Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pariksi kaltainen homeodomain 2 (PITX2) on bicoid homeodomain transkriptiotekijä, joka on keskeinen rooli ylläpitää alkion vasen-oikea epäsymmetria aikana selkärankaisten alkionkehityksen. Kuitenkin syntymässä viittaavat siihen, että poikkeava säätelyä PITX2 voi liittyä syövän etenemiseen, mutta toiminnallista roolia, PITX2 pelaa kasvainten synnyssä on tuntematon.

Keskeiset havainnot

Käyttämällä reaaliaikainen kvantitatiivinen RT -PCR (Q-PCR), Western blot ja immunohistokemiallinen (IHC) analyysit, osoitimme, että PITX2 oli usein yli-ilmennetään munasarjasyövän näytteitä ja solulinjoissa. Kliinis korrelaatio osoitti, että voimistunut PITX2 merkitsevästi liittyy korkea-asteen (

P

= 0,023) ja selkeä solujen alatyyppi (

P

= 0,011) käyttäen Q-PCR ja korkea-asteen (

P

0,001) munasarjasyövän IHC analyysi. Toiminnallisesti täytäntöön ilmaus PITX2 voisi edistää munasarjasyövän solujen lisääntymistä, ankkurointi riippumattoman kasvun kyky, muuttoliike /invaasio ja kasvaimen kasvua ksenograftimallissa hiirillä. Lisäksi täytäntöön ilmaus PITX2 kohonnut solusyklin säätelyproteiineihin kuten sykliini-D1 ja C-myc. Kääntäen, RNAi välittämä knockdovvn PITX2 in PITX2-korkea ilmentävien munasarjasyöpäsoluja oli päinvastainen vaikutus.

Johtopäätös

havaintojen mukaan lisääntynyt ilmentyminen PITX2 osallistuu munasarjasyövän etenemisen edistämällä solujen kasvuun ja solumigraation /hyökkäystä. Näin ollen, PITX2 voi toimia mahdollisena hoitomuoto hallinnassa korkealaatuisesta munasarjatuumorissa.

Citation: Fung SKL, Chan DW, Liu VWS, Leung THY, Cheung tahansa, Ngan HYS (2012) Lisääntynyt Expression of PITX2 transkriptiotekijä Auttaa munasarjasyöpä Progression. PLoS ONE 7 (5): e37076. doi: 10,1371 /journal.pone.0037076

Editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 tammikuu 2012; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 15, 2012

Copyright: © 2012 Fung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Wong Check Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi. Tämä tuki on yksityisistä lahjoituksista, eikä rahoittaja verkkosivuilla on saatavilla. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on yksi yleisin syöpä naisista maailmanlaajuisesti [1] kantavassa korkea kuolleisuus munasarjasyöpään johtuu myöhäinen diagnosointi ja huono hoitovaste koska tauti ilmenee usein vain vähän tai epäspesifisiä oireita alkuvaiheessa [2], [3], [4]. Munasarjasyöpä voidaan luokitella neljään alatyyppeihin; vakavien, endomet-, mucinous ja selkeä solu, joka perustuu histologiseen erilaistumiseen munasarjojen epiteelin ja taustalla geneettiset muutokset [3], [5], [6]. Porrastus munasarjakasvain on luokiteltu mukaisesti International Federation of Naistenklinikka ja synnytysten (FIGO) järjestelmä, paljastaa, että korkea-asteen kasvain näytteille ominaisuus nopeuttaa solujen kasvua ja huonon ennusteen sekä chemoresistance verrattuna huono laatu kasvain [7], [8].

Pariksi kaltainen homeodomain 2 (PITX2) transkriptiotekijä on jäsenenä bicoid homeodomain perheen ja tärkeä rooli alkionkehityksen selkärankaisten [9]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että mutaatio PITX2 liittyy patogeneesin Axenfeld-Rieger oireyhtymä (ARS), joka on autosomaalinen hallitseva ihmisen sairaus, kehityshäiriöitä vikoja silmä, hampaiden ja sydän [6]. Viimeaikaiset raportit ovat dokumentoineet, että PITX2 yliekspressoituu funktionaalinen Aivolisäkekasvainten [10], paikallisiin imusolmukkeisiin kolorektaalisyöpä [11] ja kilpirauhassyöpä [12]. Lisäksi esto PITX2 ilmentymisen shRNA kilpirauhassyövän hoitoon soluissa merkittävästi vähentää kapasiteettia solujen kasvua pehmeässä agarissa määrityksen, viittaa siihen, että PITX2 voi olla onkogeeninen ja saattaa olla osallisena taudin etenemiseen [12].

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että PITX2 oli usein voimistunut ja merkitsevästi liittyy korkea-asteen munasarjasyöpä. Käyttämällä munasarjasyöpäsolu malleja, me paljasti, että voimistunut PITX2 voisi nostaa solun lukiertosäätelijöistä kuten CyclinD1 ja C-myc, ja edistää solujen proliferaatiota ja muuttoliike /invaasion sekä kasvaimen kasvua ksenograftimallissa hiirillä. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy tarkempi käsitys onkogeenisel- rooli PITX2 välittämisessä munasarjasyövän kasvaimien syntyyn.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet ja solulinjoissa

kirurginen poisto 97 kasvaimen näytteitä ensisijainen munasarjasyöpä potilaiden ja normaalin munasarjat näytteitä hyvänlaatuinen tauti valittiin satunnaisesti Q-PCR-analyysiin. Histologinen alatyyppi ja vaihe kasvaimet luokiteltiin mukaan kansainvälisen liiton Naistenklinikka ja synnytysten (FIGO) luokitus. Kirjallinen suostumus ottanut yllä osallistujien ja käyttää näitä kliinisissä näytteissä hyväksyi Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (Institutional Review Board numero: UW05- 143 T1806). Kaksi ikuisti ihmisen munasarjan pintaan epiteelisolujen käytettiin: HOSE 10-2 ja LETKU 17-1 (ystävällisesti professori George Tsao, The University of Hong Kong) [13]. Kuolemattomaksi ihmisen oviduktaalisessa epiteelisolujen linja, OE-E6 /E7, saatiin tri Calvin Lee (The University of Hong Kong) [14]. Yhdeksän munasarjasyövän solulinjoissa käytettiin: OV2008, C13 *, A2780s, A2780cp (ystävällisesti professori Benjamin Tsang, University of Ottawa) [13], [15], OV420, OV429, OV433, OVCAR3, SKOV-3, TOV21G , hiiren fibroblasti Wnt3a L-solut ja ihmisen sikiön munuaisen 293-solut (HEK 293) (America Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Kaikkia solulinjoja viljeltiin joko vähintään essential medium tai Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä 75 cm

2 pulloissa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Plasmidit ja solujen transfektio

PCI

HA-PITX2A

ekspressoivat plasmidia (lahja tri Kathy Kozlowski, University of Michigan) käytettiin ektooppinen ilmentyminen HA-merkityn PITX2A. Plasmidi sisältää täyspitkä ihmisen

PITX2A

cDNA ja sen ilmentymistä ohjaa CMV-promoottori. PCI vektoria käytettiin negatiivisena kontrollina. HuSHpGFP-V-RS-plasmidivektoriin ja lyhyen hiusneulan RNA-interferenssi (shRNA) kohdistaminen

PITX2

in pGFP-V-RS-vektoriin (pGFP-V-RS-

PITX2

) hankittiin Origene Technologies (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD, USA). ShRNA sekvenssi kohdistaminen

PITX2

oli 5 ’GCC GTT GAA TGT CTC TTC TCC AAA GAC TC 3’.Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) käytettiin solujen transfektioon mukaan valmistajan ohjeet. Vakaa solut yli-ilmentävät PITX2A tai knockdovvn PITX2 kerättiin sen jälkeen, kun 14 päivää puromysiiniä (1 ug /ml) valinta ja varmistettiin Western blot -analyysillä.

RNA ja käänteistranskriptaasi-PCR: llä

Kokonais-RNA peräisin kliinisistä näytteistä, ja viljellyt solut eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen). CDNA valmistettiin käyttäen Käänteinen transkriptio reagenssipakkauksen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Määrällinen käänteistranskriptaasi-PCR (Q-PCR) arviointiin käytetyt ilmaukset

PITX2

,

sykliini-D1

ja

C-myc

suoritettiin Taqman® Gene ilmaisu määritykset; ihmisen

PITX2

(määritys ID: Hs00165626_m1), ihmisen

sykliini-D1

(määritys ID: Hs00765553_m1) ja ihmisen

C-myc

(määritys ID: Hs00153408_m1), vuonna ABI PRISM ™ 7500 järjestelmän (Applied Biosystems). Ihmisen

18S rRNA

(määritys ID: Hs99999901_m1) käytettiin sisäisenä kontrollina.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin hajotuspuskuriin (Cell Signaling Technology), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorin (Sigma) ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). Proteiini Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin päälle Hybond-P -kalvoille (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, USA). Blotit blokattiin kuoritun maidon 5%, jonka jälkeen inkuboitiin PITX2 (C16) ja C-Myc (N262) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), sykliini-D1 ja β-kateniinin (Cell Signaling ), anti-HA ja β-aktiini (Sigma) yli yön 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin sitten anti-hiiri-anti-kani (Amersham Pharmacia Biotechnology) ja anti-vuohi (Santa Cruz) sekundääriset vasta-aineet konjugoida piparjuuriperoksidaasiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja visualisoitiin käyttäen ECL ™ Western Blotting Detection Reagent (Amersham).

immunohistokemiallinen analyysi, kaksi kaupallista munasarjasyöpä kudosmatriisien (OVC1021 ja OVC481, Pantomics Inc, San Francisco, CA), immunovärjättiin primääristen kanin polyklonaalista anti-PITX2-vasta-aine (AbcamInc, Cambridge, MA, USA) 1 :200 laimennus. Värjättyjen osassa todettiin positiivinen tai negatiivinen. Niille immuno-positiivista näytettä, intensiteetti värjäyksen (+1, heikko, +2 kohtuullinen, +3 vahva ja +4 erittäin vahva) ja osuus värjätään alue (0-100%) pisteytettiin. Immunoreaktiivisuus määritettiin kummankin näytteen kertomalla intensiteetti ja prosenttiosuus värjätään alueella. Keskiarvo immunoreaktiivisuus arvo normaali ja rajatapausten normalisointiin käytettiin kaikissa tapauksissa. Kaikki kudosta osassa tutkittiin ja teki itsenäisesti kaksi tutkijaa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus analysoitiin solujen lisääntymistä kit (XTT) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) valmistajan ohjeen. Jokainen näyte suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja kolmen erillisen kokeen tehtiin.

Soft-agar määritys

yhteensä 1 x 10

4-soluja valmistettiin 1,5 ml koko alustalla, joka sisälsi 0,6% agaroosi. Seokset lisätään päälle kiinteytyi pohjaan, joka sisältää 1% agaria 2 ml täyttä väliaineen. Elinkelpoiset pesäkkeet laskettiin ja valokuvattiin jälkeen 14-36 päivää. Koe suoritettiin kolmena kappaleena ja suoritetaan kolme kertaa itsenäisesti.

haavan paranemiseen määritys

Solut ympättiin kuudella kuoppalevyllä kunnes se saavutti täyden konfluoitumiseen yksikerroksinen. Seuraavaksi kunkin kaivon alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi mitomysiini C (10 ug /ml) (Sigma) ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C.A yksi haava luotiin keskelle kunkin kuopan käyttäen mikro-pipetin kärjen. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kuva haavan otettiin eri ajanjaksoista. Suhteellinen maahanmuuttoluku ilmaistiin suhteellisena leveys haavoja /aika. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

TranswellTM solumigraatioon ja invaasiomääritys

kvantifiointi solumigraation ja invaasiota suoritettiin käyttämällä QCM ™ 24-Well Kolorimetrinen Cell Migration määritys (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) ja Cell Invasion Assay Kit (Chemicon International, Temecula, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Kolme eri aloilla värjätyt solut valokuvattiin ja laskettiin kunkin kaivoja. Kokeet suoritettiin kolmesti itsenäisesti.

In vivo

ksenograftimallissa

Sen tutkimiseksi, PITX2 yliekspressio edistää kasvaimen kasvua

in vivo

, PITX2 vakaasti yliekspressoitu SKOV-3-soluja injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Halkaisija kasvaimen mitattiin kolmen päivän välein ja hiiret karhittava kuukauden kuluttua injektiosta. Kasvaimen tilavuus laskettiin (keskiarvo halkaisijat)

3 x π /6. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin University of Hong Kong komitea elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa (CULATR nro 2053-09).

Tietojen analysointi

Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Opiskelijan

t

-testi käytettiin analyysiin parametritietoja.

P

-arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi kaikissa kokeessa.

Tulokset

UpregulatedPITX2 havaitaan munasarjasyöpäsoluja

Huolimatta toimintojen ja PITX2 alkionkehityksen aikana on tutkittu laajasti, toiminnalliset roolit PITX2 ihmisen syövissä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Täällä arvioimme ilmaus tilan

PITX2

munasarjasyövän näytteistä (n = 97), normaali munasarjat (n = 54), normaali munasarjojen solulinjojen kaksi letkua (HOSE 10-2 ja HOSE 17-1 ) ja yksi ikuisti ihmisen oviduktaalisessa epiteelisolulinja (OE-E6 /E7) Q-PCR: llä. Huomasimme, että

PITX2

merkittävästi yläreguloituja munasarjasyövän näytteistä (-15 taittuu) verrattuna normaaliin munasarjat ja munasarjojen solulinjoissa (

P

0,001) (kuvio 1A). Kliinis korrelaatio osoitti, että yli-ilmentynyt

PITX2

oli huomattavan liittyy korkea-asteen (aste 3) (

P

= 0,023) ja selkeä solujen alatyypin munasarjasyöpään (

P

= 0,011) (taulukko 1). Kuitenkaan ollut merkittävää yhteyttä välillä yli-ilmentynyt

PITX2

ja muita parametrejä, kuten ikä, vaihe ja toistuminen (taulukko 1). Lisäksi Western blot-analyysi suoritettiin myös verrata ilmentymisen PITX2 paneelissa ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ja normaali munasarjojen pinnan epiteeli (letkut) soluja. Verrattuna Letkut solulinjojen, yleinen kasvu PITX2 ekspressio havaittiin kaikissa munasarjasyövän solulinjoissa (kuvio 1 B). Lisäksi meidän Western blot tiedot osoittivat myös, että PITX2 oli ilmeisesti yliaktiivista selvällä solussa alatyypin munasarjasyövän solulinja (TOV21G) verrattuna OE-E6 /E7 (kuvio S1A), immortalisoidut normaali munanjohdin epiteelisolujen linja. Tämä tulos edelleen vahvistaa edellä kliinis havainnot. Arvioitava edelleen proteiinin tasoa PITX2 munasarjasyövän näytteiden immunohistokemiallinen värjäytyminen PITX2 suoritettiin munasarjasyöpäsolu kudoksen array (OVC481), joka sisältää 16 tapausta munasarjasyövän näytteiden pariksi normaalin munasarjat. Yhdenmukainen Q-PCR havaintojen lisääntynyt ilmentyminen PITX2 oli yleensä todetaan munasarjasyövän näytteistä erityisen korkealaatuista tai erilaistumaton kasvaimissa verrattuna niiden vastaavien uninvolved normaalin munasarjan kudoksissa (kuvio S1B). Lisäksi tutkimme ilmaus PITX2 isompi allas munasarjasyöpään näytteitä käyttämällä toista kaupallista munasarjasyöpä kudoksen array (OVC1021), joka sisältää 2 normaali, 2 hyvänlaatuinen, 1 rajatapaus cystademoma ja 97 pahanlaatuinen kasvain näytteissä. Meidän havainto osoitti, että voimistunut PITX2 korreloi merkitsevästi korkealaatuisesta munasarjakasvain vain (

P

0,001) ja oli yhdenmukainen tulos Q-PCR-analyysi (taulukko 2).

(A) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin normaalissa munasarjat (n = 54) ja munasarjasyöpä näytteitä (n = 97) käyttäen

PITX2

spesifistä aluketta. 18S ja TATA-box sitovan proteiinin (TBP) käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. *

P

0,001. (B) Western blot analyysillä käyttäen anti-PITX2 vasta-aineen arvioimiseksi eks- PITX2 (isoformeja A, B ja C)) (35 kDa), munasarjasyövän solulinjoissa (n = 9) ja HOSE solulinjat (n = 2) . β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) immunohistokemiallinen analyysi PITX2 ilmaisun (tumavärjäystä) rajatapauksissa cystadenoma ja korkea-asteen (3) serous kystadenokarsinooma koskevasta munasarjasyöpä kudoksen array (OVC1021). Suurennus: 20 ×.

PITX2 lisää solujen kasvua munasarjasyöpäsoluja

Koska voimistunut PITX2 liittyi korkea-asteen munasarjasyöpä, PITX2 voi hallussaan onkogeeninen toiminnot välittämisessä aggressiivinen fenotyypin munasarjasyöpäsoluja. Testata tätä käsitettä, ensin luotu PITX2 vakaa ilmentävien kloonien kahdesta korkealaatuisesta munasarjasyövän solulinjoissa (SKOV3 ja OVCA433) (kuvio 2A). Toisaalta, toinen korkean luokan munasarjasyövän solulinjoissa PITX2-korkea ekspressio (OV2008), sekä OVCA433 valittiin stabiileja knockdovvn PITX2 käyttäen vektori-RNAi lähestymistapaa. Neljä shRNA-konstruktit kohdistaminen eri sivustoja PITX2 avoimen lukukehyksen transfektoitiin lyhytaikaisesti soluihin vastaavasti ja kaksi niistä (K1 ja K2) saatiin 50-70%: n vähennys endogeenisen PITX2 valittiin stabiilin transfektion (kuvio 2B). XTT-solujen lisääntymisen määrityksessä, suhteellinen kasvunopeus PITX2 stabiilisti ilmentäviä klooneja SKOV3- ja OVCA433 soluissa oli merkittävästi suurempi (1,5- 3-kertainen) kuin vektori kontrolleihin (kuvio 2C). Päinvastaisessa, ehtyminen PITX2 vuonna OV2008 ja OVCA433 solut merkittävästi heikentynyt niiden solujen lisääntymistä korkoa 2- ja 3-kertainen verrattuna niiden sekoitetun ohjaimet (kuvio 2D).

(A) PITX2A stabiili ilmentäviä klooneja vahvistettiin in SKOV3- ja OVCA433 soluja. Western blot-analyysi käyttämällä anti-HA-vasta-aine osoitti ekspressiotasot HA-merkitty PITX2A C4 ja C5 klooneja SKOV-3, ja C33 ja C34 klooneja OVCA 433. β-aktiini käytettiin loading ohjaus. (B) Western blot-analyysi käyttäen anti-PITX2 vasta-aine osoitti alennettua ilmaisuja endogeenisen PITX2 vakaassa Knockdown kloonien tuottaman 2 shRNA rakentaa (K1 ja K2). Salattu on epäspesifinen shRNA ohjaus. Numeerinen yksiköt edustavat suhteellista ilmauksia PITX2 vähenemiseen kaikissa vakaa klooni verrattuna salattu valvontaa. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) ektooppinen ilmentyminen PITX2A stimuloi soluproliferaatiota in munasarjasyöpäsoluja. Sekä C4 ja C5 SKOV-3-solut osoittivat 1,5- kertainen nousu solujen kasvun (*

P

0,05), C33 ja C34 sekä OVCA 433 solua oli 3- kertainen nousu solujen kasvun (**

P

0,01) verrattuna niiden vektorisäädön. (D) väheneminen endogeenisten PITX2 vähennetään soluproliferaatiota munasarjasyöpäsoluja. 3- 4- kertainen vähennys solujen elinkelpoisuuden sekä taintumisen klooneja (K1 ja K2) on OV2008 solujen (**

P

0,01) ja 2- 3- kertainen pieneneminen soluproliferaatioon in taintumisen klooneja (K1 ja K2) on OVCA 433 soluja (*

P

0,05) havaittiin.

lisäksi täytäntöön ilmaus PITX2 lisääntyi paitsi koon, myös pesäkkeiden määrä vuonna OVCA433 ja SKOV3- soluissa 2-kertaiseksi (

P

0,05) ja 8-kertainen (P 0,01) (kuvio 3A). Sen sijaan, ehtyminen PITX2 vähensi sekä koko ja pesäkkeiden lukumäärä on OV2008 ja OVCA433 solujen 2,6-kertainen 5-kertainen (

P

0,01) vastaavasti verrattuna niiden sekoitetun ohjaus (kuvio 3B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että säätelyä PITX2 voisi edistää solujen kasvua munasarjasyöpäsoluja ja tukea onkogeeninen roolit PITX2 korkealaatuista munasarjatuumorissa.

(A) pakotettu ilmentymä PITX2A parannettu kiinnityspisteen riippumattomaan kasvuun kyky munasarjasyöpä soluja. Pylväskaaviosta näkyy, että PITX2A stabiilisti ilmentäviä klooneja (C33 ja C34) sekä OVCA 433 (**

P

= 0,05) ja (C4 ja C5) on SKOV-3 (*

P

= 0.01) oli lisääntynyt pesäkkeiden määrä pehmeässä agarissa verrattuna niiden vektorin valvontaa. Edustavia kuvissa suurempia pesäkkeitä koko PITX2A vakaa ilmentävien kloonien alla mikroskoopilla. (B) ehtyminen PITX2 mukaan shRNA esti ankkurointi riippumaton kasvu kyky munasarjasyöpä soluja. Pesäkkeiden lukumäärä vuonna PITX2stable taintumisen klooneja (K1 ja K2) sekä OVCA 433 ja OV2008 verrokkeja vähennys verrattuna salattu säätimet (*

P

0,01). Edustavia kuvia osoittaa, että alennettu siirtomaa koko PITX2stableknockdown kloonien ja niiden sekoitetun valvontaa. Edellä koe toistettiin ainakin kolme kertaa itsenäisesti ja tiedot laskettiin keskiarvo ± SD.

PITX2 tehostaa Solujen migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PITX2 voi laukaista hermosolun muuttoliikkeen kehittämisen aikana hiiren hypotalamuksen [16], mikä osoittaa, että PITX2 hallussaan solu vaeltavia edistää kapasiteettia. Täällä, yritimme tutkia PITX2 annetaan rooli Solujen migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja. Ensin suoritettiin haavan paranemiseen määritys tutkia PITX2 voisi edistää solujen vaeltamiseen. Käsittelemällä mitomysiini C jättää tekijä lisääntyneen solukasvun, havaitsimme, että täytäntöön ilmentyminen PITX2in SKOV3- solujen osoitti nopeampaa haavan nopeudella kuin vektorisäätö (kuvio 4A). Kääntäen, knockdown endogeenisen PITX2 vuonna OVCA433 soluissa vähensi huomattavasti solumigraatiota verrattuna vuoteen haavan paranemista mitattuna (

P

0,05) (kuvio 4B). Lisäksi, TranswellTM muuttoliike ja invaasio määritykset, osoitimme oli 2- 3-kertaiseksi (

P

0,01) ja 0.8- 1,5-kertaiseksi (

P

= 0,04 ja 0,01 ) lisäävät solujen maahanmuuttoluku ja invaasion korko vastaavasti PITX2 vakaa ilmentävien kloonien (C4 ja C5) verrattuna vektorin valvontaa SKOV3- soluja (kuvio 4C). Sen sijaan numerot solun lävistää kalvon TranswellTM migraatiokokeessa ja tunkeutuu läpi Matrigel in TranswellTM invaasiomääritys vähensi merkittävästi PITX2 vakaa taintumisen klooneja (K1 ja K2) verrattuna salattu valvonta OVCA433 (

P

0,01) (kuvio 4D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PITX2 hallussaan kyky edistää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen munasarjasyöpäsoluja.

(A) Haavan paranemista testi osoitti, että PITX2 stabiilisti ilmentäviä soluja (C4 SKOV-3) osoitti nopeammin haavan nopeudella kuin vektori valvonta ajankul- 8 tuntia (**

P

0,05). (B) PITX2 vakaa taintumisen klooneja (K1 ja K2 OVCA 433) osoitti merkittävää vähennystä haavan nopeudella verrattuna vektorisäädön aika aikana 12 tuntia (*

P

0,05). Nuolet osoittavat leveys haavan ja solujen suhteellisen muuttoliike on ilmaistu suhteellinen leveys haavoja /aika. Määritys toistettiin kolme kertaa itsenäisesti. (C) TranswellTM maahanmuutto ja invaasiomääritys osoittaneet PITX2 ilmentävät stabiilisti klooneja SKOV3 (C4 ja C5) solut vaeltavat nopeammin kalvon läpi (*

P 0,01

) ja hyökätä nopeammin läpi matrigeelin (C4, *

P

= 0,04 ja C5, **

P

= 0,01) verrattuna vektorin ohjaus. (D) PITX2 vakaa taintumisen klooni (K2 OVCA 433) osoitti merkittävää vähenemistä solupenetraatio kalvojen läpi ja solun invasiivisuuden verrattuna salattu säätimet (**

P

= 0,01). Kolme näkemyksiä poimittiin satunnaisesti kussakin insertit ja numerot hyökkäsi solujen laskettiin. Tulokset kolmen erillisen kokeen piirrettiin kanssa virhepalkin.

PITX2 säätelee sykliini-D1 ja C-myc in munasarjasyöpäsoluja

sykliini-D1 ja C-myc kaksi ratkaisevaa sääntelyviranomaisten edistää solujen lisääntymistä [17]. Puuttumaan onko PITX2 säätelee näiden geenien edistämisessä solujen kasvua munasarjasyöpäsoluja, me ensin suoritetaan Q-PCR-analyysi ja osoitti, että siellä oli 2-12 taittuu nousu ilmauksia

sykliini-D1

ja

C Myc

in PITX2, jotka ilmentävät stabiilisti munasarjasyöpäsoluja (kuvio 5A). Lisäksi Western blot-analyysi osoitti myös, että sekä sykliini-D1 ja C-myc-kohonnut ainakin 60% PITX2, jotka ilmentävät stabiilisti munasarjasyöpäsoluja (kuvio 5B). Toisaalta, knockdovvn PITX2 vähensi huomattavasti ilmaisuja sykliini-D1 ja C-myc vähintään 20% verrattuna niiden sekoitetun valvontaa OVCA 433 ja OV2008-soluissa (kuvio 5C) .Nämä tulokset osoittavat, että PITX2 voi sää- dellä sykliini-D1 ja C- myc edistää solukasvua munasarjasyöpä soluja.

(A) Q-PCR-analyysi paljasti, että tasot

sykliini-D1

ja

C-myc

kohosivat PITX2A stabiilisti ilmentäviä klooneja (C4, C5 SKOV-3 ja C33, C34 ja OVCA 433). (B) Western blot-analyysi osoitti, että proteiini tasot sykliini-D1 ja C-myc korotettiin PITX2 on PITX2A stabiilisti ilmentävät kloonit (C4, C5 SKOV-3 ja C33, C34 ja OVCA 433). (C) knockdovvn PITX2 merkittävästi vähensivät sykliini-D1 ja C-myc in PITX2 pudotus vakaa klooneja (C6, C8 OVCA 433 ja C1, C4 OV2008). Tasot HA-tagged PITX2A todettiin käyttäen anti-HA-vasta, kun taas endogeeniset PITX2 ilmentymistä tutkittiin anti-PITX2 vasta-β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Lukuarvo alla paneeli edustaa suhteellista ilmentymistä sykliini-D1 ja C-myc niiden vektorin valvontaa.

PITX2 edistää

in vivo

kasvaimen kasvua munasarjasyöpäsoluja

lisäksi

in vitro

tuumorigeenisia tutkimukset PITX2, yritimme selvittää yliekspressio PITX2 voisi parantaa kasvaimen kykyä kasvaa vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Kaksi PITX2 vakaa ilmentävien kloonien (C4 ja C5) ja vektori valvonta SKOV3 inokuloitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Sen jälkeen 36 päivään havaitsimme, että sekä stabiileja klooneja PITX2 yliekspressio oli 2,5-3-kertainen nousu intumor kasvu verrattuna vektorisäätö (

P

0,01) (kuvio 6A 6B). Western blot analyysi leikeltiin tuumorikudoksista kerättiin päivänä 36 osoittivat, että molemmat PITX2 vakaa ilmentävien kloonien (C4 ja C5) on SKOV3 ilmaistuna korkea PITX2 ja samanaikainen kohonnut ilmauksia sykliini-D1 ja C-myc (kuvio 6C). Tämä tulos on yhdenmukainen

in vitro

tuumorigeenisiä tiedot ja tukee lisäksi, että PITX2 voisi edistää kasvaimen kasvua ylössäätely sykliini-D1 ja C-myc.

(A) PITX2 stabiilisti ilmentäviä klooneja SKOV3 (C4 ja C5) osoitti nopeampaa kasvaimen kasvua nude-hiirissä verrattuna vektorin ohjaus. Kasvaimen koko edusti keskiarvoa ± SE Viiden hiiren ja mitattiin 36 päivää. *,

P

0,01, merkitsevästi erilainen vektori kontrolliryhmään. (B) Valokuva esittää leikeltiin kasvainten otettu nude-hiiriin ihon alle pistoksena kahdella PITX2 vakaata ilmentävien kloonien SKOV3 (C4 ja C5) ja vektorisäätö päivänä 36 (C) Western blot-analyysi osoitti ilmauksia PITX2, sykliini-D1 ja C-myc-hiiristä ihonalainen kasvain kudoksissa. Lukuarvo alla paneeli edustaa suhteellista ilmentymistä sykliini-D1 ja C-myc niiden vektorin valvontaa.

PITX2 säätelee Wnt /β-kateniinin itsenäisesti munasarjasyöpäsoluja

Aiemmat raportit ovat dokumentoineet, että PITX2 on loppupään välittäjä Wnt /β-kateniinin reitin [12], [18]. Siksi olimme kiinnostuneita tutkimaan, onko säätelyä PITX2 johtuu aktivoida Wnt /β-kateniinin. Käsittelemällä GSK3p: n inhibiittori (litiumkloridia), olemme havainneet, että Wnt /β-kateniinin aktiivisuus on aktivoitu kautta lisääntyneen ekspression β-kateniinin annoksesta riippuvalla tavalla OVCA433 ja A2780cp soluja. Oli kuitenkin vain vähän tai ei ollenkaan muutosta PITX2 ilmaisun molemmissa solulinjoissa (kuvio S2A). Samoin kun hoito Wnt3A kunnossa välineellä sekä A2780cp ja OVCA 433-solut osoittivat ei- itsestäänselvä noustua Wnt /β-kateniinin aktiivisuutta (kuvio S2B). Nämä havainnot osoittavat, että säätelyä PITX2 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja ei säätelee pääasiassa Wnt /β-kateniinin signaloinnin mutta ehkä muut molekyylitason mekanismeja.

Keskustelu

Kasvaimen eteneminen on moni- prosessi, joka etenee syöpä olla enemmän pahanlaatuinen ja aggressiivinen fenotyyppiin [19]. Korkea-asteen kasvain edustaa kehittyneempää etenemistä jolla korkeampia soluproliferatiivisen ja invasiivisuus valmiudet [20]. Tässä tutkimuksessa olemme ensinnäkin osoittaneet, että PITX2 oli usein yläreguloituja munasarjasyöpiä etenkin korkea-asteen ja selkeä solujen alatyypin munasarjasyöpään käyttämällä Q-PCR, Western blot ja IHC analyysejä. Vielä tärkeämpää on, me osoitettu kasvaimia synnyttävän roolia PITX2 hallussaan soluproliferaatioon ankkurista riippumaton kasvu kyky, solumigraatio /invaasio, sekä kasvaimen kasvu on -tuumoriksenografti hiirimallissa.

Mukaan FIGO luokittelu luokittelu, korkealaatuisesta munasarjojen kasvainsolut ovat yleensä huonosti histologisia eriytetty [20], kasvavat nopeammin ja erittäin metastaattinen [7]. Lisäksi ennustetta korkealaatuisesta munasarjojen kasvain on huono jälkeen se usein assosioituu huono pysyvyys [21], [22] kantavassa selkeä solujen alatyyppiä munasarjasyövän muodostaa noin 6% kaikista epiteelin munasarjojen kasvaimia ja useimmiten tämän alatyypin ovat korkealaatuisia kasvain näytteille aggressiivista fenotyyppi [3], [22], [23]. Tutkimuksemme osoitti, että sekä mRNA ja proteiini tasoilla PITX2 oli usein yläreguloituja munasarjasyövän erityisesti korkea-asteen ja selkeä solualatyyppien, mikä osoittaa, että PITX2may tärkeä rooli ajo aggressiivinen fenotyyppejä munasarjasyöpä.

PITX2 on homeodomeenin transkriptiotekijä, joka on keskeinen rooli alkion kehitykseen, kuten maksan, hematopoieesin, sukurauhasten ja hermosolujen erilaistumista jne [24], [25], [26]. Viime aikoina on kasvanut raportit osoittavat, että PITX2 yli-ilmentyy ihmisen syövissä, kuten funktionaalinen Aivolisäkekasvainten [10], Wilmsin kasvain [27] ja paikallisiin imusolmukkeisiin kolorektaalisyöpä [11]. Kuitenkin toiminnalliset roolit PITX2 ihmisen syövissä, kuten munasarjasyövän, ei tunneta. Jotta paljastaa toiminnalliset roolit PITX2 munasarjasyövän, me syntyy voitto tai lakkaa toimimasta PITX2 korkealaatuista munasarjasyöpäsolu malleja ja suorittaa useita

in vitro

ja

in vivo

tuumorigeenistä määrityksiä osalta vaikutus PITX2 kasvaimen solujen kasvua ja etäpesäkkeitä. Tutkimuksemme osoitti, että täytäntöön ilmentyminen PITX2 voitaisiin parantaa huomattavasti solujen lisääntymistä, ankkurointi riippumaton kykyä kasvaa, solumigraatio /invaasio ja kasvainten kasvua munasarjasyöpäsoluja hiiren ksenografti- kasvain malli. Toisaalta ehtyminen PITX2 jonka shRNA heikentynyt edellä tuumorigeenisiä fenotyyppejä korkealaatuisesta munasarjasyöpäsolu malleja. Yhdessä meidän havaintojen mukaan onkogeeninen toiminnot hallussa PITX2 yksinomaan löytyy korkealaatuisesta munasarjasyöpä ja ovat sopusoinnussa kliinis analyysin että yli-ilmentynyt PITX2 läheisesti korreloi korkealaatuisesta munasarjasyöpään.

aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PITX2 nostaa solusyklin sääntelyn tekijät, kuten sykliini-D1,-D2 ja C-myc edistää solutyyppispesifisten lisääntymistä hiiren aivolisäkkeen ja myoblas- solulinjat [18], [28], [29], [30 ]. Lisäksi biokemialliset tutkimukset kuvattu että PITX2 sitoutumiskohdat sijaitsevat pitkin promoottorialueet

sykliini-D1

, –

D2

ja

C-myc

, mikä viittaa siihen, että nämä geenit ovat suoria transkriptio tavoitteita PITX2 [18], [28], [29], [30], [31], [32]. Lisäksi aktivointi onkogeenien, kuten sykliini-D1 ja C-myc voitaisiin lisätä ankkurista riippumaton kasvu hiiren maitorauhasen epiteelisoluissa päälle ja kasvaimen kasvua vaikea sekamuotoinen immuunivajavuus (SCID) hiiriä [17].