Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eksosomit ovat nanometrin kokoisia solunulkoinen rakkulat, joiden uskotaan toimivan solujenvälisinä kommunikaattori. Täällä me raportoimme että eksosomeiksi pystyvät muuttamaan säteilyn vastaus pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja BHY ja Fadu. Eksosomeiksi eristettiin väliaine säteilytetyn sekä ei säteilytetty pään ja kaulan alueen syöpäsoluja serial sentrifugoimalla. Kvantifiointi käyttävät NanoSight tekniikkaa osoitti lisääntynyt eksosomi vapautumista säteilytettyjen verrattuna ei-säteilytetty solut 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Sen testaamiseksi, vapautetaan eksosomeiksi vaikuttavat säteilyn vastetta muiden solujen eksosomeiksi siirrettiin ei säteilytetty ja säteilytettyjä vastaanottajan soluja. Olemme löytäneet parantunutta sisäänottoa eksosomeiksi eristetty sekä säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen soluja säteilytettyjen vastaanottajan solujen verrattuna ei-säteilytetty vastaanottajan soluja. Toiminnalliset analyysit eksosomi siirto osoitti, että kaikki eksosomeiksi (ei-säteilytettyä ja säteilytettyjen luovuttajan soluja) lisäävät leviämisen ei säteilytetty vastaanottaja solujen ja selviytymisen säteilytettyjen vastaanottajan soluja. Selviytymisen edistävät vaikutukset ovat selvempiä, kun eksosomeiksi eristetty säteilytettyjen verrattuna ei säteilytetty luovuttajan solut siirretään. Mahdollinen mekanismi elonjäämisetua säteilytyksen jälkeen voisi olla lisäys DNA double-lohkon murtuma korjaus seurattiin 6, 8 ja 10 tuntia siirron jälkeen eksosomeiksi eristettyjen säteilytettyjen soluista. Tämä on kumonnut epävakautta eksosomeiksi. Tuloksemme osoittavat, että säteily vaikuttaa sekä runsaasti ja toiminnan eksosomeiksi Vastaanottajaa soluissa. Eksosomit lähettävät prosurvival vaikutuksia edistämällä leviämisen ja radioresistance pään ja kaulan syöpäsoluja. Yhdessä tämä tutkimus osoittaa toiminnallista roolia eksosomeiksi vasteessa syöpäsolujen säteilylle altistumisen sisällä terapeuttisilla annoksilla ja rohkaisee että eksosomeiksi ovat hyödyllisiä tutkimuskohteita ymmärtää paremmin kasvaimen säteilyn vasteen.

Citation : Mutschelknaus L, Peters C, Winkler K, Yentrapalli R, Heider T, Atkinson MJ, et ai. (2016) Eksosomit Johdettu Squamous pään ja kaulan alueen syövän edistää solujen Survival jälkeen ionisoivaa säteilyä. PLoS ONE 11 (3): e0152213. doi: 10,1371 /journal.pone.0152213

Editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE

vastaanotettu: 16 marraskuu 2015; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2016; Julkaistu: 23 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Mutschelknaus et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

lyhenteet: DMEM, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine; DSB, double-lohkon murtuma; EXO, eksosomeiksi; HNSCC, pään ja kaulan okasolusyöpä

1 Johdanto

Eksosomit ovat alaluokka solunulkoisen mikrovesikkelien, jotka erittävät useimmissa solutyypeissä, mukaan lukien kasvainsolut. Ne ovat endosyyttisiin alkuperältään ja vapautuu solun ympäristön fuusion sytosolin multivesikulaarisen elinten kanssa solukalvon. Eksosomi lastin sisältää laajan valikoiman proteiineja, mRNA: iden, MikroRNA ja pitkän ei-koodaavat RNA: t [1-4]. Funktionaaliset tutkimukset paljastavat, että eksosomeiksi toimivat solunulkoisen kommunikaattori toimittaessaan sisällön kohdesoluun kautta kalvofuusioon, tai vaihtoehtoisesti endosytoosin [5]. Vuonna 2007 Valadi et al. osoittivat, että eksosomeiksi pystyvät shuttle RNA solujen välillä. Siirto Hiiren syöttösolujen eksosomeiksi ihmisen syöttösoluista aiheuttaa käännöksen hiiren mRNA, jotka osoittavat, että toimitettu RNA-molekyylit ovat toiminnallisia vastaanottaja soluissa [3].

Absorbed eksosomeiksi pystyvät muuttamaan biologisiin toimintoihin vastaanottajan solut, joissa ne voivat antaa uuden fenotyypin, kuten etäpesäkkeiden [6], angiogeneesi [7] ja muuttoliike [8]. Exosomal koostumus solunulkoiseen ympäristöön on modifioitu solu stressitekijöitä, mikä muuttui, enimmäkseen suojaavia vaikutuksia, kun vastaanottaja soluihin. Näin eksosomeiksi peräisin soluista alttiiksi oksidatiivista stressiä kestämään oksidatiivista stressiä vastaan ​​ei-alttiina vastaanottajan solut [9]. Rintasyövän solulinjoissa, hypoksia lisää myös vapautumista eksosomeiksi kuljettaa suurempia määriä miR-210. Tämä parantaa selviytymisen ja invaasion vastaanottajan solujen [10]. Yhteydessä ionisoivan säteilyn eksosomeiksi peräisin säteilytettyjen glioomasolujen parantaa kulkeutumista vastaanottajan glioomasoluihin [11]. Eksosomit voi vaikuttaa näin viestintä säteilyn vaikutuksista välillä ei-kohdennettu ja kohdennettuja soluja (sivullisten kaltainen signalointi), kuten perimän epävakaisuuden [12-14].

okasolusyöpää ovat yhteisiä pahanlaatuisten pään ja kaulan alueella . Radiochemotherapy tai sädehoito on yleisin hoito HNSCC (pään ja kaulan okasolusyöpä) potilaille, joilla on paikallisesti edennyt ja leikkaushoitoon kasvaimia [15]. Kuitenkin hoito vastus ja kasvaimen uusiutumisen on suuri haaste ja niiden mekanismeja ei ymmärretä hyvin. Koska eksosomeiksi on syntymässä toimijoita lääkeresistenssin pyrimme arvioimaan, eksosomeiksi voivat vaikuttaa säteilyn vastaus pään ja niskan levy- karsinoomasoluja [16-19]. Tätä varten määritimme vaikutus ionisoivan säteilyn sisällä kohtalaisesti annoksesta range eksosomi vapautumista ja imeytymistä HNSCC. Sen analysoimiseksi oletetun toiminnallista roolia eksosomeiksi lisäsimme eksosomeiksi eristettiin differentiaalisesti säteilytettyjen luovuttajan soluja, ja analysoitiin johtuvia vaikutuksia lisääntymistä, eloonjääntiä ja DNA korjaus vastaanottajan HNSCC jälkeen käsittely ionisoivalla säteilyllä.

2 Materiaalit ja menetelmät

2.1 Soluviljely ja säteilytys

Pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja BHY (DSMZ no .: ACC 404) ja Fadu (ATCC

®HTB43

™) inkuboitiin 37 ° C ja ilman suhteellinen kosteus 95%. BHY soluja viljeltiin korkea glukoosi DMEM elatusaineessa (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine, Gibco) plus 10% vasikan sikiön seerumia (Bio SELL), 2 mM L-glutamiinia ja natriumpyruvaattia 10% CO

2. Fadu soluja ylläpidettiin alhainen glukoosi (DMEM, GE Healthcare), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia ja 25 mM HEPES 5% CO

2. Solulinjaa identiteetit todensi sekvensoimalla yhdeksästä eri loci: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, VWA, TH01, AM, TPOX, CSF1PO (suoritetaan Eurofinsille Genomics, S1 ja S2 taulukot). Mycoplasma seulonta paljasti negatiivisia tuloksia.

Solut säteilytettiin γ-säteet synnyttämä

137caesium lähteen säteilytyslaitosta HWM-D2000 (Wälischmiller Engineering) annosnopeushälytyksellä 1 Gy kohden 2,04 minuuttia.

2.2 eristäminen eksosomeiksi

eristämiseksi eksosomeiksi protokollan Théry et al. mukautettiin [20] (kuvio 1A). 5 x 10

5 solua siirrostettiin 10 cm: n petrimaljaan, 72 tuntia myöhemmin väliaine korvattiin 8 ml eksosomi-elatusaineella ja soluja säteilytettiin yli kohtalainen annosvälillä 0-9 Gy. Eksosomit eristetty ei-säteilytetty soluissa sai lyhenne EXO 0 Gy, kun taas eksosomeiksi alkaen säteilytettyjä soluja nimettiin EXO 3 Gy, EXO 6 ja EXO 9 Gy. Eksosomi eristäminen johdetaan kunnostettua alustaa kerättiin 24 ja 48 tuntia säteilytyksen jälkeen. Poistamiseksi irrottaa solut, kuolleiden solujen sekä solujen fragmentteja, soluviljelmän supernatantti sentrifugoitiin 10000 g: ssä 30 minuutin ajan ja sen jälkeen suodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 0,22 um. Ultrasentrifugointinopeutta askel 100000 g mahdollisti laskeutumisen eksosomeiksi (75 minuuttia, 4 ° C). Supernatantti heitettiin pois ja exosomal pelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan PBS: ää. Toistamisen jälkeen toisen ultrasentrifugoimalla vaiheen (100000 g) supernatantti heitettiin pois ja eksosomeiksi suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Exosomal valmisteita säilytettiin -20 ° C: ssa. Eksosomi luovuttajan solut kerättiin 24 ja 48 tuntia säteilytyksen jälkeen käyttämällä solukaavinta. Pesun jälkeen solupelletti kahdesti PBS: llä, pelletti jäädytettiin -20 ° C: ssa. Valmistamiseksi eksosomi-väliainetta, naudan eksosomeiksi poistettiin vasikan sikiön seerumia sentrifugoimalla 100.000 x g 14 tuntia.

(A) kaaviossa on eksosomi analyysi. (B) Transmission elektronimikroskoopilla osoittaa eksosomeiksi eristää soluviljelmän supernatantista 3 Gy-säteilytetty BHY soluihin [Mittakaavapalkki: 100 nm]. (C) edustaja immunoblottia HSP70, aktiini, CD63 ja kalneksiini suoritettiin eksosomi lysaatit (EXO) ja solulysaateista (CP) kerättiin 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. DMEM, DMEM täydennetty eksosomi-köyhdytettyä naudan sikiön seerumia sekä supernatanttia ultrasentrifugoinnin jälkeen ladattiin verrokkeina. (D) Koko jakelu eksosomeiksi ei-säteilytetty BHY soluissa mitataan NanoSight tekniikkaa. (E) Suhteellinen eksosomi runsaasti BHY eksosomeiksi eristetty 24 tuntia säteilytyksen jälkeen 0, 3, 6 ja 9 Gy [n = 6, p-arvo 0.05].

2.3 elektronimikroskopia eksosomeiksi

laimentamaton näyte (eristetty 3 ml väliainetta) imeytettiin hehku purkautuu hiilellä pinnoitettu verkot (G2400C Plano) 2 minuuttia. Liuos kuivattiin imupaperilla ja niiden negatiivisesti värjättiin 4% ammoniummolybdaattia (Sigma-Aldrich) liuokseen 30 sekunnin ajan. Skooppivalokuvat tallennettiin Jeol JEM 100CX elektronimikroskoopilla 100 kV päälle Kodak SO163 elokuva. Negatiivit olivat digitoitu kanssa Hasselblad Flextight X5 skanneri 3000 dpi, jolloin pikselikoko 0,25 nm /px. Visualisointiin kuvat oli binned 1 nm /px.

2.4 eksosomi määrällistä ja määritys exosomal koon jakauma

eksosomi määrä ja kokojakauma analysoitiin käyttämällä NanoSight LM10 (Malvern) mikroskoopilla. Eksosomi valmisteet (eristetty 5 ml väliainetta) laimennettiin 1: 100-1: 2000 H

2O saavuttaa 15-50 partikkeleita kehystä kohti seuranta. Näytteet olivat kukin analysoitiin kolme kertaa 30 sekunnin ajan.

2,5 eksosomi oton

Eksosomit (eristetty 15 ml elatusainetta), värjättiin vihreän fluoresoivan väriaineen PKH67 (MINI67-1KT, SIGMA-Aldrich Chemie). Tätä varten 50 ui eksosomi liuosta suspendoitiin uudelleen 250 ui laimennusainetta C plus 1,5 ui väriaine (1 mM). Sen jälkeen, kun oli inkuboitu 10 minuuttia huoneen lämpötilassa liiallisen väri poistettiin käyttäen eksosomi Spin -pylväitä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Koska ohjata yhtä paljon väriainetta laimennusaineessa C plus 50 ui PBS: ää käsiteltiin samanlainen eksosomeiksi (eksosomi negatiivinen kontrolli, -ekso).

mittaamiseksi ottoa eksosomeiksi 50000 solua 200 ul: ssa väliaineessa ympättiin 48 kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua yhtä suuria määriä PKH67-värjätty eksosomeiksi lisättiin säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen vastaanottajan soluja. Kun oli kulunut vielä 3, 6, 8, 10 ja 24 tunnin kuluttua solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää. Sisäänotto mitattiin FACSCAN LSRII (Becton-Dickinson, viritys = 490 nm, emissio = 502 nm). Sillä fluoresenssimikroskopiaan solut pestiin kolme kertaa PBS kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä pestään jälleen PBS: llä ja peitettiin Vectashield

® lukien Hoechst 33342 varten ytimiä värjäystä. Kuvat on otettu fluoresenssi mikroskooppi BZ-9000 alkaen Keyence.

2.6 inkubointi vastaanottajan solujen eksosomeiksi

määrittämiseksi biologinen aktiivisuus eksosomeiksi (lisääntymistä, eloonjääntiä ja DSB korjaus) Inkuboimme vastaanottaja solut eksosomeiksi eristettiin sama määrä luovuttajan soluja. Eksosomeiksi otettiin talteen otetaan määriä antamaan kolminkertainen pitoisuus eksosomeiksi verrattuna luontaiseen olosuhteissa.

2,7 leviämisen ja klonogeeniset selviytymisen siirtämisen jälkeen eksosomeiksi

vaikutus eksosomeiksi proliferaatioon oli määritettiin Presto Blue

™ elinkykyyn Reagent Protocol (Life Technologies). 500 tai 1500 solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppaisille levyille 100 ul: ssa eksosomi-väliaineessa. 24 tunnin kuluttua eksosomeiksi (eristetty 300 ui elatusainetta) lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 72 tuntia. Mittaamiseen soluproliferaation 10 ui Presto Blue reagenssia lisättiin per kuoppa, inkuboitiin 40 minuuttia 37 ° C: ssa, ja fluoresenssi määritettiin (eksitaatio 560 nm: ssä; Emissio: 590 nm) on (TECAN).

selviytymisen määritelmän tekemisessä klonogeeniset selviytymisen määritys suoritettiin. Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja näennäistä käsitelty tai säteilytetään 1, 2, 3, 6 ja 10 Gy. Välittömästi tämän jälkeen, eksosomeiksi (2,5 ml elatusainetta) siirrettiin solut, jotka inkuboitiin sitten 5 päivää, jotta pesäkkeiden muodostumisen yksittäisistä soluista. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 100% etanolia (30 minuuttia) ja lopuksi värjättiin Giemsa-liuoksella (Boehringer Ingelheim, 1:20 PBS: ssä, 30 minuuttia). Liiallinen väri poistettiin ja pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 30 solusta, laskettiin.

2,8 Detection of DNA double-strand katkoksia siirtämisen jälkeen eksosomeiksi

1000 6000-solut ympättiin 96-kuoppalevyille. Saavutettuaan yhtymäkohta 50-70% väliaine korvattiin 100 ul: eksosomi-elatusainetta, solut heti säteilytettiin 2 Gy ja eksosomeiksi eristettiin 300 ui väliainetta lisättiin. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 1, 6, 8 tai 10 tuntia 37 ° C: ssa useita DNA DSB: t määritettiin 53BP1 värjäys. Tallennuksesta vaihe 4% paraformaldehydillä seurasi läpäiseväksi 0,2% Triton X-100. Sen jälkeen soluja blokattiin PBS: llä + (1% naudan seerumin albumiinia, 0,15% glysiini) 60 minuutin ajan ja niitä inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen 53BP1 (laimennus 1: 500, NB100-305, Novus Biologicals) 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä soluja inkuboitiin sekundäärisen vasta-vuohen anti-kani-Alexa-488 (laimennos 1: 200, A-11034, Life Technologies) ja lampaan anti-hiiri-Cy-3 (laimennus 1: 500, 016-160- 084, Jackson Lab) 1 tunti. Tumat värjättiin Hoechst 33342 (SIGMA-Aldrich Chemie) ja solut peitettiin Vectashield

® Mounting Medium (Linaris). Analyysi suoritettiin fluoresenssimikroskoopilla Biorevo BZ-9000 (Keyence). Sellaiset koeolosuhteiden valotusajat ylläpidettiin ja pesäkkeet lukumäärä 60 solua per tila määritettiin.

2,9 validointi exosomal vakauden

Voit testata vakaus, eksosomeiksi inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa joko RNaasi A Qiagen (5 ug /ul tai 400 ug /ul) tai pesuaineen-peptidaasi-seosta (0,2% Triton X-100 /trypsiini, 2: 1). Sitten eksosomeiksi käytettiin DNA: n korjaukseen määrityksissä kuten edellä on kuvattu.

2,10 Proteiinin analysointi

Solut hajotettiin hajotuspuskuriin II (25 mM Tris, pH 7,5, 120 mM NaCl, 1% Triton X -100, 1% PSMF, 1 mM marras, 1 mM leupeptiini) 1 tunnin ajan jäillä. Sentrifugoinnin jälkeen proteiinipitoisuus kerättyjen supernatanttien määritettiin soveltamalla BCA-määritys, jossa käytetään naudan seerumin albumiinia standardina (Pierce

™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific).

Western blot-analyysi toteutettiin standardimenetelmien mukaisesti käyttäen 10 ug solu-proteiinia ja tilavuus 12 ui eksosomi lysaattia, joka vastaa eksosomi määrä 30 ml: aan väliainetta ja SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Erotetut proteiinit blotattiin nitroselluloosalle kalvoja ja inkuboitiin ensisijaisen vastaan ​​suunnattuja vasta-CD63 (sc15363, SantaCruz), HSP70 (MA3-007, Affinity Bioreagents), aktiini (SAB1305567, SIGMA-Aldrich Chemie) ja kalneksiini (sc11397, SantaCruz). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineita (sc2004 ja sc2005, SantaCruz) käytettiin havaitsemaan antigeenin vasta-aineen sitoutumisen kautta kemoluminesenssin (Amersham ECL detektioreagenssipakkaus, GE Healthcare).

2,11 Tilastollinen analyysi

Data edustaa keskiarvoa riippumattomien, biologisten rinnakkaisnäytteiden ± keskihajonta (SD). Merkitys n-kertainen muutokset laskettiin käyttäen parillista t-testiä. Vertailla keinoja kolme tai useamman muuttujan kaksipuolinen ANOVA sovellettiin. Kaikkien tilastollinen analyysi p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja p 0,01 ja p 0,001 katsottiin erittäin merkittävä.

3 Results

3,1 säteily kasvaa eksosomi vapautumista pään ja kaulan syöpäsolut

Eksosomit vapauttaa pään ja kaulan tuumorisolulinja BHY eristettiin differentiaalisella ultrasentrifugoinnilla. Validoida eristäminen menetelmä eksosomien visualisoitiin transmissioelektronimikroskopialla. Edustava mikrovalokuva osoitti pyöreä, kupin muotoinen rakenteita, joiden halkaisija on 30-100 nm (kuvio 1 B). Sillä lisätarkastamista eksosomi identiteetin exosomal markkeriproteiinien HSP70, aktiini ja CD63 havaittiin Western blot vuonna BHY eksosomeiksi sekä lysaateissa BHY soluja. Ei havaittavaa proteiinit olivat läsnä käyttämättömiä viljelyalustassa, käyttämättömiä väliaineessa täydennetty eksosomi vaje vasikan sikiön seerumia tai supernatantissa kunnostettua alustaa jälkeen ultrasentrifugoinnin. Puuttuminen kalneksiini että eksosomi lysaateissa osoittavat, että eksosomi valmisteita ei saastuttamia solukalvojen peräisin apoptoottisia kappaleita tai kuolleita soluja (kuvio 1 C). Lisäksi kokojakauma ja lukumäärä eristetty eksosomeiksi kvantitoitiin kuusi riippumatonta valmisteet kunkin hoitoon käytetään NanoSight tekniikkaa. Tämä lähestymistapa vahvisti homogeeninen eksosomi valmiste, jonka keskimääräinen koko on 111-124 nm (n = 6) varten eksosomeiksi eristettiin joko säteilytettyjen tai ei-säteilytettyjä soluja (kuvio 1 D). NanoSight mittaus osoitti myös kasvua määrän eksosomeiksi talteen säteilytettyä (EXO 3 Gy, EXO 6 Gy) verrattuna ei-säteilytetty (EXO 0 Gy) solut 24 tuntia säteilytyksen jälkeen (kuvio 1 E).

3.2 Säteily lisää sisäänottoa eksosomeiksi vastaanottavien solujen

Vertasimme oton kinetiikka eksosomeiksi eristettyjen säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen luovuttajan solut sekä niiden käyttöönotto säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen vastaanottaja soluissa. Näin ollen soluja viljellä yhdessä sellaisten PKH67-leimattujen eksosomeiksi ja eksosomi oton jälkeen fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla.

Fluoresenssimikroskopia paljasti aikariippuvainen otto eksosomeiksi. 3 tunnin jälkeen klustereita leimattujen eksosomeiksi alkoivat kertyä pitkin solukalvojen. Yhä useammat eksosomeiksi kiinnitetty ajan mittaan ja aiheutti hajanainen solulimassa merkintöjä, jotka merkitsivät sisäistäminen ja hajoamiseen eksosomeiksi (kuvio 2A).

PKH67-leimatun eksosomeiksi eristetty säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen BHY soluja viljeltiin yhdessä BHY soluja. (A) edustaja fluoresenssimikroskopiaan kuvia eksosomi oton jälkeen 3, 6 ja 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. Eksosomit värjättiin vihreänä ja tumat värjättiin sininen Hoechst 33342. (B) otto eksosomeiksi eristettyjen 6 Gy-säteilytettyä (EXO 6 Gy) ja ei-säteilytetty BHY soluja (EXO 0 Gy) jälkeen 3, 6, 8, 10 ja 24 tunnin inkubaation. Tarkoittaa fluoresenssi käsittelemättömien solujen ja solujen kanssa inkuboinnin jälkeen värjätään eksosomeiksi tai eksosomi-negatiivinen kontrolli (-ekso) on esitetty (n = 3). (C) Riippuvuus on exosomal otto määritettiin 24 tunnin kuluttua käyttämällä sarja- laimennos eksosomi valmistelua. (D) Leimatun eksosomeiksi 0, 2 ja 4 Gy-säteilytetty vastaanottaja soluista 24 tunnin kuluttua. Kaikissa kokeissa on vähintään 10000 solua analysoitiin kullekin näytteelle [n ≥ 3, ± SD, p-arvo 0.05].

Myös määrällisesti eksosomi oton virtaussytometrialla. Saadut tulokset vahvistivat aiemmat mikroskopia havainnot ja osoitti, että otto eksosomeiksi oli aikariippuvainen (kuvio 2B) ja lineaarinen kanssa lisätty määrä eksosomeiksi (kuvio 2C). Vaikutus säteilyn oton eksosomeiksi vastaanottavien solujen tutkittiin vertaamalla oton kinetiikka eksosomeiksi eristettyjen ei säteilytetty solujen niille eksosomeiksi eristetty säteilytettyjen soluista. Kuvio 2B osoittaa, että ei ollut merkitsevää eroa kinetiikka oton eksosomeiksi peräisin säteilytettyjen tai ei-säteilytettyjen luovuttajan soluja. Oli kuitenkin annoksesta riippuvan lisäys oton eksosomeiksi säteilytettyjen vastaanottajan soluja verrattuna ei-säteilytettyjen soluja. Siten exosomal otto lisääntyi merkittävästi 1,3-kertainen eksosomeiksi peräisin ei-säteilytetty soluja ja 1,4-kertainen eksosomeiksi säteilytetystä luovuttajalta soluista, jos ne inkuboitiin 24 tuntia säteilytettyjen vastaanottajan solujen (4 Gy) verrattuna ottoa ei-säteilytetty vastaanottajan soluja (kuvio 2D). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että eksosomi sisäänotto vastaanottajan solut oli aikaa ja keskittymistä riippuvaisia ​​ja että säteilytys vastaanottajan solujen kasvattivat kykyyn ottaa eksosomeiksi.

3,3 Eksosomit joko ei säteilytetty tai säteilytettiin solut lisäävät eloonjäämisen vastaanottajan solut

Olimme kiinnostuneita siitä eksosomeiksi säteilytetystä soluilla samaan biologisia vaikutuksia vastaanottajassa soluissa eksosomeiksi ei-säteilytetty soluissa. Tämän kysymyksen osoittamiseksi lisäsimme eksosomeiksi eristetty luovuttajasta soluista säteilytetty 0, 3, 6 ja 9 Gy ei säteilytetty vastaanottajan solujen ja mitattiin solujen lisääntymistä. BHY solut käsiteltiin eksosomeiksi osoittaisivat suurempaa lisääntymistä kuin soluja viljeltiin ilman eksosomeiksi (kuvio 3A). Tämän mukaisesti plating tehokkuutta pesäkemuodostusta on suurempi soluja kasvatettiin eksosomeiksi kuin soluja kasvatettu ilman eksosomeiksi (kuvio 3B). Ei kuitenkaan ole merkittävää eroa ei havaittu hoitojen välillä, jossa eksosomeiksi eristetty 0, 3, 6 tai 9 Gy-säteilytettyjä soluja (kuvio 3A).

(A) solujen lisääntymisen viljeltiin 3 päivää elatusaineessa, joka sisälsi eksosomeiksi eristetty peräisin säteilytettyjen tai ei-säteilytettyjä soluja. Kontrollina sama määrä PBS: ää ilman eksosomeiksi lisättiin vastaanottajan soluja. (B) Plating tehokkuutta soluja viljeltiin 5 päivää elatusaineessa, joka sisälsi eksosomeiksi eristetty säteilytettyjen tai ei-säteilytetty soluissa. Kontrollina sama määrä PBS: ää ilman eksosomeiksi lisättiin vastaanottajan soluja. (C) klonogeeninen eloonjäämistä BHY solujen viljeltiin yhdessä eksosomeiksi eristetty säteilytettyjen tai ei-säteilytettyjä soluja ja kontrollisoluja (BHY + PBS) inkuboitiin 5 päivää säteilytyksen jälkeen ilmoitetuilla annoksilla [n = 3, ± SD, p- arvo: * jos p 0,05, ** jos p 0,01 **** jos p 0,0001].

Seuraava vaikutuksen eksosomeiksi on säteilyherkkyydestä BHY soluja analysoitiin. Soluja inkuboitiin eksosomeiksi, sitten säteilytettiin annoksilla enintään 10 Gy ja inkuboitiin 5 päivän ajan. Myöhemmin klonogeeniset eloonjääminen määritettiin. Mukaisesti havaitun leviämisen stimuloiva vaikutus eksosomeiksi ei-säteilytettyjä vastaanottaja-soluissa (kuvio 3A ja 3B) selviytymisen säteilytetyn vastaanottajan solujen nostettiin lisäämällä eksosomeiksi (kuvio 3C ja S3 taulukko). Tässä eksosomeiksi eristettiin soluista säteilytetty 6 Gy indusoi suuremman tason säteilyn kestävyys kuin eksosomeiksi ei-säteilytetty soluissa (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että eksosomeiksi peräisin BHY soluista yleensä tukevat lisääntymistä ja säteilyn kestävyys.

3.4 Eksosomit vaikuttaa hinnat DNA double-lohkon murtuma korjaus

Koska Dutta et al. osoittivat, että eksosomeiksi vapautuu rintasyöpä solut voivat muuttaa fosforylaatiota asema DNA-vaurion korjaamiseen proteiinit [21], analysoimme määrä DNA double-lohkon murtuma (DSB) korjaus säteilytettyyn vastaanottajan solujen selvittämiseksi mekanismi elonjäämisetua solujen lisäyksen jälkeen eksosomeiksi. Eksosomeiksi peräisin säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen BHY solut siirrettiin säteilytettyihin BHY soluja (2 Gy) ja useita DNA: n DSB pesäkkeitä analysoitiin sen jälkeen, kun 1 ja 6 tuntia. Kvantifiointi DNA: n DSB korjaus pesäkkeitä 1 tunnin kuluttua säteilyaltistusta paljastaneet mitään eroa määrän aiheuttama pesäkkeitä välillä ohjaus soluja ja soluja inkuboitiin eksosomeiksi joko ei säteilytetty tai säteilytettyjä luovuttajan soluja (kuvio 4A). Kuusi tuntia hoidon jälkeen löysimme määrän väheneminen korjaus pesäkkeiden BHY soluja inkuboitiin eksosomeiksi eristetty 24 tunnin kuluttua säteilytyksen BHY solujen verrattuna soluihin inkuboitu eksosomeiksi ei-säteilytetty BHY soluissa, mikä viittaa nopeampi nopeudella korjaus (kuvio 4B ja 4C). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin kuluttua 6 tunnin eksosomeiksi eristetty 48 tuntia säteilytyksen jälkeen (kuvio 4C). Myös analyysi jakelun pesäkkeitä lukumäärät soluja inkubaation jälkeen eksosomeiksi kuvasti lisääntynyt korjaus käsitellyissä soluissa eksosomeiksi alkaen säteilytettyjen luovuttajan soluista. Erityisesti solujen määrä on korkea pesäkkeitä numero ( 12) on vähentynyt sen jälkeen, kun oli inkuboitu EXO 6 Gy (S1A kuvio). Lisäksi vaikutukset olivat myös läsnä 8 ja 10 tuntia säteilytyksen jälkeen (S1B kuvio). Jos soluja pre-inkuboitiin 24 tuntia kanssa eksosomeiksi, sitten säteilytetään 2 Gy ja vahvistetaan sen jälkeen 6 tuntia, sitä nopeammin korjaus aiheuttama eksosomeiksi säteilytetystä luovuttajalta soluista oli vielä havaittavissa (S1B kuvio). Lisääminen eksosomeiksi ei-säteilytettyjen BHY solut näyttivät kasvavan hieman pesäkkeet määrää verrattuna kontrolliin (PBS) vastaanottajan solut 6 tunnin säteilytyksen jälkeen (kuvio 4B ja 4C). Tämä vaikutus ei ollut läsnä, kun esi-inkubointi solujen eksosomeiksi ja myöhemmät säteilytys (S1C kuvio).

(A) määrä 53BP1 pesäkkeitä in BHY soluissa 1 tunti säteilytyksen jälkeen 0 ja 2 Gy ja siirtäminen BHY eksosomeiksi eristetty 24 tuntia säteilytyksen jälkeen 0 ja 6 Gy [n = 5]. (B) edustavat kuvat 53BP1 pesäkkeiden BHY soluissa 6 tunnin kuluttua 2 Gy ja siirto BHY eksosomeiksi eristetty 24 tuntia säteilytyksen jälkeen 0, 3, 6 tai 9 Gy (53BP1 pesäkkeitä vihreä, ytimet sininen). (C) määrä 53BP1 pesäkkeitä vuonna BHY soluissa 6 tunnin kuluttua 2 Gy ja siirto BHY eksosomeiksi eristetty 24 ja 48 tunnin kuluttua säteilytyksen [n

1 (kontrolli; EXO 0 Gy 24 h; EXO 6 Gy 24 h) = 6 , n

2 (EXO 0 Gy 48 tuntia; EXO 3 Gy; EXO 6 Gy 48 h; EXO 9 Gy) = 3]. (D) määrä 53BP1 pesäkkeitä vuonna Fadu soluissa 6 tunnin kuluttua 2 Gy ja siirto Fadu eksosomeiksi [n = 3]. (E) määrä 53BP1 pesäkkeitä vuonna Fadu soluissa 6 tunnin kuluttua 2 Gy ja siirto BHY eksosomeiksi [n = 3]. (F) määrä 53BP1 vuonna BHY soluissa jälkeen 2 Gy ja siirto horjuttaa BHY eksosomeiksi. Eksosomeiksi päässä BHY solut eristettiin 24 tuntia säteilytyksen jälkeen 0 ja 6 Gy käsiteltiin RNaasi A: lla tai seos Triton ja trypsiini [n

1 (kontrolli; ehjä) = 6; n

2 (RNase A 5 ug /ul) = 2; n

3 (RNase A 400 ug /ul; Triton + trypsiini) = 3]. Kaikkien kokeissa ± SD osoitettiin ja p-arvot lasketaan ohjaus katsottiin olevan merkittäviä, jos * p 0,05 ja erittäin merkitsevä ** jos p 0,01, kun taas

▲ p 0,05 ja

▲▲ p 0.01 osoittaa huomattavia eroja ekso 0 Gy.

eksosomi stimuloimaa DNA korjaus varmistettiin käyttämällä toista pään ja kaulan alueen syöpä solulinja Fadu. Jälleen inkubointi Fadu vastaanottajan solujen eksosomeiksi eristetään säteilytettyjen Fadu soluista vähensi DNA korjaus pesäkkeitä (kuvio 4D). Testata solutyypin spesifisyys eksosomi aiheuttama vaikutus lisäsimme eksosomeiksi eristetty BHY solujen säteilytetty Fadu soluihin. Eksosomeiksi päässä BHY solut kykenevät suorittamaan vastaavia säteilyltä vaikutuksia Fadu soluissa (kuvio 4E).

Lopuksi epätasapainoon eksosomeiksi kautta korkea pitoisuus RNaasi A: ta hoitoa tai lisäämällä detergentti-peptidaasi-seosta. Horjutti 0 Gy ja 6 Gy eksosomeiksi voineet muuttaa korjauksen pesäkkeitä verrattuna hoitamattomiin eksosomeiksi osoittaa toiminnan menetys hoidon vuoksi (kuvio 4F). Yhteenveto näistä tuloksista, eksosomeiksi vaikuttavat korjaus DNA DSB: t annoksesta riippuvainen, solutyypin epätarkasti.

4 Keskustelu

Cell kommunikaatio eksosomeiksi pystyy vaikuttamaan kohtalo solujen stressitilanteissa [9, 10, 22, 23]. Nyt näyttää osuus eksosomeiksi lisääntyneeseen selviytymisen pään ja kaulan syöpäsolut säteilytyksen jälkeen. Eksosomit erittyy 24 tunnin kuluessa säteilytyksen vaikuttavat proliferaatiota ja elossa pysymistä, ja DNA: n korjaukseen tehokkuutta. Tämän seurauksena solu kommunikointi eksosomeiksi aikana kasvaimen vastaisen säteily voi resistenssiä syöpäsolujen ja pelastamiseksi pään ja kaulan alueen syöpä solujen sekä, ja ulkopuolella säteilykentän. Siksi ymmärtää paremmin taustalla olevien mekanismien eksosomeiksi säteilyn vastaus tarvitaan parantamaan strategioita sädehoitoa.

4,1 Eksosomit lisäävät eloonjäämistä ja lisääntymistä pään ja niskan levy- karsinoomasoluja

Osoitamme, että eksosomeiksi vaikuttavat kohtalo säteilytetty ja ei-säteilytetty BHY ja Fadu pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Eksosomit lisätä selviytymisen säteilytettyjen vastaanottajan soluja. Prosurvival vaikutukset eksosomeiksi peräisin säteilytettyjen luovuttajan solut olivat selvempiä kuin aiheuttama eksosomeiksi peräisin ei säteilytetty luovuttajan soluja. Mukaisesti Hazawa et al. osoitti, että siirto eksosomeiksi ei-säteilytetty solujen 8 Gy-säteilytetty mesenkymaalisten kantasolujen johtaa lisääntyneeseen eloonjäämiseen [24].

Vastaavasti eksosomeiksi aiheuttaa lisääntymistä ei säteilytetty vastaanottaja soluissa. Tämä vaikutus on riippumaton säteilyn käsittely eksosomi luovuttajan soluja. Viime kirjallisuudessa vaikutuksia eksosomeiksi jakautumiseen käsitellään kiistanalaisella. Samanlaisia ​​tuloksemme, eksosomeiksi johdettu virtsarakon syöpäsoluja, krooninen myelooinen leukemia soluja, tai syöttösolut lisätä leviämisen vastaanottajan solujen jälkeen eksosomi siirron [8, 25-27]. Kuitenkin Jella et ai. osoittivat vähentynyttä elinkykyisyyttä keratinosyyttien inkuboinnin jälkeen eksosomi sisältävässä viljelyväliaineessa [14].

4.2 Eksosomit vaikuttaa DNA double-lohkon murtuma korjaus jälkeen ionisoivan säteilyn pään ja niskan levy- karsinoomasoluja

oletettu, että eksosomeiksi voivat edistää selviytymistä laukaisemalla DNA korjaa osoitettiin, että fosforylaatio kriittinen DNA korjaukseen proteiinit vaikuttavat eksosomeiksi [21]. Tuloksemme osoittivat, että DNA: n korjautumista ei vaikuttanut eksosomeiksi varhaisessa ajankohtana säteilytyksen jälkeen (1 h), kun taas lisääntynyt DNA korjaukseen havaittiin inkubaation jälkeen eksosomeiksi alkaen säteilytettyjen luovuttajan soluista myöhäisemmässä vaiheessa (6-10 h). Koska kohonnut DNA korjausta yhtä havaittu 6 h inkuboinnin joista vain rajoitettu määrä eksosomeiksi liittyy soluihin ja sen jälkeen esi-inkubaatio eksosomeiksi oletamme, että pieni määrä eksosomeiksi on riittävä indusoimaan havaittuja vaikutuksia. Eri näkökohtia vaikutuksesta eksosomeiksi DNA korjaukseen analysoitiin kahdessa viimeaikaisissa tutkimuksissa. Yksi osoittivat, että lisääntynyt määrä DNA korjaukseen pesäkkeitä havaittiin siirtämisen jälkeen eksosomeiksi peräisin ei säteilytetty rintasyövän solujen normaalin ihmisen ensisijainen nisäepiteelisoluissa [21]. Käyttäen komeetta-määritys, Al-Mayah et al. toisaalta osoitti, että eksosomeiksi lisätä DNA-vaurion rintasyövän epiteelisyöpäsolujen [12].