kastrointi kestävä (CR) sairaus, kun ADT kastraatio. Aikaa kehittää CR tautia sairastavilla potilailla on ~ 2 5 vuotta. Meidän eturauhassyövän ksenograftimallia, vastaava aika oli 5,4 ± 0,4 kuukautta. Neljä ympyrät edustavat neljää koeryhmään tässä tutkimuksessa. Verinäytteitä prostataspesifinen antigeeni (PSA) mittauksiin poistettiin kaikki hiiret ennen kasvaimet leikattiin irti ja pikajäädytettiin kinaasiaktiivisuudelle profilointia. (B) Seerumin PSA-arvot heijastuvat kliinistä mallia taudin etenemistä. PSA väheni AD ja ADL kasvaimia, ennen palautettu CR kasvaimia. Merkittäviä eroja (p 0,05) verrattuna ADT-naiivi kasvaimia on merkitty (*). Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ja SEM 3-6 kasvaimia.

kastraatio suoritettiin anestesiassa, käyttäen s.c. injektiot zoletil seosta (2,4 mg /ml tiletamlinilla, 2,4 mg /ml tsolatsepaami (Zoletil eläinlääkäri, Virbac Laboratories, Carros, Ranska), 3,8 mg /ml ksylatsiinia (Narcoxyl eläinlääkäri, Roche, Basel, Sveitsi), ja 0,1 mg /ml butorfanoli (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA)), laimennettiin 1:05 steriiliin veteen, annoksena 7,5 ul /g. Kivunlievitystä annettiin kuohittuja eläimiä s.c. injektiot buprenorfiinin (Temgesic, Schering-Plough, Bryssel, Belgia), annoksena 0,1 mg /kg.

Verinäytteet eturauhasen antigeenin (PSA) analyysi poistettiin kaikista eläimistä ”reisilaskimo oikealle ennen eutanasiaa. Näytteiden annettiin hyytyä ennen sentrifugoitiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes kaikki näytteet analysoitiin samanaikaisesti. Vapaa ja seerumin PSA-arvot määritettiin jonka fluoroimmunonometric Autodelfialla ProStatus ™ PSA vapaa /Total Kit (PerkinElmer Life ja Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku, Suomi). Eutanasia eläinten suoritettiin kohdunkaulan sijoiltaan ja heti sen jälkeen leikkaamalla kasvainkudoksen, joka suoraan oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

Potilaat

tarkoituksena validointi prekliinisiin, neljä eturauhassyöpäpotilaalla että oli tehty eturauhasen selkeät resektio marginaalit olivat mukana tutkimuksessa (taulukko 1). Potilaat rekrytoitiin vuoden Norja Radium Hospital, Oslon yliopistollisessa sairaalassa. Histopatologisten kasvain ja imusolmukestatuksesta (pTN), kasvain Gleason pisteet, ja ennen leikkausta seerumin PSA-tasot olivat kirjataan osaksi Tavanomaisia ​​menetelmiä. Potilas 4 oli saanut pitkittynyt (~ 2 vuotta) kolmen kuukauden s.c. gose- annoksella 10,8 mg kunnes hänen PSA taso alkoi nousta jälkeen ADT aallonpohja, ja hän oli tarkoitettu leikkauksella.

Kudosten valmistelu

ksenoqraftit ja kirurgiset kudos- prostatektomia yksilöt, tuore pakastettu heti resektio, arvioitiin ensin kasvainsolualtistuksen sisällön, kun se leikattiin käyttäen kryostaattia mikrotomia ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Jokainen normaali kudos läsnä Tuumorinäytteissä karkeasti poistettiin leikkely ohjaa tahroja. Kaikki kasvain yksilöihin, joita käytetään oli kasvainsolujen pitoisuus on suurempi kuin 80%. Näytteet jälkeen leikataan 10 um: n leikkeiksi, jatkuvasti säilytettävä pakastettuna ja heti uudelleen säilytettiin -80 ° C: ssa. Tilavuus ~ 3 mm

3 leikattiin kaikista ksenografti näytteistä, tarvittava määrä osioita leikata laskettu mittauksen jälkeen näytteitä ”leveys ja pituus. Samanlaisilla menettelyillä, -5 mm

3 leikattiin kunkin eturauhasen koepala (normaali ja kasvain) näyte.

Data Analysis of Eturauhasen ksenografteja ”kinaasiaktiivisuutta Profiilit

Menetelmät valmistamiseksi proteiini lysaatit ja sukupolvi kinaasiaktiivisuuden profiileja on kuvattu teksti S1. Proteiini lysaatit kolmesta biologisesta rinnakkaista kustakin neljästä koeryhmään (ADT-naiivi, AD, ADL, CR) analysoitiin tuottamaan ksenograftissa kinaasitoiminta profiileja.

Kun silmämääräisesti sekä taustan vähentäminen, päätepiste signaali-intensiteetit (keskimääräinen signaalin intensiteettiä kolmen viimeisen kineettinen sykliä) kunkin täplän, eli kunkin kinaasi- peptidisubstraatilla ryhmää kohti, laskettiin BioNavigator (PamGene International BV). Pieni määrä negatiivisen signaalin intensiteettiä hoidettiin vähentämällä 1% kvantiili kaikki tiedot ja asettamalla jäljellä signaali-intensiteetit alle 1 1. Myöhemmin kaikki signaali-intensiteetit olivat log

2-transformoitu, ennen keskimääräinen jäljitellä signaalin intensiteettiä sisällä kussakin kokeessa laskettiin kullekin peptidisubstraattia. Korjaamaan mahdollisia koe-to-kokeilumuunnelmaa, keskiarvo neljästä koeryhmään ”signaali intensiteetit kullekin peptidisubstraatti vähennettiin kustakin ryhmän peptidisubstraatilla signaalin intensiteettiä. Microarray tiedot toimitetaan ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/); hakunumero E-MTAB-1572.

Tilastollinen analyysi myöhemmin suoritettiin PASW Statistics 18,0 (IBM, Somers, NY), jossa p 0,05 katsotaan tilastollisesti merkitsevä. ANOVA levitettiin tunnistaa peptidisubstraateilla huomattavasti eri fosforylaation tasojen kokeellista ryhmien (ADT-naiivi, AD, ADL, ja CR). Dunnettin monta-yhteen (AD, ADL, ja CR vs. ADT-naiivi) post-hoc testi oikaistu monimuuttujille. Peptidi substraatit ”proteiini ja geenin nimet, mukaan lukien tiedot soluprosesseihin he ovat mukana, on voitu noutaa UniProt (https://uniprot.org, 15 toukokuu 2012) ja Hugo Gene nimikkeistökomitealle (HGNC) (http: //www.genenames.org, 15 toukokuu 2012) [16].

kinaasiaktiivisuutta profilointi prostatektomia biopsianäytteet

kolme teknistä näytteitä (sekä kasvain ja normaali näytettä) analysoitiin kustakin potilas, yhdellä tyrosiini PamChip®96 levy kello PamGene International BV paikalla ’s-Hertogenbosch, Alankomaat. Näyte käynnissä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Saadusta tietokokonaisuus, laskettuna silmämääräinen tarkastus ja taustan vähentäminen, tiedot olivat log

2-transformoidut asettamisen jälkeen muutaman datapisteiden kanssa signaalin intensiteetti on alle 1 1.

Hypoxic altistaminen eturauhassyövän solut

22Rv1, PC3 ja DU145 ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Kaikki solulinjat todistaa oikeaksi lyhyitä tandem-toisto (STR) profilointi perustuu 16 monimuotoisuus merkitsijä käytössä ATCC ja isyystestit, ja vahvistettiin olevan mycoplasma-vapaa (MycoAlert, BioNordika, Oslo, Norja). Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Sigma-Aldrich, Oslo, Norja), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 1% L-glutamiinia (Invitrogen, Oslo, Norja), ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen). Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti yksikerroksena 75 cm

2 pulloissa 37 ° C: ssa 95% ilma /5% CO

2, ja aliviljeltiin kahdesti viikossa ylläpitää eksponentiaalista kasvua.

tutkimiseksi muutokset kinaasiaktiivisuuden aiheuttama hypoksia, eksponentiaalisesti kasvavat solut -60% yhtymäkohdassa, tuoreella kasvualustalla, siirrettiin hypoksia kammioon 24 tuntia (Invivo2 200; Ruskinn Technologies, Leeds, UK). Kohtalainen hypoksian (1% O

2) saavutettiin 5% CO

2 ja jäljellä N

2. Vaikea hypoksian (hapettomuudelle) saatiin 5% CO

2 ja sekoitus 10% H

2 ja 90% N

2 yhdistettynä katalyytin, joka katalysoi konversiota H

2 tahansa O

2 vasemmalle H

2O. Kaikki normoksia ja hypoksia kokeet suoritettiin kolmesti, jotta saadaan aikaan kolme biologista rinnakkaista kaikkien koeolosuhteissa.

kinaasiaktiivisuutta profilointi eturauhassyövän solut

valmistaminen proteiinilysaattien kuvataan Teksti S1. Kinaasiaktiivisuuden profilointi on tehty samalla tavoin kuin varten ksenografteista, käyttäen 10 ug kokonais-proteiinin kaikista näytteistä. Proteiini lysaatit kolmesta biologisesta rinnakkaisnäytettä kustakin tutkittavissa ryhmissä (normoksia, kohtalainen hypoksia, vaikea hypoksia) analysoitiin tuottaa kinaasiaktiivisuuden profiileja. Vuonna post-hoc Dunnettin testissä käyttövoimaa ehto edusti normoxic soluja. Arviointi teknisestä toistettavuus paneelit (alibittien ja intrachip korrelaatiot seuraava analyysi samaa soluviljelmän lysaatti kaikissa paneelit) esitetään Teksti S2.

kobolttikloridia hoito

simuloida hypoksinen altistuminen ja ilmentyminen hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) solut altistettiin 100 uM hypoksia-jäljittelevää ainetta kobolttikloridia (CoCl

2) (Sigma Aldrich), 4 tuntia, ennen kuin proteiini lysaatit tehty. Hoito CoCl

2 indusoi HIF-1α ilmentymistä sitoutumalla PAS domain, joka tukkii HIF-1α pVHL sitova, mikä antaa HIF-1α vakauttaminen [18].

Western Blot analyysi

proteiini ja fosfoproteiinista ilmaisuja mitattiin western immunoblot. Ensisijainen vasta-aineet olivat anti-HIF-1α (BD Biosciences, Trondheim, Norja), anti-STAT5A (Sigma-Aldrich), ja anti-fosfo STAT5A /B (Y694 /Y699) (Millipore, Temecula, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-γ-tubuliinia (Sigma-Aldrich) käytettiin loading ohjaus. Toissijainen vasta-aineet olivat peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-ja aasin anti-hiiri-(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, MA). Proteiinit tehtiin näkyviksi kemiluminesenssin avulla SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL) tai LumiGLO kemiluminesenssisubstraatilla (KPL, Gaithersburg, MD).

Tulokset

validointi Prekliiniset Model

CWR22 eturauhasen ksenografteja näytteillä tilavuus reaktiokuvioiden kastraation jälkeen samanlaisia ​​kuin potilailla, ja kehittyi CR ksenografteissa jälkeen 5,4 ± 0,4 kuukautta (kuvio 1A). Kun mikä vastaa noin viisi kertaa nopeampi aineenvaihdunta hiirillä, tämä vastaa noin 2-3 vuotta ihmisillä. Kliinisesti merkittävistä taudin etenemistä ksenograftissa vahvistettiin lisäksi seerumin PSA kvantitatiivinen peräisin eläinten verinäytteissä (kuvio 1 B). Väheneminen PSA peräisin ADT-naiiveja ksenografteissa AD ja ADL ksenograftit olivat merkittäviä (p = 0,032 ja p = 0,042, tässä järjestyksessä). CR ksenografteja, pre-ADT PSA-tasot palautuivat.

kinaasiaktiivisuutta ksenoqraftit jälkeen ADT

alkaen analyysi kinaasiaktiivisuuden profiilit syntyy ksenografteista, fosforylaatio 35 kinaasin peptidisubstraatteja havaittiin vaikuttaa merkittävästi (tai vähennettynä) jälkeen ADT kastraatio (taulukko 2). Näitä alustoja edustettuna proteiineja mukana useissa solun prosesseissa, kuten angiogeneesin (esim PDGFR, VEGFR, EPOR), selviytymistä, proliferaatiota, ja etenemiseen (esim MAPK, RAF, STAT), ja tarttuvuus, muuttoliike, ja invaasiota (esimerkiksi FER, FES, MET).

verrattuna ADT-naiivi ksenografteissa, jotkut alustan fosforylaatio tasot tuottamat AD -ksenografteja heikosti vähentynyt, kun taas toiset olivat lisääntynyt. Kuviossa 2A log-keskiarvo

2-suhde ja s.e.m. Kaikkien 35 merkittävät substraatit on esitetty kolmessa hoitoryhmässä verrattuna ADT-naiivit ksenografteissa, sininen väri osoittaa negatiivinen log

2-suhde ja punainen väri osoittaa positiivinen log

2-suhde, vastaavasti. Kuviossa 2B Volcano tonttien (-log

10 p-arvot versus log

2-suhteet) ovat visualisoida kinaasi peptidisubstraateilla merkittävimmät ja /tai korkein log

2 suhdelukua käsiteltyjen ja ADT-naiivi kasvaimet ”fosforylaatio tasoilla.

(A) Vähentynyt (blue; negatiivinen log

2-suhde) ja lisääntynyt (red; positiivinen log

2-suhde) fosforylaation tasoja kinaasin peptidisubstraattien androgeenien-riistää (AD ), pitkäaikainen AD (ADL), ja kastrointi kestävä (CR) eturauhassyövän ksenografteja verrattuna ADT-naiivi kasvaimet (keskiarvo suhde ja sem per substraatti). Proteiini lysaatit kolmesta biologisesta rinnakkaisnäytettä kustakin neljästä koeryhmään (ADT-naiivi, AD, ADL, CR) analysoitiin tuottaa ksenografti kinaasiaktiivisuutta profiileja. Luettelossa näkyvät substraatit ”vastaavan geenin nimiä, alun ja lopun kannat peptidisekvenssi proteiinin sisällä suluissa. (B) Volcano tontteja (-log

10 p-arvot vs. suhteet) visualisointiin kinaasi peptidisubstraateilla kanssa merkittävin ja /tai korkein log

2 suhdelukua käsiteltyjen ja ADT-naiivi kasvaimet ”fosforylaation tasoja. Väri merkinnät: keltainen: p 0,01 ja suhde 1,0; vihreä: p 0,01 ja suhde = 0,5-1,0; tumma pinkki: p = 0,01-0,05 ja suhde 1,0; oranssi: p = 0,01-0,05 ja suhde = 0,5-1,0; sininen: p = 0,01-0,05 ja suhde 0,5; vaaleanpunainen: p 0,05.

mukaisesti merkittävää kasvaimen kasvua estävää pitkäaikaista ADT taso alustan fosforylaation ADL ksenografteissa oli vahvasti pienentynyt 32 35 kinaasin peptidisubstraatteja verrattuna vastaaviin fosforylaation tasoja peräisin eksponentiaalisesti kasvavista ADT-naiivi ksenografteissa. Kaksi kolmesta jäljellä kinaasi peptidisubstraatteja, joka edustaa signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 1 ja 5A (STAT1 ja STAT5A), osoittivat huomattavasti fosforylaation ADL ksenografteja, joiden log

2 suhde versus ADT-naiivi ksenografteissa 1,5 ± 0,3 STAT1 (p = 0,004) ja 1,5 ± 0,7 STAT5A (p = 0,019). Fosforylaatiota CR ksenografteissa oli useimpien substraattien palauttaa samalla tasolla kuin ADT-naiivi ksenografteissa. Kuitenkin myös CR ksenografteista, fosforylaation STAT1 ja STAT5A alustoihin oli korkea, sillä STAT5A merkittäväksi verrattuna ADT-naiivi ksenografteissa (p = 0,040; log

2-suhde = 1,3 ± 0,8).

kinaasiaktiivisuutta ADT-naiivi prostatektomia näytteitä

arvioimiseksi kliinistä merkitystä, kinaasiaktiivisuuden profiilit eturauhasen näytteiden eturauhassyöpäpotilaille syntyi. Kinaasin aktiivisuus allekirjoituksen noudetaan 100 kinaasi peptidisubstraateilla korkeimpien fosforylaation tasoja, vierassiirrännäisille ja potilaiden kasvain näytteissä. Vierassiirrännäisille, allekirjoitus edusti keskiarvo kaikkien ADT-naiivi ksenografteissa. Kliinisten näytteiden, allekirjoitus ilmaistiin keskiarvolla kolmen ADT-naiivi kasvain näytteissä (tapaukset 1, 2, ja 3 taulukossa 1). Vertailusta saadut kaksi allekirjoitusta paljasti 74 jaetun alustan fosforylaatiot (kuvio 3A ja B), kun taas kukin niistä koostuu 26 yksinomaan fosforyloidun substraattien (kuvio 3C). 74% limityksellä osoittaa, että ksenograftimallia käytetään nykyisessä tutkimuksessa on biologisesti relevantti malli kliinisessä tilanteessa.

ADT-naiivi kinaasiaktiivisuuden allekirjoitus määritettiin 100 kinaasi peptidisubstraateilla korkeimmalla fosforylaation tasoja. Eturauhasen ksenografteja, allekirjoitus edusti keskiarvo kaikkien ADT-naiivi alustan fosforylaation tasoja. Eturauhasen syöpä potilaita, ylhäältä 100 allekirjoitusta tuotettiin laskemalla keskiarvo kolmen ADT-infektoitunut (tapaus 1, 2, ja 3, taulukko 1) kasvain fosforylaation tasoja. (A) Seitsemänkymmentä neljä 100 alustat yhteinen ksenograftissa ja potilaiden kasvain ADT-naiivi allekirjoituksia. (B) Fosfory- kinaasi peptidisubstraateilla yhteinen ADT-naiivi eturauhasen ksenografteja (n = 3) ja ADT-naiivi kasvaimia eturauhassyöpäpotilaalla (keskiarvo tapauksessa 1, 2, ja 3). Luettelossa näkyvät substraatit ”vastaavan geenin nimiä, alun ja lopun kannat peptidisekvenssi proteiinin sisällä suluissa. (C) Yksinomaan fosforyloitu kinaasilla peptidisubstraateilla (n = 26) on ksenograftissa allekirjoitus (vasemmalla) ja potilaan kasvaimen allekirjoitus (oikealla).

STAT1 ja STAT5A Alustan fosforylaation prostatektomia Näytteet

Kun paljastamiseksi lisäsi fosforylaation STAT1 ja STAT5A alustoille ADL ja CR ksenografteissa verrattuna ADT-naiivi ksenografteissa, vastaava substraatti fosforylaatio tasoilla eturauhasen näytteistä tutkittiin. Jolloin voi vertailla eri potilailla, alustan fosforylaatiot kunkin kolmen ADT-naiivi potilaan kasvaimen näyte normalisoitiin vastaaviin fosforylaatiot jonka kontralateraalista lohko normaalia kudosta näytteestä. Yksi potilas (tapaus 4, taulukko 1) oli saanut pitkäaikaisia ​​ADT ennen ensimmäisiä merkkejä CR taudin havaittiin (nouseva seerumin PSA) ja asian eturauhasen. Koska tämä potilaan normaalia kudosta myös sen androgen-riistää, normalisoituminen alustan fosforylaation tuottaman kasvaimen näyte että normaalista kudosnäytteestä poissuljettu. Näin ollen tämä potilas, alustan fosforylaatiot kasvaimen näyte normalisoitiin keskimääräiseen normaalin kudoksen alustaan ​​fosforylaatiot kolmen ADT-hoitamattomilla potilailla. STAT1 substraatti fosforylaatio oli alhainen ja samanlainen kaikille potilaille. Kuitenkin taas STAT5A alustan fosforylaation kasvain ja normaalissa näytteitä kaikissa ADT-hoitamattomilla potilailla oli alhainen; log

2-suhde = 0,7 ± 1,2 (n = 3), se oli huomattavasti suurempi alussa CR potilas; log

2-suhde = 2,6 (n = 1) (kuvio 4A).

(A) varten androgeenipuutteen terapia (ADT) -naïve eturauhassyöpäpotilaille, log

2 suhdelukua alustan fosforylaatio tasojen tuottamat eturauhasen kasvain näyte verrattuna vastaavaan kontralateraalista koru normaalissa kudosnäytteessä laskettiin. Potilaalle, jotka saivat pitkäaikaista ADT ennen eturauhasen, log

2 suhde alustan fosforylaation tasoja kasvainnäyte versus keskimääräinen alustan fosforylaation tasoja ADT-naiivi potilaiden normaali kudosnäytteet laskettiin (koska tämä potilaan normaali kudos myös altistettiin ADT). (B) Western immunoblot analyysi eturauhasen tuumorin näytteiden ”lysaatit vastaisella vasta-aineella hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α), pääasiassa proteiinin tiedetään aktivoituvan ja stabiloida hypoksisissa olosuhteissa, paljastava lisääntynyt HIF-1α ilmentymistä lysaatti alussa CR kasvain (tapaus 4). Ei HIF-1α ilmentymisen nähtiin lysaateista ADT-naiiveja kasvaimia.

Hypoksia aiheuttama lisäys STAT5A Alustan fosforylaation prostatakarsinoomassa Cells

Valitse saavutettuja tuloksia ksenografteissa ja prostatectomies yhdistettynä tunnustamista mahdollista roolia hypoksia kehittämisessä CR taudin [5], oletettiin, että hypoksia saattaa olla mukana muuttunut STAT5A kinaasiaktiivisuutta. Arvioida, hypoksia tila oli läsnä prostatektomia näytteiden Western immunoblot-analyysi HIF-1α suoritettiin eturauhasen kasvain lysaatit. HIF-1α on mestari säätelijä hapen homeostaasiin, tiedetään aktivoituvan ja vakiintui hypoksisissa olosuhteissa. Kuvio 4B esittää, että ilmentyminen HIF-1α löytyi lysaatti potilaan varhainen CR sairaus, mikä heijastuu nousevat PSA pitkäaikaisen ADT (tapaus 4), kun taas ei HIF-1α ilmentymisen nähtiin lysaateissa ADT -naïve kasvaimia.

edelleen tarkastaa tämän hypoteesin kinaasiaktiivisuuden profiilit muodostettiin normoxic 22Rv1 eturauhasen karsinoomasoluja, samoin kuin soluista alttiiksi kohtalainen (1% O

2) ja vakavaa ( 0,02% O

2) hypoksia 24 tuntia. 22Rv1 solulinja on androgen-reagoiva ja alun perin peräisin Uusiutuneessa CWR22 ksenograftissa [19], jotka ilmentävät sekä androgeenireseptorin ja PSA, mikä edustaa malli edenneen eturauhassyövän. Fosforylointireaktio tasot 22 kinaasin peptidisubstraattien merkittävästi lisätä tai vähentää hypoksinen solulysaateista (kohtalainen tai vaikea hypoksia) verrattuna vuoteen normoxic solulysaateista. Näitä olivat STAT5A alustan, joka esitetään yhä fosforylaation tasolla yhä hypoksian (kuvio 5A, sininen pylväät), vaikka keskimääräinen fosforylaation taso kaikkien 22 vaikuttaa merkittävästi kinaasin peptidisubstraatteja oli alhainen (kuvio 5A, harmaat pylväät). Ero keskimääräisessä fosforylaation taso kohtuullisella vs. vakava hapenpuute ei ollut merkittävä. Sillä STAT5A, log

2 tunnusluvut verrattuna normoxic soluja 0,47 ± 0,27 (p 0,05) varten kohtalaisen hypoksisia soluja ja 0,63 ± 0,31 (p = 0,020) että vakavasti hypoksinen soluja. Luettelo 22 kinaasin peptidisubstraateilla vaikuta merkittävästi hypoksia on esitetty kuviossa 5B.

(A) 22Rv1 solut altistettiin kohtalainen (1% O

2) ja vakavia ( 0,02% O

2) hypoksia 24 tunnin hypoksian kammiossa. Proteiini lysaatit kolmesta biologisesta rinnakkaisnäytettä kustakin tutkittavissa ryhmissä (normoksia, kohtalainen hypoksia, vaikea hypoksia) analysoitiin tuottaa kinaasiaktiivisuuden profiileja. Kinaasiaktiivisuutta profilointi hypoksinen ja normoxic solulysaateista havaitsimme kasvoi STAT5A alustaan ​​fosforylaatio yhä hypoksian (siniset palkit), kun taas keskimääräinen fosforylaation taso kaikkien 22 kinaasia peptidisubstraateilla merkittäviä muutoksia oli alhainen (harmaat palkit). * Lisäystä normoksia vaikeaan hypoksia oli merkitsevä (p = 0,020). Ero keskimääräisessä fosforylaation taso kohtuullisella vs. vakava hapenpuute ei ollut merkittävä. (B) osuus pieneni verrattuna lisääntynyt kinaasiaktiivisuutta hypoksinen versus normoxic 22Rv1 solulysaateista. Listattu ovat geeni nimet kärsivän kinaasin peptidisubstraatit, alun ja lopun kannat peptidisekvenssi proteiinin sisällä suluissa. (C) Western blot anti-fosfo-STAT5A /B ja anti-STAT5A ilmentymisen normoxic (-) ja vakavasti hypoksinen ( 0,02% O

2, 24 h) (+) solulysaatteja PC3, DU145 ja 22Rv1 soluja. Anti-γ-tubuliinin toimi latauskontrollina. (D) Western blot anti-HIF-1α, anti-fosfo-STAT5A /B ja anti-STAT5A ilmentymisen lysaatit PC3, DU145 ja 22Rv1 soluja (+) tai ilman (-) 4 tuntia altistuksen 100 iM hypoksian jäljittelevää ainetta kobolttikloridia (CoCl

2), kemiallinen indusoija HIF-1α. Anti-γ-tubuliinin toimi latauskontrollina.

Western immunoblot vastaavasti vahvisti lisääntynyt ekspressiotaso fosfo-STAT5A /B (Y694 /699) vakavasti hypoksinen 22Rv1 soluja, verrattuna normoxic 22Rv1 soluihin (kuvio 5C). Ekspression koko STAT5A proteiinin havaittiin myös lisätä alle hypoksia, mutta vähemmässä määrin kuin kasvu fosfo-STAT5A /B ilmaisua. Jos haluat jättää että toteamisen hypoksian aiheuttaman lisääntynyt STAT5A aktiivisuus oli solulinjassa erityisiä analysoitiin kaksi solulinjat, PC3 ja DU145 eturauhassyövän solulinjoissa, paljastaen samanlaisia ​​tuloksia kuin 22Rv1 solulinjassa (kuvio 5C).

Valaistaan ​​onko STAT5A aktivaatio suoraan indusoi HIF-1α aktivointia käsittelimme solut CoCl

2, kemiallinen indusoija HIF-1α. Kuten kuviossa 5D, CoCl

2 indusoi lisääntyneen ekspression sekä HIF-1α ja fosfo-STAT5A /B kaikissa solulinjoissa. STAT5A proteiinin ekspressio lisääntyi yhden solulinjan ja muuttumattomana kaksi muita solulinjoja. Koska HIF-1α nimenomaan aiheuttama lisäys Stat5: n fosforylaation nämä tulokset tukevat että hypoksia on syynä lisääntynyt Stat5: n toiminnan kautta HIF-1α-välittyvä mekanismi.

Keskustelu

Nykyinen tutkimus tunnistettu fosforylaatio lisääntyy taso STAT5A peptidin alustalle ADL ja CR eturauhasen ksenografteja verrattuna ADT-naiivi ksenografteissa.