PLoS ONE: Suunnattu Evolution Muodostaa Novel Onkolyyttiset Virus hoitoon Colon Cancer
tiivistelmä
Background
Viral välittämä oncolysis on uusi syöpä terapeuttinen lähestymistapa, joka saattaa olla tehokkaampi ja vähemmän myrkyllisiä kuin nykyisillä lääkkeillä johtuen tekijöille selektiivisen kasvun ja vahvistus kasvaimen solut. Tähän mennessä nämä aineet ovat olleet erittäin turvallisia potilailla, mutta ovat yleensä jääneet niiden odotettavissa oleva terapeuttinen arvo monoterapiat. Näin ollen uusia lähestymistapoja tuottaville erittäin voimakkaita onkolyyttisiä viruksia tarvitaan. Tilanteen korjaamiseksi olemme kehittäneet uuden menetelmän, että me termi ”Directed Evolution” luoda erittäin voimakas onkolyyttistä viruksia.
Menetelmät /Principal Havainnot
Ottaen ”Directed Evolution” lähestymistapa, virus- monimuotoisuus nostettiin yhdistämällä joukko serotyyppien, sitten viemällä altaat olosuhteissa, jotka kutsuvat rekombinaatio serotyyppien välillä. Nämä erittäin monipuolinen virus altaat asetettiin sitten ankarissa suoralla tuottaa ja tunnistaa erittäin tehokkaita aineita. ColoAd1, monimutkainen Ad3 /Ad11p kimeeristä virusta, oli ensimmäinen onkolyyttisten virus on johdettu tämän uuden menetelmän. ColoAd1, ensimmäinen kuvattu ei-Ad5-pohjainen onkolyyttisten Ad, on 2-3 lokit voimakkaampi ja selektiivinen kuin vanhemman serotyyppiä tai kliinisesti kehittyneet onkolyyttisten Ad, ONYX-015,
in vitro
. ColoAd1 tehokkuus testattiin edelleen
in vivo
on paksusuolensyöpä maksan etäpesäke ksenograftimalli laskimonsisäisen injektion ja sen
ex vivo
valikoivuus oli osoitettu kirurgisesti johdettuja paksu- tuumorikudoksista. Lopuksi osoitimme kykyä arm ColoAd1 kanssa eksogeeninen geeni perustamisesta mahdollista vaikuttaa syövän hoitoon monilla tasoilla yhdestä agentti.
Johtopäätökset /merkitys
Käyttämällä ”Suunnattu Evolution ”menetelmiä, olemme onnistuneet tuottamaan ColoAd1, uusi kimeerinen onkolyyttisten virus.
In vitro,
tämä virus osoittanut 2 log lisääntyminen sekä tehokkuus ja selektiivisyys verrattuna ONYX-015 paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä tulokset tukevat myös
in vivo
ja
ex vivo
tutkimuksia. Lisäksi nämä tulokset ovat vahvistaneet tämän menetelmän uutena yleisnäkemyksen johtamiseksi kliinisesti merkityksellisiä, erittäin voimakas anti-syöpä virotherapies.
Citation: Kuhn I, Harden P, Bauzon M, Chartier C, Nye J, Thorne S, et ai. (2008) Directed Evolution Muodostaa Novel Onkolyyttiset Virus hoitoon Colon Cancer. PLoS ONE 3 (6): e2409. doi: 10,1371 /journal.pone.0002409
Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kiina
vastaanotettu: 15 helmikuu 2008; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008
Copyright: © 2008 Kuhn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Näitä tutkimuksia tuettiin kokonaisuudessaan Bayer Healthcare Lääkkeen.
kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
kehitys tehokkaita hoitoja ihmisen kiinteiden kasvaimet edelleen merkittävä haaste syöpätutkijoita ja onkologi samankaltaisia. Tämä johtuu monimutkaisuus ihmisen kiinteiden kasvainten, jossa on useita, joskus tarpeettomia, vuorovaikutuksessa signalointipolkujen [1], potilasryhmässä eroja [2], sekä kyky hankkia vastustuskyky hoitoja, kuten äskettäin kehitetty suunnattu molekyyli hoitomuotoja, kuten erlotinibi, gefitinibin, ja imatinibi [3]. Näin ollen uusia aineita, on ainutlaatuinen toimintamekanismit, jotka kykenevät selviytymään tämän monimutkaisuuden, tarvitaan.
Onkolyyttiset virukset ovat ainutlaatuisia syöpälääkkeet, jotka kykenevät monistamaan tulo annos läpi replikaation kasvain-riippuvaisella tavalla. Ihmisen adenoviruksen (Ad) on yksi sarja viruksia kehitetään onkolyyttinen aineita hoitamaan ihmisen maligniteettien [4]. Varhainen kliinisissä tutkimuksissa ja prekliinisissä tutkimuksissa ovat osoittaneet synergiaa tämäntyyppisten uusien syövän hoidon tavanomaista hoitoa kemoterapiaa [5] ja säteily [6], [7], [8]. Vaikka onkolyyttisten mainokset testattu kliinisissä kokeissa on osoittautunut huomattavan turvallisuutta, jota he ovat osoittaneet vähän kliinistä tehoa kuin monoterapioita [9], [10], [11], [12]. Näin ollen, useita lähestymistapoja tutkitaan lisätä niiden tehoa (määritelty virusten kyky replikoitua, hajottamaan soluja, ja leviäminen), mukaan lukien tehostaminen solulyysin [13], [14], [15], [16], [17], [18], tarttuvuuden [19], ja ”viritys” niitä terapeuttinen siirtogeenien [20].
on 51 määritellään ihmisen Ad serotyyppejä, ryhmitelty A-F ja nämä serotyypit eroavat eri tasojen (esim patologian ihmisillä ja jyrsijöillä, hemagglutinatin ominaisuuksia, solu reseptorit). Kuitenkin, lukuun ottamatta kuidun muutoksia [19], vaihtoehtoiset ihmisen Ad serotyypeistä hyvin tutkittu Ad5 serotyyppi on jätetty huomiotta. Siten vaihtoehtoiset serotyypit voivat edustaa tutkimaton avenue kehittää tehokkaampia virotherapies.
täysin tutkia niiden potentiaali, käytimme menetelmää me termi ”Suunnattu Evolution”, jossa altaat Ad serotyyppien, jotka edustavat eri Ad alaryhmiin siirrostetaan ihmisen kasvainsolulinjoilla edustaja suurten kiinteiden kasvainten merkkejä (rinta-, paksusuoli-, haima-, eturauhas-) kutsua rekombinaation ja valikoima voimakkaita viruksen varianttien tai serotyypeille. Tämä yksinkertainen, ei-ennakkoluuloinen lähestymistapaa hyödyntää monimutkaisuus ihmisen kasvainsolun ohjata kehitystä valita, erittäin tehokkaita mainokset altaan ja on erittäin houkutteleva, koska se voidaan suunnata kohti lopputulos (esim kehittämään entistä lyyttistä virus) rajoittamatta kohti mekanismi (t), jotka voivat olla vastuussa että tulos (esim tehokkuus solujen hajoamista, infektiivisyys, viruksen DNA: n kahdentuminen). ColoAd1, virus eristettiin koolonsolulinjassa-siirrostettiin viruksen allas, näytetään teho ylivoimainen Ad5 useisiin paksusuolen kasvaimen solulinjojen, ja laajempi terapeuttinen ikkuna kokoelma paksusuolen kasvainlinjojen ja ensisijainen normaaleja soluja kuin äskettäin hyväksytty ja markkinoidaan virotherapy, ONYX-015 /H101 [21]. Superior teho osoitettiin edelleen
in vivo
on maksakasvain kylvö malli ja selektiivisyys oli validoitu kliinisesti leikattiin paksusuolensyöpä kudosta. Lisäksi osoitamme, että voimme ”arm” tätä uutta agentti sisällyttämällä siirtogeenit viruksen genomiin vaarantamatta teho aineen, mikä lisää mahdollisuuksia tämän agentin käsitellä monimutkaisia ihmisen kiinteiden kasvainten. Tämä on ensimmäinen kuvaus ei-Ad5-pohjaisten onkolyyttisten Ad ja hyödyntämisestä vaihtoehtoisten Ad serotyyppien merkitsee uusi lähestymistapa kehittää entistä tehokas ja selektiivinen onkolyyttisiä virusten hoitoon ihmisen syövissä.
Tulokset
suunnattu evoluutio yhdistetään adenoviruksen serotyyppejä eri kasvainsolulinjoihin johtuu selvästi eri virus- altaat, jotka ovat parempia teholtaan Ad5
Suunnatun Evolution strategiassa hahmoteltu Materiaalit ja menetelmät (kuvio 1
) on puolueeton lähestymistapa selvittää vaihtoehtoisia serotyyppien tai rekombinantit niiden ovat parempia teholtaan Ad5 (serotyypin kaikkien nykyisten onkolyyttisten mainokset) ihmisen syöpäsolujen linjat. Koska alhaisen resoluution tapa seurata muutoksia kulkiessa viruksen altaan ja luonnehtia homogeenisen /heterogeenisen luonteen lopullisen viruksen allas, altaat tutkittiin sijoitukset TMAE anioninvaihtokolonniin hyödyntämällä viruskapsidi maksu erot liittyvät kuhunkin serotyyppi (kuva 1
B
). Jokainen virus allas kerätty eri solulinjoista puhdistamisen jälkeen 20 eluoitui yhtenä piikkinä selvällä retentioajalla (kuva 1
C
). Jokainen eluointi huippu -jaettuja viruksen altaan ilmestyi seurata yhden alkuperäisen serotyyppejä (kuvio 1
B
). Tämä viittaa siihen, että kaikki virukset eivät ole yhtä niiden teho tietyllä kasvaimen solulinja, ja että erot kasvainsolulinjoissa valita tiettyjä viruksia sekoitettu virus-allas. Koska ainakin kaksi näistä valitun viruksen allasta ei seurata kanssa Ad5 retentioaika, Ad5 ei (perustuu voimakkuudesta) paras virus johtamiseksi kaikille onkolyyttistä mainokset.
A,
edustusto Suunnatun Evolution prosessin (katso materiaalit ja menetelmät yksityiskohtainen kuvaus).
B,
kromatogrammien jokaisen puhtaan Ad serotyyppi sisältyvät seka serotyypin alkaen allas, josta ColoAd1 valittiin.
C,
kromatogrammien kanavan 20 viruksen altaat johdetut HT-29, Panc-1, MDA-231, ja PC-3 tuumorisolulinjoja, vastaavasti. Erilaiset retentioajat nämä altaat ovat sopusoinnussa hallitseva serotyyppi altaan ollessa Ad5 tai Ad40: n varten Pancin-1 allas, Ad11p että HT-29-allas, Ad3 tai Ad4 PC-3-altaan, ja Ad5 tai Ad40: n varten MDA-231-allas.
MTS määritys käytettiin vertaamaan teho eri valitun viruksen altaat alkuperäiseen sekoitettu serotyyppi altaan ja Ad5. Kaikki valitut viruksen altaat lisääntynyt teho suhteessa Ad5 tai alkaen allas, jossa suuruus kasvu vaihtelee huomattavasti eri altaat. Suurin kasvu teho suhteessa Ad5 havaittiin altaassa nuorennettiin paksusuolen kasvaimen solulinja HT-29 (noin 2 log nousu), jolla on pienin lisäys (1,2-kertainen) havaittiin altaassa johdettu passage MDA-231mt1 cell rivi (taulukko 1).
ColoAd1 on hyvin voimakas ja selektiivinen onkolyyttisten virus
Koska virus allas nuorennettiin HT-29-solut näkyvät eniten voimakkuuden kasvua sen sukulais solu linja, virukset tässä altaan jatkettiin edelleen karakterisointia. Yksittäiset Plakkipuhdistettua virukset eristettiin ja seulottiin MTS testillä lyyttinen potentiaali HT-29 tuumorisolulinjassa. Teho yksittäisten plakkien verrattiin HT-29-altaan, josta ne on eristetty. Plakkia puhdistettiin virusten havaittiin olevan yhtä suuri tai suurempi teho kuin HT-29-allas. Voimakkaimmat näistä Plakkipuhdistettua viruksia, joita kutsutaan ColoAd1, valittiin lisäkarakterisointia.
Vaikka ColoAd1 valittiin kasvun paksusuolen kasvaimen solulinja HT-29, ei ole selvää, onko tämä virus oli lisääntynyt teho kaikissa tuumorisolulinjoissa, oli valikoiva paksusuolen syövän kasvainsolulinjoja, tai oli tehokkaampi on kaikissa solutyypeissä, mukaan lukien ensisijaisen normaalit solut. Käsittelemään kahta ensimmäistä kysymystä, ColoAd1 testattiin MTS määrityksen kaikista alkuperäisen kasvainsolulinjojen tässä tutkimuksessa käytetyt (Panc1-sct, MDA-231mt1, HT-29, ja PC-3), kaksi ylimääräistä kasvainsolulinjoja (OVCAR-3, DU-145), ja paneelissa paksusuolen kasvaimen solulinjojen (DLD-1, LS1034, HCT116, LS174T, SW48, SW403, Colo320DM), vertaamalla sitä Ad5. ColoAd1 oli yli 2 lokit voimakkaampi kuin Ad5 sen sukulais solulinjassa, HT-29. Lisäksi, ColoAd1 osoitettu teho on yhtä suuri tai suurempi kuin Ad5 joissakin ihmisen kasvainsolulinjoissa (esim PC-3, MDA-231, Ovcar-3, ja DU-145), mutta on heikennetty (noin kaksi tukit vähemmän tehokas kuin Ad5) on Panc1 solulinja (taulukko 2). ColoAd1 näytetä merkittävästi lisääntynyt teho (9-100-kertainen) verrattuna Ad5 kaikki paksusuolen syövän tuumorisolulinjoja seulotaan, lukuun ottamatta Colo320DM (taulukko 3). Tämä viittaa siihen, että paksusuolen kasvainsolulinjoja on ominaisuuksia, jotka tekevät niistä merkitsevästi alttiita tartunnalle ja hajoamiselle ColoAd1.
Sen testaamiseksi, ColoAd1 oli selektiivinen kasvainsoluja yli normaalit solut, ja siten, määritelmän , joka on onkolyyttisten virus, ColoAd1 tutkittiin kahdella eri paksusuolen kasvainsolulinjoja (HT-29, DLD-1), ja ensisijaiseen endoteeli- ja epiteelisolujen (HUVEC, HMEC) verrataan sen teho kussakin MTS määrityksessä Ad5 ja ONYX-015 /H101. Tulokset osoittavat, että ONYX-015: n ja Ad5 ovat merkittävästi vähemmän tehokas kuin ColoAd1 on HT-29 ja DLD-1-solulinjoja (taulukko 4). Sen sijaan, teho ColoAd1 HUVEC-soluissa oli sama kuin Ad5 ja hieman voimakkaampi kuin ONYX-015 (taulukko 4). On HMEC-soluissa, ColoAd1 oli vähemmän tehokas kuin Ad5 ja ONYX-015 (taulukko 4). Kvantitoimiseksi nämä erot ColoAd1, ONYX-015, ja Ad5, joka on
in vitro
terapeuttinen laskettiin, määritellään suhteena IC
50 tietyn viruksen normaalit solut, HUVEC tai HMEC jaettuna IC
50 paksusuolen kasvaimen solulinjojen HT-29 tai DLD-1 (taulukko 2). Nämä laskelmat vahvistaa, että ColoAd1 on terapeuttinen ikkuna, joka on 3-4 tukkien suurempi kuin Ad5 tai ONYX-015 /H101 näissä
in vitro
määrityksissä.
ColoAd1 on kimeerisen viruksen, joka näyttää lisääntyneen tehon yli sen emo- virus, Ad11p
Kromatografinen analyysi osoitti, että suuri kerros proteiinit ColoAd1 olivat peräisin Ad11p, B-ryhmän viruksen. Määrittää suhde ColoAd1 ja Ad11p, virus sekvensoitiin, paljastaa, että ColoAd1 on Ad11p, jossa on lähes täydellinen E3-alueella poistetaan, pienempi deleetion E4-alueella, ja kimeerinen Ad3 /Ad11p E2B-alueella (kuvio 2).
genomiset erot ColoAd1 ja Ad11p todetaan kaavamainen. Vuonna E2B alueella on usein substituutioita Ad3 sekvenssejä Ad11p sekvenssien välillä emäsparien 6081 ja 9322. Lisäksi, ColoAd1 on lähes täydellinen (2444 bp) E3-alueella poistetaan, ja pienempi (25 bp), toinen poistetaan, että karttoja oletetun E4orf4 alue viruksen.
on mahdollista, että Ad11p tai Ad3 ovat serotyypit, jotka ovat luonnostaan tehokkaampia, ja on laajempi terapeuttinen ikkuna, kuin Ad5, ja että tämä ominaisuus on riippumaton hankittu geneettisiä muutoksia löytyy ColoAd1 genomissa. Tämän testaamiseksi me tutkittiin ColoAd1, Ad11p ja Ad3 kahteen paksusuolen kasvainsolulinjat, HT-29 ja DLD-1, ja ihmisen primaarisia endoteeli- ja primäärisistä ihmisen epiteelisoluissa, HUVEC ja HMEC, vastaavasti, MTS-määritys. Kuten esitetään taulukossa 4, ColoAd1 ylivoimaiset väkevyys sekä Ad11p ja Ad3 paksusuolen kasvaimen solulinjojen, mikä osoittaa, että tämä yhdistelmä-DNA-virus oli parempi teho sekä sen vanhemman viruksia. Mielenkiintoista, Ad11p, eikä Ad3, näy luontainen terapeuttinen ikkuna määritellyn tänne käyttäen MTS-analyysi. Näin ollen, ColoAd1 on johdannainen Ad11p, joiden erot Ad11p parantaa tehoa viruksen muuttamatta serotyypin luonnollista kykyä replikoitua selektiivisesti tuumorisoluihin verrattuna ensisijaisen normaalit solut.
On tärkeää huomata, että ilmoitetut seropositiivisuus of Ad11p on alhainen [22], [23] suurin tarve tämäntyyppiseen terapeuttinen on Potilasryhmiin jossa kasvain on edennyt systeeminen, metastaattinen syöpä. Täten hoidettaessa potilaita aineen kanssa, joka ei ole ennestään koskemattomuuden lisätä mahdollisuus asiamiehen kiertää ja poistaa metastasoitunut syöpäsoluja. Vahvista edellinen raportit alhainen seropositiivisuuden of Ad11p, seerumin kuudesta eri yksilöitä kerättiin ja testattiin kykyä neutraloida tarttuvuutta ja lyyttinen potentiaali näiden virusten reportterisolulinjaa, Ovcar-3. Kanssa kirjallisuudessa, seerumin osoitti vähän vaikutusta ColoAd1 (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että ColoAd1 voi olla toteuttamiskelpoinen lähestymistapa systeemiseen hoitoon paksusuolen syöpä.
ColoAd1 on antituumorivaikutus parempi ONYX -015 ja Ad11p on paksusuolensyöpä maksakasvain kylvö ksenografti hiirimallissa seuraavat iv hallinto
Useimmat kiinteät kasvaimet ovat metastasoitunut aikaan diagnoosi. Koska alustava sivusto etäpesäkkeiden paksusuolen syöpä on maksassa, paksusuolen syöpä maksakasvain kylvö malli [24] käytettiin tutkimaan
in vivo
tehoa ColoAd1. Selvittää ennalta virus antituumoriaktiivisuus riippuu kyvystä viruksen replikoitumisen ja levitä tässä mallissa, annosvastetutkimuksessa tehtiin vertaamalla ColoAd1 on replikaatiopuutteel- muoto ColoAd1 (jossa olennaisia E1-alue viruksen poistettu). Kuten kuviosta 3 nähdään
, systeemisesti toimitetaan ColoAd1 pienentää selvästi tuumoritaakka annoksena, ja replikointi, riippuvaisella tavalla. Koska HT-29-solujen irtoa karsinogeenisia alkion antigeeni (CEA), tämä voidaan käyttää helposti mitata vastineena kasvaintaakkaa. Tärkeää on, mittaukset CEA verenkiertoon (kuva 3
B
) korreloivat hyvin tuloksia kasvaimen punnituksia (kuva 3
).
HT-29 paksusuolen syövän solut ympättiin maksan nude-beige-hiiriä (n = 10 hiirtä per hoitoryhmä). Plasma CEA taso tarkkailuun käytettiin kasvaimeen perustamiseen.
ja
B
, Hiiret käsiteltiin hännän laskimoon (iv) injektiona 1 x 10
10, 5 x 10
10, tai 1 x 10
11 yhteensä viruspartikkeleita ColoAd1 hiirtä kohti. Neljäs sarja maksa-kasvain hiiret olivat i.v. injektoitiin 1 x 10
11 yhteensä virus- partikkeleita replikaatiopuutteel- [E1
(-)] version ColoAd1, ColoAd1CJ132. Viidennessä hiiriin injektoitiin ajoneuvon ohjaus (puskuri). Kasvain punnitukset osoittaa ColoAd1 on antituumoriaktiivisuus, joka on annosriippuvaista (
). Veren CEA tasot lopussa tutkimuksen (päivä 12 post virusperäisen hallinto) tukevat kasvaimen paino data (
B
).
C ja D,
vertailu antituumoriaktiivisuus of ColoAd1, Ad11p ja ONYX-015 HT-29 maksan etäpesäke ksenografti- hiirimallissa. Toisessa tutkimuksessa suoritetaan samaa mallia kuin paneelit A ja B, ColoAd1 verrattiin sen vanhempien virus, Ad11p ja kliinisesti hyväksytty onkolyyttisten virus ONYX-015; Kunkin viruksen annosteltiin i.v. yhteensä 1 x 10
11 viruspartikkelit hiirtä kohti.
Voit testata, onko ylivoimainen
in vitro
tehoa ColoAd1 suhteessa Ad11p ja ONYX-015 /H101 oli toisteta
in vivo
, nämä virukset verrattiin maksassa kasvain kylvö malli. Kuten kuviosta 3 nähdään
C
(kasvaimen paino) ja kuviossa 3
D
(CEA taso mittauksiin), anti-kasvaimen aktiivisuus ColoAd1 oli ylivoimainen sekä Ad11p ja ONYX-015 tässä malli, joka vahvistaa
in vitro
johtopäätöksiä.
valikoivuus ColoAd1 ihmisen tuumorikudoksista eristetty paksusuolen syöpäpotilaiden
in vitro
ja
in vivo
malleja ennustamaan kliininen tehokkuus on ollut vaikea tunnistaa, ja puute tällaisten ennustemalleja edelleen johtaa laajaan poistuma syöpälääkkeiden. Näin ollen juuri eristettyjä, kirurgisesti poistettu ihmisen paksusuolen syövän ainetta tutkittiin ylimääräisenä malli testausjärjestelmä ColoAd1. Koska kirurginen materiaali sisältää sekä kasvainkudoksen ja normaalin solun marginaalit, tämä järjestelmä tarjoaa erinomaisen mahdollisuuden testata kasvain valikoivuus viruksen yhteydessä ehjä ihmisen kudosta. Elinkelpoisuus sarja Tuumorinäytteissä analysoitiin kudosviljelmässä; elinkelpoisuus vaihteli 2-6 päivää. Tämän vuoksi varmistetaan, että solukuolema johtui virally aiheuttama hajoamiseen ja vapautumisen jälkeläisten virus ja ei johtunut spontaanin hajoamisen kirurgisen materiaalin 24 tunnin päätepisteen valittiin. Kuusi kasvain kerättiin ja lyönti viljelmät kasvaimen ja normaalin kohdat (määritettynä kliinisen patologi) tuotettiin ja altistettiin joko Ad5 tai ColoAd1. Määrittää kunkin virusten kykyä replikoitua, hajottamaan ja vapauttaa tarttuvan viruksen, supernatantti kerättiin 24 tuntia infektion jälkeen ja määritettiin läsnäolo jälkeläisten virus. Kuten kuviosta 4 nähdään
, ColoAd1 syntyy noin kaksi lokit enemmän virus jälkeläisiä kasvaimen materiaalista kuin vastaaviin normaaleihin kudoksiin, vahvistaa sen kasvain valikoivan replikaation juuri eristettyjä ihmisen kasvainkudoksessa. Nämä tutkimukset osoittivat myös, että ColoAd1 esillä ainakin yksi log korkeampi kasvaimen selektiivisyys kuin kontrolli viruksella, Ad5.
A,
Punch näytteitä vasta-leikattiin ihmisen paksusuolen kasvain (n = 6), ja Hyväksytty normaali marginaali alueilla, tartutettiin joko ColoAd1 tai Ad5 ja ylläpidetään kudosviljelmässä. Viruksen purskeen kustakin näytteestä mitattiin plakkimäärityksellä 24 tuntia infektion jälkeen.
B,
immunohistokemiallinen värjäys CD46 läsnä kliinisissä paksusuolen kasvain, normaali paksusuoli, ja normaali maksan näytteet.
CD46 on tunnistettu solun liitetiedoston reseptori Ad11p, vanhempi virus ja ColoAd1 [25], [26]. Määritellä paremmin ilmentymisen CD46 perus- ja metastaattinen paksusuolen syövän, tutkimme paksusuolensyöpä materiaali, normaali maksakudosta ja normaalissa paksusuolen kudosta CD46 ekspression immunohistokemiallinen (IHC) (kuva 4
B
). Vahva CD46 IHC värjäytyminen johdonmukaisesti nähtävissä paksusuolisyöpäkudoksessa, mutta ei ollut läsnä tai yleensä heikkoja normaalissa paksusuolen ja maksakudosta. Tämä viittaa siihen, että CD46: n ilmentyminen olla osasyynä havaittuun kasvain valikoivuus ColoAd1 ja voi siten olla mahdollinen työkalu esitarkastuksen potilaiden hoitoa tällä terapeuttista ainetta.
ColoAd1 voidaan aseistettu tinkimättä teho
Armed onkolyyttisiä virukset pyrkivät täydentämään teho onkolyyttisten viruksen lisäämällä terapeuttisten siirtogeenien [20]. Tässä lähestymistavassa on tärkeää, että terapeuttinen siirtogeeni insertiokohta sisällä virus- genomin voidaan tunnistaa, joka ei vaaranna elinkaari ja näin ollen teho viruksen. Toisin kuin Ad5, jossa biologia ja kuvaus insertiokohtiin yhteensopiva viruksen elinkaaren on kuvattu hyvin, ColoAd1 edustaa uutta ainetta, joka on pääasiassa johdettu huonosti tutkittu Ad11p genomin. Näin ollen, transposoni-pohjainen järjestelmä, joka voi skannata genomin insertiokohtien ei-ennakkoluuloinen tavalla käytettiin tunnistamiseksi yhteensopivien siirtogeenin insertiokohdat [27] Ottaen huomioon, että virusgenomin koodaava kapasiteetti ihmisen Ad on rajoitettu [28] konsensus silmukoinnin akseptorikohdan sijoitettiin ylävirtaan siirtogeenin, poistaa tarpeen eksogeenisen promoottorin ja yhdistää ilmaisun endogeenisen ColoAd1 promoottori [29]. Parantaa kykyä tunnistaa siirtogeenin ilmentävien ColoAd1 variantteja, GFP valittiin siirtogeenin. Useita virus- isolaateista luodaan ja seulotaan sitten tehon ja viruksen kutsutaan ColoAd1-GFP valitaan sen perusteella, vastaava teho kuin vanhemman ColoAd1 (Fig. 5A ja 5B).
MTS määritykset suoritettiin ColoAd1 ja ColoAd1-GFP on A) paksusuolen kasvain solulinja, HT-29 ja B) ensisijaisen endoteelisolujen, HUVEC. Reportterigeeni, GFP, ilmaistaan myöhään kinetiikka (so., Riippuu aloittamisen viruksen DNA: n replikaation ja ekspression), kuten on määritelty ilmaisu C) ainoastaan puuttuessa AraC ja D) ei ole ilmentymisen läsnä AraC .
Past tutkimukset käyttäen silmukointiakseptorin perustuva ekspressiokasetin osoittaneet, että ilmaisu tapahtui myöhään viruksen elinkaaren ja oli riippuvainen viruksen DNA: n kahdentuminen [29]. Linkittäminen terapeuttinen ilmentymistä valikoivuuden virus on merkittävä turvallisuutta etu verrattuna perinteisiin konstitutiivinen ilmentyminen järjestelmiin vuodesta geenin ilmentyminen olisi vähäinen ja riippuvainen kasvain valikoivuus viruksen järjestelmän [30]. Määrittää GFP: n ilmentymisen kinetiikan välillä ColoAd1-GFP, HT-29-solut infektoitiin läsnä ollessa tai puuttuessa AraC, yhdistettä, joka inhiboi viruksen replikaatiota. Kuten kuvioista 5C ja 5D, GFP ilmaisu esti lisäämällä AraC osoittaa, että ilmentyminen tapahtuu myöhään viruksen elinkaaressa ja liittyy virusreplikaation.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa olemme vahvistanut, että valita voimakas virustekijät ilman suosimista mitään mekanismia, poolista Ad serotyyppien edustavat Ad alaryhmään B-F. Tämä menetelmä, joka on erittäin nopeutettu versio luonnollinen valinta viruksia, voidaan soveltaa mitä tahansa virusta ja minkä tahansa syöpätyypin valinta.
Käyttämällä tätä prosessia, me muodostetaan ja tunnettu ColoAd1, uusi Ad3 /Ad11p kimeerinen onkolyyttisten virus hoitoon ihmisen paksusuolen syövän ja mahdollisesti muissa käyttöaiheissa. Tämä virus on osoitettu olevan tehokkaampia ja niillä on suurempi terapeuttinen ikkuna kuin Ad5 ja kliinisesti kehittyneet onkolyyttisten virus Onyx-015 (taulukot 2-4). Futhermore, ColoAd1 havaittu olevan potentcy laskimonsisäiseen tuumorin malli ja kasvaimen eksplantaatteja (kuviot 3 ja 4) .Tämä virus on useita muutoksia suhteessa alkuperäiseen Ad11p virus, mukaan lukien kimeerinen E2B alueella ja deleetioita E3 ja E4-alueilla. Joka muuttaa tai muutoksia osansa tehostetussa teho tämä virus ei ole selvä. Menetys geenien Ad5 E3-alue on osoitettu B-ryhmän mainokset parantaa viruksen hajoamiseen ja levitä [31] mukaan määrittelemättömän mekanismi. E2B alue koodaa pre-terminaalista proteiinia (PTP) ja virus-DNA-polymeraasia (DNA pol), kaksi kolmesta E2-koodattuja proteiineja, joita tarvitaan viruksen DNA: n replikaatiota. Päätelaite 18 bp virusgenomin, pidetään minimaalinen replikaation suoraan vuorovaikutuksessa pTP ja DNA pol heterodimeerin. On tärkeää huomata, että kun sekvensoitiin genomista päät ColoAd1 ja villityypin Ad11p olivat samat kuin Ad3 ja ristiriidassa kuvatun DNA-sekvenssin päät on kuvattu Ad11p [32], [33]. Siten E2B muutoksia ColoAd1 voi tuottaa PTP-DNA pol heterodimeeri, joka on enemmän yhteensopiva päätelaite 18BP ColoAd1 kuin alkuperäinen Ad11p pTP-DNA pol. Yhdessä ColoAd1 pienempien genomin (seurauksena genominen poistot) tämä voi monistaa nopeammin ja myös saavuttaa kriittisen viruksen purskekoon nopeammin, parantamalle viruksen lyysin ja leviämistä.
osalta valikoivuus, tutkimuksia, joilla pTP Ad5 ovat osoittaneet, että se on vuorovaikutuksessa CAD, isäntä proteiini vastaa TP-ydin- matriisin -alueella. Taso CAD korreloi määrä solunjakautumisen; kaksi-viisi kertaa korkeampi tuumorisoluissa kuin normaaleissa soluissa ja lähes olematon lepotilassa olevat solut [34], [35]. Näin ollen, TP muutokset ja niiden mahdolliset vuorovaikutukset CAD (tai vastaavia proteiineja), voi olla myös mekanismeja parempaan replikaatioon ja /tai viruksen selektiivisyyttä.
kolmas muutoksen jälkeen ColoAd1 viruksen genomi on pieni deleetio (24 ep), joka jäljittelee oikean E4orf4 alueelle viruksen. E4orf4- proteiinin Ad5 vuorovaikutuksessa isäntäsolun seriini /treoniini-proteiinifosfataasi 2A (PP2A), [36]. Tämä vuorovaikutus on osoitettu indusoivan p53-riippumattoman apoptoosin, inaktivoivat liittämiseen tekijät, ja vähentää E1A aktivointi AP-1, JunB, ja ilmentäminen Ad E2 ja E4 transkription yksiköitä [37]. Kuitenkin, koska E4-alue on erittäin saumattu, The E4orf4 geeni poistetaan voivat myös muuttaa ilmaisun toisen E4-geenin tämän monimutkaisen transkriptioyksikön, mikä epäsuorasti edistää lisääntyneen tehon ja ColoAd1. Lisäksi ei ole selvää, että Ad11p ja Ad3 proteiineja pitää voimassa tai kaikki toiminnot katsoneet homologisia Ad5 proteiineja. Näin ekstrapolaatioiden Ad5 proteiinin toimintojen proteiineihin ColoAd1 on huolellisesti testattava. Näin ollen, vaikka on selvää, että CololAd1 on tehty useita geneettisiä muutoksia, joiden seurauksena voimakkaampi virus, se ei ole selvää, mikä muutos (t) ovat vastuussa lisääntyneen tehon.
On tärkeää huomata, että ColoAd1 on ryhmän jäsen B-mainokset ja siten selvästi erilainen kuin perinteinen Ad5-pohjainen onkolyyttisten viruksia. Se ei esimerkiksi käytä Ad5-reseptori, (coxsackie- B- ja adenovirus-reseptori, CAR), liitettäväksi soluihin. Sen sijaan, ColoAd1 näyttää käyttää ainakin kaksi reseptoreja, jotka ovat selvästi erilaisia kuin CAR [22], [38], [39], joista yksi on hiljattain kuvattu CD46 [25], [26]. Tämän merkitys korostuu viimeaikaiset tutkimukset kliinisestä materiaalista joka osoittaa, että auto on huonosti ilmentyy erilaisia kasvain tyypit ja että CAR lauseke laskee etukäteen vaiheessa ja arvosana kasvain [40], [41], [42 ], [43], [44]. Muita raportteja tuumorisuppressorin ominaisuuksien CAR [45], [46] ja havaitseminen liukoisen CAR kasvaimen mikroympäristössä [47] kyseenalaistaa auto riippuvaisen adenovirusten hoitoa varten kaikkien ihmisen syövistä. Sen sijaan kasvaimen ilmentyminen solun pinnalla CD46, oletetun ColoAd1 reseptoria, näyttää lisääntyvän vaiheessa ja luokan eri syövistä [48]. Siten ColoAd1 voi olla terapeuttisesti käyttökelpoisia pidemmälle paksusuolensyöpä, ja osoittavien tähän ovat käynnissä. Ylimääräisiä tärkeitä ovat tiedot, jotka osoittavat, että seropositiivisuus on Ad11p on alhainen [22], [23]. Koska suurin tarve tämäntyyppiseen terapeuttinen on Potilasryhmiin jossa kasvain on edennyt suljetussa paikallisen taudin systeemisen, metastaattinen syöpä, hoidettaessa potilaita, joilla aineella, johon heillä ei ole ennestään koskemattomuuden lisätä mahdollisuus agentti kiertää ja poistaa metastasoitunut syöpäsoluja. Tämä on päinvastoin kuin Ad5 jossa sero-esiintyvyys, mitattuna neutraloivien vasta-aineiden, saavuttaa tason noin 50% yleisestä väestöstä [23], [49].
On tärkeää huomata, että teho ColoAd1 voidaan täydentää yhdellä ja mahdollisesti useamman terapeuttisen siirtogeenien. Kyky virittää näitä aineita on ainutlaatuinen mahdollisuus vaikuttaa syövän hoitoon monilla tasoilla yhdestä agentti. Mistä osoituksena perustaminen ja tehokas ilmentyminen GFP päässä ColoAd1 genomista, viritys voi tapahtua vaarantamatta teho tai valikoivuus viruksen terapeuttista. Sen lisäksi, jotka sisältävät aineita, jotka täydentävät onkolyyttinen mahdolliset viruksen (esimerkiksi aihiolääke muunnetaan entsyymien, anti-angiogeenisten tekijöiden, immunoterapeuttisiin,), viritys luo mahdollisuuden kliinikot seurata toiminnan virotherapy hoidon vähän invasiivisia tavalla [50] . Tämä on sitäkin mielekkäitä jos menetelmä seurantaa varten virotherapy liittyy suoraan viruksen elinkaaren. Kun kyseessä on ColoAd-GFP, tämä on selvästi osoitettu, jossa GFP: n ilmentymisen on osoitettu olevan suoraan yhteydessä DNA: n replikaatiota (kuvio 5B). Useita geenejä on tunnistettu, joka antaisi lääkäreille seurata viruksen toimintaa ja sisältää geenejä, jotka liittyvät radionuklidikuvastamisessa (esim HSV-1 TK, ihmisen thyroidal natriumjodidi symporter, [51], [52]) ja liukoinen markkeri peptidejä helposti havaittavissa verenkierrossa tai virtsaan näytteet (esimerkiksi ihmisen karsinoembryonaalinen antigeeni, β-ketju koriongonadotropiinia [53], [54], [55]). Käyttäen ilmentyminen liittyy geenin biomarkkerina virusreplikaation ja leviäminen merkitsee mahdollisuutta Lääkäreille muokata hoitoa, antaen lisäannos vain tarvittaessa, mikä siirtymässä vakio, ajastettu annokset yleisesti yhdistetään nykyiseen kemoterapia. Yhtä tärkeää, koska pidämme tasapainotetaan tarve lisääntynyt teho kanssa turvallisuuden viruslääkkeitä, viritys voitaisiin käyttää myös sisällyttää ”varoventtiili” osaksi virotherapy, joka pystyy keskeyttämään viruspohjaisella terapialla kautta antaminen kliinisesti hyväksytty huumeiden (esim. sisällyttämällä HSV TK-geenin ja hallinnon gansikloviiri).