Krooninen sairaus

tiivistelmä

K-Ras riippuvaisten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solut ”koukussa” perustasolle autophagy että reprograms solujen aineenvaihduntaan on lysosomaalisen-ottavalla tavalla. Tässä osoitamme, että xenophagy liittyvä kinaasi TBK1 ajaa pohjapinta autophagy, johdonmukainen sen tunnettujen vaatimus K-Ras-riippuvaista NSCLC leviämisen. Lisäksi pohjapinta autophagy tässä yhteydessä on ominaista vakuustakavarikointi xenophagy lastin reseptorin Ndp52 ja sen paralogi Tax1bp1, jota osoitamme täällä olla

bona fide

lastin reseptoriin. Autophagy näistä lastin reseptorien edistää kaanoniin NF-KB: n signalointi. Ehdotamme, että tämä TBK1 riippuvaisen mekanismin NF-KB signalointi edistää autophagy riippuvuuden K-Ras ajettu NSCLC.

Citation: Newman AC, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman M, McIver EG, Kamal A, et ai. (2012) TBK1 Kinase väärinkäytön Lung Cancer Cells välittyy kautta Autophagy of Tax1bp1 /Ndp52 ja Kaanonisoimaton NF-KB merkinanto. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10,1371 /journal.pone.0050672

Editor: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 23 lokakuu 2012; Julkaistu: 29 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Newman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ SW laboratoriossa Rahoitin Cancer Research UK Urakehitys Fellowship (C20685 /A12825) hallussa SW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ahmad Kamal, Ed McIver ja Michelle Newman ovat työntekijöitä Medical Research Council Technology, Lynton House, 7-12 Tavistock Square, London WC1H 9LT, UK. Medical Research Council Technology omistaa patenttihakemus (PCT ei WO2010100431) on TBK1 estäjien MRT68601. Nämä kirjoittajat voivat siis saada taloudellista hyötyä tahansa tulevaa hyödyntämistä tämän patentin. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Strategia kohdistaa kasvaimen etenemistä on tunnistaa tiettyjä molekyylien heikkoudet siirrettävä geneettinen tausta. Aktivointi K-Ras mutaation, tai muilla keinoin, tekee ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin ”koukkuun” läsnäolollaan TBK1 (TANK sitova kinaasi 1) proteiinin jatkuvaa lisääntymistä ja /tai eloonjääminen [1], mahdollisesti suora stimulaatio TBK1 toiminnan [2]. TBK1 ja sen paralogi, IKKε ohella hyvin tunnettu IKKα ja IKKβ proteiinit muodostavat alaryhmä seriini-treoniiniproteiinikinaaseja [3]. TBK1 ja IKKε alun perin kuvattu välittävä NF-KB: n transkriptiotekijän aktivaation [4], [5], [6]. On myös ehdotettu, että perustava edistäminen NF-KB signalointia NSCLC soluissa, alavirtaan K-Ras, voisi pohjana TBK1 ”riippuvuus” [1]. Todellakin, geeniekspressioprofilointi on osoittanut, että K-Ras ajettu, NF-KB: n kaltainen allekirjoitus on riippuvainen TBK1 geenin [1]. Kuitenkin mekanistinen näyttöä TBK1 välittämää NF-KB sitoutuminen syöpä on ollut niukkaa. Vaihtoehtoiset selitykset TBK1 riippuvuuden on ehdotettu, kuten suora aktivaatio pro-eloonjäämisen Akt kinaasisignaloinnin [7], [8]. Kuitenkin mikään yksittäinen panos TBK1 välttämättä toisensa poissulkevia muiden kanssa.

Toinen polku mukana alavirtaan K-Ras aktivointia macroautophagy (jäljempänä autophagy) [9], [10], [11]. Autophagy on monivaiheinen lysosomaalinen hajoaminen prosessi [12]. Alkuvaiheessa, riippuu toiminnan ytimen autophagy geenejä, kuten

ATG5

ja

ULK1

, kaksinkertainen membraned rakkulat koristeltu ubikitiinistä kuten proteiineja LC3 /GABARAP perhe, nimeltään autophagosomes, alkaa muodostua. Nämä orastava autophagosomes liittää ympäri, ja eristää, sytosolin niiden erääntyessä. Riippuen yhteydessä, tämä voi olla ei-selektiivinen tai valikoiva prosessi, jälkimmäinen liittyy sitomista erillisten populaatioiden tai kuljettamia ”, on soluelimiin, proteiineja tai muita rakenteita, kuten bakteerien ollessa kyseessä” xenophagy ”. Valikoivuus välittyvät lasti reseptorien, jotka viittaavat LC3 /GABARAP proteiineja lastin in oletettu monen molekyylikomplekseja [12]. Autophagy vaikutuksia solujen kohtaloon sekä tämä selektiivinen sitominen lastin komplekseja sytosoliin ja kautta myöhemmin lysosomaalisen hajoamisen sisällöstä autophagosome, joka vapauttaa aineenvaihduntatuotteet sytosoliin. Tämä jälkimmäinen vaihe on estää lysosomotrophic kuten klorokiini. Tällaiset yhdisteet ovat potentiaalisia aineiden luokka terapeuttista manipulointi autophagy [11], [13].

rooli autophagy akuutissa vastauksena Ras-mutaatio on epäselvä. On osoitettu toimimaan efektori säilyminen, solukuoleman tai vanhenemista [9], [14], [15]. Kuitenkin jatkuva pohjapinta autophagy yksiselitteisesti tarvitaan lisääntymistä ja /tai eloonjäämistä perustettu K-Ras ajettu syöpäsoluja [10], [11], [13]. Rooli on autophagy tässä suora säätely solujen aineenvaihduntaan kautta mitokondrion homoeostasis, proteiini laadunvalvonta ja /tai remontin solun metaboliitin allas. Kumulatiivisesti nämä mekanismit säätelevät tasapainoa oksidatiivisen fosforylaation ja aerobinen Glykolyysivaiheen [10], [11], [13]. Jotkut näistä mekanismeista ovat riippuvaisia ​​lysosomaalisen hajoamisen, mikä näkyy herkkyys metabolisia vaikutuksia lysosomotrophic aineita, kuten klorokiini. Kuitenkin, se ei ole käsitelty miten autophagy harjoittaa myötävirtaan K-Ras. Lisäksi on epäselvää, onko autophagy ”riippuvuus” voidaan selittää pelkästään suoria vaikutuksia aineenvaihduntaan tai jos sitomisen tiettyjen proteiinien moduloi solun kohtalon kautta muuttaminen signaalitransduktion solun sisällä.

Mielenkiintoista, TBK1 on liitetty että autophagy sytosolin

Salmonella spp.

bakteerien soluissa [16]. Uuden TBK1 sitova proteiini ja xenophagy lastin reseptori, Ndp52, tunnistaa ubikitinoituja proteiineja, pinnalla bakteerien ja hiilihydraattia sitovia proteiineja on revennyt isäntä rakkulat [17], [18]. Ei-tarpeeton Tämän reaktiotien on hiljattain osoitettu olevan TBK1-välitteistä fosforylaatiota vielä uusi lasti reseptori, Optineurin [16]. Merkitystä TBK1 signalointi ulkopuolella xenophagy on epäselvä. Kuitenkin osoitamme tässä, että pohjapinta autophagy, joitakin rinnastuksia xenophagy ja johtaa liikevaihdon lastin reseptorien kuten Ndp52 ja paralogista proteiini Tax1bp1, konstitutiivisesti harjoittaa TBK1-addiktoitunut NSCLC soluihin kinaasiaktiivisuutta TBK1. Osoitamme keskeinen asema tässä autophagy ajo kaanoniin NF-KB signalointia välittyvät RelB transkriptiotekijä. Ehdotamme, että tämä toteutustapa täydentää suoraa metabolisen mekanismeja osuus pohjapinta autophagy tukemiseen lisääntymistä ja /tai eloonjäämisen NSCLC soluissa. Meidän havainnot siten laajentaa roolia autophagy riippuvuuden K-Ras ajettu syövän ja näyttää mekanistinen vuorovaikutus TBK1-NF-KB-reitin.

Tulokset

Autophagy K-Ras Dependent Lung Cancer Cells on alavirtaan TBK1 Kinase

roolin tutkimiseksi TBK1 K-Ras ajettu pohjapinta autophagy kehitimme NSCLC kulttuuri malli K-Ras ”koukkuun” A549-soluja [1]. Olemme havainneet, että sytosoliin näistä sisälsivät runsaasti pistemäinen rakenteita, jotka on leimattu GFP-LC3B fuusioproteiinia, mutta ei lipidiä unconjugatable GFP-LC3BΔG- A (Fig. 1a). Runsaus GFP-LC3B puncta dramaattisesti kohonnut klorokiinikäsittely (Fig. 1a). Menetelmän mukaisesti kentän [19], me sitten otti nämä LC3B puncta edustamaan pohjapinta, steady-state tason autophagosomes. Nämä autophagosomes olivat poissa, kun RNAi käytettiin pudotus autophagy geenit

ATG5

ja

ULK1

(Fig. 1 b-d). RNAi on

TBK1

tuottivat samankaltaisia ​​vaikutuksia, paikannus tämä kinaasi ylävirtaan pohjapinta autophagosome runsauden (Fig. 1 b-d). Laajensimme Näiden havaintojen avulla autophagy flux määrityksiä yhdistettynä jäsenen äskettäin kuvattua perheen entsymaattisen estäjiä TBK1 (MRT68601, jäljempänä TBKi, Fig. S1) [20]. Estäjähoidon A549 tandem-loisteputki LC3B soluihin [21] johti vähentäminen sekä varhaisen autophagic ( ”vihreä + punainen) LC3B puncta ja happamien myöhään autophagosomes (” punainen ”puncta) (Fig. 1 e, f). Vastaavasti klorokiini välittämää kertymistä lipidoitujen LC3B-II tai GABARAP-II, muodossa näiden proteiinien korreloi muodostumista autophagosomes, estivät estäjähoidon (Fig. 1 g). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että TBK1 kinaasi todellakin edistää autophagy, joka toimii varhaisessa vaiheessa autophagosome muodostumisen, eikä tukahduttaa autophagosome kypsymistä lysosomaalisen hapan osasto [19].

A549 GFP-LC3B tai GFP-LC3BΔG – 0,05, ** = p 0,01). e, f) A549 tandem-fluoresoiva-LC3B (tfLC3B) soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 1 uM MRT68601 (TBKi) 24 tunnin ajan ja e) kuvattiin, ja f) määrällisesti kokonaismäärästä autophagic puncta (vihreä ja punainen) ja osajoukko näiden puncta kanssa havaita GFP-signaali (punainen), kuten kuvataan yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät. g) A549-soluja käsiteltiin DMSO: lla tai 10 uM MRT68601 (TBKi) 24 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa PBS: ää tai 5 uM (CQ) klorokiini ja solu-uutteet blotattiin varten ilmoitettu proteiineja. Mittaviivat = 50 pm kaikkiin paneeleihin.

Basal Autophagy kohdistettu Cargo reseptorit Ndp52 ja Tax1bp1

Bakteerien autophagy (xenophagy) välittyy kautta TBK1 ja sen parien ollessa kysymyksessä, xenophagy lastin reseptorit Ndp52 ja Optineurin [16], [18]. Vuonna Samanaikaisesti tämän, löysimme rekrytointi Ndp52, ja Ndp52 paralogi Tax1bp1, että pohjapinta autophagosomes A549-soluissa (kuvio. 2a, c). Olemme myös osoittaneet konstitutiivinen Ndp52-TBK1 monimutkainen ja vahvisti aiemman raportin, joka Tax1bp1 voi sitoa TBK1 [22] (Fig. S2a, b). Nämä tiedot merkitsevät sitä, että Ndp52 ja Tax1bp1 voidaan kohdistetaan varten sitominen pohjapinta autophagy. Näin ollen, klorokiinikäsittely stabiloitu Tax1bp1 samanlainen Positiivisena kontrollina p62 lastin reseptorin (Fig. 2b), ja samanaikaisesti lisääntynyt Tax1bp1 lokalisointi LC3B-positiivisia vesikkelit (Fig. 2c). Ubiquitin kaltaiset proteiinit LC3 ja GABARAP subfamilies kykenevät sitoutumaan Tax1bp1, vaihtelevalla affiniteetit (Fig. 2d). Tämä viittaa siihen, että Tax1bp1 on, kuten, Ndp52,

bona fide

lastin reseptoriproteiinia. Lisätukea tämä havainto tulee havainto, että poisto oletettujen LC3 /GABARAP perhe sidosmotiivia Tax1bp1 ablates lokalisointi autophagosomes (Fig. 2e). Nämä aiheet sisältää sekä ”kanoninen” LIR (LC3-vuorovaikutuksessa alue) motiivi (W49, V50, G51, I52) ja ”ei-kanoninen LIR” aihe, jälkimmäinen päätteli, että viime aikoina kuvattu Ndp52 sitoutumisesta LC3C (L141, V142, V143) [23] (Fig. 2e, myös nähdä linjauksia kuvassa. S2C). Yhdenmukainen rooli TBK1 edellä mainituissa prosesseissa, TBK1 proteiini osoitettiin myös paikallistaa perustasolle autophagosomes (Fig. 2f).

A549 GFP-LC3B solut värjättiin Ndp52 ja kuvaamisen. b, c) A549-soluja käsiteltiin PBS: llä tai 5 uM klorokiinin (CQ) yön yli, ja b) solu-uutteiden blotattiin varten osoitetaan proteiinien (α-amme = alfa tubuliinin) tai c) solujen yhteistyötä värjättiin Tax1bp1 ja LC3B, ja kuvantaa konfokaalimikroskopia. d) 293FT solut transfektoitiin myc-TAX1BP1 ekspressiovektoriin, tai tyhjän vektorin ohjaus, ja lysaatit altistettiin vetää alaspäin ja osoitetun fuusioproteiinia, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (- = GST vain, B = GST-LC3B, C = GST-LC3C, G = GST-GABARAP). e) A549 FLAG-HA-TAX1BP1 solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti ilmoitettu variantteja Tax1bp1 proteiinin (katso teksti) käsiteltiin 5 uM klorokiinin yön yli ja värjättiin HA puncta. f) A549 GFP-TBK1 mCherry-LC3C solut kuvattiin (nuolet osoittavat colocalisation). Mittaviivat = 25 pm kaikkiin paneeleihin.

TBK1 Drives Kaanonisoimaton NF-KB merkinanto by Autophagic CCS: ää Ndp52 ja Tax1bp1

vieressä hypoteesina linkkinä TBK1 perustuva autophagy ja pohjapinta NF-KB: n signalointi. Nuclear lokalisointi kanonisen NF-KB-reitin alayksiköt c-Rel tai RelA ei ollut havaittavissa A549 solulinjassa (p53 villityypin), mutta pohjapinta ydinvoiman lokalisoinnin kaanoniin polku alayksikköä RelB oli havaittavissa (kuvio. S3). RelB tumaanohjaussignaali riippui TBK1 kinaasiaktiivisuutta mikä näkyy menetys ydin- RelB tahra (Fig. 3a, b) tai tappio asutusta tumafraktios- (Fig. 3c) käsittelemällä TBK1 estäjä. Tax1bp1 on aiemmin osoitettu estävän kanoninen NF-KB-signaloinnin nucleation olevan ubikitiinipromoottori editointi monimutkainen kanoninen NF-KB sääntelyviranomaisten TRAF6 ja RIP1 [24]. Kuitenkin ristiriidassa olevia raportteja ovat osoittaneet NF-KB: n tehostava vaikutus, vaikkakin alavirtaan dysregulaatio Tax1bp1 toiminnon viruksen onkoproteiini Tax [25]. Huomasimme, että RNAi on

ATG5

,

ULK1

,

TBK1, TAX1BP1

tai

NDP52

esti RelB ydinvoiman lokalisointi (Fig. 3d-f), mikä merkitsee, että alavirtaan seuraus Tax1bp1 ja Ndp52 sitominen autophagy on sitoutuminen ei-kanoninen NF-KB. Hoito autophagy estävän yhdisteen 3-MA (3-metyyli adeniini) myös ablatoitu RelB ydinvoiman lokalisointi, mikä edelleen tukee näitä havaintoja (Fig. 3G). On epäselvää, onko autophagic hajoaminen lastin lysosomeihin, tai pelkkä autophagic sitomisen lastin, tarvitaan RelB signalointi. Vaikka E64d /Pepstatin Hoito ei ollut estävää vaikutusta RelB ydinvoiman lokalisointi, pieni mutta merkittävä vaikutus havaittiin suurilla annoksilla klorokiinin ja merkitty estävä vaikutus nähtiin bafilomysiini A1 (Fig. S4). Vahvista havainto, että autophagy edistää RelB toimintaa, voimme arvioida muutoksia geenien transkription. Analyysit mahdollisten RelB kohdegeenien osoittaneet, että

BIRC3

mRNA-tasot voimakkaasti vaimentua mukaan RelB esto (Fig. 3 h, i). Tärkeää on, RNAi on

ATG5

,

ULK1

,

TAX1BP1

ja

TBK1

samalla vaimentua

BIRC3

mRNA (kuva. 3j) .

A549-soluja käsiteltiin yli yön DMSO tai 10pM MRT68601 (TBKi) ja a) värjättiin RelB (asteikko bar = 50 nm), ydinvoiman lokalisointi määrällisesti b) (n = 3, ± SEM, * * = p 0,01) tai c) valmistettiin tumauutteet ja siirrettiin varten ilmoitettu proteiineja. d-f) A549-soluja transfektoitiin osoitti siRNA (

NTC

= ei-kohdistuksen ohjaus) 72 h ja e) solu-uutteiden blotattiin varten osoitetaan proteiinien tai d, f) solut värjättiin ja määrällisesti ydinvoiman RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05). g) A549-soluja käsiteltiin PBS: llä tai 10 mM 3-metyyliadeniinin (3-MA) ​​24 tuntia ja sitten värjätään ja määrällisesti ydin- RelB (n = 3, ± SEM, *** = p 0,005). h, i) A549-soluja infektoitiin merkityillä lentiviruksen ja kello 72 tuntia infektion, h) solu-uutteita blotattiin varten osoitetaan proteiinien tai i) kokonais-RNA määrällisesti

BIRC3

mRNA (n = 3, ± SD) . j) A549-soluja transfektoitiin ilmoitettu siRNA 72 h ja kokonais-RNA-uutteet altistettiin qRT-PCR:

BIRC3

mRNA: ta (n = 3, ± S.D.). k) A549-soluja infektoitiin merkityillä lentiviruksen ja 120 tuntia infektion solujen määrä laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (n = 3, ± SEM, * = p 0,05).

RelB Activity Auttaa TBK1 ja Autophagy ”väärinkäytön”

vahvistaneet edellinen havainnot [1], [11], että krooninen vaiennettu

ATG5

tai

TBK1

, jonka lentiviruksen shRNA kohdistamisesta vähensi solujen määrässä A549-soluja, samoin kuin RNAi on

KRAS

(Fig. S5a-f). Tärkeää on, lentivirus- RNAi on

RELB

johtanut myös vähentynyt selvästi solumäärä (Fig. 3k). Tämä viittaa TBK1- ja autophagy välittämä sääntely RelB voi ainakin osittain pohjana TBK1- ja autophagy-riippuvuus.

Autophagy ja Ndp52 /Tax1bp1 välittämän RelB merkinanto voi olla riippumaton Optineurin ja Tax1bp1 ei edistä Canonical NF-KB merkinanto

A549-soluja, toinen autophagy lasti reseptorin aiemmin sekaantuneet TBK1 toiminto, Optineurin [16], näyttää olevan rajallinen osallistuminen RelB signalointi. On vain pieni, vaikkakin merkittävä väheneminen RelB tumalokalisaatio, kun

OPTN

RNAi (Fig. 4a, b). Nämä löydökset eivät sulje pois rooli Optineurin erilaisissa geneettisissä taustoissa tai stressiolosuhteissa, ja näitä mahdollisuuksia on käsiteltävä tulevassa työssä. A549-soluja, rooli Tax1bp1 edistämisessä NF-KB: n signalointi on myös nimenomaan uuden autophagy-RelB reitti tässä on kuvattu. Stimulointi kanoninen NF-KB-signaloinnin TNFa hoito, joka arvioidaan ydinvoiman lokalisointi RelA ei ei aiheuta häiriötä

TAX1BP1

RNAi, ainakin siltä osin kuin ei vähennetä TNFa aiheuttama tumaansiirtymiseen havaitaan (Fig. 4c , d). Siten stimuloiva rooli Tax1bp1 on NF KB näyttää olevan erityinen ei-kanoninen RelB signalointi. On kuitenkin tärkeää huomata, että tässä määrityksessä ei käsitellä jo hyvin kuvattu inhiboiva rooli Tax1bp1 kestosta ja suuruus kanonisen NF-KB: n signaloinnin [24].

A549-solut transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA (

NTC

= ei-kohdistuksen ohjaus) 72 h ja a) solu-uutteiden blotattiin varten osoitetaan proteiinien tai b) solut värjättiin ja määrällisesti ydin- RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05) . c, d) A549-soluja transfektoitiin osoitti siRNA (

NTC

= ei-kohdistuksen ohjaus) ja stimuloitiin 5 ng /ml TNF-α 3 h ja c) värjätään ja d) määrällisesti ydin- RelA ( n = 3, ± SEM). Asteikko bar = 25 pm.

RelB Aktivointi Autophagy ja Ndp52 /Tax1bp1 nähdään myös p53-mutatoitunut, K-Ras-riippuvainen NSCLC Cells

On ehdotettu, että p53-mutatoitunut NSCLC linjat, kuten NCI-H23, pohjapinta kanoninen NF-KB signalointi on paljon suurempi kuin p53 villityypin linjat, kuten A549. Kuitenkin ainakin NCI-H23, vielä löytää konstitutiiviseen RelB signalointi, riippuu pohjapinta autophagy toiminto, mikä viittaa siihen, että pohjapinta kaanoniin ja kanonisen NF-KB signalointi voi olla co-tapaus (Fig. 5a-e). Tarkemmin, huomasimme, että NCI-H23-soluilla oli konstitutiivisen autophagy, arvioituna tandem-loisteputki LC3 markkeriproteiinina, jota säädeltiin vähentävästi mukaan

TBK1

RNAi (Fig. 5a-c), ja että perustava ydinvoiman lokalisointi RelB tässä solulinjassa oli herkkä RNAi-välitteinen inhibitio

TBK1

,

ATG5

,

NDP52

tai

TAX1BP1

(Fig. 5d, e) .

NCI-H23-soluja transfektoitiin merkitty siRNA (NTC = ei-kohdistuksen ohjaus) 72 tuntia ja a) solu-uutteiden blotattiin varten ilmoitettu proteiineja. b, c) NCI-H23 tandem-fluoresoivia LC3B solut transfektoitiin merkitty siRNA ja analysoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. d, e) NCI-H23-soluja transfektoitiin tarkoitettu siRNA 72 h ja solut d) värjättiin ja e) määrälliset ydin- RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05, ** = p 0,01) . Asteikko bar = 50 pm kaikkiin paneeleihin.

mallina Engagement Basal RelB merkinanto K-Ras-riippuvainen Lung Cancer Cells

esitetyt tiedot tämän käsikirjoituksen johtavat muotoiluun seuraavan mallin (Fig. 6). Vaikka aktiivisuus TBK1 sitovan lastin reseptoreihin Optineurin, Ndp52 ja, mahdollisesti, Tax1bp1, ajaa autophagy bakteerisoluista aikana xenophagy, samanlainen TBK1-välitteisen autophagic varastoimalla Tax1bp1 ja Ndp52 ohjaa pohjapinta autophagy K-Ras-riippuvaisten NSCLC-soluja . Tämä johtaa sitoutuminen kaanoniin NF-KB signalointi ja solujen lisääntymistä ja /tai eloonjääminen. Olipa TBK1 säätelee myös suora, lysosomaalisen toiminta autophagy in solun aineenvaihduntaan ei tunneta; se myös edellyttää toimenpiteitä, onko tämä asema autophagy on kokeellisesti erotettavissa selektiivinen sitominen Tax1bp1 ja Ndp52. Mekanistisesti se ei myöskään ole selvää, kuinka TBK1 ajaa autophagy. Koska tämä käsikirjoitus oli loppuvaiheessa tarkistuksen, ryhmä Deretic julkaistu että fosforylaatiota yleisen funktion autophagy reseptorin ja edistäjänä autophagosome biogeneesiä, p62 /SQSTM1, että ubikitiinistä sitova (UBA) domain, voi olla osallisena uusi rooli TBK1 nälkään aiheuttaman autophagy [26], [27]. Todellakin, alustavat tulokset tältä laboratoriolta viittaavat siihen, että A549-soluja on basaalisesti fosforyloitu p62, joka on pienentynyt runsaasti by TBKi käsittely (Kuva. S6).

Katso teksti yksityiskohtainen keskustelu. Ub = ubikitiinipromoottori.

Keskustelu

Autophagy on monitahoinen prosessi, toteuttamasta muutoksia solujen kohtalon sekä ei-selektiivisten mekanismien [12]. On todennäköistä, että sitoutuminen autophagy syöpäsoluissa vaikuttaa suoraan sekä aineenvaihduntaan [10], [11], [13] ja solun signalointi, integroidusti vastausta. On houkuttelevaa spekuloida, että xenophagy on kytketty synnynnäisen immuniteetin signalointi vasteen kautta kaanoniin NF-KB, ja tämä mekanismi on yksinkertaisesti poikkeavasti kytkeytyy onkogeenin perustuva autophagy in NSCLC soluissa. Rooli TBK1 ajo autophagy voi myös selittää, miten autophagy harjoittaa, vaikka ennustettu korkea pohjapinta mTOR aktiivisuus, in NSCLC soluissa. Mekanistisesti P62 fosforylaation voi olla rooli tässä prosessissa [26]. Olemme kuitenkin spekuloida, että TBK1 on siveetön kinaasi lukuisia alustoille, ja ennustaa, että P62, ja todellakin Optineurin (vieressä LIR motiivi) fosforylaatio [16], edustavat vain osajoukko toiminnallisesti merkitykselliset tavoitteet TBK1 in autophagy. Näin ollen on mahdollista, että eri substraatteja TBK1 toimivat eri vaiheissa autophagy, joko aikaisin vaiheet, meidän tiedot ehdottaa, tai myöhemmin kypsymisen vaiheita, kuten on äskettäin ehdotettu [26].

Yleisesti, NF-KB: n signalointi on ajateltu olla ylävirtaan autophagy [28], [29], [30]. Kuitenkin suora sääntely kanoninen NF-KB-signaloinnin autophagy on ehdotettu. Hypoteesi mekanismit ovat olleet varastoimalla p62, IκBα, NEMO tai Bcl10 [31], [32], [33], [34], [35]. Monimuotoisuus mekanismien autophagy toimintaa havainnollistaa erilaisia ​​toimintoja tämän prosessin; tässä lisäämme uuden mekanismin NF-KB: n sääntelyä, tällä kertaa sääntelyssä ei-kanoninen RelB reitin. Äskettäin poikkeava RelB aktiivisuus on tunnistettu keuhkotuumoreita, istuva meidän malli [36]. Kuitenkin p53 villityypin NSCLC voi olla riippuvainen, jonkin verran, kun kanoninen NF-KB signalointi [37], [38]. Todellakin, A549-solut (p53 villityypin) riippuvat c-Rel toimintaa lisääntymistä ja selviytymisen [1]. Tämä ei ole toisiaan poissulkevia kanssa tuloksemme; havaittavissa määrä ydin- c-Rel voisi olla tarpeen lisääntymistä /selviytymisen ohella RelB. Itse asiassa yhteydessä p53-mutatoitunut NSCLC, jossa sitoutuminen kanoninen NF-KB signalointi on paljon selvempää [39], on hyvä areena leikellä tällaista vuorovaikutusta. Kiinnostavaa kyllä, olemme osoittaneet tämän käsikirjoituksen, että ainakin joissakin solulinjoissa p53-mutaation, ja ilmoitetaan näkyvästi pohjapinta kanoninen NF-KB signalointia (esim. NCI-H23), joka pohjapinta, autophagy perustuva RelB tumaanohjaussignaali voidaan kuitenkin havaita. Tulevaisuuden tutkimus autophagy lastien tuonut autophagosomal membraaneihin Tax1bp1 ja Ndp52, ubikitinoitu tai muuten myös valotti mekanismia, jolla nämä lasti reseptorit liittyvät sovittelun kaanoniin NF-KB: n signalointi. Proteomic kokeita identiteetin määrittämiseksi lastien ovat käynnissä laboratoriossamme.

Koska kiinnostusta kehittää TBK1 estäjät syövän hoitoon, meidän täytyy ymmärtää yksityiskohtaisesti seurauksia menetys reitin kuvata tässä.

in vivo

ympäristössä, vaikutukset RelB sääntelyn autophagy ja TBK1 eivät todennäköisesti kokonaan solun itsenäistä, koska vakiintunut rooli NF-KB signalointi kontrolloinnissa solu-solu viestintä ja tulehdusta. Mielenkiintoista,

TAX1BP1

voivat säädellä suolen tuumorigeneesiä hiirimalleissa syöpä [40]. Myös ituradan

TAX1BP1

hiirten näyttää elinspesifisellä tulehduksellinen fenotyyppiin [41]. On mahdollista, että nämä havainnot voivat liittyä rooli Tax1bp1 tässä kuvattuja tai vaihtoehtoisesti sitä parempi on kuvattu asema tukahduttaa kanoninen NF-KB signalointi [24]. Lopuksi, kohdentamiseen autophagy on myös ehdotettu keinona syövän hoitoon, ainakin jotkin geneettiset taustat. Tiedot täällä ehdottaa varovaisuutta ekstrapoloidaan tulokset geneettisen eston autophagy kohdentamalla autophagosome muodostumista ja sitomisen, että lääkkeiden vaikutusta, jotka kohdistuvat lysosomaalisen toiminto, kuten klorokiini, proteaasinestäjien bafilomysiini A1. Ei ole selvää, että aineet, kuten nämä vaikuttavat kaikkiin muutoksiin, kuten NF-KB: n aktiivisuuden, että kohdistaminen alkuvaiheessa autophagy tulee, ja

päinvastoin

.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja Plasmidit

Kaikki solut viljeltiin DMEM: ssä (Sigma) + 10% FCS: ää (Sigma), 5% CO2, 37 ° C: ssa. HEK293FT solut Invitrogen. A549-soluja käytetään saatiin Institute of Cancer Research (London, UK) ja identiteetti varmistettiin microsatellite genotyypitys (Health Protection Agency, UK). NCI-H23-solut ostettiin suoraan ATCC. A549 ja NCI-H23-soluja derivatisoida ilmaista ekotrooppisille Reseptori käyttäen pEcoR-neo ja valinta G418. Retrovirus tehdä vakaan infektantteja syntyi Phoenix-Eco soluista standarditekniikoilla. Nämä virukset olivat: pBabe GFP-LC3B puro [42]: rotan LC3B cDNA fuusioitu N-terminaalisesti GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- & gt: A puro: edellinen plasmidi koodaus proteiini katkaistu niin C-ter Gly alttiina käsittely C-terminuksesta Atg4 konstitutiivisesti alttiina. Tämä C-ter Gly on mutatoitu Ala. PBabe tfLC3B puro: pBabe puro tandem loisteputki LC3B [21] kloonattu NheI (tylppä) /SalI osaksi SnaBI /Sali-. pWZL GFP-TBK1 HYGRO: pWZL GFP DEST IRES HYGRO vektori (julkaisematon) täyspitkä TBK1 fuusioitu C-päähän GFP rekombinaatiolla pDONR 223 TBK1 (julkaisematon) Gateway teknologia (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: pBabe Cherry DEST BLAST-vektoriin (julkaisematon) täyspitkä LC3C fuusioitu C-päähän mCherry rekombinaatiolla kanssa pDONR 223 LC3C [43], jonka Gateway-tekniikalla (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Kuten kirjallisuudessa {Behrends 2010 # 4}. MSCV FLAG-Ha- TAX1BP1 (WT ja LIR mutantit): TAX1BP1 cDNA kloonattiin pDONR 223 standardeilla Gateway kloonausmenetelmillä käyttäen pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1 (alla) mallina. TAX1BP1 Sitten cDNA Gateway kloonattiin MSCV NTAP IRES PURO [43]. Kohdennettu mutageneesi suoritettiin pDONR ennen rekombinaatiolla MSCV NTAP IRES PURO tuottaa cDNA, joka koodaa TAX1BP1 mutaatioiden kanssa oletetun kanoninen tai ei-kanoninen LIR motiivi (mutaatiot, kuten on kuvattu tekstissä). Kaikki mutagenisoitu cDNA sekvensoitiin kokonaan.

Muut plasmidit, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat: pcDNA 3.1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 täyspitkän cDNA: n (NCBI isoformin 1) monistettiin PCR: seuraavilla alukkeilla peräisin IMAGE-klooni ja kloonattiin BamHI-XhoI osaksi pCDNA 3.1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG ATT TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC TTT CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC ja CTC GAG CTA GTC AAA ATT TAG AAC ATT CTG ATC AAA ATG GGT C. Saatu cDNA koodaa 307I variantti tämän proteiinin (yleinen polymorfia). pDEST15-tyhjän vektorin (ilmentämiseen GST ohjaus proteiinia): luotu lisäämällä lukukehyksessä lopetuskodonin sisältävien kasetti pDEST15 Gateway kloonaamalla erityisesti rakennettu pDONR223 plasmidi. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C ja pDEST15-GABARAP (ilmentämiseen GST-fuusioproteiineja) luotiin rekombinaatiolla pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C tai pDONR 223 GABARAP [43] Gateway teknologia (Invitrogen).

Kemikaalit

Chloroquine saatiin Sigma ja pidettiin jäädytettynä kantaliuoksena PBS: ssä. 3-MA saatiin Sigma ja uusia ratkaisuja tehty DMEM ennen työskentelytasolla pitoisuus ennen levittämistä soluihin. TNFa saatiin Sigma ja säilytetään pakastettuina erinä vesiliuoksessa. TBKi (MRT68601, Fig. S1) saatiin MRC Technology ja pidettiin jäädytettynä kantaliuoksesta DMSO: ssa. Bafilomysiini A1 saatiin Sigma ja varastoidaan pakastettuna kantaliuoksesta DMSO: ssa. Pepstatiini A: ta saatiin Sigma ja varastoidaan varastossa etanolissa. E64d Calbiochem ja varastoidaan pakastettuna kantaliuoksesta DMSO: ssa.

Vasta-aineet

vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa, ovat seuraavat: TBK1 (Rabbit AOW9 monoklonaalinen, Millipore), Phospho-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), ATG5 (for ATG5-12, Kanin polyklonaaliset, Cell Signalling Technology), ULK1 (Kanin polyklonaaliset A705, Cell Signalling Technology), LC3B (Immunoblotvärjäys, Rabbit monoklonaalinen D11, Cell Signalling Technology), LC3B (Immunofluoresenssi, hiiren monoklonaalinen 2G6, Nanotools), GABARAP (Kanin polyklonaaliset Ap1821a, Abgent), ERK (Kanin polyklonaaliset 9102, Cell Signalling Technology), RelB (Rabbit monoklonaalinen C1E4, Cell Signalling Technology), histoni H3 (H3, hiiren monoklonaalinen 6-6-2 , Millipore), Tax1bp1 (Rabbit poly HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (Rabbit poly ab68588, Abcam), p62 (hiiri 3 /p62 monoklonaalinen, BD Pharmingen), myc (Rat JAC6 monoklonaalinen, ABD Serotec [TBK1 coIP kokeita] tai hiiren 4A6 monoklonaalinen, Millipore [GST avattavasta kokeita]), c-Rel (Kanin polyklonaaliset, 4727, Cell Signalling Technology), RelA (Rabbit monoklonaalinen C22B4, Cell Signalling Technology), α-tubuliinin (hiiren monoklonaalinen DM1A, Sigma), HA ( Rat monoklonaalinen 3F10, Roche), GST (GST-2 hiiren monoklonaalinen, Sigma), Optineurin (Kanin polyklonaaliset Item no. 100000, Cayman Chemical), K-Ras (hiiri monoklonaalinen 3B10-2F2, Sigma). Anti-fosfo-S403-p62 oli ystävällinen lahja Nobuyuki Nukina (RIKEN, Japani). Fosfospesifisiä vasta IRF3, RelA ja JNK saatiin Cell Signalling Technology.

siRNA Transfektio

35 mm astiat, 0,8 x 10

5 A549 tai 1,2 x 10

5 NCI-H23 maljattiin yhdessä yössä. Solut transfektoitiin 8 h Oligofectamine (Invitrogen) ja 10 nM siRNA (A549) tai 20 nM siRNA (NCI-H23), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.