Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) solujen käynnissä neuroendokriini erilaistumiseen (NED) ovat kliinisesti merkityksellisiä kehittämiseen uusiutunut kastraation vastustuskykyisten PCa. Lisääntyvä todisteet osoittavat, että autophagy liittyy kehittämiseen neuroendokriinisten (NE) kasvaimet, mukaan lukien PCa. Selventää vaikutuksen autophagy on NED, androgen-herkkien PCa LNCaP tutkittiin. Hoito LNCaP-solujen IL-6 johti induktio autophagy. Puuttuessa androgeenin, IL-6 aiheutti jopa vahvempi aktivointi autophagy. Samanlainen tulos todettiin NED induktio. Esto autophagy klorokiinin (CQ) huomattavasti vähentynyt NED. Tämä havainto vahvistettiin beclin1 ja Atg5 hiljentäminen kokeiluja. Mikä tukee roolia autophagy vuonna NED, huomasimme, että LC3 oli säädelty PCA kudos, joka oli uusiutunut jälkeen androgeenipuutteen terapia verrattuna niiden primaarikasvaimen vastine. LC3 värjäystä uusiutunutta PCa kudoksessa osoittivat pistemäinen kuvio samanlainen värjäytymisen kromograniinilla A (CGA), merkkiaine NED soluja. Lisäksi autophagy esto indusoi apoptoosia IL-6 indusoi NE eriytetty PCa soluja. Tasaisen, esto autophagy mukaan knockdovvn beclin1 tai Atg5 herkistynyt NE eriytetty LNCaP etoposidiksi, kemoterapia lääke. Tunnistaa mekanismeja, fosforylaatio IL-6 alavirran tavoitteet analysoitiin. Lisääntyminen fosfori-AMPK ja lasku fosfori-mTOR havaittiin, mikä tarkoittaa, että IL-6 säätelee autophagy kautta AMPK /mTOR-reitin. Tärkeintä tässä tutkimuksessa on löytö REST, neuronaalista geenispesifisiä transkription repressori, joka osallistuu autophagy aktivointi. Loput alassäädetty IL-6 hoitoa. Knockdown kokeet viittaavat siihen, että loppu on kriittinen NED ja autophagy aktivaatio IL-6. Yhdessä tutkimuksemme viittaavat siihen, että autophagy on mukana PCa etenemistä ja sillä on cytoprotective rooli, kun NED indusoituu PCa-soluissa IL-6 hoitoa. Nämä tulokset paljastavat potentiaalin kohdistaminen autophagy osana yhdistetyn terapeuttisen järjestelmän NE kasvaimia.

Citation: Chang P-C, Wang T-Y, Chang Y-T, Chu C-Y, Lee C-L, Hsu H-W, et al. (2014) Autophagy Pathway vaaditaan IL-6 aiheuttama Neuroendokriininen erilaistuminen ja Chemoresistance Eturauhassyöpä LNCaP Cells. PLoS ONE 9 (2): e88556. doi: 10,1371 /journal.pone.0088556

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 18 marraskuu 2013; Hyväksytty: 07 tammikuu 2014; Julkaistu: 14 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat NSC avustuksia (NSC 101-2320-B-010-047-MY3) ja MMH avustukset (MMH10194). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on johtava syy syövän kuolleisuus länsimaissa ja sen esiintyvyys kasvaa nopeasti Aasiassa [1]. Androgeenipuutteen terapia (ADT) käytetään ensisijaisesti ja metastaattinen androgeeniriippuvaisissa PCa [2]. Kuitenkin 80%: sta 90%: Eturauhassyövän potilaista kehittyy kastraatio vastustuskykyisten kasvainten 3 vuoden kuluessa onnistuneen ADT. Terapeuttinen hoito Eturauhassyövän haittaavat tällaista kehitystä hormonin tulenkestävä tilassa, jolloin hormonihoito epäonnistuu, jolloin tauti tekemästä aggressiivisempi ja lopulta kohtalokas vaiheessa [3]. Yksi kiehtova mutta tutkittu ilmiö piirre hormoni tulenkestävät PCA sen yhdessä neuroendokriinisten erilaistumiseen (NED) [4]. NED on prosessi, joka on havaittu ADT [5], [6]. Yleensä solujen kasvaimen meneillään NED osoittavat, ominaisuuksia, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin NE solut ja näiden solujen kutsutaan neuroendokriinisten-, kuten (NE-like) soluja. NE kaltaisia ​​soluja ovat ei-proliferatiivisia, lopullisesti erilaistuneita, ja androgeenireseptorin (AR) -negatiivinen. Ne ovat erittäin vaikea tappaa, koska ne reagoivat huonosti hormonihoito takia puuttuu AR; Lisäksi, ne ovat resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa, koska ne eivät jaa [7]. Lisäksi ne vapauttavat useita neurokines, kemokiinien, sytokiinien ja kasvutekijöiden; tämä johtaa kasvuun leviämisen viereiset kuin NE PCa soluissa; tämä tapahtuu parakriinisesti aikana ADT. NE kaltaisia ​​soluja ovat todennäköisesti perussyitä hormoneja ja kemoterapia vastus kastraation kestävästä PCa ja läsnäolo NE kaltaisten solujen korreloi huonoon ennusteeseen [7] – [9]. Kyky tunnistaa uuden mekanismeista NED Eturauhassyövän soluja ja terapeuttisen vastus NE-kaltaisten solujen antaa uusia strategioita, jotka voivat olla soveltaa ehkäisyyn uusiutunut kastraation vastustuskykyisten PCa tai vaihtoehtoisesti kehittämiseen yhdistetyn terapeuttisen järjestelmät relapsoituneen kastraatio kestävä PCa.

NE kaltaisia ​​soluja voidaan tunnistaa perustuen morfologisia muutoksia ja ilmaus hermosolujen markkereita. Useita reittejä on osoitettu aiheuttavan NED PCA-soluissa käyttäen

in vitro

kulttuuri-järjestelmät; näitä ovat androgeenien [10] ja interlerukin-6 (IL-6) hoito [11]. Jälkimmäinen on erityisen tärkeää, koska IL-6-arvot ovat selvästi lisääntyneet potilailla, joille tehdään ADT ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin IL-6 ovat usein suurempi potilailla, joilla kastraatio kestäviä ja metastasoitunut PCa [12] – [14]. IL-6 on pleiotrooppinen sytokiini tärkeä erilaisten immuunivasteiden, solujen selviytymistä, proliferaatiota ja kasvaimen kehittymisen [15], [16]. Kanoninen IL-6 signalointireittien ovat (i) JAK-STAT3, (ii) pIK3-Akt ja (iii) MEK-ERK. Tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-6 välittää kasvun pysähtymisen ja indusoi NED PCA soluissa aktivaation kautta erottuva signalointireittien; näihin kuuluvat STAT3 [17] ja di pIK3-ETK /bmx [18]. Äskettäin Delk

et al

osoitti, että IL-6 erittämä luuydinperuskudos- solujen aiheuttama NED ja autophagy luun metastaattisen PCa solujen kautta STST3-riippumattoman reitin [19]. Siten IL-6 on ehdotettu indusoivan NED ja helpottanut PCa soluja tulossa tulenkestäviä. Tämä tekee IL-6 houkutteleva kohde terapiaan. Kuitenkin, koska sen pleiotropism kohdistaminen IL-6 on todennäköisesti aiheuttaa odottamattomia reaktioita. Parannettu ymmärrystä solujen liittyviä tapahtumia IL-6 altistuminen voi auttaa tunnistamaan mahdolliset tehokasta kohde (s) ehkäisyyn ja /tai hoitoon PCa.

Autophagy, jota kutsutaan myös macroautophagy, on merkittävä säännelty lysosomaalisen hajoamisen polku, joka eukaryoottisolut käyttää hajottamaan pitkäikäinen proteiineja ja soluelimiin vastauksena ravinnon nälkään tai metabolisen stressin. Tämä itsestään ruoansulatusta reitti on välttämätön normaalille kehitykselle ja säilyttää solunsisäisen metabolisen homeostaasin terminaalisesti erilaistuneita soluja, kuten neuroneja. Se on myös keskeinen biologinen polku, joka toimii suojata organismien vastaan ​​erilaisia ​​taudinaiheuttajia ja syöpää vastaan; se pystyy näin edistää terveyttä ja pitkäikäisyyttä. Kuitenkin, kun autophagy kaappaa syöpäsoluja, käy ilmi tapa suojata kasvainsolujen kuolemasta, ja siten pystyy antamaan lääkeainetta vastustusta syöpäsoluja. Ymmärtäminen molekyylimekanismeja liittyy autophagy alkoi vuonna 1993, kun autophagy liittyvien geenien (Atgs) oli ensimmäinen tunnistettu

S. cerevisiae

[20]. Autophagy on monivaiheinen prosessi, ja siten voidaan jakaa useisiin vaiheisiin; (I) induktio, (ii) vesikkelin ydintyminen, (iii) vesikkelin venymä ja loppuun muodostamiseksi autophagosome, (iv) telakointi ja fuusio lysosomiin muodostamiseksi autolysosome, (v) hajoamista, ja (vi) haku [21]. Tärkeimpiä ylävirtaan säätelijöinä autophagic koulutusjakson, luokan I PI3K (PI3KI) -Akt [22] ja MEK1 /Erk [23], [24] molekyylit viittaavat reseptorityrosiinikinaaseilla on mTOR; nämä toimivat keskeinen negatiivinen säätelijöinä autophagy ja siten tukahduttaa autophagy läsnäollessa insuliinin kaltainen ja muut kasvutekijä signaaleja. Mielenkiintoista, funktio luokan III PI3K (PI3KIII) on täysin päinvastainen kuin PI3KI sääntelyssä autophagy. Vuorovaikutuksessa ydin komponentin beclin1, PI3KIII kiihdyttää autophagy edistämällä rakkula ydintymis [25]. Yksi pieni mekanismeja liittyy LKB1-AMPK molekyylejä, jotka yhdistävät solunsisäisten energian tilan solujen negatiiviseen säätelyyn mTOR; tämän reitin toimii aktivoida autophagy läsnäollessa rasitukset lisäävät AMP /ATP-suhde [26]. Muita pieniä mekanismit sisältävät p53, ER stressi-Ca

2+ signalointi, ja sytoplasman STAT3. Rooli p53 autophagy on paradoksaalista ja riippuu sen subsellulaarinen sijainti [27] – [29]. ER stressin mukana Ca

2 + signalointi on myös mukana sääntelyn autophagy ja tämä tapahtuu aktivoimalla CaMKKβ riippuvaisen AMPK reitin [30], [31]. Lopuksi, sytoplasminen STAT3 estää autophagy sitoutumalla proteiinikinaasi R (PKR) ja fosforylaation inhibitiota eIF2α [32].

NE-tyyppisten solujen kehitys on riippuvainen verkon transkriptiorepresso- ja aktivaattoreita, joka ohjaa hankinnan ja huolto hermosolujen ominaisuuksia. Repressori elementti-1 hiljentäminen transkriptiotekijä /neuroni-rajoittavia hiljentäminen tekijä (lepo /NRSF) havaittiin ensimmäisen master transkription repressori, joka on vastuussa rajoittaa hermosolujen geenin ilmentyminen ei-hermosolujen [33] – [36]. Repressori sitoutuu 21 emäsparin repressori elementti 1 /neuroni-rajoittavia hiljentäminen (RE1 /NRSE) ja sitten rekrytoi tukahduttavan chromatin remodeling monimutkainen, mSin3 ja Co-REST. Tämä tapahtuu kahden tukahduttamisen verkkotunnuksen (yksi aminopäässä ja toinen karboksyylipäässä) ja tulos on epigeneettisten hiljentäminen transkription kohdegeenin [37]. Loput on erittäin ilmaistaan ​​alkion kantasolut (ESC), hermoesiastesolut (NPC) ja ei-hermosolujen, jossa proteiini: n ekspressiota vähentävän hermo spesifisten geenien, ja näin säilytetään pluripotenttisuuden talous- ja sosiaalineuvostojen ja NPC estämällä hermosolujen erilaistumiseen ei-neuronaalinen soluihin [33]. Mielenkiintoista, REST on osoitettu estävän geenin transkriptiota synaptofysiinin (SYN) [38], [39], yksi yhteinen merkkiaineiden NED PCA-soluissa. Erittäin tuoreen raportin Svensson

et al

osoitti myös, että REST välittää AR toimia ja moduloi androgeenipuutteen aiheuttaman NED PCA [40].

Jotta kohdistaa osuutta NED että eteneminen Eturauhassyövän osaksi hormoneja tulenkestävä tilassa, tässä tutkimuksessa on tarkoituksena onko IL-6 kykenee säätää ylös autophagy PCA soluissa, mikä puolestaan ​​edistää solujen NED. Tämä estää apoptoosia aikana IL-6 indusoi NED ja sen seurauksena mahdollistavat NE-tyyppisten solujen eloonjääntiä uusiutunut PCa. Ratkaistakseen meidän hypoteesi, tutkimme kyky IL-6 aiheuttaa autophagy ja NED androgeeni herkkien LNCaP. Huomasimme, että autophagy indusoi IL-6 ja sillä on keskeinen rooli IL-6 indusoiman NED. Yhdenmukainen aktivointi autophagy aikana NED, kohonnut taso LC3 voidaan havaita uusiutunut PCa kudosten ja tällainen kudos on samanlainen pesäkkeitä värjäyskuvion CGA, merkkiaine NE kaltaisia ​​soluja. Olemme tutkineet autophagy mahdollisena signaalin, joka kykenee suojaamaan PCa soluja apoptoosin ja kemoterapia lääkkeet, kuten etoposidi. Yhdenmukainen tehostettuun autophagy, AMPK aktivointi ja mTOR inhibitio osoitettiin olevan läsnä IL-6 hoidon puuttuessa androgen. Tärkeintä on, meidän Tutkimuksessa selvitetään alas-säätely REST, neurospesifinen rajoittava äänenvaimennin; Tämän todettiin olevan kriittinen NED induktion ja autophagy aktivaatio IL-6.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Plasmidit

LNCaP PCa soluja viljeltiin RPMI 1640 (Gibco /Invitrogen, 31800-014), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone, SH30071.03), 1% penisilliini /streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, P4458) ja L-glutamiinia (Sigma-Aldrich, G7513). LNCaP-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti eGFP-LC3, LNCaP-eGFP-LC3, oli luotu aiemmin [41] ja ylläpidettiin, kuten on kuvattu LNCaP, jota oli täydennetty 400 ug /ml G418: aa (Amresco, E859). Indusoituvan shRNA kasetti, H1 /TO-shRNA-linkkeri, joka sisältää BsmBI leikkaus päällä, tuotiin pLenti4 vektorin, jotta saadaan aikaan indusoituvan shRNA lentivirusvektori, eli plenti4-H1 /TO-shRNA. Indusoituvan promoottorin shRNA lauseke on hybridi H1-promoottorin ja tet-operaattori (Invitrogen, H1 /TO). ShRNA kasetti beclin1 (5′-CACCGGTCTAAGACGTCCAACAACACGAA TGTTGTTGGACGTCTTAGACC-3 ’), Atg5 (5′-CACCAAGCAACTCTGGATGGG ATTGCGAACAATCCCATCCAGAGTTGCTT-3′) ja muu (5’-CACCGTGTAA TCTACAGTATCACCGAAGTGATACTGTAGATTACAC-3 ’) on yksittäin insertoitiin plenti4-H1 /TO- shRNA ja nämä tuotiin sitten LNCaP-TR-solujen lentivirus transduktion. Solut valittiin 14 päivää käyttäen 50 ug /ml zeocine (InvivoGen, ant-zn-1). Knockdown tehostunut beclin1, Atg5 ja REST jonka shRNAs testattiin hoidetaan doksisykliini (Dox) 48 tunnin ajan. LNCaP-TR-shBeclin1, LNCaP-TR-shAtg5, LNCaP-TR-shREST ylläpidettiin, kuten on kuvattu LNCaP, jota oli täydennetty 5 ug /ml blastisidiini S (InvivoGen, ant-bl-1) ja 50 ug /ml zeocine .

fluoresenssimikroskopialla

LNCaP-soluja maljattiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin peitelaseille (Marienfeld, 0111530) ja käsittelyn jälkeen, kuten on osoitettu, ne fiksattiin 4% paraformaldehydillä 1 × PBS: ssä 15 minuutin ajan. Seuraavaksi peitelaseja asennettu asennusratkaisu [20 mM n-propyyligallaatti, 80% glyseroli, 20% 1 x PBS], ja visualisoidaan faasikontrastimikroskopiaan (Lecia, DMI4000B). Pituus neuriitteja peitelasit analysoitiin MetaMorph (Molecular Devices,: n neuriitin kasvua). LNCaP-solut osoittavat alhainen perustason NED normaaleissa viljelyolosuhteissa (RPMI 1640 täydennettynä 10% FBS). Keskimääräinen neuriittien pituuden ohjaus soluja viljeltiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää kussakin kokeissa käytettiin 1, ja vertailu tehtiin sitten neuriitin pituus on saatu sen jälkeen, kun IL-6-hoitoja. LNCaP-eGFP-LC3 soluja valmistettiin edellä kuvatulla tavalla LNCaP-soluja lukuun ottamatta värjäämällä Hochest 33258 (Invitrogen, H3569) ennen asennusta. EGFP-LC3 kuvia visualisoitiin käyttäen Lecia DMI4000B fluoresenssi mikroskooppi, jossa on 63 x linssin ja analysoitiin MetaMorph (Molecular Devices, Transflour). LNCaP-solut osoittavat alhainen perustason autophagy normaaleissa viljelyolosuhteissa. Erottaa autophagy induktio, solujen näyttämään enemmän kuin 50 intensiivistä eGFP-LC3 aggregaatteja 5-7,5 um ja 15 intensiivistä eGFP-LC3 aggregaatit 7,5 20pm laskettiin niin autophagy-positiivisten solujen induktion jälkeen.

Western blot ja vasta-aineet

Yhteensä solulysaateista (TCLs) valmistettiin soluista käyttäen NP-40-hajotuspuskuria [0,5% NP-40 (Amresco, E109), 1 x PBS: ää, 1 x proteaasi-inhibiittorit (Roche, 04693132001) ]. Proteiinipitoisuus kunkin näytteen mitattiin sitten käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä värireagenssia ja valmistajan protokollan (Bio-Rad, 500-0006). Immunoblottausta, yhtäläiset määrät proteiinia ladattiin ja erotettiin 6%, 8% tai 15% SDS-polyakryyliamidigeelillä, kuten on tarkoituksenmukaista. Erotetut proteiinit siirrettiin sitten geelistä 0,45 um huokoskoko PVDF-kalvoille (GE Healthcare, RPN303F). Seuraavaksi kalvot estettiin estopuskurilla [5% BSA 1 x TBST]. Ensisijainen vasta-aineet p-Akt (Ser473) (Soluviestintä, # 9271), Akt (Soluviestintä, # 9272), p-mTOR (Ser2248) (Soluviestintä, # 2976), mTOR (Soluviestintä, # 2983), s -STAT3 (Tyr705) (Soluviestintä, # 9145), STAT3 (Soluviestintä, # 9139), p-Erk (Thr202 /Tyr204) (Soluviestintä, # 9101), Erk (Santa Cruz Biotechnology, sc154), p-AMPK (Thr172) (Soluviestintä, # 2535), AMPK (Soluviestintä, # 2793), LC3B (Soluviestintä, # 2775), beclin1 (Soluviestintä, # 3738), Atg5 (Soluviestintä, # 2630), tubuliinin III ( Soluviestintä, # 5666), androgeenireseptorin (Millipore, 06-680), REST (Millipore, 09-019), ja GAPDH (GeneTex, GTX100118) laimennettiin 5% BSA 1 x TBST. Sitten membraanit tutkittiin eri primaaristen vasta-aineiden, sitten käsitellään sopivalla sekundaarisella vasta-aineella. Lopuksi kalvot visualisoitiin käyttäen Pierce ECL Western blotting alusta (Thermo Scientific, 34080) ja kuvattiin kautta Luminenssi /fluoresenssi Imaging System (FUJIFILM, LAS-4000).

immunohistokemia Värjäys (IHC-värjäys)

parafinoidut näytteitä primaarisessa ja uusiutunut kastraatio kestävä PCa joka oli kerätty vuosina 1990 ja 2010 Mackay Memorial Hospital olivat mukana tässä tutkimuksessa. Ethics hyväksyi Mackay Memorial Hospital Institute Review Board. Tietoon perustuva suostumus oli kirjoitettu. Kudosleikkeet poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät kautta lajitellut etanolia (100, 90, 80, 70, 50%), altistettiin antigeenille noudettavaksi microwaving 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 10 minuutin ajan, blokattiin endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus 3 % H

2O

2 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten tukossa vasta-laimentimen sisältävä tausta vähentävää komponentit (DAKO, S302281). Lopuksi objektilasit värjättiin yön yli 4 ° C: ssa beclin1 (GeneTex, GTX61619), LC3 (Novus Biologicals, NB110-57179), REST (BETHYL, IHC-00141), tai CGA (Abcam, ab15160) spesifisiä vasta-aineita ja visualisoitiin protokollaa käyttäen 3-amino-9-etyylikarbatsolia (AEC), kuten (DAKO, K346430) läsnä ollessa hematoksyliinillä counterstaining. Histologia ja värjäytyminen arvioitiin patologina sokkotavalla käyttäen neliportainen asteikko edustaa negatiivinen (0), heikko (1), keskitason (2), ja vahva (3) signaaleja.

3 – (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) Pitoisuus

LNCaP, LNCaP-TR-shBeclin1, ja LNCaP-TR-shAtg5 solut ympättiin 96-kuoppaisille levyt, viljeltiin kaksi päivää, ja sitten käsiteltiin kuten on esitetty. Seuraavaksi solujen elinkelpoisuus tutkittiin MTT: llä (Sigma-Aldrich, M5655). MTT lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0,5 mg /ml ja formatsaanikiteet liuotettiin 10% SDS. Optinen tiheys (OD) kvantitoitiin käyttäen mikrolevyn spektrofotometriä aallonpituudella 570 ja 660 nm.

kaspaasi-3/7 ELISA-määritys

LNCaP-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille . Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin, kuten on ilmoitettu. Kaspaasi 3/7 aktiivisuuden tasot mitattiin sitten käyttäen Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (Promega, TB295) mukaan valmistajan protokollaa. Soluja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa seoksen kanssa alustan ja reaktiopuskuria. Kaspaasi-3/7 toiminta oli sitten mitataan fluoresenssi mikrolevynlukijaa (Tecan Systems, Infinite 200).

Reverse Transcription (RT) ja Kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

Kokonais-RNA eristettiin ulkopuolisten aiheuttama ja Dox aiheuttama LNCaP-TR-shREST soluihin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, 15596-018). Kokonais-RNA (2 ug), tehtiin käänteistranskriptio käyttäen Oligo-dT ja SuperScript

III RT (Invitrogen, 18080-085). MRNA tasot eri geenit määritettiin sitten qPCR ja normalisoidaan GAPDH.

Tulokset

IL-6 ja androgeenideprivaatio synergistisesti Pakotettava Autophagy LNCaP Solut

Lisääntyvä näyttö on osoittaneet, että autophagy on tärkeä rooli tukemisessa neuronaalista erilaistumista [42] – [44]. Uudempi tutkimus osoittaa myös, että antophagy voi olla keskeinen rooli IL-6 indusoi NED luu- metastaattisen PCa soluihin [19]. Seerumin IL-6 on havaittu lisääntyvän potilailla, joille tehdään androgeenipuutteen terapia (ADT) [12], [14]. Androgeenipuutteen [45] ja IL-6 [18] on löydetty myös vastuussa NED kehittämiseen ja PCa immuuniksi ADT. Tutkia, autophagy aktivoidaan yhdessä NED Eturauhassyövän solu ADT, androgeenideprivaatio ja IL-6 yhdistelmähoito käytettiin täällä. LNCaP-solulinja, androgeeni-herkkä ihmisen eturauhasen adenokarsinoomasolulinja nopeasti hankkii NE ominaisuudet, mukaan lukien lopettaminen mitoosia, Neuriittilaajentumisen ja parannettu ekspressio neuronaalisen markkereita, kuten tubuliini III, kun stimuloidaan, valittiin tutkimukseen. LNCaP-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti eGFP-LC3, nimittäin LNCaP-eGFP-LC3 soluja, viljeltiin säännöllisesti, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2,5%

hiili /dekstraani

hoidetun FBS (

CDT

) ( androgeenin puutteen ehto), tai 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6. Autophagosomic soluja (solujen GFP-LC3-II punctation) oli määrä käyttää kiinteitä LNCaP-soluja 48 tunnin kuluttua hoidon. Androgeenipuutteen lisäsi solujen käynnissä autophagy 41% (Fig. 1). IL-6 yksin määrä kasvoi autophagic solujen 17% (Fig. 1). Mielenkiintoista on, että solujen lukumäärä, joille autophagy indusoiman IL-6 alle androgeenipuutteen on merkittävästi parannettu edelleen 87% (Fig. 1). Induktion NED mukaan androgeenideprivaatio ja IL-6 hoito varmistettiin käyttämällä LNCaP. Neuriittien pidentyminen, tyypillinen fenotyyppiä NED soluja, havaittiin (Fig. 2A ja 2B). Kiehtovan aste autophagy induktio korreloi voimakkaasti aste NED keskuudessa LNCaP. Tämä korrelaatio vahvistettiin lisäksi Western blot -analyysillä. IL-6-hoito lisäsi merkittävästi ekspressiota neuroni-markkeri, tubuliinin III ja muuntaminen LC3-I LC3-II (Fig. 2C). Tulosten perusteella näyttää, että aktivointi autophagy saatetaan tarvita IL-6-aiheuttama NED alle androgeenideprivaatioterapian olosuhteissa.

(A) LNCaP-eGFP-LC3 solut olivat kulttuuri 10% FBS, 2,5% FBS tai 2.5 % CDT täydennettyä RPMI 1640 ilman (kontrolli) ja läsnä oli 100 ng /ml IL-6: ssa 48 tuntia. Tätä seurasi kiinnittäminen, ydin- counterstaining DAPI (sininen), ja analyysi fluoresenssimikroskopialla (FITC, 63-kertainen suurennus). (B) Kunkin käsittelyn prosenttiosuus solujen eGFP-LC3 pistemäinen laskettiin käyttäen keskiarvoa 15 mikroskooppikentäs-;

baareja

, SD.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 2,5% CDT tai 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6: ssa 48 tuntia. Indusoituneen neuriittien pidentyminen arvioitiin käyttäen brightfield mikroskoopilla kuvia (40-kertainen suurennus). (B) toinen neuriittien pidentyminen kvantifioitiin käyttäen keskimääräistä 3-5 mikroskooppikentäs-;

baareja

, SD. (C) LNCaP-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Kokosoluliuotteista (TCLs) valmistettiin ja sitten immunoblotattu havaita tubuliinin III, androgeenireseptorin (AR) ja LC3. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus.

Autophagy inhibitio vaimentaa NED LNCaP-soluissa

Sen määrittämiseksi, onko autophagy induktio on välttämätöntä IL-6-indusoidun NED mukaisesti androgeenien olosuhteissa, me estävät autophagy käyttäen klorokiinin (CQ), joka on autophagy inhibiittori, joka estää toiminnan lysosomissa. Kuten kuviossa 3A, SA (50 uM) esti voimakkaasti IL-6 aiheuttama NED LNCaP-soluissa ja pienensi hieman erilaistumista aiheuttama androgeenien puute. Kvantifiointi neuriittien pituuden mukaan MetaMorph osoitti oli myös merkittävä inhibitio tämän fenotyypin (Fig. 3B). CQ voi olla ei-spesifisiä vaikutuksia kuin inhibition autophagy kautta. Edelleen vahvistaa, että on tärkeää, että autophagy polku IL-6-indusoidun NED mukaisesti androgeenien olosuhteissa, käytimme pieni hiusneula-RNA: iden (shRNAs), shBeclin1 ja shAtg5, että pudotus ilmaus beclin1 (Atg6) ja Atg5, kaksi Atg geenit välttämättömiä autophagy aloittamista ja autophagosome muodostumista, vastaavasti. Ensinnäkin, loimme shBeclin1 indusoitavissa knockdown solulinjassa ja shAtg5 indusoitavissa knockdown solulinjan LNCaP-soluissa, nimittäin LNCaP-TR-shBeclin1 ja -shAtg5. Immunoblottaus osoitti, että sekä shRNAs pystyivät pudotus tavoitteensa onnistuneesti (Kuva. 4A ja 5A). Mielenkiintoista on, beclin1 pudotus soluilla on huomattavasti alhaisempi NED kuin kontrollisolut (kuvio. 4B ja 4C), ja samanlainen tulos havaittiin Atg5 pudotus-soluissa (kuvio. 5B ja 5C). Kvantifiointi tiedot osoittivat, että sekä Atg5 ja beclin1 pudotus on merkittävä inhibitio tehokkuutta IL-6 indusoi NED (Fig. 4C ja 5C). Yhdenmukainen solujen morfologia, esto NED lakkauttamalla beclin1 ja Atg5 tunnistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä tubuliinia III vasta-ainetta (Fig. 4D ja 5D). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että autophagy reitti on välttämätöntä PCa solut tehdään NED.

(A) LNCaP-eGFP-LC3 soluja käsiteltiin 2,5% CDT tai 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL- 6 puuttuessa ja läsnä oli 50 uM klorokiinin (CQ) 48 tunnin ajan. Tätä seurasi kiinnittäminen, ydin- counterstaining DAPI (sininen), ja analyysi fluoresenssimikroskopialla (FITC, 40-kertainen suurennus). (B) toinen neuriittien pidentyminen kvantifioitiin käyttäen keskimääräistä 3-5 mikroskooppikentäs-;

baareja

, SD.

(A) LNCaP-TR-shBeclin1 soluja käsiteltiin 1 ug /ml Dox 48 tuntia. TCLs valmistettiin ja immunoblotattiin havaitsemaan beclin1 käyttämällä GAPDH kuin latauskontrollina. (B) LNCaP-TR-shBeclin1 soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 1 ug /ml Dox jotta aiheuttaa knockdovvn beclin1 ja niitä käsiteltiin sitten vielä 48 tuntia 2,5% CDT eli 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL -6 aiheuttamaan soluissa NED. Esto neuriittien pidentymisen beclin1 Knockdown arvioitiin käyttäen brightfield mikroskoopilla kuvia (40-kertainen suurennus). (C) hermosolujen pidennys mittaamaan keskimääräistä 3-5 mikroskooppikentäs-;

baareja

, SD. (D) TCLs saatiin LNCaP-TR-shBeclin1 solut, joita käsiteltiin, kuten on kuvattu (A) ja nämä analysoitiin sitten immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

(A) LNCaP-TR-shAtg5 solujen käsiteltiin 1 ug /ml Dox 48 tuntia. TCLs valmistettiin ja immunoblotattiin havaitsemaan Atg5 käyttämällä GAPDH kuin latauskontrollina. (B) LNCaP-TR-shAtg5 soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 1 ug /ml Dox aiheuttaa knockdovvn Atg5 ja sitten käsiteltiin vielä 48 tunnin ajan 2,5%: CDT tai 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6 aiheuttaa solu NED. Esto neuriittien pidentymisen Atg5 Knockdown arvioitiin käyttäen brightfield mikroskoopilla kuvia (40-kertainen suurennus). (C) hermosolujen pidennys mittaamaan keskimääräistä 3-5 mikroskooppikentäs-;

baareja

, SD. (D) TCLs saatu LNCaP-TR-shAtg5 solut, joita käsiteltiin, kuten on kuvattu (A) ja nämä analysoitiin sitten immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

Autophagy Gene Expression in Primary ja Relapsivaiheessa PCa näytteet

edellä esitetyt havainnot osoittavat, että autophagy voidaan aktivoida yhdessä NED PCA soluissa aikana hormonin tulenkestävä uusiutumisen. Luonnehtia suhde autophagy ja NED PCA soluissa, tutkimme ilmaus CGA, joka on NE tuumorimarkkeri ja ilmaus LC3, joka on autophagy sukulaisgeenejä, kolmessatoista paria ensisijainen ja hormoni tulenkestävät uusiutunut PCa kudosnäytteiden parit on saatu samasta potilaasta. Edustavia immunohistokemia (IHC) tulokset CGA ja LC3 on esitetty kuvassa 6. Positiivinen CGA värjäytyminen osoittaa pesäkkeitä kuvio (Fig. 6, suljettu nuolet), joka on tyypillinen piirre NE solujen uusiutunut PCa yksilöt; mutta tämä malli ei ollut läsnä ensisijainen PCa yksilöitä. On kiinnostavaa, että pesäkkeitä värjäytyminen LC3 havaittiin myös uusiutunut PCa yksilöt (Fig. 6, avoimet nuolet). Out of kolmetoista paria PCa yksilöitä, 8 (62%) osoitti merkittävää kasvua LC3 lauseke (keskiarvo LC3 immunoreaktiivisuus (IR) ensisijaisen ja uusiutunut PCa kasvain oli 0,51 ja 1,12, vastaavasti; P 0,005) uusiutunutta PCa kudoksessa vertaamalla niiden primaarikasvaimen vastine.

edustaja IHC värjäys kuvia kaksi paria kudosnäytteiden, nimittäin ensisijainen ja uusiutunut PCa näytteet samasta yksilöstä, värjättiin käyttäen anti-LC3, anti-CGA, ja anti-REST vasta .

Autophagy indusoima IL-6 Suojaa NE Differentiated LNCaP solut Cell Death

Autophagy on tärkeää ylläpito homeostaasiin terminaalisesti erilaistuneita soluja [46]. Se havainto, että autophagy on hermosoluja suojaava [47] ja että autophagy indusoi IL-6 sai meidät oletuksen, että autophagy voi toimia suojamekanismi ylläpitää homeostaasiin ja eloonjäämisen lisäämiseksi IL-6-indusoidun terminaalisesti erilaistuneita NE kaltaisia ​​soluja . Jos näin on, solun tappaminen tulisi tehostua, jos autophagy estyy. Tätä varten suoritimme MTT-määritys tunnistaa roolia autophagic väylän IL-6 indusoi kasvun pysähtymisen ja kestävyys solukuolemaa. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten IL-6 indusoi kasvun pysähtymistä LNCaP-soluissa (kuvio. 7A). Kun autophagy inhiboitui käsittelemällä CQ, tämä indusoi merkittävää kasvua solukuolemaan joukossa IL-6 käsiteltyjen LNCaP-solut (Fig. 7A). Lisääntynyt solujen tappaminen havaittiin olevan suurelta osin parannettu apoptoosin, osoituksena, että läsnä on merkittävä kasvu kaspaasi-3/7 aktiivisuutta 48 tunnin kuluttua IL-6 plus CQ yhdistelmähoidon (Fig. 7B). Nämä havainnot osoittavat ensimmäisen kerran, että inhibitio autophagy pystyy voittamaan apoptoosin vastus IL-6-indued NE erilaistuneita soluja, ja osoittavat, että autophagy on perimmäinen syy takana chemoresistance NE-kaltaisten solujen.

(A) LNCaP-soluja viljeltiin 2,5%: CDT täydennettyä RPMI 1640 ja käsiteltiin sitten 100 ng /ml IL-6: n tai ajoneuvon hallinnan läsnä ollessa tai poissa ollessa 50 uM SA. Solujen lukumäärät analysoitiin käyttäen MTT-solunelinkykyisyysmääritys osoitetuissa aikapisteissä.

Pisteitä

, tarkoittaa;

baareja

, SD. (B) LNCaP-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A), ja sitten määritettiin kaspaasi-3/7 aktiivisuus ilmoitettuina ajankohtina. Kukin datapiste näkyy on keskiarvo kolmen erillisen kokeen;

baareja

, SD.

suojaava rooli autophagy vuonna chemoresistance NE eriytetty PCa solujen kemoterapeuttisten lääkkeiden, kuten etoposidi varmistettiin sitten seuraavat havainnot. Kuten odotettua, etoposidi voinut tappaa IL-6 aiheuttama NE eriytetty LNCaP. Mielenkiintoista, etoposidi indusoi tilastollisesti merkittävän kasvun solukuoleman jälkeen knockdovvn joko beclin1 tai Atg5 NE eriytetty LNCaP-soluja, jotka oli indusoitu IL-6 alle androgeenideprivaatio olosuhteissa (Fig. 8). Kun yhdessä edellä havainnot viittaavat siihen, että autophagy indusoi IL-6 kykenee suojaamaan IL-6-indusoidun NE eriytetty LNCaP-solujen apoptoottisen solukuoleman ja että inhibitio autophagy voi kumota apoptoosiresistenssiin sekä kemoterapiaa resistanssi liittyy NE-, kuten PCa soluja.

LNCaP-TR-shBeclin1 (A) ja LNCaP-TR-shAtg5 (B) soluja käsiteltiin Dox 48 tunnin ajan indusoi joko beclin1 tai Atg5 pudotus, vastaavasti, tai ne jätetään hoitamatta.