Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keski vuorokausirytmin kellon sisällä suprakiasmaattiseen nucleus (SCN) näyttelee tärkeä rooli ajallisesti organisoida ja koordinoida monet prosessit säätelevät syöpäsolujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua synkronoituna päivittäin valo /pimeä sykli, joka voi edistää endogeenisen syövän ehkäisyyn. Bioenergetic alustoissa ja molekyylitason välituotteita voidaan rakentaa kasvaimen biomassan päivittäin saadaan sekä aerobinen Glykolyysivaiheen (Warburg vaikutus) ja rasva-aineenvaihduntaan. Käyttämällä kudos-eristetty ihmisen rintasyövän ksenograftien kasvatettu nude-rotilla, olemme päättäneet, että kiertävä systeemisiä tekijöitä isännän ja Warburg vaikutus, linolihappo otto /aineenvaihduntaa ja kasvua signalointi toimintaa kasvaimen dynaamisesti säännelty, koordinoitu ja integroitu vuorokausirytmin ajan rakenteeseen yli 24 tunnin valo /pimeä sykli SCN-ajettu öisin pineal tuotantoa syövänvastainen melatoniinia. Hämärässä yöllä (LAN) aiheuttama melatoniini tukahduttaminen häiritsee tätä vuorokausirytmin-säännellyn isäntä /syöpä tasapaino useita tärkeitä syövän ennaltaehkäisevä signalointimekanismeja, mikä johtaa hyperglykemian ja hyperinsulinemian vastaanottavassa ja karanneet aerobinen Glykolyysivaiheen, rasva-signalointi ja proliferatiivista aktiivisuutta kasvain.

Citation: Blask DE, DAUCHY RT, DAUCHY EM, Mao L, Hill SM, Greene MW, et al. (2014) valotettiin Night häiritsee Host /Syöpä Circadian Regulatory Dynamics: Vaikutukset Warburg Effect, Lipid Signaling ja tuumorikasvun ehkäisy. PLoS ONE 9 (8): e102776. doi: 10,1371 /journal.pone.0102776

Editor: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 syyskuu 2013; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 06 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Blask et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuki häntä anteliaasti American Association for Laboratory Animal Science (www.aalas.org) Apuraha Laboratory Animal Science (GLAS) Award TTK, National Institutes of Health (www.nih.gov) myöntävät R21CA129875 ja DEB, Tulanen yliopiston School of Medicine (www.tulane.edu) ja Louisiana Cancer Research Consortium (www.louisianacancercenter.org) Startup Grant 631455 on DEB ja National Institutes of Health myöntää R01CA054152 ja SMH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

uutta mielenkiintoa aineenvaihdunnassa syövän kasvu [1] – [3] on äskettäin johtanut intensiivinen uudelleenarviointiin roolin aerobinen Glykolyysivaiheen (esim Warburg vaikutus) in pahanlaatuisten kasvainten etenemistä [4 ]. Vastatakseen heidän bioenergetic tarpeita tukemaan biosynteesiä molekyyli- ja solutason rakennusaineita tarvitaan nopeasti kasvava kasvain biomassaa, syöpäsolut pääosin luottaa Warburg vaikutus sijaan oksidatiivisen fosforylaation [1] – [4]. Itse asiassa, Warburg vaikutus on tunnettu siitä, että vahva solujen glukoosin ottoa ja sen aineenvaihduntaa laktaatin kautta glykolyysin huolimatta runsaasti happea [1] – [4]. Tutkimukset ovat keskittyneet signaalin siirtoon ja transkription verkkoihin, mukaan lukien AKT [5], hypoksia-indusoituva tekijä-1 alfa (HIF-1α) ja c-MYC [6], että ajaa Warburg vaikutus ohjata syöpäsolun bioenergetiikan kohti sukupolven molekyyli välituotteita tukea hellittämätön syöpäsolujen jakautuminen [1] – [3]. Syöpä solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua myös luottaa ottoa solun sisään linolihappoa (LA), olennainen omega-6 rasvahappojen (FA), joka on yleisin FA Länsi ruokavalio [7] – [9]. Monissa kasvaimissa, syöpäsolut take-up LA kautta cAMP-riippuvaisen kuljetuksen mekanismi ja aineenvaihdunta se mitogeeni 13-hydroxyoctadecadienoic happo (13-HODE) entsyymin 15-lipoksigenaasin-1 [9] – [12], aktiivisuus joka on säädelty aktivaatiolla epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-1 (IGF-1) reseptorit [13], [14]. Monissa kasvaimissa, mukaan lukien ihmisen syövän ksenograftien [9], [11], [12], 13-HODE kohdistaa positiivista vaikutusta EGF ja IGF-1-reseptorin kasvua signaalinvälitysreittien parantaa alavirtaan fosforylaation ERK1 /2 ja AKT johtavat monistaa solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen vastauksia [15]. On kuitenkin huomattava, että joissain muissa syöpään mallijärjestelmiin ja kokeellista yhteyksissä 13-HODE voi olla antiproliferatiivinen rooli [16].

homeostaattisina prosessit säätelevät nisäkkäiden fysiologian ja aineenvaihduntaa solujen, kudosten ja elinten näytteille vuorokausirytmiä että synkronoidaan valo /pimeä-sykli kattaa kunkin 24 tunnin päivä. Tämä saavutetaan endogeenisen oscillatory kellonaikatoimintoa aktiivisuus SCN hypotalamuksen, joka vastaanottaa tietoa valo /pimeä sykli katseilta ensisijaisesti kautta luonnostaan ​​valolle, melanopsin-positiivisten gangliosolu ylimääräisiä panosta sauvat ja käpyjä. Photic informaatio käsitellään sitten SCN ja transduktoitiin joukko hormonaalista ja hermoston lähdöt perifeerisiin kohdekudoksissa [17]. Ihmisillä häiriöitä vuorokausirytmin säätelyyn metabolisia prosesseja kuten sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan aiheuttama kautta epänormaali ajoitus valo voi johtaa lisääntynyt riski tyypin 2 diabeteksen, lihavuuden [18], [19] ja erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien rintasyöpä on raportoitu yövuoron työntekijät [20], [21]. Lähtösignaali SCN että luotettavimmin heijastaa vuorokausirytmin aktiivisuus on yöllä käpylisäke melatoniinin tuotantoa joka on tukahdutti LAN. Vuorokausirytmin melatoniini signaali on yhdistetty ajallisen järjestämisestä ja synkronointi monia fysiologisia ja metabolisia toimintoja kuten glukoosi- ja rasva-aineenvaihduntaan [19], [22], [23].

Lähdöt alkaen SCN uskotaan koordinoida biologinen ajoitus, ja jos kyseessä on melatoniini, moduloida prosesseja säätelevät kasvain aloittamista, edistäminen ja eteneminen myös solujen jakautumista, DNA-synteesi, solujen selviytymistä /apoptoosin, solusyklin traverse, DNA vaurioita /korjausmekanismit, tuumorisuppressoriproteiinia toimintaa ja kasvainsolun invaasio /etäpesäke [24] – [27]. Olemme aiemmin osoittaneet, että melatoniini, fysiologisessa yöllisen pitoisuuksia veressä, suoraan estää kasvaimen DNA-synteesiä ja kasvua tukahduttamalla cAMP kasvain oton LA ja sen aineenvaihdunta on mitogeenisesta molekyyliin 13-HODE [10], [12] kautta melatoniinireseptorin -välitteinen mekanismi. Kuitenkin mahdollinen osallistuminen vuorokausirytmin sääntelyn ja seuraukset sen häiriintymisen syövän aineenvaihduntaan, erityisesti Warburg vaikutus, ei ole koskaan käsitelty, koska tutkimukset tällä alalla ovat perustuneet lähes yksinomaan,

in vitro

tutkimukset mikä vaikutus syövän isännän keskeinen vuorokausirytmin asetus on poissa. Me olettaisi, että päivittäinen bioenergetic, metabolinen signalointi, ja proliferatiivinen toimintaa voidaan rakentaa kasvaimen infrastruktuurin näytteille dynaamisia vuorokausirytmiä sekä isännän ja kasvain, joka edistää kasvaimen kasvua ehkäisyyn. Nämä rytmit, jotka ovat riippuvaisia ​​yöllä melatoniinin tuotantoa, vuorokausirytmin kasvaimen kasvun ehkäisy signaali, hajotetaan altistamalla isäntä LAN mikä lisää kasvainten aineenvaihduntaa ja kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Tulanen yliopiston Institutional Animal Care ja Käytä komitea (NIH Assurance # A4499-01). Kaikki eläimet pidettiin laitoksessa akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care, International. Kaikki Leikkaus suoritettiin ketamiini /ksylatsiinia anestesia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

reagenssit

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -laadun kloroformiin, etyylieetteriin, metanoli, väkevä etikkahappoa, heptaani, heksaani, ja Sep-Pak C18 patruunat HPLC uuttamalla näytteitä hankittiin Fisher Chemical (Pittsburgh, PA). Vapaiden rasvahappojen, kolesterolin esteri, triglyseridi, fosfolipidi, rypsiöljyn metyyliesteri standardien, sekä booritrifluoridi-metanoli, kaliumkloridi, natriumkloridi, perkloorihappo ja trikloorietikkahappo hapot ostettiin Sigma Scientific (St. Louis, MO). HPLC standardit, (+/-) 5-HETE ja 13 (S) -HODE), sekä erittäin puhdasta vettä hankittiin Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan).

Eläimet, valaistusolosuhteissa , kasvain istutusta, ja kasvu

vastavieroitettu nainen alaston rottia (Hsd: rh-

Foxn1 [RNU]

) välillä 35 ja 50 g sijoitettiin kirkkaasta polykarbonaatista häkeissä (2 rottaa /häkki) in laboratoriolaitoksessa valoaltistuksen kammioihin 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä (LD, 12:12) sykli (valot päällä 0600-1800 tuntia tai Zeitgeber aika ZT0-ZT12 23 ° C: ssa ja 45-50%: n kosteudessa ja sallittu mukautua näihin olosuhteisiin kahden viikon ajan. rotat tarjotaan vettä ja ruokaa (Purina Prolab RMH 1000) ad libitum koko opiskelun ajan. sen jälkeen sopeutumisjakso, eläimet jaettiin satunnaisesti kontrolliryhmään 36 rotilla pysyi LD, 12:12 valaistus hoito (täydellisessä pimeydessä pimeinä vaihe) ja toinen ryhmä 36 rottien ylläpidetään LD, 12:12 altistuminen himmentää LAN pimeinä vaiheessa. valovoima aikana 12 tunnin valo vaiheessa niin ryhmiä tarjosi yhden kuristin /lampun järjestelmä (GE Watt Miser, F34CW-RS-WM, 34-W polttimo) kussakin kammiossa säädetyn tasaisen kirkas valo ärsykkeen eläinten silmien tasolle 141 | iW /cm

2 ( 345 lux). Kammiossa tarjoavat hämärä LAN, oli toinen kuristin /lampun järjestelmä (GE Starcoat, F32T8-SP-11, 32-W polttimo), joka vapautuu tasaisesti hämärässä ärsykkeen eläinten silmien tasolle 0,08 | iW /cm

2 ( 0,2 lux) aikana 12 tunnin pimeä vaihe [12]. Kuusi viikkoa myöhemmin, eläimet implantoitiin steroidireseptoriperheen negatiivinen (SR) ihmisen MCF-7 rintasyövän ksenograftien kudoksessa-eristetty tavalla, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Nämä kasvaimet ovat kehittyneet useiden kohtien osajoukkoa SR + ksenograftien että oli menettänyt ilmaus estrogeenin ja progesteronin reseptoreihin ja tuli estrogeeni vastaa. Nämä -ksenografteja histopatologisesti luonnehtia huonosti eriytetty, 3. asteen, soluttautuminen adenokarsinooma kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Aikana vuorokausirytmin /kasvaimen kasvua tutkimus, kun kasvaimet olivat saavuttaneet riittävän kokoinen mittausta rottia altistettiin valolle CO

2 narkoosi, ja kasvaimen mitat mitattiin ihon läpi noniusmittaharppia joka toinen päivä; kasvaimen mitat muunnettiin arvioitiin kasvaimen painot käyttäen lineaarista regressiokaavaa ja kasvu laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [9], [12]. Lopullinen kasvaimen paino kasvaimen kasvua tutkimuksessa määritettiin punnitsemalla lopussa kokeen. Lopussa kunkin kasvaimen kasvun aikana, kun kasvaimet saavuttivat noin 5-6 g sekä ohjaus- ja LAN-alttiina ryhmiä, osajoukot 6 eläintä jaettiin satunnaisesti lopetettiin ja niiden vastaavat kasvaimet kerättiin 4 tunnin välein yli yhden 24 tunnin ajankohtaan 6 eri vuorokausirytmin ajankohtina (esim 0800 tuntia = ZT2, 1200 tuntia = ZT6, 1600 tuntia = ZT10, 2000 tuntia = ZT14, 2400 tuntia = ZT18, ja 0400 tuntia = ZT22) aikaisemmin kuvatulla [28]. Johtuen nopeutuu suuresti kasvaimen kasvu lähiverkon ryhmässä, ksenograftit (n = 36) oli tavoitellulla sato koko 5-6 g noin kaksi viikkoa ennen kuin ksenograftien (n = 36) LD 12:12 ohjaus ryhmä.

valtimoveren nouto Kasvain Host Rats

jälkeen kahden viikon valaistuksen hoito edellä kuvatut, eläimille tehtiin sarja kuuden pienet veren imee kautta cardiocentesis kerätä vasemman kammion valtimoiden, kuten aiemmin on kuvattu [9], [10], [12], [28] ajan 30 päivää ennen kasvaimen istutuksen (katso edellä). Lyhyesti, veri kokoelmat suoritettiin nimetty 4 tunnin välein 24 tunnin ajan, joka alkaa klo ZT2 (0800 tuntia) jokaisen eläimen joutua cardiocentesis vain kerran 5 päivän välein aikana 30 päivän aikana ennen kasvaimen istutuksen. Tämä tehtiin, jotta eläimet voivat palauttaa niiden pienen verimäärän menetyksen ja minimoida stressiä ja vähentää mahdollisia vaikutuksia menettelyn ruokinta ja sairastuvuuteen /kuolleisuuteen. Eläimet olivat kevyesti nukutettiin CO

2 hengitettynä (70% CO

2/30% ilmaa); 1 ml: n näytteitä otettiin vasemman kammion sydänpunktiolla (alle 5% koko verimäärä) kautta tuberkuliiniruiskuun (25 mittari, 3/8 in, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) kostutetaan natriumhepariiniin (1000 U /ml; Elkin-Sinn, Cherry Hill, NJ), kuten aiemmin on kuvattu. Verinäytteenotto pimeinä-vaihe (eli 2000, 2400, 0400 tuntia) suoritettiin alla suojavalossa punainen valo (Kodak 1A, malli B, luettelo # 152 1517, 120 V, 15 W, Rochester, NY), jotta säilyttämiseksi yöllinen melatoniinia aalto [9], [10], [12], [28]. Eläinten punainen valo altistuminen silmien tasolla aikana lyhyen 45 sekunnin cardiocentesis menettely ei ollut suurempi kuin 0,48 ± 0,01 luksia (1,16 ± 0,04 | iW /cm

2). Ei ollut komplikaatioita johtuen anestesian tai cardiocentesis aikana verinäytteitä aikana; eloonjääminen oli 100% ja eläimet olivat välittömästi aktiivinen menettelyä noudattaen. Plasman näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa kunnes analysoitiin melatoniinia, insuliinin, glukoosin, laktaatin ja rasvahappojen kokonaismäärästä.

kokoelma valtimoveren peräisin Kasvaimen perfuusio Donor Rats

Ennen aloittamista kasvain -perfuusioiden, 3-4 aikuinen alaston naarasrotilla ylläpidetään LD 12:12 nukutettiin käyttämällä ketamiini-ksylatsiini liuosta (89,1 mg /kg ja 9,9 mg /kg, IP). Eläimet olivat heparinisoituihin kautta kaulavaltimoa injektion natriumhepariinia (25 mg /kg, Sargent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL). Neljäkymmentä 50 ml valtimoveren kerättiin vuosina 0600 ja 0900 tuntia (matala melatoniinin) oikealta kaulavaltimoon luovuttajan rottien kautta katetri kasvaimen perfuusio kokeissa (3-4 -perfuusioiden per ryhmä), yhdistettiin, suodatettiin 2 ”x 2 ”cheesecloth pad (Kendall Curity Sideharso sieni, Tyco Healthcare, Mansfield, MA), varastoidaan säiliössä mineraaliöljyn alla (Cat. # M1180-500 ML; Sigma Scientific, St. Louis, MO) ja jäähdytettiin 4 ° C: ssa säiliö jäällä ja sekoitettiin kevyesti mekaanisella sekoittimella (malli # 6975-171, Corning, NY) [9], [10], [12], [28].

Tissue-Isolated Kasvain Perfuusiotaso

In situ

Kun (SR) MCF-7 ihmisen rintasyövän ksenograftien saavutetaan 5-6 gm arvioitu kasvaimen paino, eläimet valmistellaan valtimo–laskimoiden ero mittaukset rasvahappojen kokonaismäärästä (TFAs), LA, 13-HODE, glukoosi, laktaatti, po

2, CO

2 ja pH välillä 0600 ja 1000 tuntia, kun endogeenisen melatoniinin tasot olivat alhaiset. Tissue-eristetty ksenograftit perfusoitiin

in situ

rotan luovuttajan kokoverestä, johon joko synteettisiä melatoniinia (Sigma, St. Louis, MO) ja /tai 13 (S) -HODE (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), tai MT

1 /MT

2 melatoniinin reseptoriantagonisti S20928 (antelias lahja Institute de Recherches Internationales Servier, Courbevoie Cedex, Ranska) lisättiin aikaisemmin kuvatulla [9], [10], [12 ], [28]. Sarjaa (3 tai 4 kasvaimet /perfuusio) kudos–eristetty ihmisen rintasyöpä ksenografteja perfusoitiin

in situ

1 h aiemmin kuvatulla [9], [10], [12], [28] kanssa koko -blood luovuttajaeläimiltä rotilla. Sisällyttäminen [

3 H] tymidiinin osaksi kasvain DNA aloitettiin 20 minuuttia ennen loppua kunkin perfuusion ruiskuttamalla 20 ui fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 2 pCi [metyyli

3H] tymidiiniä /g (New England Nuclear, Perkin Elmer, Boston, MA) arvioidaan kasvaimen paino osaksi valtimokatetrista. Vuoden loppuun kunkin perfuusion, kasvaimet olivat jäädytys-kiristetään nestemäisessä typessä, punnitaan ja varastoidaan -85 ° C: ssa analyysiin asti.

Arterial glukoosi, laktaatti ja Acid /Gas Mittaukset

aikana tämän tutkimuksen aikana valtimoiden kokoverta otettiin näytteitä pH-mittaukset, po

2, pCO

2, glukoosi ja laktaattitasot, ja hematokriitin käyttäen iSTAT1 Analyzer ja CG4 + ja CG8 + patruunat (Abbott Laboratories, East Windsor, NJ). Arvot glukoosin ja laktaatin ilmoitetaan mg /dl ja mmol /l, ja PO

2 ja pCO

2 kuten mmHg. Minimi tunnistustasoa pH, po

2 ja pCO

2, glukoosi ja laktaatti-arvot olivat vastaavasti 0,01, 0,1 mm Hg, 0,1 mm Hg, 0,2 mg /dl ja 0,01 mmol /l.

Melatoniini ja insuliinin analyysit

Arterial plasman melatoniinin mitattiin kautta radioimmuunimäärityksellä käyttäen melatoniinia rotta

125l – radioimmunoanalyysipakkaus (Labor Diagnostika Nord, Nordham, Saksa) ja analysoitiin käyttäen Packard Cobra 5005 Automated Gamma Counter (Palo Alto, CA), kuten aiemmin on kuvattu [10], [12]. Valtimoiden plasman insuliinitasot mitattiin käyttämällä ELISA Kit (Diagnostic Systems Labs., Webster, TX).

Rasvahappojen louhinta ja analysointi

Arterial plasman vapaiden rasvahappojen (FFA), triglyseridit (TGA ), fosfolipidejä (PL), ja kolesterolin esterit (CE) uutettiin 0,1 ml: n näytteitä, kuten aiemmin on kuvattu [9] – [10], [12], [28]. Ennen uuttamista margariinihappo (100 ug), joka oli liuotettu kloroformiin (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), käytettiin sisäisenä standardina. Metyyli rasvahappojen (FA) analysoitiin käyttäen Hewlett Packard (Palo Alto, CA) malli 5890A kaasukromatografilla, jossa on liekki-ionisaatiodetektori (malli # 7673 A) autoinjektoria (malli # 7673 S), ja integraattori (malli # 3396A). Kaikki erotukset suoritettiin käyttäen 0,25 mm x 30 m kapillaarikolonnia (malli # 2380; Supelco, Inc., Bellefonte, PA) 190 ° C: ssa, jossa heliumia kantokaasun (lineaarinen nopeus 20 cm /s; split 100:1). Injektio portti ja detektori säädettiin 220 ° C: ssa. Kaikki metyyliestereitä tunnistettiin sen perusteella, niiden retentioajan, verrattiin tunnettujen standardien. Pienin havaittavissa raja määrityksessä oli 0,05 mikrog /ml.

Kasvain lysaattia louhinta, proteiini uuttamalla ja Western blot-analyysi

Jäädytetyt kasvaimet jauhettiin ja käsin homogenisoitiin 50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,1% natriumdeoksikolaatti, 1 mM Na3VO4, 100 nM okadahapon, ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta Set I (Calbiochem /EMD Biosciences, Billerica, MA). Kasvaimen lysaatit sentrifugoitiin 15300 x g 20 minuuttia. Supernatantit jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatiot supernatantit määritettiin käyttäen proteiinin määrityskittiä (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Kokonaisproteiinista (80 ug per näyte) erotettiin elektroforeettisesti 10%: isella SDS-polyakryyliamidigeelillä ja elektroblotattiin päälle Hybond kalvo. Inkubaation jälkeen 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween, immunoblot seulottiin vasta-aineilla fosfo-AKT (Ser

473), c-MYC (Cell Signaling Tech., Inc., Danvers , MA) tai HIF-1α (BD Biosciences, San Jose, CA). Sama blotit stripattiin ja uudelleen vasta-aineilla ja AKT (Cell Signaling Technology, Inc.), tubuliinia tai GAPDH (glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi) (Millipore Corp., Billerica, MA).

Statistical analyysi

läsnäolo merkittävä kasvaimen rytmit yli 24 tunnin aikana ja missä määrin niiden kestävyyden joko vuorokausirytmin-ohjattaviin tai -disrupted LAN-altistuvat ryhmät määritettiin cosinor analyysillä käyttäen periodogrammi (VBScript) ohjelmisto . Raaka yksittäiset kasvain kerättyjä yli yksi 24 tunnin aikana analysoitiin tällä menetelmällä, jossa on kiinteä 24 tunnin aikana. Tilastolliset erot keskiarvojen LAN-altistuvan ryhmän kontrolliryhmään verrattuna kussakin vuorokausirytmin aikapisteessä arvioitiin käyttäen paritonta Studentin t-testiä. Tilastollinen eroja ryhmä tarkoittaa kasvaimen perfuusio tutkimuksissa määritettiin yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutesti tehdä seuraavat monivertailuja kaikissa ryhmissä: ohjaus vs. melatoniini; ohjaus vs. melatoniini + 13-HODE; ohjaus vs. 13-HODE; melatoniini verrattuna melatoniini + 13-HODE; melatoniini + 13-HODE versus 13-HODE; ja melatoniini vs. 13-HODE. Erot rinteillä regressiolinjoja (ts kasvaimen kasvuvauhti) ryhmissä määritettiin regressioanalyysisarjoissa ja testit Yhdensuuntaisuus (Studentin t-testi). Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä p 0,05. Studentin t-testiä, yksisuuntaista ANOVA seurasi Bonferronin post hoc testi, ja lineaarinen regressio analyysit suoritettiin kaikki käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa.

Tulokset

Circadian sääntelyä ja häiriöitä isännän verenkierrossa tekijöiden

ensin tutkittiin mahdollisia vuorokausirytmin dynamiikkaa ja niiden haittavaikutusten LAN useissa isännän tekijät, kuten plasman melatoniini yhteensä FAS (TFAs), LA, glukoosi, laktaatti ja insuliini rotilla, joilla kudos-eristetty, steroidi reseptorinegatiivinen (SR) MCF-7 ihmisen rintasyöpään ksenograftien koskevasta valo /pimeä (LD) 12:12 kierto [12]. Plasman melatoniinin oli alhainen koko valon vaihe ja merkittävästi kasvoi huipputaajuutta keskellä tumma vaiheen (Fig. 1A). Eläinten altistuminen himmentää LAN indusoi 88% tukahduttaminen on yöllisen melatoniinin amplitudi vaikuttamatta sen vuorokausirytmin vaihe (Fig. 1A). Plasma TFA (Fig. 1 B) ja LA (Fig. 1 C) rytmit LD tarkastuksia, jotka ovat riippuvaisia ​​vuorokausirytmin SCN-driven yöllistä ravinnonottoaktiivisuus, säilyivät LAN-altistuneet rotat osoittaa, että vuorokausirytmin häiriöitä rajoittui tukahduttaminen yöllisen melatoniinin signaali. Vuorokausirytmin valvonta sekä veren glukoosi- ja insuliinitasot riippumattomia vaikutuksia ravinnonoton on raportoitu rotilla [29]. Plasman glukoositasot lisääntyi jälkeen valot huippunsa puolivälissä valo vaihe seuraa lasku kunnes valot (Fig. 1 D). Sen jälkeen valot, glukoosi pitoisuuksia ensin nousi sitten laskivat pahimmillaan puoliväliin pimeä vaihe seuraa toinen nousu loppuvuoden pimeän aikana. Plasma laktaattipitoisuuksien eläimillä ylläpidetään LD 12:12 olivat yleensä alhaisia ​​koko valoisan vaiheen jälkeen myyntimäärä kasvoi pimeinä aikana saavuttaa huippunsa kaksi tuntia ennen valot (Fig. 1 E). Hämärässä LAN olosuhteissa, rotat tuli hyperglycemic kanssa arytmisillä verensokeritaso Jäljellä huomattavasti koholla 50% yli verrokkitasojen (Fig. 1 D), kun taas arrhythmic veren laktaattipitoisuus oli jatkuvasti alhaisempi kuin valvontaan koko 24 tunnin jakson aikana (Fig. 1 E). Kiertävä insuliinitaso näytteillä päivittäin värähtely alle LD 12:12 (Fig. 1 F), joka yleensä peilattu rakenteessa kiertävien IGF-1 pitoisuuksien aiemmin raportoitu [28]. LAN-altistuneet rotat tuli selvästi hyperinsulinemic kanssa insuliinitaso säilyttää huojuntaefektin kuvio samankaltainen kuin LD 12:12 säätimet (Fig. 1 F); verenkierrossa IGF-1 tasot olivat myös vuorokausirytmin-häiriintynyt ja kohonnut LAN- olosuhteissa [28].

(A-F) Plasman melatoniinin (A), TFAs (B), LA (C), glukoosi ( D), laktaatti (E) ja insuliinia (F) mitattiin alaston nainen isäntä rotilla, joilla kudos-eristetty SR MCF-7 ihmisen rintasyövän ksenografteja alle LD, 12:12 (kiinteä mustat ympyrät) tai LD, 12:12 + LAN (0,2 lux) (kiinteät punaiset ympyrät). Valtimoiden verinäytteet otettiin sydänpunktuurilla kuudessa eri vuorokausirytmin ajankohtina aikana yhden 24 tunnin jakson aikana. Samaa 24 tunnin malli jokaiselle plasma analyytin näkyy kahdesti havainnollistamaan rytmiä jatkuvuus. Zeitgeber aika (ZT) edustaa tunnin kuluttua valot (ZT0 tai 0600 tuntia); valot pois ZT12 (1800 tuntia). Mustat palkit alareunassa luvut osoittavat pimeän vaiheen ja punaiset palkit ilmaisevat LAN. Kiinteä musta tai punainen ympyrät ovat keskiarvo ± SD; n = 6 kussakin aikapisteessä. Merkittävä rytmikuvioita alle LD, 12:12 olosuhteet A – F, p 0,001; huomattava mutta häiritsi rytmikuvioita hämärässä LAN olosuhteissa A – C ja F vain, p 0,001 (yksisuuntainen ANOVA). * P 0,01; ** P 0,05 LAN vs LD, 12:12 (Opiskelijan

t

testi).

Circadian sääntelyä ja häiriöitä kasvaimen glukoosin ja linolihappoa aineenvaihduntaan

seuraavaksi testasimme ovatko tuumoriksenografteja itse näytteillä vuorokausirytmiä kasvaimen cAMP tasoja, LA otto, 13-HODE muodostumista ja Warburg vaikutus, joka voisi häiriintyä LAN aiheuttama melatoniinia tukahduttaminen. Esillä olevassa tutkimuksessa Warburg vaikutus tunnistetaan kasvaimen oton valtimoveren glukoosin yhdistettynä julkaisun laktaatin kasvaimeen laskimoverta [1] – [4]. Alle LD, 12:12 olosuhteissa, kasvaimen cAMP-tasot (Fig. 2A), TFA oton (Fig. 2B), LA (Fig. 2C) otto, ja 13-HODE muodostumista (Fig. 2D), lisääntynyt valoisan vaiheen aikana ja saavuttavat huippunsa kaksi tuntia ennen valot seurasi lasku pimeinä vaiheessa päästä aallonpohja kaksi tuntia ennen valot päällä. Kasvaimen glukoosin oton (Fig. 2E) ja laktaatin (Fig. 2F) noudattivat samaa päivittäin rytminen kuvio lisäämällä valoisan vaiheen aikana saavuttaa huippunsa kaksi tuntia ennen valot. Pimeinä aikana oli asteittain vähentynyt näiden muuttujien kanssa glukoosin sisäänoton päästä aallonpohja lopussa pimeän vaiheen ja laktaatintuotto vähentyi kaukaloon puoliväliin pimeä ajanjakso seuraa nousu vasta kaksi tuntia ennen valot. Alle LAN olosuhteissa, ei kuitenkaan ainoastaan ​​nämä olivat rytmiä täysin poissa, mutta tasot näiden muuttujien pysyivät merkittävästi kohonnut yli 24 tuntia.

(A-H) Kasvain tasoja cAMP (A) , TFA otto (B), LA oton (C), 13-HODE muodostuminen (D), glukoosin otto (E), laktaatti muodostuminen (F), [

3H] tymidiinin yhdistyminen DNA: han (G), ja DNA-pitoisuus mitattiin alle LD, 12:12 tai LD, 12:12 + LAN; katso legenda Kuva 1 edelleen koeolosuhteissa. (I) Kasvaimen kasvu molemmissa ryhmissä mitattiin aikana kokeen. Kiinteä musta tai punainen ympyrät ovat keskiarvoja ± SD arvioitiin kasvaimen paino; n = 6 arvioitu kasvaimen painoa. Cosinor analyysi paljasti vankan ja erittäin merkittävä rytmikuvioita alle LD, 12:12 olosuhteet kasvaimen analyyttejä; ei merkittävää päivittäistä rytmikuvioita havaittiin hämärässä LAN (katso yhteenveto taulukko 3). * P 0,01; ** P 0,05 LEN vs LD, 12:12 (Opiskelijan

t

testi). Kasvaimen kasvu käyrät I, p 0,01 kaltevuus kasvaimen kasvua LAN vs LD, 12:12 ryhmä (lineaarinen regressio).

Circadian sääntelyä ja häiriöitä kasvaimen ilmaisun signaloinnin ja transkriptiotekijöitä

Meillä on myös osoitettu, onko AKT, c-MYC ja /tai HIF-1α, avain transkription sääntelevät Warburg vaikutus, näytteille vuorokausirytmin rytmiä, joka on häirinnyt hämärä LAN. Koska keskeinen stimuloiva signaali kasvainsolujen eloonjäämisen /lisääntymiseen, ja glukoosin ja LA aineenvaihduntaa, AKT aktivointi [esimerkiksi fosforylaatio seriinillä 473 (s473)] oli korkein valoisan vaiheen aikana ja laski sen jälkeen pahimmillaan aikana puolivälissä pimeässä vaiheessa. HIF-1α ekspressiotasot olivat alhaiset valoisan vaiheen aikana seurata nousu huippuun ilmaisun pimeinä vaiheessa (Fig. 3 E F). Kuitenkin hämärässä LAN altistuminen, rytminen ilmaus molempien fosfo-AKT (Pakt

s473) ja HIF-1α oli keskeytyneet kokonaan (Fig. 3 A B ja E F). Kasvain c-MYC ilmentyminen oli suuresti koholla aikana koko valoisan vaiheen seuraa merkittävä lasku on aallonpohja toisella puoliskolla tumma vaiheen (Fig. 3C F).

(A-F ) Kasvain tasot fosfo-AKT

Ser473 (A B), cMyc (C F) mitattiin alla LD, 12:12 tai LD, 12:12 + LAN; katso legenda Kuva 1 edelleen koeolosuhteissa. Kiinteä musta tai punainen ympyrät edustavat keskiarvoa ± SD suhteellinen ilmentyminen (johdettu densitometristä kvantitointiin immunoblot) joko Pakt

Ser473, c-MYC ja HIF-1α kussakin vuorokausirytmin ajankohtana; n = 3 edustavia kasvainnäytteet kunakin ajankohtana. Suhteellinen ilmentyminen Pakt

Ser473 edustaa suhdetta Pakt

Ser473 proteiinin yhteensä (t) AKT-proteiinia; suhteellinen ekspressio c-MYC ja HIF-1α edustaa suhdetta näiden proteiinien tubuliiniin ja GAPDH, vastaavasti. Cosinor analyysi paljasti vankan ja erittäin merkittävä rytmikuvioita alle LD, 12:12 olosuhteet kasvaimen analyyttejä; lukuun ottamatta c-myc, mitään merkittävää päivittäistä rytmikuvioita havaittiin hämärässä LAN (katso yhteenveto taulukko 4). Tilastollinen vertailut eivät voineet tehdä välillä vastaavien ajankohtina välillä LD, 12:12 ja LAN ryhmiä koska immunobloteilla tehtiin kaksi ryhmää erillisissä ajoja. Vain yksi 24-tunnin sykli Immunoblottien ajettiin ja näytetään, kun taas densitometristä edustus samojen Immunoblottien näytettiin kahdesti havainnollistamaan rytmiä jatkuvuus kuten kuvatekstissä kuvion. 1.

Circadian sääntelyä ja häiriöitä kasvaimen lisääntymisaktiivisuus

Kun otetaan huomioon edellä esitetyt päätelmät, me postulated esiintyminen vastaavien vuorokausirytmin muutoksista kasvaimen lisääntymisaktiivisuus ja DNA-pitoisuus. Huomasimme, että kasvain [

3 H] tymidiinin DNA: han (kuvio. 2G) sekä DNA-pitoisuus (Fig. 2 H) lisääntyi valoisan vaiheen aikana pian valot saavuttaa huippunsa kaksi tuntia ennen valot. Pimeinä vaiheessa kuitenkin sekä [

3 H] tymidiinin ja DNA-pitoisuus laskivat pahimmillaan kaksi tuntia ennen valot (kuviot. 2 G H). Vuorokausirytmin heilahtelut [

3 H] tymidiinin ja DNA-pitoisuus mukaan kasvaimen solujen määrä lisääntyi valoisan vaiheen aikana johtuen lisääntyneestä lisääntymisaktiivisuus samalla pimeinä vaiheen solujen määrä väheni viittaa siihen, että apoptoottinen solu menetys oli tapahtumassa rinnakkain vähentynyt cell leviämisen. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten transplantable hiiren rintasyövän osoittaa, että brutto kasvainten koot ja kasvu todella heilahtelevat vuorokausirytmin tavalla koko päivälle kauden netto kasvaimen kasvua [30]. Vastauksena LAN, päivittäinen värähtelyn lisääntymisaktiivisuus ja DNA-pitoisuus oli mitätöity koska nämä tekijät pysyivät jatkuvasti koholla koko 24 tunnin jakson aikana (Fig. 2 G H). Alle vuorokausirytmin säädelty olosuhteet, kasvaimen kasvua kasvoi tasaisesti yli kahden viikon aikana taas alle vuorokausirytmin-häirinnyt olosuhteet kasvuvauhti nousi kaksinkertaiseksi yli säätimet (Fig. 2 I).

Mahdolliset melatoniinia sääntelyä