Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mitokondrioiden-ydin cross keskusteluja ja mitokondrioiden taaksepäin sääntely voi olla merkittävä rooli solujen ominaisuuksia. Transmitochondrial cybrid järjestelmät (cybrids) ovat erinomainen väline tutkia konkreettisia vaikutuksia muuttuneen mitokondrioiden alle määritellyn ydin- tausta. Suurin osa tutkimuksista käyttäen cybrid mallia keskittyi merkitystä erityisten mitokondriaalisen DNA vaihteluita mitokondrioiden toimintaan tai kasvain ominaisuuksia. Kuitenkin useimmat näistä variantit ovat hyvänlaatuisia polymorfismia ilman tunnettua toiminnallista merkitystä. Objektiivisesti korjata mitokondrioiden vikoja syöpäsoluissa ja perustaa mitokondriot mahdollisena syöpälääkettä tavoite, ymmärtäminen roolia toiminnallisten mitokondrioiden kääntämään kasvaimia synnyttävän kiinteistöihin syöpä ydinvoima tausta on hyvin tärkeää. Tässä olemme analysoineet potentiaali käänteinen onkogeenisten ominaisuuksien erittäin metastaattinen solulinjan käyttöön ei-syöpä mitokondrioita. Cybrids perustettiin fuusioimalla mitokondrioiden DNA köyhdytetyn 143B TK ρ0 solujen aggressiivista luusarkoomasolulinjassa kanssa mitokondrioita hyvänlaatuisia rintojen epiteelisolulinja MCF10A, kohtalaisen metastasoitunut rintasyöpä MDA-MB-468 ja 143B-soluissa. Huolimatta yhtenäisen syöpä ydinvoiman tausta, kuten havaittiin mitokondrioissa luovuttajan solut, cybrids hyvänlaatuinen mitokondrioita osoittivat korkeaa mitokondrioiden toiminnalliset ominaisuudet kuten lisääntynyt ATP synteesi, hapenkulutus ja hengitysteiden ketjun toimintaa verrattuna cybrids syöpätiloihin mitokondrioita. Mielenkiintoista, hyvänlaatuinen mitokondriot voitaisiin kääntää eri onkogeenisia ominaisuuksia 143B TK

– solujen myös solujen jakautumista, elinkelpoisuuden hypoksisissa edellytyksellä, antiapoptoottisia ominaisuuksia, vastustuskykyä syöpälääkkeen, invaasio, ja pesäkkeiden muodostumista pehmeässä agarissa, ja

in vivo

kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Mikrosiruanalyysi ehdotti, että useat onkogeeninen reittejä havaittu cybrids syövän mitokondrioiden estyy cybrids kanssa ei-syöpä mitokondrioita. Nämä tulokset viittaavat siihen, kriittinen kasvaimia synnyttävän sääntelyä mitokondrioiden-ydin- rajat puhua ja kohokohtia korjaamiseen mitokondrioiden toiminnalliset ominaisuudet lupaava kohde syövän hoidossa.

Citation: Kaipparettu BA, Ma Y, Park JH, Lee TL, Zhang Y, Yotnda P, et ai. (2013) Crosstalk peräisin ei-syöpä Mitochondria Can estää kasvaimen ominaisuudet metastasoituneen solujen tukahduttamalla onkogeeninen Pathways. PLoS ONE 8 (5): e61747. doi: 10,1371 /journal.pone.0061747

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 lokakuu 2012; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2013; Julkaistu: 09 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Kaipparettu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu DOD (W81XWH-11-1-0292), National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (U54-CA149196 Pilottihanke) ja DLD Cancer Center kokeiluhankkeestaan ​​B. Kaipparettu ja NIH /NCI ( R01 CA-100023) myöntää L. Wong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut sopeutua hypoksisissa olosuhteissa vaiheiden aikana kasvainsolujen kasvua siirtämällä taakkaa energia-aineenvaihdunnan oksidatiivisen fosforylaation glykolyysin, kutsutaan Warburg vaikutus [1]. Asetus ydin- geeniekspressiota mitokondriaalisen genomin välityksellä ”mitokondriot taaksepäin signalointi”, mahdollistaa soluelimiin koordinoimaan funktion tumaan. Kasvainsolut jatkavat käyttää Glykolyysivaiheen kuin energialähteenä vaikka kulttuuri alle happiolosuhteissa [2], mikä viittaa siihen, että mahdolliset vakaa geneettisiä tai epigeneettiset muutokset ovat tapahtuneet syöpäsoluissa. Lisäksi syövän mitokondriot ilman havaittavia geneettisiä muutoksia voi lähettää onkogeenisiä signaaleja tumaan ja aloittaa mitokondrioiden taaksepäin sääntely johtaa kaksisuuntaisen tiedonsiirron välillä genomien [3].

Tutkiakseen erityistä mitokondrioiden panos kasvain ominaisuudet, vaikutus ydin- geenien on suljettava pois. Transmitochondrial cybrid järjestelmä on erinomainen lähestymistapa tämän tavoitteen saavuttamiseksi [4] – [9]. Useat tutkimukset käyttivät tätä jännittävä teknologia enimmäkseen näyttää toiminnalliset ja patogeeninen merkitys erityisten mitokondriaalisen DNA (mtDNA) mutaatioita tai variantteja [5], [10]. Mtdna tiedetään muuttua usein erilaisia ​​syöpiä, mutta useimmat näistä mitokondrion muutokset, lukuun ottamatta muutamia, ovat ilman tunnettua toiminnallista merkitystä, ja se voi yksinkertaisesti heijastaa genomin epästabiilisuuden kasvainsolujen. Jopa ilman läsnäoloa tunnettujen vahingollisia mtDNA mutaatioita, tutkimukset ovat osoittaneet, että metastaattinen mitokondrioissa voivat parantaa kasvain omaisuutta syöpäsolun ja tehdä niistä metastasoituneen [9], [11]. Kuitenkin terapeuttinen näkökulmasta, jotta kohdistaa sairaita mitokondrioita, on tärkeää tietää, onko ei-syöpä funktionaalisia mitokondriot voivat kääntää onkogeenisiä omaisuutta metastaattisen soluja. Jos näin on, kohdistaminen sairaiden mitokondrioissa tai korjata toiminnallisia vika normaalin mitokondrioiden voivat tarjota kriittinen druggable alueen syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa olemme pyytäneet mielenkiintoinen kysymys, onko ei-syöpä mitokondriot voivat kääntää onkogeenisiä ominaisuuksia aggressiivista syöpäsolun. Alle määritelty syöpä ydin- tausta, vertasimme mitokondrioita ei-syöpä, kohtalaisen metastaattisen rintasyövän solujen erittäin metastaattinen ydin- tausta mitokondrioita erittäin aggressiivinen syöpäsolun kontrollina. Jopa saman ydinvoiman tausta, mitokondrioita kuin syöpäsolujen voi estää useita kasvaimia synnyttävän reittejä, kääntää onkogeenisel- ominaisuuksia ja parantaa terapeuttisen vasteen syöpäsoluja. Tämä korostaa merkitys mitokondrioiden kriittisenä säätelijänä solujen syövän omaisuutta ja potentiaalinen kohde syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuma eläinkokeet

Kaikki eläin menettelyjä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Baylor College of Medicine ja mukaisesti suoritettujen NIH suuntaviivat eettisistä eläinten hoitoon.

Cybrids

Immortalized ei-syöpä rintaepiteelisolulinja MCF10A soluja , rintasyöpä MDA-MB-468-soluja ja metastasoituneen osteosarkooma johdettu 143B TK

– soluja (143B) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Yksityiskohtainen protokolla sukupolven

ρ

0

soluja ja cybrids on äskettäin julkaissut [3], [6], [8]. Lyhyesti, mtDNA köyhdytettyä 143B ρ

0-soluja käytettiin ydin- luovuttaja. Tuottaa cybrids, mitokondrio luovuttajan soluja (MCF10A, MDA-MB-468 ja 143B TK) on enukleoidaan yön yli aktinomysiini-D-käsittely ja fuusioitiin 143B ρ

0-soluihin käyttäen 45% polyetyleeniglykolia (MW 1450; Sigma cat P-5402), 60 sekunnin ajan. Yhden päivän kuluttua fuusio, soluja viljeltiin selektioelatusaineessa bromideoksiuridiinia (BrdU), mutta ilman uridiinia [3], [12]. Kiinnittämätön ohjaus 143B ρ

0-solut eivät voi selvitä ilman uridiinia ja mitokondrioita luovuttajan solut tapettiin BrdU. Cybrids sisältävä mitokondriot johdettu MCF10A, MDA-MB-468 ja 143B solujen 143B ρ

0 solujen ydin- tausta on nimetty 10A /143B, 468 /143B ja 143B /143B cybrids, vastaavasti.

kvantifiointi ja sekvenssianalyysi mtDNA ja validointi Nuclear DNA

Yhteensä genomista DNA uutettiin fenoli /kloroformilla menetelmän ja 16,6 kb mitokondrion genomin monistettiin 24 paria päällekkäisiä alukkeita julkaistu ennen [13] – [ ,,,0],15]. qPCR käytettiin määrällisesti mtDNA kopioluvun tarkastamista

ρ

0

kunnossa ja määrällisesti mtDNA sisällön cybrids julkaistujen menetelmien mukaisesti [16], [17]. Vain cybrid klooneja, jotka sisältävät vastaavia mtdna kopioida useita käytettiin kokeissa. Koko genomin mtDNA ja viite tuman DNA-sekvenssianalyysi tehtiin käyttämällä BigDye Terminator (versio 3.1) syklisekvensointireagenssipakkausta reagenssipakkauksen ABI 3730XL DNA Analyzer (Foster City, CA). Tulokset DNA-sekvenssit verrattiin julkaistiin Cambridge viitaten sekvenssin https://www.mitomap.org. Nuclear lähde cybrids vahvistettiin genotyypin.

reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto

Soluja ympätään ja kasvatetaan glukoosia tai galaktoosia alustassa 24 tuntia 24-kuoppalevyillä (2 x 10

4 kuoppaa kohti). ROS tuotanto mitattiin 30 minuutin kuluttua lastausta 5 mikromol /l 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) [18]. Kun oli pesty PBS-puskurilla, solut trypsinoitiin ja suspendoitiin PBS-puskurissa. Fluoresenssimääritykset virityksellä ja emissioaallonpituuksia 485 ja 535 nm, vastaavasti, tehtiin Tecan äärettömän M200® mikrolevynlukijaa (Mannedorf, Sveitsi).

ATP synteesi

ATP synteesi oli mitataan lusiferiini /lusiferaasi-määritys [3]. Soluja inkuboitiin 5 mmol /l malaatti plus 5 mmol /l glutamaattia (kompleksi I-odotuksiin substraatteja), tai 10 mmol /l sukkinaattia (kompleksi II perustuva substraatti) plus 2 ug /ml rotenone (kompleksi I: n estäjä), ja 0,2 mmol /l ADP 3 minuuttia, kun läsnä tai poissa ollessa 10 ug /ml oligomysiini. Määrä oligomysiini herkkä ATP synteesi analysoitiin käyttäen Tecan äärettömän M200® ja ilmaistaan ​​nmol ATP tuotettu /min /mg proteiinia.

Western blot -analyysi

Proteiinit erotettiin SDS-PAGE 12% geeliä. Spesifisten vasta-aineiden, joita käytetään Western Blot-analyysi ja kemiluminesenssi tunnistettiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasilla merkitty sekundaarista vasta-ainetta (Bio-Rad, CA). Mitokondrioiden proteiinit: ATP nopaliinisyntaasin alayksikköä alfa (F1α), Core 2, FeS alayksikkö (lp), COXII, ND6, ja Porin (kaikki Mitoscience, OR). Apoptoottiset proteiinit: pilkottiin kaspaasi 3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) (Cell Signaling, MA). β-aktiini ja Porin käytettiin lastaus säätimet ydin- ja mitokondrioiden koodatut proteiinit vastaavasti [3].

proliferaatiomääritystä

Solulisääntyminen mitattiin normoksia (21% O

2 ) tai hypoksia ehdon (1% O

2) käyttämällä kolorimetristä määritystä, joka perustuu mittaukseen BrdU (4 tuntia) DNA-synteesin aikana, mukaan valmistajan protokollan (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa).

TUNEL-määritys

Apoptoosi analysoitiin TUNEL-määritys käyttäen DeadEnd ™ Fluorometric TUNEL-järjestelmä (Promega, WI, USA) valmistajan ohjeiden [19], [20].

Anticancer Drug hoito ja MTT-määritys

Yli yön viljelemällä 5 x 10

3 cybrids on 96-kuoppaiset levy, cybrids sai vehikkeliä, doksorubisiinia (0,1 uM) nojalla normoxic (21% O

2) ja hypoksinen (1% O

2) ehdot toiset 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus analysoitiin MTT: llä käyttäen Tecan Infinite M200 mukaan julkaistun protokollan [21], [22].

Colony Formation Soft Agar

Six-kuoppalevyn 0,5% agar DMEM väliaine pohjakerros käytettiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys. Kunkin hyvin, 5 x 10

3 cybrids suspendoitiin DMEM 0,35% agaroosia maljattiin kuin pintakerroksen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3-4 viikkoa. Pesäkkeet värjättiin 0,005% Kristalliviolettiliuos ja laskettiin. Pesäkkeiden lukumäärä kunkin cybrid piirrettiin keskiarvo ± SD.

Matrigel ™ Invasion Assay

invasiivisen kasvun kyky cybrids kvantitoitiin käyttäen BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion jaosto (6- hyvin) (Becton Dickinson Biosciences, MA, USA) valmistajan protokollan [23]. Jälkeen trypsiinikäsittelyllä, 5 x 10

4 solua 0,5 ml: ssa alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan kolmena kappaleena. 24 tunnin kuluttua solut tunkeutuneet alempaan kammioon kiinnitettiin ja värjättiin 100% metanolia ja 1% toluidiinisinisellä. Määrä hyökkäsi solujen laskettiin mikroskoopilla ja prosenttiosuudet Matrigel matriisin-tunkeutuvat solut lasketaan verrattuna päällystämättömän kontrollimembraanin.

Microarray Gene Expression analyysi ja validointi qPCR

geeniekspressio profiilia 10A /143B ja 468 /143B cybrids verrattiin käyttämällä Affymetrix ihmisen U133 Plus 2.0 taulukot kolmena kappaleena mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, RNA: ta 10A /143B ja 468 /143B cybrids uutettiin kolmena kappaleena ja 5 ug kokonais-RNA: ta käytettiin ensimmäisen ja toisen juosteen cDNA-synteesi. Microarray hybridisaatio suoritettiin Affymetrix U133 Plus 2.0 microarray pelimerkkejä Affymetrix F450 fluidistori- asema käyttämällä EukGE-WS2v5_450 protokolla ja skannataan kanssa Affymetrix GeneChip- 7 G skanneri (Affymetrix, Santa Clara, CA). Aineisto analysoitiin tilastollista ydin laitokseen Dan L. Duncan Cancer Center Baylor College of Medicine. Geenit määriteltiin muuttunut merkittävästi kahden cybrids t-testi P 0,01, taita muutos 2 tai 0,5; globaali erot ylitti mahdollisuus odotettavissa. Geeniekspressiota datasarja edelleen alistettiin polkuun allekirjoituksen analysointi löytää otaksuttu ero reitin aktivointi tapahtumia. Pathway liittyvä geeni allekirjoitukset määriteltiin, käyttäen julkisia tietoja: p53 allekirjoitus koostui kanoninen sidottu ja säädelty p53-geenin tavoitteita, kuten luetteloitu p53 IARC tietokanta (https://www-p53.iarc.fr/TargetGenes.html ), ja toinen geeni allekirjoitukset tutkittiin aiemmin luetteloitu ja kuvattu [24]. Käyttämällä joukon ainutlaatuisia geenien edustettuina aineisto (jossa useat koettimia tarkoitettu samaa geeniä, koetin, jolla on korkein vaihtelua käytettiin edustamaan geeni), ja ilme arvojen keskitetty keskiarvo poikki näytteiden keskimääräinen lauseke geenit ”up” allekirjoitus vähennettiin keskimäärin geenien ”alas”, jotta voidaan laskea yhteenvedon koulutusjakson pisteet tietyn allekirjoituksen ja Esimerkkiprofiili. Satunnaisesti valitun geenin, mRNA: n ekspressio havaitut erot mikrosiruanalyysi oli vielä validoitu q-RT-PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka on kuvattu taulukossa S1.

In vivo

Tumor Growth Analysis

Kasvaimen kasvu määritettiin cybrids suoritettiin käyttäen nu /nu-naaraita nude-hiiret (Charles River Laboratories, MA, USA). Neljä hiirtä käytettiin kullekin cybrid ryhmän. Noin 1,5 miljoonaa solua kutakin saman cybrids sekoitettiin Matrigelillä (300 ui solususpensiota PBS: ssä 300 ul vähentää kasvutekijän Matrigel), ja injektoitiin sekä vasemmalle ja oikealle kyljet eläinten käyttäen 26 gaugen neulaa. Kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa paksuus ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa LW

2/2 (L ja W edustavat pituus ja leveys kasvaimet) [25]. Koko koe suoritettiin loppuun, kun keskimääräinen tuumorin tilavuus tahansa kontrollihiirissä (143B /143B) ylitti 1,0 cm

3. Lopussa kokeen, hiiret lopetettiin altistamalla CO

2 ja ensisijainen tuumorit leikattiin ja punnittiin.

Tilastot

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD tai SEM . Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen

t

testi ja ANOVA. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset ja keskustelu

cybrid teknologia kuvattu tässä sallii tutkinnan vaikutuksen mitokondrioiden peräisin syöpää tai ei-syöpäsolujen on mitokondrioiden toimintaan ja onkogeeninen ominaisuudet yhteisten ydinalan tausta. Kaikkia soluja voi selvitä alle mitokondrion köyhdytetty olosuhteissa. Tässä käytimme 143B TK

– soluja ydin- luovuttaja, joka on yksi hyvin tunnettu solulinja cybrid tutkimuksia ja ensin ihmisen ρ0 solulinjassa.

Non-syöpäsoluja ja niiden Cybrids Näyttelytilat parempi mitokondrioiden toiminnalliset ominaisuudet verrattuna Cancer Mitochondria

ensin analysoidaan mitokondrioiden toimintaa vanhempien mitokondrioiden luovuttajan solulinjat ja niiden cybrids. Koska vuoto ROS on osoitus viallisen mitokondrioiden toimintaa, ROS tuotanto analysoitiin kaikissa kantasolulinjoista käyttämällä solun läpäisevä koetin, DCFH-DA. Under metabolinen stressi, kuten ilman glukoosia, soluja pakko riipu pelkästään mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation energiahuollon [22]. Sen vuoksi, jos on vikaa mitokondrion hengitystä, solut odotetaan tuottavan lisääntynyt määrä ROS galaktoosia väliaineessa [25]. Kuten odotettua sekä syöpäsolulinjoista (143B ja MDA-MB-468), jota tuottaa merkittävästi korkeammat (p 0,05) ROS galaktoosia väliaineessa verrattuna glukoosielatusaineessa. Kuitenkin, ei ollut merkittävää kasvua ROS tuotannon MCF10A soluja galaktoosin väliaineessa (Fig. 1A). Sitten analysoimme cybrids ja saadaan samanlainen vaste havaitaan emosoluilta. Sillä cybrids kanssa mitokondrioita hyvänlaatuinen MCF10A soluista, ei ollut merkittävää kasvua ROS tasolla galaktoosia väliaineessa. Kuitenkin cybrids syöpään mitokondrioita osoitti merkittävästi lisääntynyt ROS tasolla galaktoosia väliaineessa (Fig. 1 B). Tutkimiseksi edelleen paikalla epäonnistumisen Hengitysketjun vastuussa heikentynyt oksidatiivisen fosforylaation, ATP synteesi mitattiin läsnäollessa kompleksin I substraattien (glutamaatti plus malaatti), tai kompleksi II alustalle (sukkinaatti). Kuten on esitetty kuviossa. 1C, ATP-synteesin olivat merkitsevästi korkeammat hyvänlaatuiset soluissa verrattuna syöpäsoluihin läsnä ollessa kompleksin I (p 0,01) tai kompleksi II substraattien (p 0,01). Kuten odotettua, cybrid solut osoittivat myös samankaltaisia ​​tuloksia ATP valmistuksessa havaittua emosoluilta. Läsnäollessa joko monimutkainen I alustoille tai monimutkaisia ​​II alustoille, ATP synteesi korko oli merkittävästi lisääntynyt 10A /143B cybrids verrattuna 143B /143B ja 468 /143B cybrids (p 0,01) (Fig. 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että syöpä mitokondrioita luultavasti ovat muuttaneet toiminto vaikuttaa useita komplekseja Hengitysketjun. Western blot-analyysi osoitti, että verrattuna cybrids syöpä mitokondrioissa mtDNA-koodattu mitokondrion kompleksin I ND6 alayksikköä mitokondrion NADH dehydrogenaasi proteiini lisääntyi merkitsevästi MCF10A /143 cybrids mutta eroa ydin- koodattuja proteiineja kuten F1α, Core 2 ja Ip (kuvio. 1E). Täten käyttöön mitokondrioita ei-syöpä MCF10A voisi ainakin osittain lisätä ilmentymistä mtdna koodatun hengitysteiden ketjun proteiinien, siten, korjata vähentää mitokondrioiden toimintaa 143B syöpäsolun.

(A) ROS tuotantoa emosoluilta . Jälkeen Soluja kasvatettiin DMEM-glukoosia tai DMEM-galaktoosi-väliaineessa 24 h ja ROS mitattiin käyttäen DCFH-DA-fluoresoiva väriaine. Data ilmaistaan ​​DCF fluoresenssi /mg proteiinia. (B) ROS tuotantoa cybrid soluissa. (C) Mitokondrioiden ATP synteshastighet vanhempien soluissa. ATP synteesi johtui kompleksi I alustoille (glutamaatti plus malaatti) tai kompleksi II alustalle (sukkinaatti) läsnäollessa kompleksi I: n estäjä (rotenone). Hinnat ATP-synteesin ilmaistaan ​​nmol ATP /min /mg proteiinia. (D) Mitokondrioiden ATP synteesi korko cybrids. (E) Western blot-analyysi edustavan proteiinin alayksiköiden mitokondriot hengitysteiden komplekseja cybrids. β-aktiini ja Porin käytettiin lastaus säätimet ydin- ja mitokondrioiden proteiineja vastaavasti. (* = P 0,05).

ei-syöpä Mitokondrioita voi Käänteinen onkogeeninen ominaisuudet metastasoituneen Cell

Ymmärtää toiminnallinen merkitys mitokondrioiden taaksepäin sääntely ei-syöpä mitokondriot on kasvaimia ominaisuuksia metastaattinen tuma, vertasimme cybrids eri onkogeenisistä ominaisuuksia.

Cell Proliferation ja elinkelpoisuuden Hypoxic kunto

kiinteitä kasvaimia, syöpäsolut on kyky lisääntyä ja ylläpitää elinkelpoisuuden hypoksisissa johtuvat olosuhteet alennettu vascularization ja laski verenkiertoa kasvain kudoksissa. Vertasimme soluproliferaatiota cybrids hypoksisissa olosuhteissa. Mielenkiintoista, jopa yhtenäinen ydin- tausta, cybrids kanssa ei-syöpä mitokondriot osoitti merkittävästi vähentynyt soluproliferaatiota hypoksinen olosuhteissa (Fig. 2A).

(A) Prosenttia soluproliferaation cybrids hypoksisissa ehdon (1% O

2 4 tuntia) verrattuna normoxic ehto (21% O

2). DNA-replikaation arvioitiin käyttämällä ELISA-pohjainen BrdU. (B) prosenttiosuus cybrids hyökkäsi Matrigel invaasiomääritys. (C) Faasikontrasti- kuva kiinnityspisteen riippumattoman kasvun cybrids kanssa pesäkemuodostusta pehmytagarissa. (D) Keskiarvo (± SD) pesäkkeiden määrä kunkin cybrids. (E) syöpälääkettä kestävyys cybrids: Prosenttiosuus elinkelpoisten cybrid solujen havaittiin MTT-analyysi hoidon jälkeen doksorubisiinilla normoxic (ristissä bar) ja hypoksinen (himoitsi bar) olosuhteissa 24 tuntia. (B) Western blot -analyysi apoptoottisten markkereita pilkottiin kaspaasi 3 ja PARP-1-hoidon jälkeen ajoneuvon tai doksorubisiinin (DOX) 24 tuntia. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (* = P 0,05, 10A /143B vs 143B /143B ja 468 /143B;

† = P 0,05, 468 /143B vs 143B /143B ja

# = P 0,05, 10A /143B doksorubisiinin jälkeen normoxic vs hypoksinen kunnossa).

In vitro

Kasvaimia synnyttävä Properties

kyky hyökätä solumatriisimo- ja kasvamaan ankkurointi riippumattomat olosuhteet ovat joitakin syövän ominaisuuksia . Ydin- luovuttaja 143B luusarkoomasolulinjassa on erittäin tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen luonnossa. Ensin analysoidaan hyökkäys mahdollisuuksia cybrids käyttäen matrigeelin hyökkäystä kammioon. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, Matrigel invaasiomääritys ehdotti huomattavasti alhaisempi hyökkäys indeksi 10A /143B cybrids verrattuna cybrids syöpä peräisin mitokondrioita. Sitten analysoimme ankkurointi itsenäinen kasvupotentiaali käyttämällä

in vitro

pesäkemuodostusta pehmytagarissa. Jopa yhtenäinen metastaattinen ydin- tausta, cybrids sisältävä ei-syöpä mitokondriot muodostivat merkittävästi vähemmän pesäkkeitä verrattuna cybrids syöpään mitokondrioita. Pesäkkeiden lukumäärä vuonna cybrids kanssa kohtalaisen metastaattinen MDA-MB-468-soluissa oli välillä 10A /143B ja 143B /143B cybrids (Fig. 2C ja D).

Vastustuskyky syöpälääkettä Therapy

Resistance solun kuoleman syöpälääke on yksi tärkeimmistä syistä syövän hoidon epäonnistumisen. Suurin osa tavanomaisia ​​kemoterapia-aineet tappavat kautta mitokondrioiden reitin apoptoosin. Koska doksorubisiini käytetään usein hoidettaessa kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta-, maksa-, ja luun kasvaimet, solujen elävyys jälkeen syöpälääke hoidot analysoitiin cybrids alle normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa. Solujen elinkelpoisuus analyysi ehdotti, että verrattuna 143B /143B ja 468 /143B cybrids syöpä mitokondrioita, cybrids sisältävä ei-syöpä MCF10A mitokondriot olivat lisääntyneet voimakkaasti solukuolemaa jälkeen syöpälääkettä kohtelu sekä normoxic ja hypoksinen olosuhteet (Fig. 2E). Lisääntynyt solukuolemaa jälkeen syöpähoidolla vahvistettiin edelleen lisääntynyt ilmentyminen apoptoottisten merkkiaineiden aktivoitu kaspaasi 3 ja halkaistut PARP doksorubisiini käsitelty 10A /143B cybrids (Fig. 2F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mitokondrioiden ominaisuuksilla merkittävästi vastaus syöpälääke terapia.

In vivo

tuumorikasvun

in vitro

analyysit voimakkaasti ehdotti inhibitio onkogeenisiä ominaisuuksia aggressiivinen 143B solujen käyttöön ei-syöpä mitokondrioita. Nämä havainnot varmistettiin vielä käyttämällä

in vivo

nude hiirimallissa. Kuten odotettua, kaikki cybrids muodostunut kasvaimia alla erittäin tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen 143B ydin- tausta. Kuitenkin, kuten havaittiin

in vitro

pesäkemuodostusta, kasvaimen kasvu estyi merkittävästi 10A /143B cybrids sisältävät ei-syöpä mitokondriot verrattuna 143B /143B cybrids syöpätiloihin mitokondrioita (Fig. 3A). Kasvaimen paino ja koko olivat huomattavasti matalammat cybrids kanssa mitokondrioita peräisin hyvänlaatuinen MCF10A solut (Fig. 3B ja C). Kuten havaittiin

in vitro

pesäkemuodostusta, kasvaimen koko ja kasvu cybrids kanssa mitokondrioissa johdettu kohtalaisen syöpä MDA-MB-468 rintasyövän solut olivat välillä 143B /143B cybrids ja 10A /143B cybrids . Kaikkiaan meidän

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset viittaavat vahvasti siihen, että mitokondrioiden ydinenergiaa ylikuulumisen ei-syöpä mitokondriot voi estää kasvaimen ominaisuudet erittäin metastaattinen solu.

(A) valokuva kasvainten muodostettu eri cybrids istutuksen jälkeen sisään nude-hiirissä. (B) keskiarvo (± SEM) paino kasvainten jälkeen kirurginen poisto. (C) keskiarvo (± SEM) tilavuus

in vivo

kasvaimen kasvua eri päivää istuttamisen cybrids. (* = P 0,05 t-testiä verrattuna 143B /143B ja # = P 0,01 ANOVA).

Mitokondrioiden Retrograde signaloinnin hyvänlaatuinen Mitochondria torjumista Useat onkogeeninen Pathways

mitokondrioiden taaksepäin signalointi on koulutusjakson tiedonannon mitokondrioiden tumaan normaaleissa ja patofysiologisissa tiloissa. Ymmärtää mitokondrioiden taaksepäin sääntelyn ydin- geenien syöpä- ja ei-syöpä mitokondriot, käytimme mikrosiruanalyysillä. Geeniekspressioprofiilien verrattiin ja bioinformatically analysoitiin onkogeenisel- väyliä cybrids kanssa mitokondrioita hyvänlaatuisia rintaepiteelissä (10A /143B) ja rintasyöpä solujen (468 /143B). Mielenkiintoista, jopa saman ydinvoiman tausta, 6478 koetinsarjojen edustavat 4071 ainutlaatuinen geenejä muutu merkitsevästi 10A /143B cybrids verrattuna 468 /143B cybrids (Fig. 4A). Joukossa merkittävästi muuttunut geenejä, 4794 koetinsarjojen edustavat 2816 ainutlaatuinen geenejä sai säädelty ja 1684 koetinsarjojen edustavat 1255 ainutlaatuinen geenejä alas säänneltävä cybrids kanssa MCF10A mitokondrioita. Lisäanalyysi onkogeenisten polkuja mukaan monien onkogeeniset polkuja kuten RAS, HER2, SRC ja P53 reitit alaspäin säännellään MCF10A /143B cybrids kanssa ei-syöpä mitokondrioiden (Fig. 4A). Osa tuumorisuppressorigeeneille kuten RB1, PTEN ja VHL lisääntyneet huomattavasti MCF10A /143B cybrids hyvänlaatuisia mitokondrioita. Microarray tiedot satunnaisesti valittua geenien todensi q-RT-PCR-analyysi (kuva S1). Siten mikrosiruanalyysi viittaa vahvasti siihen, että jopa erittäin aggressiivinen syöpä ydin- tausta, mitokondriot-ydin- ylikuulumisen ei-syöpä mitokondriot voi estää useita kasvaimia synnyttävän reittejä ja tekevät solut vähemmän syöväksi.

(A) vertailu 10A /143B vs 468 /143B cybrids kanssa määriteltyjen geenien merkitystä t-testi P 0,01, taita muutos 2 tai 0,5. Keltainen, korkeampi ilme. Genes validoitu RT-PCR: llä on osoitettu. (B) Pathway allekirjoitus analyysi ilmaisun aineisto osoittaa otaksuttu ero reitin aktivointitasoa (allekirjoitus nimet kursiivilla merkitsevät erot näytteen ryhmien kanssa P 0,01, t-testi). Punainen, suurempi päätelty polku allekirjoitus toimintaa. Pathway allekirjoitukset määritelty aiemmissa tutkimuksissa, sulkeissa [24].

Vaikka yli 3 vuosikymmentä, kasvaimet pidetään sairauksien mutatoitunut onkogeenien, vaihtoehto ”metabolinen” malleissa on myös ehdotettu osansa kehittymistä ja etenemistä syövän. Mitokondriovauriot pidetään yksi yhteinen ja johdonmukainen fenotyypit syöpäsoluja. Viime vuosina yhä virta asiakirjojen on yhdistää syövän geenien energia-aineenvaihdunnan [26]. Lukuisat erilaiset molekyyli- koostumus mitokondrion sisemmän kalvon normaalin ja syöpäsolujen on myös raportoitu. Analyysi sisemmän kalvon lipidikoostumuksen eri kasvaimen mitokondrioita on ilmoittanut kohonneet kolesteroli-, vaihtelee yhteensä fosfolipidimäärä, ja /tai määrän muutokset yksittäisten fosfolipidien suhteessa normaaleihin kontrolleihin [27]. Tuloksemme osoittivat, että vaikka geenit, jotka koodaavat useimpien mitokondrioiden proteiinit sijaitsevat tumassa, käyttöönotto mitokondrioita, jotka ovat peräisin ei-syöpäsolujen syöpään ydin- ympäristön johti tukahduttaminen onkogeenisten reittejä ja muuttaa syövän ominaisuuksia. Useat raportit oletetut että ROS voisi olla välittäjänä viallisen mitokondrioiden syöpä [11], [25]. Kuitenkin muut tekijät kuin ROS syöpään mitokondriot voivat myös olla rooli kasvaimen ominaisuuksista. On myös mahdollista, että havaittua solujen uudelleenohjelmointi, mitokondrioita eri solutilassa ehkä ohjelmoitu tietyllä tavalla ja se voi siirtää joitakin sen vaikutus seuraavan sukupolven riippumatta ydinvoiman tausta. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että muuntunut mitokondriot voivat vaikuttaa epigeneettiset muutoksia ydinvoiman geenejä, mukaan lukien DNA: n metylaatio [28], [29]. Tällaiset epigeneettiset muutokset mukaan lukien DNA: n ja chromatin muutokset ja signalointi pienten RNA voi edistää ylläpitoon mitokondrioiden välittämän syövän syntyyn sukupolville.

Useimmat cybrid tutkimukset keskittyivät somaattisten mutaatioiden mitokondrioita genomiin ja sen toiminnallinen merkitys. Monia kokeita on tehty tutkia roolia erityisten mtDNA mutaatioita syöpä [3], [30] – [36]. Vaikka somaattiset mtDNA muutokset ovat yhteisiä piirteitä syöpien ja jotkut todisteet osoittavat, että tietyt mtDNA mutaatioita todellakin olla toiminto syövän kehittymiseen, vaikutus syövän mitokondrioita on kasvaimien synnyn edelleen suurelta osin epäselvä [5], [25]. Emme havainneet mitään tiedetä patogeeniset mutaatiostatuksesta ero 143B ja MCF10A soluja. Kuitenkin, vaikka suurin osa mitokondrioiden mutaatiot ovat yksittäin ole haitallisia, on olemassa mahdollisuus, että yhdistelmä eri mutaatioiden yhdessä voivat edistää proteiinin stabiiliuden ja /tai taaksepäin signaloinnin.

Resistance solun kuoleman syöpälääkkeen on yksi tärkeimmistä syistä syövän hoidon epäonnistumisen. Suurin osa tavanomaisia ​​kemoterapia-aineet tappavat kautta mitokondrioiden reitin apoptoosin. Mitokondrioiden reitin apoptoosin käyttäytyy kriittisen ilmiö, jossa on nopea, binary siirtyminen normaalisti toimivaksi solun nopea ohjelman suoritusta solukuoleman [37]. Tuoreen jännittävä tutkimuksessa todettiin, että erot vastauksena kemoterapian saattaa johtua eroista esikäsittelyn valmiusnäyttöön kasvainsolujen apoptoosiin, mitattavissa oleva ominaisuus, että ne kutsuvat ”mitokondrioiden pohjustus” [38]. Mukaan niiden havainto, ero ”mitokondrio esikäsittely” on tärkeä mekanismi taustalla terapeuttinen indeksi tavanomaisten kemoterapia [38]. Syöpälääkkeet erityisesti suunnattu syöpäsolujen mitokondriot on nimetty ”mitocans” [39] – [42].