Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta osoitti edut EGFR /EGF kohdennettuja hoitomuotojen metastaattisessa kolorektaalisyövässä (metastasoituneen kolorektaalisyövän ), monet potilaat aluksi vastata, mutta merkkejä taudin etenemistä. Uusia terapeuttisia strategioita tarvitaan, jotta toimintaa lääkkeille tehokkaampia. Tutkimuksemme tavoitteena oli selvittää, onko samanaikainen kohdentaminen EGFR /EGF ja COX-2 (COX-2) voivat auttaa hoitoon ja hallintaan metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaista. Dual tyrosiinikinaasiestäjä AEE788 ja selekoksibi käytettiin inhiboimaan EGFR /VEGFR ja COX-2, vastaavasti, paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. COX-2-estoon Selekoksibilla täydensi kasvaimia torjuvan ja antiangiogeenisten tehoa AEE788, kuten estämällä solujen lisääntymisen, apoptoosin induktio ja G1 solusyklin pysähtymiseen, alas-säätely VEGF tuotannon syöpäsoluja ja vähentää solujen vaeltamiseen. Nämä vaikutukset liittyivät kanssa saarto on EGFR /VEGFR signalointi akselilla. Erityisesti yhdistetyn AEE788 /Selekoksibihoidon esti β-kateniinin tumakertymään kasvainsoluissa. Tämä vaikutus liittyy merkittävä downregulation FOXM1 proteiinin tasot ja arvonalentuminen vuorovaikutuksessa tämän transkriptiotekijän kanssa β-kateniinin, joka vaaditaan sen tumaanohjaussignaali. Lisäksi yhdistelmähoito vähensi myös ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita loka 3/4, Nanog, Sox-2 ja Snail syöpäsoluissa, ja osaltaan vähenemiseen CSC alapopulaatio, kuten on esitetty colonosphere muodostumisen määritykset. Johtopäätöksenä on, että yhdistetty hoito AEE788 ja selekoksibi ei ainoastaan ​​osoittaa, parannettu kasvaimia torjuvaa tehoa ja peräsuolen syövän soluja, mutta myös vähentää paksusuolen CSCS alaryhmästä kohdistamalla stemness liittyviä reittejä. Näin ollen samanaikaisesti kohdistus EGFR /VEGF: n ja COX-2 voi auttaa estämään metastasoituneen kolorektaalisyövän etenemistä ja parantaa tehoa olemassa oleviin hoitomuotoihin kolorektaalisyövässä.

Citation: Valverde A, Peñarando J, Cañas A, López-Sánchez LM, Conde F, Hernandez V, et ai. (2015) samanaikainen EGFR /VEGFR ja COX-2 Targets Stemness-Related Pathways in peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 10 (6): e0131363. doi: 10,1371 /journal.pone.0131363

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu 15 joulukuuta 2014; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2015; Julkaistu: 24 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Valverde et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: EA tukivat Espanjan Cancer Network (RTICC), Instituto de Salud Carlos III (RD12 /0036/0038) (www.isciii.es). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syövän (CRC) on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpä ja syy syövän kuolleisuus kehittyneissä maissa [1]. Euroopassa CRC on kolmanneksi yleisin syöpä ja keuhkosyövän jälkeen se oli toiseksi yleisin kuolinsyy vuonna 2012, lähes 215,000 kuolemantapausta [2]. Vaikka kuolleisuus CRC on laskenut hieman kahden viime vuosikymmenen aikana, ja vaikka kehitys havaitsemiseen ja kirurginen hoito, metastaattisen CRC (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) liittyy huono ennuste, jossa on 5-vuoden eloonjäämisluvut välillä 5% ja 8%. Kohdistaminen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on todistettu olevan tehokas hoito CRC. Erityisesti, hoito monoklonaalisilla vasta-aineilla (setuksimabi tai panitumumabipitoisuus) solunulkoista domeenia vastaan ​​reseptorin on tullut tärkeitä terapeuttisia strategioita hoitoon metastasoituneen kolorektaalisyövän. Kuitenkin vastauksia EGFR kohdistetut vasta-aineet ovat suhteellisen alhaiset, ja parannusta oli selviytymisen yleensä kestävät vain useita kuukausia, ja teho rajoittuu tiettyihin potilaan alatyyppeihin [3]. Itse asiassa, CRC potilaat määritelty ”nelinkertaistaa negatiivinen”, kasvaimia puuttuu mutaatioita EGFR loppupään efektoreja KRAS, BRAF, PIK3CA, ja PTEN, on suurin todennäköisyys vaste anti-EGFR hoitojen [4]. Toisaalta, erilaisia ​​strategioita, joiden tarkoituksena on estää verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) sekä sen reseptorit on kehitetty inhiboimaan angiogeneesiä CRC potilailla [5,6]. Huolimatta osoitti hyötyä näistä antiangiogeenistä hoitojen hallintaan CRC, monet potilaat, joilla on edennyt sairaus aluksi vastata VEGF-hoidon, mutta sitten merkkejä taudin etenemistä, mikä viittaa resistenssin hoitoa [7]. Siksi on olemassa selkeä tarve parantaa luonnehdinta prosessien tehottomuus EGFR /EGF kohdistettuja hoitomuotoja ja löytää uusia terapeuttisia strategioita, joilla toiminnan lääkkeille tehokkaampaa.

Viime vuosikymmenellä , on osoitettu, että kasvaimia on solujen populaatio, jota kutsutaan yleisesti syövän kantasoluja (CSCS), kyky lisääntyä ja tuottaa muun syöpäkasvaimen [8,9]. Kyky itse uusimisen CSCS mahdollistaa homeostaasin ja ylläpito kasvain, samaan tapaan kuin kantasolut eivät normaaleissa kudoksissa. CSCS ovat paljon kestävämpi kuin eriytetty syöpäsolujen hoitoja käytetään klinikalla [8]. Täten on osoitettu, että riski paksusuolen syövän uusiutumiseen on verrannollinen ilmaisua primaarikasvaimen sarjan erityinen ja suoliston kantasolujen geenejä, jotka myös tunnistaa solupopulaation CSC ominaisuuksia kasvain [10]. Tärkeää on, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CSCS ovat mukana mekanismeja, joilla kasvaimia kiertää sekä anti-EGFR ja anti-VEGF-kohdennettuja hoitoja [11,12]

Selekoksibi on selektiivinen syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) estäjä, jota käytetään estämään polyyppien muodostumista familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP) potilaat, populaatio on suuri riski peräsuolen syövän kehitystä [13]. Kuitenkin tutkimukset osoittavat, että selekoksibi saattaa olla tehokas kasvaimen vastainen ja antimetastaattisia ominaisuuksia vastaan ​​myöhäisessä vaiheessa CRC. Täten tehokkuus angiogeneesin vastaista tyrosiinikinaasi-inhibiittorin (axitinib) on osoitettu merkittävästi parantaa, kun se yhdistetään selekoksibin prekliinisessä mallissa CRC [14]. Lisäksi rinnakkaisten estäjät, on mahdollistanut samanaikaisesti EGFR: n ja VEGF polkuja. Tässä tapauksessa on AEE788, suun kautta estäjä, jolla on voimakas aktiivisuus useita tyrosiinikinaaseja sisältäen EGFR, ja VEGFR [15], jonka on osoitettu aiheuttavan kasvaimia torjuvaa vaikutusta erilaisissa ihmisen syövän mallit [16-18]. Näin ollen samanaikaisesti kohdistus EGFR /VEGF: n ja COX-2 voi myös auttaa estämään metastasoituneen kolorektaalisyövän etenemistä. Tämä tutkimus osoittaa, että yhdistelmä AEE788 erityisten COX-2-estäjä selekoksibi paitsi osoittanut parannettu kasvaimia torjuvaa tehoa ja peräsuolen syövän soluissa, mutta myös vähensi paksusuolen CSCS subpopulaatio kohdistamalla stemness liittyviä reittejä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Caco-2-soluilla (ECACC, Salisbury, UK) kasvatettiin MEM Earle: n suoloja (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta), joka sisälsi 15% naudan sikiön seerumia. HCT-116-solut (DSMZ, Braunschweig, Saksa) kasvatettiin McCoyn 5A-alustassa (Biowest, Nuaille, Ranska), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (PAA Laboratories). HCT-116-solujen satama aktivoivaa mutaatio KRAS (G13D), kun taas Caco-2-solut ovat KRAS villityypin. Viljelyalustassa, johon oli lisätty 2 mM glutamiinia, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja amfoterisiini B: tä (2,5 ug /ml). Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta. Sen jälkeen, kun viljelmät tuli 80% konfluentteja (yleensä sen jälkeen 3 päivää), solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin tuoreeseen elatusaineeseen. Kaikki solut käytettiin kokeisiin näkyy 95% elinkelpoisuuden ja ympättiin 96-kuoppaisille levyille, 6-kuoppaisille viljelylevyille, 60 mm: n viljelymaljoille ja ultra low-kiinnityslevyt (Corning Inc, Lowell, MA, USA). Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

reagenssit

AEE788 (Novartis Pharma AG, Basel, Sveitsi), NS-398 ja selekoksibi (Sigma-Aldrich, Madrid, Espanja) liuotettiin DMSO: hon tuottamaan varastossa pitoisuudet 10 mM, 10 mM ja 20 mM, vastaavasti, ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Työskentely liuokset valmistettiin laimentamalla sulatetaan viljaa soluviljelyalustaan. DMSO: n konsentraatio lopullisessa laimennuksen ei ylittänyt 0,1% v /v. Ihmisen EGF ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ja liuotetaan glyseroli tuottamaan varastossa pitoisuudet 10% v /v. Ihmisen rekombinantti VEGF ostettiin Sigma-Aldrich ja liuotettiin veteen tuottamaan varastossa pitoisuudet 10 ug /ml. Western blot -analyysiä varten, seuraavia vasta-aineita käytettiin: fosfo-EGF-reseptori (Tyr1068) kanin pAb, fosfo-VEGF-reseptorin 2 (Tyr1175) (19A10) kanin mAb, VEGF-reseptori 2 (55B11) kanin mAb, fosfo-p44 /42 MAPK (Erk 1/2) (Thr202 /Tyr204) (D13.14E) kani mAb, fosfo-Akt (Thr308) (C31E5E) kani mAb, fosfo-Akt (Ser473) (587F11) hiiren mAb, Akt kani pAb ja β-kateniinin kanin pAb hankittiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA). EGFR hiiren mAb (0.N.268), aktiini (C-2) hiiren mAb, vuohen anti-kani, vuohen anti-hiiri, aasin anti-vuohi-vasta-aineita, ja FOXM1 (K-19): sc-500 ostettiin Santa Cruz Biotechnology. MAP-kinaasin ERK1 /ERK2 kanin pAb oli Calbiochem-EMD Millipore (Billerica, MA, USA), COX-2-hiiri-mAb (klooni CX229) oli Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA) ja Ep-Cam hiiren mAb oli kotoisin Chemicon International (Billerica, MA, USA). Propidiumjodidia saatiin Sigma-Aldrich ja se valmistettiin liuottamalla 1 mg 1 ml: ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta. Tämä liuos suojattiin valolta ja varastoitiin 4 ° C: ssa. RNaasi, DNaasi-vapaa saatiin Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Kanta pitoisuudet 500 ug /ml RNaasi valmistettiin ja pidettiin Vapaasti 20 ° C: ssa.

Cellular runsaudenmäärityksessä

Solujen lisääntyminen ja elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen XTT kolorimetristä määritystä (Roche Applied Science). Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 4000 solua /kuoppa, ja anna kiinnittyä 24 tunnin ajan. Solut käsiteltiin sitten AEE788 (0-20 uM) yksittäisenä aineena tai yhdistelmänä selekoksibi (10 uM) läsnä ollessa tai puuttuessa EGF: ää (100 ng /ml). Tarkastukset soluja käsiteltiin saman pitoisuuden DMSO ajoneuvon. Hoidon jälkeen ilmoitetuilla aikoina ja annokset, XTT määritys suoritettiin seuraten protokollaa valmistajan toimittama käyttämällä mikrolevyn absorbanssi lukijaa.

Colonosphere muodostumisen määritys

colonosphere muodostumista määrityksessä, käsittelyjen jälkeen solut oli tripsinized, laskettiin uudelleen ympättiin kloonitiheydessä (1 solu /ul) 96-kuoppaisella levyllä, äärimmäisen pieni kiinnityspinta (Costar, Corning, NY, USA) seerumittomalla Dulbeccon MEM ravinneseoksen F + 12 Ham -elatusainetta B27 (01:50; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (PeproTech, Lontoo, Iso-Britannia)), 20 ng /ml EGF: ää (Santa Cruz Biotechnology) ja 1% tilavuus /tilavuus metyyliselluloosaa (R BD, Franklin Lakes, NJ, USA) määrittää prosenttiosuus apoptoottisten solujen.

Entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA) analyysit VEGF: n ja prostaglandiini E2: n tuotanto

VEGF tuotantoa soluissa arvioitiin ELISA-määritykset (Human VEGF-A: Platinum ELISA e-Bioscience) suoritetaan soluviljelysupernatanttia 48h sen jälkeen, kun eri hoitoja ja sen jälkeen toimittamaa menettelyohjetta valmistaja. Lyhyesti, viljelmät sentrifugoitiin 300 x g 5 minuuttia 4 ° C: ssa ja supernatantit kerättiin, jaettiin osiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa määritykseen asti. Optinen tiheys mitattiin 450 nm: ssä korjaus aallonpituus asetetaan 650 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Prostaglandiini E2 (PGE2) tuotannon soluissa arvioitiin käyttäen PGE2 EIA kit, (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). Tämä määritys suoritettiin solulysaateista 12 h kuluttua käsittelyt AEE788 ja /tai Selekoksibi ja seuraava protokolla valmistajan toimittamia. Optinen tiheys mitattiin 450 nm: ssä korjaus aallonpituus asetettu 570-590 nm käyttäen mikrolevylukijaa.

Solusyklianalyysiä

Solut (0,5-1 x 10

6 solua ) trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Jääkylmää 100% etanolia lisättiin pisara vaiheittaisesti vorteksoiden varovasti ja inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet sentrifugoitiin 300 x g 5 minuutin ajan, suspensoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidia ja 100 ug /ml RNaasi A: ta ja inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämmössä valolta suojattuna. Analyysi ja mittaaminen propidiumjodidia fluoresenssi tehtiin FACSCalibur (BD Biosciences) -virtaussytometrissä (FACS, BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

angiogeneesimääritys

Angiogeneesi mitattiin kyky endoteelisolujen muodostaen kolmiulotteisia rakenteita matrigeeliä tyvikalvon matriisin (BD Biosciences)

in vitro

. Angiogeneesiä määritystä, HUVEC-soluja (CC-2519 Lonza Sales AG, Basel, Sveitsi) viljeltiin päälle matrigeeliä tiheydellä 20000 solua /kuoppa Caco-2-elatusaine eri käsittelyjen jälkeen. Caco-2-elatusaine erilaisten käsittelyjen jälkeen keskittyi Amicon Ultra-0,5 Centrifugal Filter Devices (EMD Millipore) on valmius saamiseksi korkean pitoisuuden tekijöitä ja poistamalla lääkejäämiä. Kontrollina, HUVEC-soluja viljeltiin EBM väliaineessa (Lonza Walkersville, MD USA) läsnä ollessa tai VEGF: n puuttuessa (10 ug /ml). HUVEC-solut inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä ja seuraavan värjäytymisen kanssa fluoresenssiväriä Calcein AM (Cell Biolabs, Inc.), putken muodostumista tutkittiin ja valokuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Laajuus putken muodostumiseen (keskiarvo putken pituus ja haara pistettä) kvantifioitiin kautta kuvankäsittelyohjelma (Image J ohjelmisto).

Vasta paneelit

Erityisiä vasta-paneelit määrittämiseen käytettiin ilmaisua solunsisäisten reseptorin (RTK) liittyviä signalointipolkujen ja ilmaisu pluripotenttisuuden liittyvien proteiinien koko solun uutteiden seuraavien protokollien valmistajilta. Lyhyesti, solu- uutteet laimennettiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: n PathScan RTK Signaling Vasta Array Kit Cell Signaling Technology) tai Proteome Profiler Human Pluripotentit Kantasolujen Array (Cat # ARY010, R Reverse-aluke: 5′-AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3, Tehokkuus: 2; GAPDH: (240 bp), Forward-aluke: 5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ’;

Käänteinen aluke: 5′-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3′, Tehokkuus: 2; Tulokset normalisoitiin että GAPDH ja kvantifiointi suhteellinen ekspressio määritettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä.

lyhytaikainen ekspressio mutantti K-RAS-geenin Caco-2-solujen

Caco -2-soluja transfektoitiin ohimenevästi pBabe K-Ras 12V plasmidin tai tyhjän vektorin (pBabe-puro), toimittanut Addgene (plasmidit # 12544 ja # 1764). PureYield Plasmidi Midiprep System (Promega) käytettiin seuraavaa protokollaa valmistajan toimittamia. Solut ympättiin 90% konfluenssiin 6-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen 24 h solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 3000 (Life Technologies) kuten transfektioreagenssin, seuraten valmistajan ohjeita. Analyysi EGF-riippumattoman aktivoinnin ERK1 /2 Western blot ja soluproliferaatiomääritykset suoritettiin transfektoiduissa soluissa.

Immunofluoresenssi konfokaalimikroskopialla

Soluja kasvatettiin poly-L-lysiini-käsitelty peitelasit muodostaa lähes yksisolukerroksena jälkeen 6h eri hoitoja. Sitten elatusaineet heitettiin pois, solut pestiin kolmesti PBS: ssä ja läpäiseviksi metanolissa. Pesun jälkeen PBS: llä, peitinlasit inkuboitiin anti-β-kateniinin (1/250) hiiren mAb (BD) ja FOXM1 (1/250) kanin pAb (Santa Cruz Biotechnology), 1 h huoneen lämpötilassa, pestiin kolmesti PBS: ssä ja leimatun anti-hiiri-IgG Alexa fluor 488-leimattua vasta-ainetta (1/500) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ja anti-kani-IgG (H + L), Alexa fluor 594-leimattua vasta-ainetta (1/500) (Santa Cruz Biotechnology), 1 h huoneen lämpötilassa. Lopuksi soluja inkuboitiin 300 nM 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) PBS: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Peitelasi kiinnitettiin käyttämällä Aqua Poly /Mount (Polysciences, Warrington, PA, USA) ja visualisoida Zeis LSM 5 Exciter konfokaali laser-skannaus (Zeiss, Saksa). Kuvat analysoitiin käyttäen kuva-J ohjelmisto (National Institutes of Health).

Co-immunopresipitaatiomäärityksiä

Solut hajotettiin yhteistyössä IP-puskuria (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF: ää, 0,075% NP40 ja 1% v /v proteaaseja /fosfataasien -estäjä cocktailit), sentrifugoitiin ja poistetaan inkuboimalla 22,5 ui Protein A /G-geeli 1 h 4 ° C: ssa. Pre-kastettu supernatantti alistettiin IP käyttäen esitettyä ensimmäistä vasta-aineita, 4 ° C: ssa 1 h. Sitten proteiini kompleksit kerättiin inkuboimalla 22,5 ui Protein A /G-geeli 4 ° C: ssa yön yli. Kerätyt proteiini kompleksit pestiin kolme kertaa PBS-puskurilla, sentrifugoitiin 14000 x g, 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja analysoitiin western-blottauksella.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhettä. Kaikki Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism 5. Ennen vertaamalla kahta dataryhmän, normaalisuus testi sekä yhtä varianssi testi tehtiin. Jos tietoryhmät läpäissyt molemmat testit, vertailu tehtiin parametrisena lähestymistapaa (pariton Studentin t-testi). Jos normaalius ja /tai yhtä suuri varianssi testi rikottu, vertailu tehtiin parametristä menetelmällä (Mann-Whitney koe). Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä p 0.05.

Tulokset

AEE788 estää soluproliferaatiota, indusoi apoptoosia ja muuttaa solusyklin peräsuolen syöpäsoluissa

AEE788 aiheutti antiproliferatiivinen vaikutus HCT-116 ja Caco-2-solut jolla on suurempi antituumorivaikutus, kun kyseessä on Caco-2-soluja (kuvio 1A). Eri herkkyys AE788 kahden solulinjojen oli selvempää, kun kyseessä on EGF-ajettu solujen lisääntymistä, jossa 2,5 uM AE788 vähentää proliferaatiota Caco-2-solujen 60%, kun taas K-Ras mutatoitu HCT-116-solut eivät olleet vaikutti merkittävästi (kuvio 1 B). Kanssa nämä tulokset, AEE788 aiheutti annoksesta riippuvaisen apoptoottisen solukuoleman Caco-2, mutta ei HCT-116-solut (kuvio 1C). Lisäksi hoito Caco-2-solujen eri annoksilla AEE788 johti lisääntyneeseen solujen prosenttiosuus G1 vaiheen annoksesta riippuvaisella tavalla, käsittelemättömiin soluihin verrattuna, kun taas nämä muutokset solusyklin ei havaittu AE788-käsiteltyjen K -Ras mutatoitu HCT-116-solut (kuvio 1 D).

A) solujen proliferaatio arvioitiin 72 h kuluttua hoidon eri annoksilla AEE788. B) Solujen lisääntymisen inhibitio, jonka AEE788 testattiin kasvavien solujen EGF: n läsnäollessa (100 ng /ml). C) fraktio apoptoottisten solujen arvioitiin 48 tunnin kuluttua hoidon eri annoksilla AEE788 kasvavien solujen EGF: n läsnäollessa (100 ng /ml). D) analyysi solusyklin suoritettiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun 48 tunnin hoidon eri annoksilla AEE788 kasvavien solujen EGF: n läsnäollessa (100 ng /ml). Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05 verrattuna kontrolliin).

AEE788 estää EGFR-signalointi ja peräsuolen syövän soluja

vieressä analysoidaan aktivaation EGFR, ERK- ja AKT-kinaasien arvioida merkitys EGFR-signaalin esto on kasvaimia torjuvaa vaikutusta AEE788 (kuvio 2). Käsittely AEE788 esti EGFR fosforylaatiota sekä HCT-116 ja Caco-2-soluihin. Kuitenkin AEE788 tehokkaasti inhiboi EGF: n signalointi-akselin vain Caco-2-soluissa, kuten on osoitettu EGF-indusoitu fosforylaatio ERK 1/2 (kuvio 2). Lisäksi, joka on EGF-indusoidun fosforylaation Akt Thr havaittiin AEE788 saaneilla Caco-2, mutta ei HCT-116-soluissa. Siksi havaittu EGFR aktiivisuus AEE788 paksusuolen syöpäsoluissa riippuu voimakkaasti villin tyypin K-Ras status.

Fosforyloidulla ja ei-fosforyloitua muotojen EGFR, ERK 1/2 ja Akt havaittiin Western-blot käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman EGF: ää (100 ng /ml) ja käsiteltiin AEE788 (2,5 uM) ja 5, 10 tai 15 min. Ilmaisu taso aktiini sisällytettiin latauskontrollina.

AEE788 estää VEGF-indusoituun in Caco-2-solut

Lisäksi anti-EGFR aktiivisuutta, AEE788 myös tavoitteet VEGFR-signalointia. Tältä osin toiminta VEGF ei rajoitu angiogeneesiä ja verisuonten läpäisevyyden, ja on tunnettua, että sekä autokriinisiä ja parakriinisiä VEGF signalointi tapahtuu kasvainsoluissa [19]. Siksi tutkimme seuraavaksi AEE788 heikentää VEGF signaloinnin paksusuolen syöpäsoluissa. Kuten esitetään S1 kuviossa, käsittely AEE788 esti VEGF-ajettu soluproliferaation Caco-2, mutta ei HCT-116-soluissa.

COX-2 eston augments kasvaimia torjuvaa tehoa AEE788

tiedetään, että VEGF stimuloi COX-2 ilmaisun ja prostaglandiinisynteesin, joka puolestaan ​​indusoi VEGF tuotantoa [20,21]. Siksi yhdessä COX-2-estäjät voivat olla tehokas keino lisätä toiminnan AEE788. Kuten kuviossa 3, lisäksi molemmat NS-398 ja selekoksibi, kahden tunnetun COX-2-estäjät, parannettu antituumorivaikutus ja AEE788, kuten on esitetty soluproliferaation inhibointi (kuvio 3A). Lisäksi teknologisen hoito AEE788 ja selekoksibi lisäsi prosenttiosuutta Caco-2-solujen pidätettiin G1 (kuvio 3B). Erityisesti on huomattavasti suurempi prosenttimäärä solujen G1 vaiheessa havaittiin jälkeen yhdistelmähoito kuin joko huumeita yksinään. Päinvastoin, mitään näistä vaikutuksia havaittiin HCT-116-solut, jotka voidaan liittyy paljon pienempi ekspressiotasot COX-2 näissä soluissa verrattuna Caco-2 (kuvio 3C), ja niiden mutatoidut K-Ras status. Siten transfektio Caco-2-solujen, joissa on mutantti K-Ras ilmentävät plasmidin vahvistettiin, että alavirtaan aktivointi EGFR-Ras-ERK-reitin, kuten on esitetty EGF-riippumaton ERK1 /2-fosforylaation, poistettiin antiproliferatiivinen AEE788 ja /tai selekoksibia (S2 Kuva). Lisäksi selekoksibi inhiboi yli 70% PGE2-tuotantoon Caco-2-soluja (S3 kuvassa). Lisäksi todettiin, että AEE788 käsittely laski COX-2-proteiinin ilmentymisen Caco-2-soluissa, mikä selittää 40% vähennys PGE2-tuotantoa, kun taas COX-2 entsyymiaktiivisuus selekoksibin ei vaikuttanut COX-2: n ilmentymisen (S3 kuvio ). Näin ollen yhdistetty hoito AE788 ja selekoksibi esti EGFR, ERK 1/2, ja AKT (Ser /Thr) fosforylaatiota Caco-2-solut (kuvio 3D). Kvantitatiivinen analyysi käyttäen vasta-ainetta paneeli vastaan ​​signalointikinaasit osoitti, että yhdistelmähoito on Caco-2-solujen AEE788 ja selekoksibi aiheutti huomattavasti suurempi esto VEGFR, Akt (Ser /Thr) ja Stat3 fosforylaatio kuin kumpikaan lääke yksin (S4 kuvio).

A) EGF-driven solujen lisäkasvua tutkittiin soluissa kasvaa, kun läsnä oli EGF: ää (100 ng /ml) ja läsnä ollessa tai puuttuessa AEE788 (2,5 uM), selekoksibi (10 uM) ja NS- 398 (10 uM). B) analyysi solusyklin suoritettiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun 48 tunnin hoidon AEE788 (2,5 uM) ja /tai selekoksibi (10 uM) kasvavien solujen EGF: n läsnäollessa (100 ng /ml). C) Expression tasot syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) analysoitiin western-blot kokosoluekstraktien muodostavat Caco-2 ja HCT-116-solut. Expression of β-aktiini on sisällytetty latauskontrollina. D) fosforyloitu ja ei-fosforyloitua muotojen EGFR, ERK 1/2 ja Akt havaittiin Western-blotilla käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Soluja kasvatettiin, kun läsnä oli EGF: ää (100 ng /ml) ja käsiteltiin AEE788 (2,5 uM) ja /tai selekoksibi (10 uM) ja 6 tuntia. Ilmaisu taso aktiini sisällytettiin latauskontrollina. Vastaava densitometrinen analyysi on myös esitetty. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05, verrattuna kontrolliin, # p 0,05, verrattuna AEE788-käsitellyt solut).

COX-2 inhibition tehostaa anti -angiogenic aktiivisuus AEE788

COX-2 yhdessä anti-EGFR /VEGFR aktiivisuutta AEE788, aiheutti merkittävän väheneminen VEGF-A mRNA: n ekspressio (kuvio 4A) ja VEGF165-proteiinin erityksen tasojen (kuvio 4B) in Caco-2, mutta ei HCT-116-soluissa. Lisäksi endoteelin putken muodostumiseen määritykset osoittivat, että angiogeeninen aktiivisuus Caco-2-väliaine oli merkittävästi pienempi, kun soluja käsiteltiin AEE788 ja selekoksibi kuin joko lääkkeen yksin. (Kuvio 4C ja 4D).

A) VEGF-A mRNA: n ekspressiotasot analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR-peräsuolen syövän solut kasvavat, kun läsnä oli EGF: ää (100 ng /ml) ja altistetaan ilmoitettu hoitoja 48 tuntia. B) VEGFA165 kvantitoitiin ELISAlla vakioitu väliaine kerätään kasvavien solujen EGF: n läsnäollessa (100 ng /ml) ja käsiteltiin AEE788 (2,5 uM) ja /tai selekoksibi (10 uM) 48 tunnin ajan. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05 verrattuna kontrolliin). C) Angiogeeninen aktiivisuus media ehdollistettu Caco-2-solut altistettiin 24 h asianomaiset hoidot arvioitiin käyttämällä endoteelisolujen putken määritystä, kuten on kuvattu kohdassa materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat kokonaispituus on muodostettu putkien pikseliä (px), joka osoittaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05 verrattuna kontrolliin). D) edustaja kuvia muodostettu yhteenliitettyjen verkkojen käsittelyn jälkeen endoteelisolujen kanssa osoitti Caco-2-solujen käytetty elatusaine. Laajuus putken muodostumiseen kvantitoitiin esitettyjä Materiaali ja menetelmät osassa. (Lopullinen suurennus: X40, asteikko bar vastaa 100 mikronia).

toimintojen lisäksi VEGF angiogeneesin ja endoteelisolujen, edistämällä syöpäsolujen muuttoliike on osoitettu olevan joukossa autokriinisen toiminnot VEGF tuumorisoluissa [22,23]. Siksi tutkimme seuraavaksi vaikutuksia AEE788 ja /tai selekoksibi on Caco-2 ja HCT-116-solut muuttoliike käyttämällä scratch-haavan paranemista määrityksessä.