Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MicroRNA-21 on säädelty eri syöpiä kuten rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, keuhkojen, pään ja kaulan jne Kuitenkin sääntely miR-21 in munuaissolukarsinooma (RCC) ei ole vielä tutkittu systemaattisesti.

menetelmät ja tulokset

mitattu miR-21 tasoilla 54 paria munuaisten syövistä ja niiden normaalin Hyväksytty kudoksiin reaaliaikaisella PCR. Ilmaisu taso miR-21 korreloi 5 vuoden pysyvyys ja patologinen vaiheessa. Funktionaaliset tutkimukset tehtiin sen jälkeen, estämällä miR-21 RCC solulinjoissa. Tutkimme

in vitro

ja

in vivo

vaikutuksia Chemo ehkäisevä aine genisteiini- Mir-21 ilme. 48 tapauksessa (90%), miR-21 lisättiin. Kaikki potilaat, joilla on alhainen miR-21 ilmentyminen selvisi 5 vuotta, kun taas korkean miR-21 ilme, vain 50% selvisi. Korkeampi ilmentyminen miR-21 liittyy kasvuun vaiheessa munuaissyövän. Funktionaaliset tutkimukset jälkeen estämällä miRNA-21 RCC solulinjoissa osoittavat solusyklin pysähtymiseen, apoptoosin induktio ja vähentää invasiivisia ja muuttavat ominaisuuksia. Western blot-analyysi osoitti kasvua ekspression p21 ja p38 MAP-kinaasin geenien ja vähentää sykliini E2. Genistein esti ilmaus miR-21 A-498-soluissa ja kasvaimia jälkeen muodostettu ruiskuttamalla genisteiini- käsitellylle A-498-solut nude-hiirissä lisäksi tuumorin muodostumisen.

Johtopäätökset

Nykyinen tutkimus osoittaa selvää korrelaatiota miR-21 ilmentyminen ja kliinisiä tekijöitä munuaisten syöpä. Näin ollen uskomme, että miR-21 voidaan käyttää tuumorimarkkeri ja sen inhibitio voi olla hyötyä kontrolloinnissa syöpiä säädelty miR-21.

Citation: Zaman MS, Shahryari V, Deng G, Thamminana S, Saini S, Majid S, et ai. (2012) Up-asetus MicroRNA-21 korreloi Ala munuaissyöpä Survival. PLoS ONE 7 (2): e31060. doi: 10,1371 /journal.pone.0031060

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 marraskuu 2011; Hyväksytty: 01 tammikuu 2012; Julkaistu: 08 helmikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Veterans Association Merit Review, Veterans Association Research Enhancement palkinto-ohjelma ja National Institutes of Health Grant RO1CA130860 (pääasialliseen tutkija, tohtori R. Dahiya). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka tärkeä rooli lukuisissa solujen prosesseissa kuten kehitys-, leviämisen, ja apoptoosin [1]. Koska miRNA ovat mukana kriittisessä soluprosessien, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ne ovat mukana myös useiden erilaisten sairauksien mukaan lukien munuainen. Ominaisuus miRNA allekirjoituksia useita epiteelisyöpien, kuten rinta-, keuhko-, haima-, maha- ja munuaisten syövät, on raportoitu [2], [3], [4], [5]. Histologinen todisteet osoittavat, että on olemassa useita muunnelmia pahanlaatuisten munuaissyövän,

eli.

Selkeä solu, papillaarinen, kromofobista leikettä ja kerätä kanava karsinoomien [6], [7], [8], [9]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet ero ilmentymistä miRNA näissä variantteja munuaissyövän [10], [11], [12]. MicroRNA-21 on säädelty eri syöpien, kuten rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, keuhkojen, pään ja kaulan, jne. Kuitenkin sääntely ja toiminnallista roolia miR-21 munuaissyövän ei ole vielä systemaattisesti tutkittu. Tässä tutkimuksessa mitattiin miR-21 tasoilla 54 paria ihmisen munuaisen syövistä ja niiden normaalin Hyväksytty kudoksiin reaaliaikaisella PCR: llä. Ilmentymisen taso miR-21 korreloi 5 vuotta selviytymisen ja vaiheessa potilailla. Sen määrittämiseksi roolin miR-21 munuaissolukarsinooma (RCC) funktionaalisia määrityksiä kuten solusykliä, apoptoosin, invaasio, ja muuttoliike, tehtiin sen jälkeen kaatamalla miR-21 ilmentyminen A-498-soluissa. Ohjelmisto-analyysi ja PCR-array-analyysi osoitti kasvua ekspression p21 ja p38 MAP-kinaasien jälkeen inhibitio miR-21 ja väheni Sykliini ja sykliiniriippuvaisten kinaasien. Nämä tulokset todensi Western-analyysillä. Lisäksi olemme myös arvioineet vaikutusta ravinnon kemopreventiossa agentti, genisteiini (soija tuote), ilmenemistä koskevat miR-21 hiirillä kasvaimia. Genistein vähensi ilmentymistä miR-21 hiirissä injektoitiin genisteiini- käsiteltyjä soluja verrattuna vehikkelikontrolleihin. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa korrelaation miR-21 ilmaisutapoja kliinisten parametrien ja sen toiminnallinen rooli RCC. Lopuksi säädelty miR-21 munuaissyövän voi olla hyvä kasvain merkkiaine munuaissyövän diagnosointiin.

Tulokset

miR-21 on ylöspäin säädeltyä munuaissyöpä kudosnäytteistä ja munuaissyövän solulinjat

Ymmärtääksemme kliinistä merkitystä miR-21 munuaissyövän mittasimme miR-21 tasoilla 54 paria munuaisten syövistä ja niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin reaaliaikaisella PCR: llä. 48 tapauksessa (89%), miR-21: n havaittiin lisääntynyt (T /N [Tumor /Normaali] oli yli 1,2). Expression of miR-21 mitattiin myös munuaisten syöpäsolulinjoissa, A-498, Caki-1, Caki-2 ja normaalin HK-2-soluissa. miR-21 ilmentyminen A-498-soluissa oli noin 7,3 × että HK-2-solujen kun taas Caki-1 oli 1,6 ×, ja Caki-2, 3 x.

Korrelaatio miR-21 ilmaisutapoja vaihe ja eloonjäämisen munuaisten syövän

ilmaisu taso miR-21 korreloi 5 vuoden pysyvyys ja vaihe potilaista. Potilaille, joilla on alhainen miR-21 ilmentyminen (kuvio S1), selviytyivät kaikki 5 vuosi leikkauksen jälkeen, kun taas ne, joilla on korkea miR-21 ilmentyminen (kuvio S2), vain 50% selvisi (Kuvio 1). Selviytymisen käyrä perustui potilaiden määrä (36), joka meillä oli eloonjääminen tietoa ulos yhteensä 54 potilasta. Potilaissa, joilla on alhainen miR-21 lauseke (T /N 1,2), korkea ilmentyminen (T /N = 1,2-10) ja erittäin korkea ilmaisun (T /N 10) prosenttia niistä alkuvaiheen (Stage I) pieneni 80%, 51,5% ja 37,5%, tässä järjestyksessä. Tämä merkitsee sitä, että lisääntyneen ekspression miR-21 korreloi lisääntyneen vaiheessa munuaissyöpään. Tämä tieto perustui potilaiden määrä, joille meillä oli vaiheen tiedot (46 out of 54 potilasta). Ei korrelaatiota kasvaimen ja miRNA-21 tasoja havaittiin.

Expression of miR-21 eri muodoissa munuaissyövän

ilmentyminen miR-21 luokiteltiin joko alhainen (T /N 1,2), korkea (T /N = 1,2-10) ja erittäin korkea (T /N 10). Eri muodot syöpiä, joissa ilmentyminen miR-21 analysoitiin olivat selkeitä karsinooma, papillaarinen karsinooma ja putkimainen syöpä. Kaikkiaan 54 näytettä, 45 näytettä olivat selkeitä cell carcinoma, 8 olivat papillaarinen ja 1 oli putkimainen syöpä. Molemmissa kirkas solu (71,1%) ja papillaarinen karsinooma (75%) suurin osa näytteistä oli korkea ilmentyminen miR-21 (T /N = 1,2-10). 17,7% kirkasta solukarsinooman oli erittäin korkea ilme. Yksittäinen putkimainen munuaissyövän näyte oli erittäin korkea miR-21 ilme.

toiminnallinen rooli miR-21 A-498-solujen

valaista toiminnallista roolia miR-21 munuaisten syöpä me esti ilmentymisen miR-21 A-498 munuaissyöpäsoluissa kaupallisesti saatavilla miR-21-estäjä. Anti-miR-Negatiivinen kontrolli # 1 käytettiin standardi negatiivisena kontrollina näissä kokeissa. MIR-21 tason väheni enemmän kuin 99%, verrattuna negatiiviseen kontrolliin (kuvio S3). Kun kyseessä on anti-miR-21 transfektiolla Caki-2-soluissa samalla tasolla vähentäminen miR-21-ekspressio havaittiin (kuvio S4).

Vaikutus A-498 solukierron ja apoptoosin.

vaikutuksia miR-21 estoa solusyklin ja apoptoosin analysoitiin virtaussytometrialla. Solusyklin kasvoi huomattavasti (9,1%) vuonna G0 /G1 vaiheeseen, jossa kaventumiseen (6,8%) G2 /M vaiheessa, mikä osoittaa, että väheneminen miR-21 ilmentyminen A-498-soluissa esti solun kasvun ja aiheutti G0 /G1 pidätys (kuvio 2a). Apoptoosimäärityksessä käyttämällä virtaussytometria osoitti marginaalinen määrä kasvaa koko apoptoottisten solujen (varhainen apoptoottiset plus apoptoottinen) (5,17%) vuonna miR-21 anti-miRNA-estäjän transfektoidut solut verrattuna negatiiviseen kontrolliin (1,79%) ja mock ( 2,49%) (kuvio 2b). Siinä tapauksessa, että Caki-2-solujen inhibitio miR-21 aiheutti huomattavan apoptoosin lisääntyminen ilman muutosta solusyklin (tietoja ei esitetty).

(a) Vaikutus solusyklin: virtaussytometrinen analyysi solusyklin osoitti merkittävää kasvua G0 /G1 vaiheeseen (9,1%), jossa on samanaikaisesti väheneminen G2 /M-vaiheen (6,8%), mikä osoittaa, että pakko vähentäminen miR-21 ilmentyminen A-498-solut voivat estää solun kasvuun ja syy G0 /G1 pidätys (p-arvo 0,010). (B) Vaikutus apoptoosin: apoptoosimäärityksessä osoittivat marginaalinen määrä kasvaa koko apoptoottisten solujen (5,17%) vuonna miR-21 anti-miRNA-estäjän transfektoidut solut verrattuna negatiiviseen kontrolliin (1,79%) ja mock (2,49% ) (p-arvo 0,017).

Vaikutus solujen invaasiota ja muuttoliike ominaisuuksia.

Voit selvittää miR-21 vaikuttaa munuaisten syöpäsolujen muuttoliikettä ja Invasion cytoselect 24 syvennyksen solumigraation ja hyökkäys kit käytettiin. A-498-solut transfektoitiin anti-miR-21-estäjän ja anti-miR-Negatiivinen kontrolli. Sekä A-498 soluinvaasiota ja muuttoliike laskivat verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Vähemmän absorbanssi todettiin 560 nm: ssä anti-miR-21 transfektoiduissa soluissa kuin negatiivinen kontrolli sekä hyökkäyksen ja muuttoliike määritykset (kuviot 3a ja 3b). Esto miR-21 ilmentyminen oli selvempi vaikutus invaasio verrattuna maahanmuuttoon, (vähennys 50% vs. 25%). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin tapauksessa Caki-2-solut sekä hyökkäyksen ja muuttoliike määrityksissä (tuloksia ei ole esitetty).

(a) Vaikutus soluinvaasion: Invasive ominaisuudet A-498-soluja pieneni, kun esto Mir-21 verrattuna negatiiviseen kontrolliin, Mosaiikki A-498-solut (Suurennus-40 x); Absorbanssi 560 nm: ssä (p-arvo 0,026). (B) Vaikutus solumigraation: muuttavien ominaisuuksien A-498-soluja laski myös sen jälkeen, kun estoa miR-21 verrattuna negatiiviseen kontrolliin, Mosaiikki A-498-soluja (suurennus-40 x); Absorbanssi 560 nm: ssä (p-arvo 0,016).

miR-21 kasvattaa ilmentymisen sykliiniriippuvaisten estäjät CDKN1A (p21).

nähdä vaikutuksen miR-21 ilmentyminen eri geenit osallistuvat solusyklin ja apoptoosin käytimme PCR taulukot. Koska näimme merkittävää vaikutusta solusyklin inhiboimalla miR-21 A-498-solut, ensin päätynyt PCR paneelit liittyvät solusyklin geenejä. Solusyklin perustuu PCR-taulukot osoittivat muutoksia ilmentymisen määrä geenejä. Yksi geenien ylös säännelty PCR array jälkeen eston miR-21 oli sykliiniriippuvaiset estäjät, CDKN1A tunnetaan myös CIP1 tai p21. Muita PCR taulukot osoitti muutoksen geenin ilmentymistä p38 MAP-kinaasi. Myöhemmin olemme vahvistanut tämän tuloksen käyttämällä MAP-kinaasin, joka perustuu PCR-taulukot ja saadaan sama tulos (tuloksia ei ole esitetty). Molemmat tulokset todensi Western blottauksella (kuva 4). Western blotting kokeet osoittavat selvästi jopa säätää sekä p21 ja p38 MAP-kinaasi geenien miR-21 eston verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Olemme myös tarkistaa ilmentymisen muiden geenien, jotka liittyvät solusyklin ja apoptoosin ja todettu downregulation sykliini E2. Me tarkasteltiin myös mRNA: n ilmentymisen sykliiniriippuvaisten kinaasien, CDK2, CDK4, CDKE1 ja CDKE2 ja löysivät lauseke merkittävästi vähentää, kun esto miR-21 (tuloksia ei ole esitetty). Western blot kokeissa pyysimme CDK4, E1 ja E2 kuten CDK2 on jo tiedetään vaikuttavan p21-geeni [13], [14]. Olemme havainneet muutoksen proteiinin ilmentymisen vain CDKE2.

Expression of p21, p38MAP kinaasin ja sykliini E2 jälkeen inhibitio miR-21 A-498-soluja, verrattuna negatiiviseen kontrolliin. GAPDH: ta käytettiin normalisoi ohjaus. p21 ja p38 MAP-kinaasi olivat jopa säänneltyjä, kun taas sykliini E2 ilmentyminen todettiin säädeltiin.

In vitro

ja

In vivo

vaikutuksia genisteiinin on munuaissyöpäsoluissa

genisteiini vähentää ilmentymistä miR-21-kasvaimista.

Kuten aiemmin mainittiin tarkastetaan vaikutukseen kemopreventioon ainetta, genisteiini (soija tuote), sen ilmentymisen miR-21 paljaan hiiren kasvaimia. Ensinnäkin A-498 munuaissyövän-soluja käsiteltiin 25 uM genisteiini ja 4 päivää, ja sen jälkeen RNA miR-21 ilmentyminen tarkistettiin. Ilmaisu havaittiin alennetaan 30% genisteiiniä käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin niitä (kuvio 5a). Nähdä vaikutus genisteiinin hoito hiirillä kasvaimia ja miR-21 ilmentyminen A-498-soluja käsiteltiin jälleen genisteiini- (25 uM) ja 96 tunnin kuluttua hoidon injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Kahdet kolmen hiiren kunkin käytettiin. Vuonna DMSO kontrollituumoreilla kolme hiirille kehittyi merkittävästi suurille kasvaimia, noin 800 mm

3 tilavuudessa (kuvio 5b, vasen paneeli), kun taas kanssa genisteiini käsiteltyjen solujen pienen koon kasvain havaittiin yhdellä kolmesta hiirestä, noin 25 mm

3 tilavuudessa (kuvio 5b oikea paneeli,). Kahdessa muussa hiirten yksi heistä oli hyvin pieni kasvain klo injektiokohdassa (kuvio 5b oikea paneeli) ja kolmas hiiri ei ollut kasvain. Muodostamisen jälkeen palpoitavissa kasvainten kontrollisoluja, me leikattiin kasvaimet ja mitataan ilmentyminen miR-21 jälkeen kasvaimen homogenointi Qiazol ja RNA. Ekspression miR-21 havaittiin alennetaan -40% vuonna genisteiiniä käsiteltyjen näytteiden verrattuna käsittelemättömiin niitä (tuloksia ei ole esitetty).

(a) Vaikutus genisteiinin (25 uM) on ilmaus miR-21 A-498-solut: miR-21 ilmentyminen havaittiin alennetaan -30% vuonna genisteiiniä käsitellylle A-498-soluja verrattuna käsittelemättömiin soluihin. (B)

In vivo

vaikutus genisteiinin kasvaimen kokoa nude-hiirissä: Genistein pystyi vähentämään kasvaimen muodostumisen merkittävästi (mustat nuolet, oikea paneeli).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoitettava, että säätelyn miR-21 munuaissolusyövässä liittyy alentaa munuaissiirteiden syöpäpotilailla. Ekspression miR-21 sekä munuaisten syöpäsolulinjoissa ja ihmisen munuaissyövän kudosnäytteitä havaittiin olevan suurempi verrattuna normaaliin, joka on sopusoinnussa aiempien tutkimusten munuaissolukarsinooma ja muiden syöpien [15]. Tutkimuksemme osoittaa ensimmäistä kertaa, että potilailla, joilla on suurempi ilmaus miR-21 munuaisten syöpä on pienempi todennäköisyys selviytyä. Myös pienempi ilmentyminen miR-21 johtaa suurempaan eloonjäämisaste. Olemme myös korreloi ilmaus miR-21 kanssa vaiheessa syöpä niille potilaille, jotka meillä oli täydelliset tiedot vaiheessa (34/39). Meidän analyysi osoitti, että hyvin korkea ilmentyminen miR-21 potilasnäytteissä johti kasvuun sairauden vaiheesta. Valaista tärkeää miR-21 munuaissolukarsinooman toiminnalliset analyysit suoritettiin. Solujen elinkelpoisuus määritykset osoittivat anti proliferatiivinen vaikutus A-498-soluissa, kun esto miR-21. Merkittävin muutos havaittiin solusyklin jossa G0 /G1 faasi kasvoi jyrkästi (9,1%) ja kaventumiseen G2 /M vaiheessa (6,8%). Tämä sai meidät etsimään mahdollisia solusyklin geenit vaikuttavat estämällä miR-21 A-498-soluissa. Solusyklin PCR array kokeet osoittivat, että cDKN1A (p21) oli jopa säännelty jälkeen eston miR-21 A-498-soluissa. Aiemmat tutkimukset käyttäen mikrosiruja mukaan p21 ilmaus positiivisesti korreloi tukahduttaminen geenejä, jotka ovat tärkeitä solukierron etenemisen [16]. p21 vastaa erilaisia ​​ärsykkeitä, joka edistää kasvua inhiboivaa aktiivisuutta, riippuen sen kyvystä inhiboida sykliini-riippuvaisen kinaasin CDK2. Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet, että p21-geeni on lisäksi rooleja solusyklin säätelyssä, jotka ovat riippumattomia CDK2. Joitakin esimerkkejä ovat sen yhdessä transkriptiotekijän E2F1 ja tukahduttaminen sen transkriptionaalisen aktiivisuuden [17]. Lisäksi p21 myös tukahduttaa transkriptiotekijöiden STST3 [18] ja MYC [19]. Lisäksi p21 edistää myös solusyklin esto välityksellä p53-riippuvainen tukahduttaminen geenien kuten CDC25C, cdc2, CCNB1 ja BIRC5 tunnetaan myös surviviinista [20], [21], [22]. Vaikka p21 estää geenien solusyklin etenemisen se estää myös apoptoosin [23]. Kun solut kohtaavat genotoksisia loukkaukset tai mikrotubulia epävakautta aineet, p21 suojaa niitä apoptoosin aktiivisena solukierron vaaditaan aistia näiden aineiden ja laukaista apoptoosin. Tämä voi selittää ole niin dramaattinen lisääntyminen solujen apoptoosin jälkeen inhibitio miR-21 A-498-soluja verrattuna muutoksiin solusyklin etenemisen kuviossa 2b. Kuitenkin vaikutus p21 on torjua useita mekanismeja johon kuuluu siirtyminen solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin selektiivisen transkription repression p21, selektiivinen aktivointi pro-apoptoottisen geenejä tai vikoja p21 ilmentymisen alavirtaan p53 [24], [25 ], [26]. Tietyissä tapauksissa p21 myös edistää apoptoosia sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien alle solustressiä mutta vaikutusmekanismia ei vielä tunneta [27]. Niinpä yritimme onko p21 oli välittömänä kohteena miR-21 käyttäen 3 ’lusiferaasianalyysissä mutta emme löytäneet suoraa vuorovaikutusta. Niinpä pyysimme proteiinin ilmentymistä eri sykliiniriippuvaisten kinaasien CDK4, E1 ja E2 ja voisi löytää eroa vain cyclinE2 (kuva 4).

Genistein, yksi tärkeimmistä soija isoflavones, on laaja valikoima chemopreventive toimet. Syövän vastainen vaikutus genisteiinin on katsoneet useita signalointireittejä ja mekanismit, jotka vaikuttavat solukierron pysähtymisen, apoptoosin, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä, attribuutteja, jotka voivat estää kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen [28], [29]. Genistein (40,5,7- trihydroxyflavone) on runsaasti soijatuotteita ja on todettu estäjänä Proteiinityrosiinikinaasien ja voi siten olla keskeinen rooli solujen kasvuun ja apoptoosin [30], [31]. Sen on raportoitu olevan estrogeenisiä ominaisuuksia, ja antineoplastinen useita kasvaintyypeissä [32]. On myös havaittu olevan epigeneettiset vaikutuksia hiiren eturauhasen [33]. Aiemmassa tutkimuksessa Hillman

et. al.

ovat osoittaneet, että yhdistelmä genisteiinin kanssa Primaarikasvaimen säteilytys säädöksiä tehokkaammin kuin terapeuttinen lähestymistapa, vakiintuneissa munuaisten kasvaimet, koska kasvaimen kasvua kasvun estoon sekä ensimmäisen ja metastaasien. Heidän tutkimuksessaan genisteiini- yksin osoittaneet taipumusta edistää kasvua ensisijainen munuaisen kasvain ja lisätä etäpesäkkeiden [34]. Tutkimuksessamme otamme haluaa yksinkertaistaa ja ovat osoittaneet, että A-498-solut käsiteltiin genisteiini- vain muodostunut pienentää kasvaimia verrattuna vehikkelikontrolleihin.

miRNA säädellä geeniekspressiota kohdentamalla sisältävien geenien mRNA: n sekvenssit [35]. Monet solureiteillä vaikuttaa sääntelyn toiminta miRNA ja näkyvin näiden reittien ohjata kehitys- ja onkogeenisten prosessien [36]. miR-21 oli yksi ensimmäisistä miRNA havaittu ihmisen genomissa [37], ja on havaittu yli-ilmentyvän eri syöpätyyppien [38]. On olemassa muutamia tutkimuksia dokumentoi toiminnallista merkitystä miR-21 näyttämällä syyn ja seurauksen suhde miR-21 ja neoplastisen transformaation. Näitä tutkimuksia on tehty glioblastoma [39], rintasyövän [40], maksasyövän [41], peräsuolen syöpä [42] ja myeloomasolut [43]. Tuoreessa raportissa roolista miR-21 munuaisten syövän osoittaa, että se moduloi apoptoosia kohdistamalla useita geenejä Zhang

et.al

[44]. Kuitenkin tähän mennessä ei ole tietoa, joka liittyy kliinisiä korrelaatiota miR-21 ilmaisutapoja vaiheessa ja selviytymisen munuaisten syöpäpotilailla. Lisäksi osoitamme chemo ennaltaehkäisevä rooli genisteiinin estossa kasvainmuodostusta

in vivo

vähentämällä miR-21 ilmentyminen hiiren kasvaimissa. Lopuksi tämä on ensimmäinen raportti korreloi miR-21 tasolle selviytymisen ja vaiheessa munuaisten syöpäpotilaiden ja dokumentoi onkogeeninen roolia miR-21 erilaisten solureiteillä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) munuaissyövän näytteitä saatiin San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01). Kaikki eläinten hoito oli suuntaviivojen mukaisesti San Francisco Veterans Affairs Medical Center ja tutkimuksen hyväksyi San Francisco VA IACUC (Protocol numero: 08-003-01).

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen munuaisten syöpäsolulinjoissa A-498, Caki-1, Caki-2, ja normaali munuaisten solulinja HK-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Solulinjat tarkastettiin ATCC kautta DNA (STR) profilointi. Normaali munuaisten HK-2-soluja viljeltiin yhtenä kerroksena on Keratinosyyttien Serum Free Medium (K-SFM), johon oli lisätty 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE), 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml penisilliiniä ja 50 mg /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Munuaisvaltimoiden syöpäsolu linja A-498 viljeltiin yhtenä kerroksena Eaglen Minimum Essential Medium, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-1 ja Caki-2 viljeltiin samalla tavalla McCoy’s5A media (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Kaikkia solulinjoja pidettiin inkubaattorissa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO2, 37 ° C: ssa. Subkonfluentit A-498cells (60-70% konfluentteja) käsiteltiin Genisteiini (25 uM). Genisteiini (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) liuotettiin DMSO: hon, ja solut, joita käsiteltiin ainoastaan ​​vehikkelillä (DMSO) toimi kontrollina. Tuore genisteiini annettiin jokapäiväistä yhdessä elatusaineen vaihto, ja soluja inkuboidaan 4 päivää.

Quantitative real-time PCR

Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin kokonais-RNA (1 ug) käyttämällä käänteisen transkription (Promega, Madison, WI, USA). Kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy mini -kittiä Qiagen (Valencia, CA, USA). Sillä reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), komplementaarinen DNA monistettiin inventoitu Gene Pitoisuus tuotteita, joissa on kahta geeniä aluketta ja yhtä TaqMan MGB koetin (6-FAM väriaine-leimattu) käyttämällä TaqMan Universal Fast PCR Master Mix on 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Lämpökäsittelyyn olosuhteissa mukana 95 ° C: ssa 20 sekuntia (s), 40 sykliä 95 ° C: ssa 3 s ja 60 ° C: ssa 30 s mukainen TaqMan Fast Universal PCR. GAPDH: ta käytettiin endogeenista ohjaus. Sillä miRNA reaaliaikainen kokeissa cDNA-juoste syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit, 200 ng kokonais uutettu miRNA. RNU48 käytettiin endogeenista ohjaus. Real-time PCR kokeissa, joissa miRNA eristettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) munuaisten näytteet, let7-f käytettiin endogeenista ohjaus. Yhteensä miRNA uutettiin FFPE näytettä seulotaan miRNA FFPE Kitin Qiagen.

PCR taulukot kautta reaaliaikainen PCR

ekspression tutkimiseksi profiilia geenien mukana erilaisissa solureiteillä, polku-specific PCR-array (solusyklin array, apoptoosin array, MAP-kinaasin array, SABioscience) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aineisto analysoitiin valmistajan ohjelmiston.

Micro leikkelyn munuaissyövän kudosten ja RNA uuttamalla FFPE ihmisen munuaisen kasvainnäytteestä

Vieressä normaali ja syöpä- munuaiskudoksiin saatiin 39 edustaja FFPE kudosta lohkojen radikaali nephrectomy yksilöitä patologian osaston Veterans Affairs (VA) Medical Center of San Francisco. Lohkot olivat munuaissyövän potilailla, jotka leikattiin klo VA Medical Center välillä 1980-2009. Osiot (4 pm) lohkoista valmistettiin, H Beckman Coulter).

apoptoosimäärityksessä

apoptoosin, soluja 72 tuntia transfektion jälkeen otettiin kaksi värjättiin elinkelpoisuuden väriaine 7 amino-aktinomysiini D ja anneksiini V-FITC: llä käyttämällä anneksiini V-FITC /7-amino-aktinomysiini D kit (Beckman Coulter), mukaisesti valmistajan protokollaa. Stained solut välittömästi analysoitiin virtaussytometrillä (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

Muuttoliike ja invaasio määritykset

cytoselect 24 kuopan solumigraation ja invaasiomääritys Kit (Cell Biolabs, Inc. ., San Diego, CA) käytettiin muuttoliikettä ja invaasiota määritykset 72 tuntia transfektion jälkeen (8 um, kolorimetrinen muodossa) mukaan valmistajan protokollaa.

Western-analyysi

Kokosolun uutteita valmistettiin radioimmunosaostuskokeella puskurissa (RIPA; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA, 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 NaCl: a, 0,5% deoksikolaatti, 0,1% SDS: ää ja 1,0% NP-40) joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Basel, Sveitsi). Proteiinimääritykset suoritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonaisproteiinista (40 ug) suoritettiin elektroforeesi 12% SDS-PAGE-geeleillä ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen standardiprotokollia ja kemiluminesenssilla. Kaikki vasta-aineet, jotka sisältyvät p21 (cat. No. 2552), p38 MAPkinase (cat. No. 9212) ja cyclinE2 (kat. No. 4132) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA, USA), kun taas GAPDH (cat. no. sc-32233) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Genistein hoidossa A-498-solujen ja subkutaaninen injektio nude-hiirissä

Kuten edellä mainittiin, -498-soluja käsiteltiin 25 uM genisteiini 96 tuntia. DMSO: ssa (vehikkeli) käsiteltyjä soluja toimi kontrollina. 96 tunnin kuluttua solut pelletoitiin ja ~ 2 miljoonaa solua injektoitiin ihon alle (100 ui) oikean kyljen nude-hiirten (4- 5 viikon ikäisiä; Charles River Laboratories). Kaksi hiiriä, joissa kolme hiirtä kussakin, käytettiin tässä kokeessa. Yksi sarja edusti ajoneuvo (DMSO) valvontaa ja toinen genisteiini käsiteltyjen solujen. Kasvaimet kontrollista ja genistein käsitellyt solut irrotettiin 8 viikon kuluttua, kun DMSO käsitelty kontrolli hiirille kehittyi kasvaimia noin 800 mm

3 tilavuudessa (pituus-16 mm, leveys-10 mm). Kokonais-RNA uutettiin homogenisoimalla kasvaimia Qiazol ja uuttamalla RNA: sta käyttäen valmistajan protokollan (Qiagen). Expression of miR-21 mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen StatView 5.0 for Windows. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan eri ryhmiin. p-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

miR-21 tasoa potilailla, joilla on alhainen ilmaisun ( 1,2): Alhainen miR-21 potilailla, joilla on 100% eloonjääneitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031060.s001

(TIF )

Kuva S2.

miR-21 tasoa potilailla, joilla on korkea ilmentymisen ( 1,2): Korkea miR-21 potilailla, joilla on 50% eloonjääneitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031060.s002

(TIF )

Kuva S3.

ekspressiotasot miR-21 jälkeen knockdovvn A-498-solut: MIR-21 taso aleni yli 99% (+1,0-+0,030), verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

doi: 10,1371 /journal .pone.0031060.s003

(TIF) B Kuva S4.

ekspressiotasot miR-21 jälkeen knockdovvn in Caki-2-soluissa: MIR-21 taso aleni yli 99% (+1,0-+0,011), verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

doi: 10,1371 /journal .pone.0031060.s004

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Roger Erickson tukea ja apua valmisteluun artikkelin.