Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eksosomit ovat 30-150nM kalvoon sitoutunut erittyy rakkulat, jotka ovat helppo eristää biologisista nesteistä kuten virtsasta (UE). Eksosomit sisältävät proteiineja, mikro-RNA (miRNA), lähetti-RNA (mRNA), ja pitkän ei-koodaavat RNA (lncRNA) niiden solujen alkuperä. Vaikka miRNA, proteiinia ja lncRNA on eristetty seerumista mahdollisina biomarkkereita hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset tauti, ei tiedetä, lncRNAs sisään UE välillä urothelial virtsarakon syöpä (UBC) potilaat voivat toimia biomarkkereita. lncRNAs ovat 200 nukleotidin pitkä selostukset, jotka eivät koodaa proteiinia ja kriittisiä rooleja tuumoribiologiassa. Kuten määrä tunnustettu kasvaimeen liittyvien lncRNAs kasvaa edelleen, on yhdensuuntainen tarpeen sisällyttää lncRNAs osaksi biomarkkereiden löytö ja terapeuttinen kohde algoritmeja. LncRNA HOX transkripti antisense-RNA (hotair) on osoitettu helpottavan kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen ja liittyy huonoon ennusteeseen useissa syövissä. Tärkeys hotair syöpäbiologiassa on herättänyt kiinnostusta käyttää hotair biomarkkerina ja potentiaalinen terapeuttinen kohde. Tässä näytämme hotair ja useita kasvaimeen liittyvien lncRNAs rikastuvat UE välillä UBC potilailla, joilla on korkea-asteen lihas-invasiivisen sairauden (HGMI pT2-pT4). Knockdovvn hotair vuonna UBC solulinjoissa vähentää

in vitro

muuttoliikettä ja invaasiota. Tärkeää on, menetys hotair ilmentymisen UBC solulinjoissa muuttaa ilmaus epiteelisolujen-to-mesenchyme siirtyminen (EMT) geenejä, mukaan lukien SNAI1, TWIST1, ZEB1, ZO1, MMP-1 LAMB3, ja LAMC2. Lopuksi, käytimme RNA-sekvensointi tunnistaa neljä uutta lncRNAs rikastunut UBC potilaan UE. Nämä tiedot viittaavat siihen, että UE-johdettu lncRNA saattavat toimia biomarkkereita ja terapeuttisina kohteina.

Citation: Berrondo C, pellava J, Kucherov V, Siebert A, Osinski T, Rosenberg A, et al. (2016) Expression of Long koodaamattoman RNA hotair korreloi taudin eteneminen on Virtsarakon syövän ja sisältyy virtsarakkosyöpäpotilaan Virtsan Eksosomit. PLoS ONE 11 (1): e0147236. doi: 10,1371 /journal.pone.0147236

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 12 lokakuu 2015; Hyväksytty: 30 joulukuu 2015; Julkaistu: 22 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Berrondo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: CTSI yliopistossa Rochester 5UL1TR000042-09.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

lncRNAs ovat kopioita, jotka ovat 5 ’7-methylguanosine rajattu ja joko poly-adenyloidut tai unadenylated ja ovat 200 nukleotidin pituinen. Kun katsotaan genomista melu, lncRNA ovat osoittautuneet olevan tärkeitä välittäjiä normaalin solun prosessit mukaan lukien, kehityksen painamista, annostus korvaus, ja solujen erilaistumista sekä tehtäviä kypsiä soluja, kuten valvonta liitos ja hormoni sääntelyä [1,2]. Dysregulaatio lncRNA ilmentymisen on osoitettu olevan tärkeä pahanlaatuinen prosesseja, kuten syövän etenemistä [3-6].

With transcriptome laajuinen RNA-sekvensoinnilla (RNA-kohdat) löytö lncRNAs on lisääntynyt merkittävästi. Äskettäin Iyer

et al

sovellettu

ab initio

kokoonpano RNA-sekvensointi (RNA-seq) kirjastot useista kasvaimista paljastaa tuhansia linjaa ja syöpään liittyvien lncRNAs korostumisena lukien lncRNA osaksi biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde löytö algoritmit [7].

Yksi erinomainen lähde biomarkkereiden löytö on eksosomeiksi. Eksosomit ovat 30-150nM kalvoon sitoutunut erittyy rakkulat että helposti puhdistettavien soluviljelymediumeista ja biologiset nesteet kuten seerumi, vatsaonteloneste ja virtsa (UE) [8-14]. Eksosomit osallistuvat solujen väliseen viestintään toimittamalla proteiineja, miRNA, mRNA, ja lncRNA vastaanottajalle soluihin [15,16].

On syntymässä näyttöä siitä, että transkriptin pakkauksen eksosomeiksi ei ole stokastinen ja voi luottaa allekirjoitus motiiveja ja toissijainen rakenne. [17-20]. Lisäksi onkogeeninen signalointi kuten KRAS johtaa valikoivaan pakkaamisessa miRNA osaksi eksosomeiksi, mikä osoittaa, että solutransformaatioon voi tuottaa syöpää erityinen eksosomi profiilin, joka voisi toimia biomarkkereina [21].

On huomattava, kvantitatiivinen vertailuja tuottajan solujen vs. eksosomeiksi osoittavat, että eksosomeiksi ovat huomattavasti köyhdytetty mRNA mutta rikastettu lncRNA [18-20]. Lisäksi lncRNAs osoittavat suurempaa spesifisyyttä proteiinia koodaavan mRNA biomarkkereina syöpä [22]. Koska lncRNA rikastuvat eksosomeiksi ja näyttelytila ​​syöpä spesifisyys ne ovat houkuttelevia ehdokkaita biomarkkereiden löytö.

Useat ryhmät ovat osoittaneet, että miRNA, mRNA ja proteiini seerumiperäisiä (SE) ja virtsan eksosomeiksi (UE) voi toimia biomarkkereita sekä hyvän- että pahanlaatuisia taudin [23-36]. Olemme esimerkiksi aiemmin tunnistettu, epidermaalisen kasvutekijän kaltaisen toistoja ja discoidin I: n kaltaiset domeenit 3 (EDIL-3) proteiinin eksosomeiksi alkaen urothelial virtsarakon syöpä (UBC) solulinjojen ja UE eristetty UBC potilailla, joilla on korkea-asteen lihas invasiivisia kasvaimet (HGMI pT2-pT4) [34,37].

eturauhasen ja UBC liittyviä lncRNAs on eristetty mitätöity soluista tai vapaasti kelluvana virtsaan, ja useat ryhmät ovat tunnistettu lncRNA UE eturauhassyöpään potilaista [28, 38,39]. Ei kuitenkaan julkaistuissa tutkimuksissa on osoitettu, että UBC UE-johdettu lncRNAs voi toimia biomarkkereita [28,38,39]. Yksi hyöty käyttämällä UE on, että eksosomi kalvo suojaa sisältöä proteaaseista ja RNAaseja, jotka ovat läsnä virtsassa [40]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ensisijainen UBC kasvaimet sisältävät ainutlaatuisia lncRNA siksi pyrimme vallata lncRNA UE UBC potilaalla on HGMI tauti [7]. Tärkeä jäsen luokan kasvaimeen liittyvien lncRNAs on hotair, joka on yli-ilmentynyt, jopa 2000-kertaisesti rintasyövän potilaiden kasvaimissa verrattuna normaaliin kudokseen [3]. Hotair yli-ilmentyminen liittyy myös lisääntynyt invasiivisuus ja huonon ennusteen [3,41]. Tärkeää on, hotair on osoitettu säätelevän useiden geenien mukana epiteelin-to-mesenchyme siirtyminen (EMT) mukaan lukien Snail perheen sinkkisormen 1 (SNAI1), laminiini, beta 3 (LAMB3), laminiini, gamma 2 (LAMC2), liitosadheesiomolekyyliin molekyylin 2 (JAM2) ja ABL esikasvaintekijän 2 (ABL2) [3,42-44].

tärkeys hotair vuonna UBC alkaa tulla valoa läpi useat viimeaikaiset tutkimukset. Esimerkiksi Yan

et al

. osoittaneet, että kohonnut ilmentyminen hotair ennustaa laadukkaat ei-lihas- invasiivisia UBC (NMIBC) toistuminen [45]. He myös suorittaa

In vitro

tutkimukset osoittavat, että hotair osallistuu maahanmuutto- ja invaasion ja tukahduttamisesta kanonisen Wnt-reitin antagonistiproteiini WIF-1 [45].

Martinez-Fernandez

et al

. tutki mahdollisuutta, että hotair ilmaisu voisi olla ennustetyövälineenä merkki taudin uusiutumisen NMIBC [46]. He osoittivat, että potilailla, joilla on korkeampi hotair ilmentymisen oli myös aiemmin taudin uusiutumisesta. Lisäksi ne osoittavat, että Enhancer of Zeste 2 Polycomb Tukahduttamistoimet Complex 2-alayksikkö (EZH2) säätelee ilmentymistä hotair. Lopuksi he käytetty Cancer Genomic Atlas (TCGA) tietokokonaisuus virtsarakon syövän osoittaa, että hotair ilmentyminen korreloi vaiheessa UBC kaikkein invasiivisia T4 kasvaimet, joissa on korkein hotair ilmaisua.

Toisessa tutkimuksessa Sun

et al

. osoittivat, että miR-205 on tärkeää lisäkasvun estäminen, siirtolaisuuden ja hyökkäys UBC solulinjoissa. Ne tunnistaa solusyklin sääntelyn geeni sykliini J (CCNJ) uutena kohteena miR-205. Mikä tärkeintä, he osoittivat, että hotair osallistuu vaiennettaisi miR-205 ilmentymisen UBC soluihin epigeneettisellä asetuksella [47].

Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat hotair näyttelee kriittistä rooleja UBC. Kun otetaan huomioon hotair kasvaimen etenemistä on lisääntynyt kiinnostus käyttää hotair biomarkkerina sekä terapeuttisena kohteena syövissä, joissa hotair on poikkeavasti ilmaistaan ​​[2,48,49]. Tärkeää on, joilla on ei-invasiivisia tapa havaita hotair syöpäpotilailla, kuten UE, olisi ihanteellinen biologisten merkkiaineiden kehitystyöhön [15,16,23].

Täällä me laajentaa hotair osallisuudesta UBC biologia. Esimerkiksi olemme tunnistaneet muita EMT tekijöistä, jotka vaikuttavat ilmaus hotair. Kriittisesti osoitamme hotair ja muut lncRNA, mukaan lukien kasvaimeen liittyvät lncRNAs HOXA klusterin antisense-RNA-2 (HOX-AS-2), Antisense ei-koodaavan RNA:

INK4

lokus (ANRIL), pitkä geenien välinen RNA Regulator uudelleenohjelmointi (linc-RoR), ovat yliekspressoituu UBC solulinjoissa ja rikastetaan eksosomeiksi eristetään UBC solulinjoista. Samalla osoitetaan, että hotair, HOX-AS-2, etäpesäke liittyvä keuhkoadenokarsinooma transkriptio 1 (MALAT1), ja lincRoR yliekspressoituvat kasvaimissa ja rikastettu UE välillä UBC potilaalla on HGMI sairaus (pT2-pT4 lopullisesta cystectomy patologia). Mikä tärkeintä, käytimme RNA-seq tunnistamaan uusia ja uusia lncRNAs rikastettu UE sairastavien potilaiden HGMI (pT2-pT4) UBC kuin terveillä vapaaehtoisilla. Löysimme neljä tällaista lncRNAs; Rypäleraskaus liittyvät ja painettu ei-proteiinia koodaavan RNA 1 (HYMA1), Long geenien välinen ei-proteiinia koodaavan RNA 477 (LINC00477), LOC 100506688, Orthodenticle homeobox 2 antisense-RNA 1 (OTX2-AS 1) B

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja vapaaehtoisten

Tutkimus hyväksyi Research aiheita Review Board yliopiston Rochester Medical Center (RSRB hyväksymisnumero IRB # 46706). Kemoterapiaa saamattomien potilailla, joille cystectomy HG taudin (lopullinen cystectomy patologia pT2-pT4) otettiin tässä tutkimuksessa. Kirjallinen suostumus saatiin kaikille osallistujille, ja säilytetään turvallinen tiedostoja kohden RSRB määräyksiä. Tutkimustieto koodattiin, jotta aiheita ei voitu tunnistaa, suoraan tai jotka liittyvät tunnisteet, noudattaen Department of Health and Human Services säännöt suojaamiseksi ihmiseen kohdistuvan (45 CFR 46,101 (b)). Aihe tunnistenumerot myös koodata uudelleen julkaistavaksi. Keräsimme virtsa, kasvaimet, ja distaalinen normaalia kudosta (dinitrotolueenin) potilaista. Tissue saatiin patologian formaliiniin parafiiniin upotetut (FFPE) lohkot. Tissue oli hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään määrittää kasvain kudosten ja DNT (vähintään 3 cm: n päässä kasvain mitattuna riippumaton patologi). Vapaaehtoiset olivat terveitä 18+ vuotias joilla ei ole ollut urologiset sairaudet.

RNA-sekvensointi ja data-analyysin

RNA määrä määritettiin käyttäen NanoDrop spektrofotometriä ja laatu määritettiin Agilent Bioanalyzer käyttäen Pico määritys. RNA laadunvalvonta, kirjasto valmistelu ja sekvensointi suoritettiin yliopiston Rochester Genomics Research Center (GRC) käyttäen Ribo-köyhdytettyä cDNA-kirjastojen tuottamat TruSeq RNA Kit V2 (Illumina). cDNA hajanainen, viivakoodilla kanssa Illumina valmistettuja sovittimia, ja PCR-monistettiin. Illumina HiSeq2500 käytettiin suuren suoritustehon RNA-sekvensointi. Kaksikymmentä miljoonaa 125 emäsparin pair-päättyi lukee /näyte saatiin.

NSG tietojenkäsittely; Raaka 125 emäsparin lukee poistui-mutiplexed. Matala monimutkaisuus lukee ja vektori saastuminen poistettiin. FASTX Toolkit (fast_quality_trimmer) käytettiin poistamaan emäksiä laatupisteet alle Q = 13 ja rinnastaa ihmisen perimän kokoonpano versio hg19 /GRCh37 käyttäen Burrows-Wheeler Aligner oletusasetuksilla. Lue lukumäärät generoidaan HTSeq ja kalvosinnapit /Tophat käytettiin ero ilmentymisen analyysi [50].

Solulinjat

BC solulinjoja käytettiin: SV-HUC, 5637, TCC-SUP, T24 , UMUC3, HT1376, J82, ja RT4, saatu ATCC. HEK293-solut, joita käytetään viruksen pakkaus. Soluja kasvatettiin asianmukaisia ​​välineitä ja mukaan ATCC ohjeita. UBC-solulinja identiteetti geneettisesti validoitu DDC Medical.

shHOTAIR ja shScramble stabiilien kloonien

HEK293-solut transfektoitiin plasmideilla: pSPAX2, pMD2G, ja GFP-proteiinia ekspressoivien shRNA hotair (shHOTAIR) tai Sekoita ohjaus (shScramble) lentivirusvektorilla konstruktioita, jotka olivat antelias lahjoja Systems BioScience (Mountain View, CA). TCC-SUP ja T24 soluja infektoitiin shHOTAIR tai shScramble lentivirus ja valitaan puromysiinissä (2 ug /ml) ja FACS lajitellaan. Knockdovvn hotair varmistettiin qRT-PCR: llä.

siRNA

T24-soluja maljattiin 6-kuoppalevyille pitoisuudessa 6×10

4 solua /kuoppa, ja inkuboitiin yön yli. Inkubointi ja transfektio siRNA avulla DharmaFECT 1 reagenssia (GE Life Sciences, Dharmacon) suoritettiin kohti valmistaa protokollaa. Erityisesti jokaisen hyvin, 2.5μL 5 uM siRNA ja 1.37μL of DharmaFECT 1 reagenssia (GE Life Sciences Dharmacon) käytettiin. SiRNA käytetty aiemmin julkaistu: siHOTAIR (siRNA-1 UAACAAGACCAGAGAGCUGUU, siRNA-2 CCACAUGAACGCCCAGAGAUU); ja hallita siGFP (CUACAACAGCCACAACGUCdTdT.) saatiin GE Life Sciences Dharmacon [51].

eksosomi valmistelu ja seuranta analyysi

eksosomi tuottavista solulinjoista TCC-SUP ja T24 kasvatettiin Bioflasks kuin kohden valmistajan suositusten (CELLine 1000AD) sopivassa viljelyalustassa täydennetty 10% eksosomi-vapaa FBS (EF-FBS). EF-FBS valmistettiin ultrasentrifugoimalla 100000 x g 4 ° C: ssa 18 tunnin ajan.

Eksosomit kerättiin sarja- sentrifugoimalla ja ultrasentrifugointi, kuten aikaisemmin on kuvattu [34,52]. Eksosomi proteiini kvantitoitiin käyttäen mikroBCA (Pierce) ja hiukkasten analyysi suoritettiin käyttäen LM10 nanohiukkasten karakterisointi järjestelmä (NanoSight) varustettu sinisellä laserilla 488.

haavanparantumis-, Trans-hyvin ja 3D Invasion Analyysit

arpeutumisprosessit määritystä käytettiin arvioitiin muuttoliike [53]. Haavat mitattiin ajanhetkellä nolla, vain tehtyään haavan ja nelosta myöhemmin. Haavan mitattiin ImageJ ohjelmistoa.

trans-hyvin määritystä käytettiin määrittämään hyökkäystä kuten aiemmin on kuvattu muutoksin [54]. 1 x 10

5 soluja peruselatusaineessa lisättiin 8um pore trans-hyvin insertit (Corning Inc.) oli esipäällystetty alentunut kasvutekijän Cultrex (Trevigen Inc). Insertit otettiin talteen, kiinnitettiin ja värjättiin 1% toluidiinisinisellä, valokuvataan, ja kokonaispinta-ala blue-värjäytyneiden solujen laskettiin käyttäen partikkelianalyysimallia piirre ImageJ ohjelmiston.

3D invaasio analyysiä, 1325 solua /190 ul ympättiin 3D mictrotissue

® levyt (Sigma) päivänä 0 [55,56]. Sen jälkeen sferoidi muodostumista, media korvattiin tyvikalvon uute (BME) (Cultrex). Sferoidiviljelmiä kuvat otettiin käyttäen Progrès

® CapturePro 2.7.7 (Jenoptik) suhtautua Axio tarkkailija A1 (Zeiss). Invasion mitattiin pituus ja määrä ulokkeita osaksi median avulla ImageJ.

Western-blottaus-analyysi

Western blotting 20 gg eksosomi tai solulysaattia proteiini analysoitiin 10% SDS-PAGE. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen mikroBCA (Pierce) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Alix (3A9) (Cell Signaling Technology, Cat # 2171, 1: 1000 laimennus), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-32233, 1: 200 laimennus), Etana (C15D3) (Cell Signaling Technology, Cat # 3879, 1: 1000-laimennos), ZEB1 (H-102) (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, 1: 200 laimennos), ja Beta-Tubulin (Cell Signaling Technology, Cat # 2128, laimennus 1: 1000). Anti-Rabbit IgG-piparjuuriperoksidaasi, anti-vuohi-IgG-piparjuuriperoksidaasi ja anti-hiiri-IgG-piparjuuriperoksidaasi käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology). Kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin käyttäen Super Signal West Femto Suurin herkkyys Substrate (Thermo Scientific) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Kuvan ottaminen suoritettiin käyttäen ChemiDoc kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad).

Immunofluoresenssikoe

immunofluoresenssi shHOTAIR ja shScramble TCC-SUP soluja, kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja estetty 0,5% normaalia vuohen seerumia PBST (0,3% Triton X-100 PBS: ssä) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Soluja inkuboitiin ZEB1 (H-102), vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, 1:50 laimennos PBST) yön yli 4 ° C: ssa, pestiin kolme kertaa PBS: llä, sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen Goat anti- kani-IgG (H + L) Alexa Fluor

® 594 konjugaatti 2 tuntia huoneenlämmössä (Thermo Scientific Catalog #: A-11012, 1: 200 laimennos PBST). Kolmen pesun jälkeen PBS, värjätään solut kiinnitettiin Vectashield HardSet mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Medium DAPI. ICC kuvantaminen:

Solut värjättiin ja käsitellään samanaikaisesti. Solut kuvattiin käyttäen FV1000 Olympus laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla 20x tavoite URSMD valomikroskopia resurssin. Laser ja jännite asetukset säädettiin siten, että intensiteetti tasot DAPI ja Alexa 594 ilmaisun olivat lineaarisella alueella varten kaikki kuvat ja asetukset pysynyt samana kaikissa kuvissa. Gain ja offset säädettiin alkuvaiheen ohjaus kuvaa ja sen jälkeen käytetään kaikissa kuvissa. Sivusuhde 1024 x 1024 ja Kalman keskiarvon 2 käytettiin. Kaikki asetukset olivat samat kaikille neljään ryhmään. Kuviot julkaistaan ​​tässä käsikirjoitus on toistettu kahdessa erillisessä kokeessa ja tiedot edustavat toistettavissa tulos hoitoja ja värjäys näitä proteiineja.

elektronimikroskopialla

5 ui of eksosomi valmisteen pantiin 200 mesh kupari verkkojen päällystetty formvar /hiiltä ja inkuboitiin 1-2 minuuttia. Ristikot värjättiin 20 ui 2,0% fosfovolframihappoa (pH 6,5), ja sen annettiin kuivua. Hitachin 7650 transmissioelektronimikroskoopin at 80kv käytettiin katsella näytteitä. Edustavia ektronimikröskooppivalokuvat siepattiin käyttäen Gatan Erlangshen 11 megapikselin digitaalikamera.

RNA: n valmistaminen

Virtsa kerättiin HG potilaista leikkaussalissa jälkeen yleisanestesian induktion. Virtsa kerättiin terveiltä vapaaehtoisten poliklinikoilla. Virtsan käsiteltiin heti poistoon solujen detritus ja suuri ekstrasellulaarisen rakkuloiden serial hidaskäyntisten ja nopeiden sentrifugoinnilla [40]. Virtsan jaettiin sitten 40 ml näytteitä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes lopullinen patologian määritettiin.

Vain näytteet, potilailla, joilla oli lopullinen cystectomy kasvain patologian pT2-pT4 prosessoitiin edelleen RNA käyttäen virtsa eksosomi RNA eristyspakkausta kohti valmistajan ohjeiden (Norgen). RNA toimitettiin välittömästi eristäminen RNA-sekvensointi. Jäljellä oleva RNA säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA-sekvensointi tietoja oli saatavilla, ja RNA: ta, joita tarvitaan vahvistuksen RNA-sekvensoinnin tulokset.

solulinja eksosomi RNA valmistettiin käyttämällä TRIzol (Thermo Fisher Scientific) niin kohden valmistajan suositusten mukaisesti. Solulinja RNA valmistettiin käyttämällä Rneasy Mini plus (Qiagen) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Tissue RNA eristettiin RNeasy FFPE (Qiagen) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Kaikissa tapauksissa, RNA valmistettiin ja käytettiin välittömästi cDNA: n sukupolven ja sen jälkeen qRT-PCR: llä.

cDNA muodostettiin Bio-Rad iScript cDNA-synteesi kit. qRT-PCR suoritettiin Bio-Rad SYBR-vihreä ja Bio-Rad CFX96 Real-Time-järjestelmä. House pitää geenit sisältyvät GAPDH ja 18S, jotka molemmat pakataan eksosomeiksi [57]. Normfinder ohjelma käytettiin määrittämään sopivan taloudenhoito geeni normalisointia qRT-PCR data. Arvioinnin perusteella beeta-aktiini, GAPDH ja 18S, analyysi valita joko GAPDH tai 18S. Valittu taloudenhoito geeni on dokumentoitu jokaisessa kuvassa legenda [58]. Primer sekvenssit on lueteltu S1 taulukossa.

Tulokset

UBC solulinjat sisältävät kasvaimeen liittyviä mRNA ja lncRNA

Jotta voidaan tunnistaa kohde lncRNA analysoitaviksi UBC Seuloimme valittu lncRNAs ja mRNA: t osallistuvat kasvaimen etenemisen muissa epiteelikasvaimissa. Valitsimme viisi lncRNAs (hotair, HOXA-AS-2, lincRNA-ROR, MALAT1, ja ANRIL) ja kolme mRNA Homeobox A13 (HOXA13), SRY-box 2 (Sox2) ja POU luokka 5 homeobox 1 (POU5F1 /Oct4) sekaantunut useissa eri syöpiä, kuten UBC.

esimerkiksi HOXA-AS-2 on osoitettu tukahduttaa apoptoosin promyelosyyttileukemian soluissa [59]. LincRNA-RoR oli osoitettu aiheuttavan EMT rinta- ja maksan syöpien [60]. Erityisesti hotair osoitettiin pakataan eksosomeiksi ja näin vaikuttaa kemosensitiivisyys ja selviytymistä hypoksisissa olosuhteissa vastaanottaja soluissa [16].

MALAT1 on osoitettu olevan ennustaja etäpesäke useissa syöpiä, kuten UBC [61 , 62]. ANRIL lisää solujen lisääntymisen ja vähentää apoptoosia UBC soluissa [63]. Vaikka HOXA13 lisää sekä leviämisen ja invaasion, sekä estää apoptoosin glioblastooma monimuotoinen soluissa [64]. Transkriptiofaktoreiden Sox2 ja Oct4 normaalisti ajaa pluripotenttisuuden alkion kantasoluja, mutta on nyt liitetty säilyttää syövän kantasoluja, jotka voivat toimia kasvaimen aloittamista solujen suuren määrän kasvaimia [65].

verrattuna ilmentymisen taso näiden valittujen lncRNA ja mRNA: n ohjauksessa SV-40 kuolemattomiksi ei-tuumorigeenisiä urothelial solulinja SV-HUC, löydettiin kohonnut ilmentyminen hotair, HOXA-AS-2, ANRIL, ja HOXA13 in T24 UBC-soluissa . Vaikka TCC-SUP UBC solulinja löydettiin hotair, HOX-AS-2, linc-RoR, ANRIL ja HOXA13 olivat koholla (kuvio 1A ja 1B).

qRT-PCR suoritettiin solulysaateista useista eri UBC solulinjoja ja ohjaus SV-40 kuolemattomaksi urothelial solulinja SV-HUC. MRNA: n tasoon ja lncRNA ilmentyminen oli ensin normalisoitiin GAPDH ja taita-muutos geenin ilmentymisen yksittäisissä UBC solulinjoissa kontrolliin verrattuna SV-HUC soluja. (A) T24 solulysaateista (B) TCC-SUP solulysaateista. (C) qRT-PCR hotair vuonna UBC solulinjoissa normalisoidaan SV-HUC solulinjassa transkriptipitoisuuksissa. (N = 3 koetta). Studentin t-testejä käytettiin kaikissa kokeissa tunnistamaan tilastollista merkittävyyttä ilmaisun välillä UBC ja ohjaus SV-HUC soluja (kuvio 1A-1C) * p 0,05, ** p 0,001, *** p 0,0001.

Kun otetaan huomioon hotair kasvaimen etenemisen arvioimme sen ilmentymistä useissa UBC solulinjat vaihtelevat Grade II luokka IV. Huomasimme, että UBC solulinjoilla on laaja valikoima hotair ilmaisun TCC-SUP (luokka IV), jolla on korkein ja T24 (luokka III) keskitason ilmaisun (kuvio 1 C). Nämä tulokset tukevat julkaisi äskettäin havaintoja monenlaisia ​​hotair ilmentymisen UBC solulinjoissa [66]. Koska T24 ilmaisivat välitasojen ja TCC-SUP ilmaistaan ​​suhteellisesti korkeampaa hotair verrattuna muihin UBC solulinjojen (kuvio 1 C), valitsimme nämä kaksi solulinjaa arvioimaan toiminnallisia rooleja hotair vuonna UBC.

hotair vaikuttaa UBC solumigraation ja invaasiota

in vitro

hotair on osoitettu vaikuttavan muuttoliikettä ja invaasio rinta-, maha-, ruokatorven ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [3,51,67,68]. Osoittaakseen, että hotair on funktionaalinen rooli UBC, ensin luotu hotair Knockdown solulinjoissa shRNA vastaan ​​hotair in T24 ja TCC-SUP-soluissa. (S1A ja S1B kuvio, vastaavasti). Knockdovvn hotair in T24 ja TCC-SUP UBC solulinjojen vähensivät muuttoliikettä standardin scratch-haavan määritys (kuvio 2A ja 2B).

Etäisyys muuttoliikkeen mitattiin seuraavat scratch-haavan määritys lentiviruksesta shRNA knockdovvn hotair vs. kontrolli shScramble (A) T24, ja (B) TCC-SUP UBC solulinjat. Trans-hyvin invaasiomääritys of shHOTAIR vs. kontrolli shScramble (C) T24 ja (D). TCC-SUP solulinjoja (E) 3-D invaasiomääritys vertaamalla shScramble ohjaus TCC-SUP solujen shHOTAIR TCC-SUP-soluissa. Solut ympätään microtissue

® syntyy pyörän geelit ja annettiin muodostaa sferoideja. Sen jälkeen muodostuu steroideja, BME on varovasti kerrokseksi pyörän geeli. Tumma pyöreitä pallosia näkyvät ja Nuolet ennusteisiin hyökkäävän solujen ympäröivään BME. F. jälkeen 7 päivän kulttuurin, projektio pituudet mitattiin pallomainen pinta distaaliseen kärkeen käyttämällä ImageJ ja keskipituus projektio määräytyy kunkin solun tyypin. Studentin t-testiä käytettiin määrittämään tilastollisia eroja kussakin kokeessa esitettiin (AF) * p 0,1, ** p 0,05, *** p 0,01 (n = 3-6 kokeiluja /paneeli).

Invasion tutkittiin kummankin trans-hyvin ja 3-D määritys järjestelmät (microtissues

®). 3-D kulttuuri kasvainsoluja spontaanisti pallosten muodostamiseksi. Se on vakiintunut, että soluja kasvatettiin 3-D pallosia maksimoida solu-solu vuorovaikutusta ja matkivat tiiviimmin endogeenisen kudos käytös [55,56]. Hotair Knockdown solut olivat vähemmän invasiivisia sekä trans-hyvin (kuvio 2C ja 2D) ja 3-D-määritykset (kuvio 2E ja 2F).

hotair vaikuttaa epiteelin-to-mesenchyme siirtyminen geenin ilmentymisen

EMT on ajateltu olevan keskeinen onkogeenisen siirtyminen syöpäsoluihin irtoavan epiteelikalvot ja tunkeutua ympäröiviin kudoksiin. Hotair on osoitettu vaikuttavan sekä aktivoinnin ja tukahduttaminen lukuisia EMT reittiin välittävä geenejä useassa epiteelisyövissä [3,69,70]. EMT geenit ovat osoittautuneet säätelemään kasvaimen invaasio

in vitro

määrityksissä kuten trans-hyvin määritys ja

in vivo

aikana kasvaimen invaasion jokaisessa kasvain tutkitaan [71,72].

odotettavissa, että alennettu maahanmuuttoa ja invaasio, että me havaittu UBC hotair knockdown solujen kuvassa 2A-2F johtui vaikutuksista hotair EMT geenin ilmentymisen. Hotair on osoitettu sekä aiheuttamiseksi ja tukahduttaa useita osallistuvia geenejä EMT lukien SNAI1, LAMC2, LAMB3, ABL2, JAM2, PCDHB5, ja PCDHB10 [3]. Kuitenkin, hotair ei säädetä näistä geeneistä jokaisessa kasvaintyyppi [48].

Vastatakseen hotair /EMT reitin suhdetta UBC, käytimme qRT-PCR arvioida hotair kohdegeenien aikaisemmin tunnistettu lisäksi useita muut EMT tekijät shScramble ohjaus soluissa verrattuna shHOTAIR UBC solulinjoihin.

Kuva 3A ja 3B osoittaa, että sekä shHOTAIR T24 ja shHOTAIR TCC-SUP solulinjat ovat vähentäneet ilmentymistä SNAI1, master säätelijä EMT, samoin kuten EMT polku geenit LAMB3 ja LAMBC2 mRNA verrattuna shScramble valvontaa. Emme kuitenkaan ole havainnut, että hotair pudotus vaikuttaa ilmentymisen JAM2, ABL2, PCDHB5 tai PCDHB 10 (tuloksia ei ole esitetty). Siksi pyysimme pohjapinta ilmentymistaso näissä tunnetuissa hotair tavoitteet T24 ja TCC-SUP cell (S2 Kuva). Vaikka aikaisemmin tunnistetut tavoitteet hotair ilmennettiin sekä T24 ja TCC-SUP, niiden ilmentyminen ei vaikuttanut menetys hotair (tietoja ei esitetty).

(A) qRT-PCR tunnettuja hotair kohdegeenien ja klassinen EMT tekijät mRNA shHOTAIR T24 verrattuna shScramble T24 UBC soluja. (B) EMT kohdegeenin mRNA: n ekspression shHOTAIR TCC-SUP solujen verrattuna shScramble TCC-SUP-solut (paneeleissa A ja B EMT mRNA-tasot normalisoituivat GAPDH). (C) siRNA kohdistettu hotair tai GFP käytettiin T24-soluissa ja EMT tekijät ZEB1 ja SNAI1 mRNA: n ilmentymisen arvioitiin qRT-PCR (mRNA normalisoitiin 18s). (D) Immunoblotti T24 siGFP ja siHOTAIR solut, joissa on näkyvissä vähensi proteiinin tasot ZEB1 ja SNAI1. GAPDH on latauskontrollina. Beeta-aktiini käytettiin latauskontrollina. Studentin t-testiä käytettiin määrittämään tilastollisia eroja ohjaus ja hotair Knockdown solujen qRT-PCR kokeissa esitetään (AC) * p 0,1, ** p 0,05, *** p 0,01 (n = 3-6 kokeiluja /paneeli).

on tärkeää, että ilmaus kaksi muuta klassista merkkiaineita EMT, sinkki sormen E-box sitova homeobox 1 (ZEB1), ja Twist perhe bHLH transkriptiotekijä 1 (TWIST1) pienennettiin että shHOTAIR pudotus UBC solulinjoissa (kuvio 3A ja 3B).

ilmentyminen E-kadheriinin (CDH1) ja vimentiinista (VIM) mRNA arvioitiin shScramble ja shHOTAIR T24 ja TCC-SUP solulinjoissa. Sekä CDH1 ja VIM mRNA ilmaistiin erittäin alhaisilla tasoilla ja pysyivät ennallaan välillä shScramble ja shHOTAIR solulinjoja osoittaa, että hotair todennäköisimmin ei välittävän UBC solulinja invasiivisuus kautta muutokset näissä kahdessa EMT pelaajaa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu raportit osoittavat, että CDH1 ja VIM hyvin vähäistä ilmaistaan ​​T24 ja TCC-SUP [73,74].

Mielenkiintoista, Matrix metallopeptidaasi 1 (MMP-1) mRNA: n ekspressio väheni shHOTAIR TCC- SUP UBC-soluissa (kuvio 3B). MMP-1-proteiinin pilkkoo interstitiaalinen kolla- soluväliaineen mikä helpottaa kasvaimen invaasio [75]. Käänteisesti, havaitsimme lisääntynyt ilmentyminen tiiviin liitoksen proteiini 1 (TJP1 /ZO1) mRNA shHOTAIR TCC-SUP UBC solujen verrattuna shScramble ohjaus soluissa (kuvio 3B). ZO-1 proteiini säilyttää solujen välinen tiukka liittymissä olennaista epiteelikalvosta eheys [76]. Korrelaatio menetyksen hotair lisääntynyt ilmentymä ZO1 viittaa siihen, että shHOTAIR TCC-SUP solut palataan entistä epiteelin fenotyyppi. Lisäksi nämä tiedot viittaavat siihen, että hotair voi olla rooli tukahduttaa joissakin epiteelin liittyvien geenien TCC-SUP soluissa.

Tukeakseen tulokset shHOTAIR knockdown tietojen käytimme aiemmin julkaistu vastaan ​​suunnattu siRNA hotair tuottaa siHOTAIR knockdown T24 UBC soluihin [51] (S3 kuvassa). Koska ilmentymisen SNAI1 ja ZEB1 mRNA molemmat vaikuttavat hotair pudotus on T24 ja TCC-SUP UBC-soluissa (kuvio 3A ja 3B, vastaavasti), arvioimme mRNA: ta (kuvio 3C), ja proteiinin tasot (kuvio 3D) ja SNA1 ja ZEB1 in siGFP ja siHOTAIR T24 soluja. Sekä mRNA ja proteiini tasoilla SNA1 ja ZEB1 vähenivät siHOTAIR taintumisen T24-soluissa (kuvio 3D). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot tukevat korrelaatio menetys hotair ilmaisun pienemmällä maahanmuutto- ja hyökkäyksen ja EMT tekijä ilmentyminen UBC solulinjoissa.

HGMI (pT2-pT4) UBC kasvaimia rikastettu kasvaimeen liittyviä lncRNA ja mRNA

Kasvaimet ja dinitrotolueenin päässä kemoterapiaa saamattomien potilailla, joille cystectomy HG sairaus (vahvistettu viimeinen patologinen vaiheessa pT2-pT4) eristettiin kanssa IRB hyväksynnän. Potilaan kliinisiä piirteitä ovat esillä S2 taulukossa.

Käytimme qRT-PCR tunnistaa kasvaimeen liittyvien lncRNA ja mRNA tuumoreissa verrattuna dinitrotolueenin epiteelissä samoista potilaista (kuvio 4A). Olemme havainneet, että hotair, HOX-AS-2, MALAT1 ja kaksi mRNA Oct4 ja Sox2 ovat korkeampia ekspressiotasoja kuin dinitrotolueenin (ekspressiotason yksittäisten kasvainten yhdistettiin ja verrattiin yhdistettiin dinitrotolueenin ilmentymisen tasoa).

( A) qRT-PCR kasvaimeen liittyvien mRNA: iden ja lncRNAs kasvaimissa potilailla, joiden kystektomia HG taudin (lopullinen patologia pT2-pT4). Kasvain ja distaalinen normaalia kudosta (dinitrotolueenin) mRNA tai lncRNA normalisoitiin 18s ja sitten suhde kasvaimen dinitrotolueenin laskettiin. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi verrata kasvaimen dnt normalisoitua ilmaisun, * p 0,05. (N = 10 potilasta). chemotherapy.

doi:10.1371/journal.pone.0147236.s006

(DOCX)

Acknowledgments

Functional