Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Monet tärkeät biologiset prosessit ovat hallinnassa läpi solu-vuorovaikutuksiin mukaan lukien siirtokuntien etäpesäkekasvainten solujen ja valvontaa erilaistumista kantasoluja niiden kapealla. Huolimatta ratkaisevaa merkitystä solun ympäristön säätelyssä solusignalointi,

in vitro

tutkimusmenetelmät tällaista vuorovaikutusta ovat vaikeita ja /tai epäsuora.

Menetelmät /Principal Havainnot

Me raportoivat kehityksestä kuvan perustuvaa menetelmää erottamaan kaksi solutyyppejä viljellään yhteisviljelmä. Lisäksi solut on yhtä tyyppiä, jotka ovat suorassa kosketuksessa solujen kanssa toisen tyypin (viereisten solujen) voidaan analysoida erikseen soluihin, jotka eivät kuulu yhteen hyvin. Muutokset arvioidaan käyttämällä väestötilastot, jotka ovat käyttökelpoisia havaitsemaan pieniä muutoksia kahdella eri populaatioissa. Olemme käyttäneet tätä järjestelmää luonnehtia muutoksiin LNCaP eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja kasvatettuna kosketuksissa ihmisen verisuonten endoteelisolujen (HUVEC). Huomaamme, että ilmaisun ja fosforylaatiota WWOX pienenee LNCaP kasvatettuna suorassa kosketuksessa HUVEC. Alennettu WWOX signalointi on liittynyt alentunut aktivaation tai ilmentymisen JNK ja p73. Huomaamme, että p73 tasot ovat myös vähennetään LNCaP kasvatettu joutuessaan HUVEC, mutta emme noudata tällaista muutosta JNK tasoilla.

Johtopäätökset /merkitys

Huomaamme, että kuvatulla menetelmällä on tilastollisesti luotettava ja voidaan sovittaa erilaisia ​​tutkimuksia, joissa solun toimintaa tai signalointi vaikuttaa heterotyyppisten solu-solu-kontakti. Ironista kyllä, mahdollinen haaste menetelmä on sen korkea herkkyys pystyy luokitella tapahtumien tilastollisesti merkitsevä (koska suuri määrä soluja arvioitiin erikseen), kun biologinen vaikutus voi olla vähemmän selvä. Menetelmiä olisi parasta käyttää yhdessä muita tapoja arvioida biologista merkitystä mahdollisesti hienoisia eroja väestön. Kuitenkin monia tärkeitä tapahtumia, kuten perustamalla etäpesäkekasvainten, tapahtua harvinaisia ​​mutta tärkeitä muutoksia, ja menetelmiä, kuten kuvaamme tässä voidaan tunnistaa ja kuvata osuus ympäristön muutoksiin.

Citation: Lapan P, Zhang J, Hill A, Zhang Y, Martinez R, Haney S (2009) Image-Based arviointi kasvu ja opasteiden syöpäsoluissa Tukena Direct Cell-Cell yhteyttä. PLoS ONE 4 (8): e6822. doi: 10,1371 /journal.pone.0006822

Editor: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2009; Julkaistu: 31 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Lapan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus, joka usein luonnehditaan säädeltyyn kasvu [1]. Vaikka juuri syöpä solujen lisääntymistä on seurausta menetys kasvun ja solukierron lakisääteiset tarkastukset sisällä syöpäsoluja itseään, muutoksia tapaan syöpäsolujen vuorovaikutuksessa ympäristön kanssa ovat myös kriittinen kasvainten kehittymiseen ja syövän kliininen [2], [3]. Näitä ovat proliferatiiviset ja invasiivisia lähetettyjen signaalien stroomasoluissa ja proangiogeeninen signaaleja syöpäsolujen endoteeliin. Nämä vuorovaikutukset syöpäsolujen ja niiden ympäristö on ollut vaikeampi luonnehtia ja kohdistaa terapeuttista intervention kuin luontainen muutoksia syöpäsoluja, koska

in vitro

malleissa solu-solu-vuorovaikutukset ovat vaikea määrittää ja standardoida, erityisesti asteikko välttämätön lääkkeen seulontaan. Näistä vaikeuksista huolimatta vuorovaikutus syöpäsolujen ja niiden ympäristö ovat osoittautuneet tehokas strategia syövän hoitoon [4], ja siksi enemmän huomiota siihen, miten syöpäsolut toimia kasvaimia on merkittävä ongelma.

Menetelmät

in vitro

tutkimuksessa syöpäsolujen vuorovaikutus strooman ja endoteelisolujen on kehitetty, kuten miten syöpäsolujen indusoi angiogeneesiä ja makrofagien [5] – [8]. Samankaltaiset menetelmät mahdollistavat tutkimuksen solujen välisen signaloinnin kautta yhteisviljelmä vaiheen indusoimiseksi parakriinisen ja heterotypic yhteystiedot riippuvat muutokset, minkä jälkeen erottamalla solutyyppejä kvantitointiin transkription profilointi, western-blottauksella tai niihin liittyviä menetelmiä. Kyky havaita muutoksia näytteissä kasvanut suorassa yhteisviljelmä, sekoitettu monokulttuuri (käyttämällä inserttien tai niihin liittyvien fyysiset esteet), ja standardi monokulttuurit käyttäen väliaine sallia tällaisten prosessien johtua tiettyjen tasojen vuorovaikutusta. Vaikka arvokasta, nämä järjestelmät kantaa rajoitukset luottamalla vastauksista, jotka on keskimäärin koko näytteestä kutakin hoitoa, ja yleensä liittyy merkittäviä käsittely erottaa solutyyppejä jälkeen suoraan yhteisviljelmä tuottaa homogeenisen näytteitä profilointiin tai niihin liittyviä analyyseja. Integrointi määrällisen fluoresenssimikroskopiaan (High Content Screening, tai HCS) alkupuolelle Lääkekehitysprosessi ja biologiseen perustutkimukseen [9] – [11] tarjoaa menetelmiä parantaa yhteisviljelmä tutkimuksia helpottamalla suoraan mittaamiseen morfologia, leviämisen ja solujen signalointia soluja kasvatetaan suoraan kosketukseen erilaisia ​​solutyyppejä.

Olemme kehittäneet ja testattu algoritmin mittaamiseksi muutokset epiteelisyöpäsolujen kasvatettu suoraan kosketukseen endoteelisoluissa. Menetelmä tunnistaa solutyyppi ja sijainnin määrittämiseksi läheisyys endoteelisolujen syöpäsoluja, ja kvantitoi solujen ominaisuuksia, kuten solun terveyttä ja laajuus aktivointi signalointireittien viereisiä soluja varten endoteelisoluihin ja vertaa näitä ominaisuuksia epiteelisoluihin, jotka ovat ei -adjacent endoteelisoluihin. Prosessi voidaan kääntää, luonnehtia muutokset endoteelisoluissa, jotka johtuvat vuorovaikutuksesta syöpäsoluja. Vaikutus syöpäsolujen endoteelisoluissa voidaan mitata vertaamalla näitä kahta ryhmää samassa näytteessä erottamatta soluja. Osoitamme lähestymistapaa käyttäen eturauhas- ja rintasyövän soluja, ja validoimaan menetelmän osoittamalla, että geenien ilmentyminen muuttuu tunnistettu transkription profilointiin tutkimuksissa havaitaan tutkitut näytteet kuvattujen menetelmien.

Materiaalit ja menetelmät

solut, media, reagenssit ja viljelyolosuhteet

HUVEC-solut ostettiin Cambrex (Cat #: CC-2519) ja ylläpidetään EBM-2 väliaine (Endoteelisolukasvun Medium: CC-3162, jossa on 2% FBS) HUVEC-soluja viljeltiin enintään kymmenen kohtia. Eturauhassyövän LNCaP (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin RPMI1640-elatusalustassa, jota oli täydennetty glutamaatin, ei-välttämättömiä aminohappoja, penisilliiniä, streptomysiiniä ja 10% FBS: ää (kaikki Invitrogen, Carlsbad, CA).

Hiiri anti-CD31 (Cat #: 550389) oli BD Pharmingen (San Diego, CA), hiiren anti-CDw75 (IgM) (Cat #: ab9515-500) oli peräisin Abcam (Cambridge, MA), Kanin anti WWOX (28- 42) (Cat #: AP1008) oli Calbiochem /EMD Chemicals (Gibbstown, NJ), Rabbit anti- (pThr33) WWOX (Cat #: AP1009), oli Calbiochem /EMD Chemicals, hiiren anti p73 (Cat #: 32- 4200) oli kotoisin Zymed /Invitrogen, hiiren anti-c-Jun (Cat #: OP55) oli Calbiochem, hiiren anti-JNK1 (Cat #: MAB17761) oli R anti-WWOX, anti-pWWOX, anti-P73, anti-c-Jun, anti-JNK1 käytettiin kaikkia laimennuksessa 1:100. Kolmen PBS pesun, Alexa-leimatut sekundääriset vasta-aineet (Molecular Probes /Invitrogen) lisättiin yhdellä 1:200 laimennus ja DAPI lisättiin tahra ytimiä, kuten kuvassa legendoja.

yhteisviljelmä, erottaminen ja RNA valmistelu Transcription Profilointi

LNCaP ja HUVEC-solut laajennettiin erikseen T75-pulloissa. HUVEC-solut kasvatettiin 70% konfluenssiin, minkä jälkeen 7 x 10

5 LNCaP-solut ympättiin, ja soluja kasvatettiin EBM2-2% FBS 48 tuntia. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan (yksi T75-pulloa kohti) jääkylmällä PBS: llä /0,1% BSA: ta ( 4 x 10

6 solua /ml), 25 ui CD31-sidottu Dynabeads (4 x 10

8 helmiä /ml) (Invitrogen: 111-55D) lisättiin, sekoitettiin hyvin ja inkuboitiin + 4C kevyesti kallistus ja kierto 20 min. 1 ml: lla jääkylmää PBS /0,1% BSA: ta lisättiin ja näyte pantiin Dynal MPC (Magnetic Particle Concentrator, Invitrogen) 2 min sedimenttiin helmiä. Supernatantti, joka sisälsi LNCaP-solut, jotka tallennetaan erikseen, ja helmet suspendoitiin uudelleen 1 ml: lla jääkylmää PBS /% 0.1BSA uudelleen, ja supernatantti poistettiin ja tallennetaan. Pesu- prosessin toistettiin 4 kertaa ja supernatantit yhdistettiin. Allas sentrifugoitiin ja pelletti merkitty LNCaP osa ja helmet leimattiin HUVEC osa. RNA hajotuspuskuria lisättiin sekä jakeet ja RNA puhdistettiin käyttämällä Qiagen miniRNA kit (Valencia, CA). mRNA näytteet valmistettiin ja käsiteltiin transkription profilointiin käyttäen Affymetrix U133A GeneChips kuten aiemmin on kuvattu [12].

Läheisyys algoritmi

Cell keraviljelmiä värjätään DAPI, joka värjää tumat kaikkien solujen , ja toinen solutyyppispesifisellä tahra. Käytämme joko CD44 tunnistaa HUVEC-solujen tai CDw75 tunnistamiseksi LNCaP. Fluoresenssi kvantitoitiin käyttäen Cellomics VTi korkea pitoisuus skanneri. Kuvat analysoitiin CellProfiler [13] edellyttäen, että x-y-koordinaatti sijainnin ytimen tietyn kuvan. Käyttämällä ydin- x-y-koordinaatit, x- ja y-siirtymät yhden solun toisesta solusta voidaan laskea. Nämä siirtymät tarjoavat pituus puolin suorakulmaisen kolmion.

etäisyyden d kahden ytimien lasketaan käyttämällä näitä siirtymiä ja Pythagoraan lauseen, whereand on x välinen etäisyys x

1 ja x

2 ja on y välinen etäisyys y

1 ja y

2. Jos etäisyys d on pienempi kuin keskimääräinen halkaisija solujen, kaksi solut pidetään toistensa vieressä. Sitä vastoin, jos etäisyys d on suurempi kuin keskimääräinen halkaisija solujen, kaksi solut pidetään ei-vierekkäisiä. Keskimääräinen halkaisija solujen määritettiin taulukoitava ”MajorAxisLength” ja ”MinorAxisLength” arvot laskettiin CellProfiler joukolle viite kuvia.

ydin- etäisyyden ja CDw75 värjäytyminen tai CD44 värjäys olivat sitten käytetään määrittämään, mikä HUVEC-soluja kosketuksessa LNCaP solun läpi seuraavan prosessin. Ensimmäinen vaihe sisältää yksilöidään kaikki solut yleisessä yhteisviljelmä väestöstä käyttämällä tumaväriä DAPI. Toinen vaihe on jakaa väestön kaikkien solujen kahteen alapopulaatioista, ne solut, jotka värjäytyvät CD44 (HUVEC) ja ne, jotka värjäytyvät CDw75 (LNCaP). Kolmas vaihe on edelleen pienempiin osiin epiteelin väestön kahteen alapopulaatioihin, ne LNCaP vieressä HUVEC soluun ja ne ei-vieressä HUVEC soluun. Luettelo kaikista LNCaP (CDw75 positiivinen tai CD44 negatiivinen) ja HUVEC-soluja (CDw75 negatiivinen tai CD44 positiivinen) rakennettiin. Pythagoraan matkan jokaiselle LNCaP solun verrattuna kuhunkin HUVEC kenno laskettiin. Etäisyydet pienempi kuin keskimääräinen halkaisija olevan LNCaP-soluja merkitty LNCaP-solujen vieressä HUVEC-soluihin.

KS tilastollinen

vieressä ja ei-vierekkäiset alapopulaatioista solut tunnistettiin käyttämällä edellä kuvattuja läheisyys algoritmi. Intensiteetti kiinnostavan antigeenin verrattiin koko näiden kahden populaation käyttäen ks.test toiminto R ohjelmointikielellä (www.r-project.org). Kaksipuolinen ks.test p-arvo on alle 0,05 käytettiin päätellä, että kaksi alaryhmästä jakaumat eivät peräisin samasta vanhemman jakeluun.

Mosaic analyysi vierekkäisten ja ei-viereisten LNCaP

data kuvassa, kaksi kaivoa tarkasteltiin. Näistä kaksi kaivoa, 3428 LNCaP olivat saatavilla, ja luokitellaan joko viereisen (655) tai ei-vierekkäisten (2773). Näistä soluista, kaikki mahdolliset 655 viereisten solut valittiin, ja 1000 ei-vierekkäiset solut satunnaisesti näytteet. Jotta neliön mosaiikki, ensimmäinen 625 solua kustakin näistä näytteistä näytetään 25 x 25 matriisin kuvia. Jokainen solu kuva oli 10 x 10 pikselin neliön, keskitetty (x, y) koordinaatit solun. Kanava 3 kuvaa (P73) näytettiin käyttäen oletuksena HSV värikartta, kiinteä 12-bittiset värit rajat (intensiteetit 0-4096), jotta intensiteetti asteikot olivat samat kaikissa kuvissa.

Tulokset

kehittäminen kuva-tekniikkaan perustuva menetelmä tutkimukseen endoteelisolujen suorassa kosketuksessa syöpäsolujen

kautta epäsuoralla immunofluoresenssilla solutyyppiparametria antigeenejä, olemme pystyneet tunnistamaan olosuhteet, jotka mahdollistavat solujen eri alkuperää on merkittävä varten HCS. Edellytykset nimenomaan merkitsemiseksi HUVEC-solut on jo kuvattu, käyttämällä spesifisten vasta-aineiden PECAM tai CD31 [14]. Tällaiset merkinnät käytetään virtaussytometrialla perustuvat tutkimukset ja siten oli erittäin todennäköistä, että tällainen havaitseminen olisi mahdollista kiinnittyvä kulttuuri järjestelmä. Vasta-aineet saatiin kaupallisista lähteistä ja minimaalisella seulonta kiinnitys ja värjäys olosuhteet määritettiin. Monenlaisia ​​ehdokas markkereita ovat käytettävissä havaitsemiseksi eturauhassyövän soluissa, erityisesti eturauhasen-antigeenin (PSA) ja eturauhasen-spesifisen membraanin antigeenin, jotka ovat kliinisesti merkityksellisiä eturauhassyövän (vaikka PSA itsessään on erittyvä proteiini, sen tuotantoa voidaan havaita eturauhasen syöpäsolujen) [15]. Muita ehdokas markkereita ovat kasvaimen antigeenejä, jotka normaalisti osoittavat erittäin rajoitettua lauseke (tyypillisesti sikiön tai rajoitetun aikuisen kudoksen tyyppejä). Yksi esimerkki tästä viimeksi mainittu ryhmä on CDw75, solupinnan merkkiaine B-lymfosyyttien tuottaman beeta-galaktosidaasi-alfa-2,6-sialyyli-transferaasi [16]. Expression of CDw75 antigeenejä on havaittu monissa epiteelisyöpien, kuten mahalaukussa, ja paksusuolen [17], [18]. Seulonnassa ehdokas merkkiaineiden havaitsemiseksi eturauhaskarsinooman solujen yhteisviljelmä kanssa endoteelisolujen, olemme havainneet, että CDw75 oli spesifinen merkki kaikkien kolmen eturauhasen solulinjojen tutkimuksessa. Yhteisviljelmä kokeet osoittivat, että solutyypit voivat olla helposti ja lopullisesti tunnistaa käyttämällä vasta-aineita näitä markkereita.

jälkeen määritysohjelman solutyyppien yhteisviljelmä, pyrimme tunnistamaan soluja, jotka ovat heterotypic kosketuksessa. Lähestymistapamme Näin oli tunnistaa kaikkien solujen tyypin ja sijainnin, ja sitten kehittää menetelmä jäsentämiseen soluja ryhmissä vierekkäisten ja ei-viereisten solujen osalta solujen siellä kohderyhmä on yhteisviljelmä kanssa. HCS on erittäin moniparametrisissä, syömällä välillä kymmenkunta ja yli 100 ominaisuuksia solua kohden [10], [11], [19]. Peruspiirteitä ovat DNA: n määrä, koko ja muoto ytimen. Muita ominaisuuksia ovat riippuvaisia ​​käytetyistä menetelmistä leimaamiseen soluihin, ja voi sisältää mittaukset solun tukirangan, soluelimiin tai erityiset proteiinit ja niiden lokalisointi ja fosforylaatio asema [20]. Osana nykyisen tutkimuksen, olemme kehittäneet edellytykset havaitsemiseen yksittäisten solujen ja niiden ilmentyminen joko CD31 tai CDw75 antigeenejä, ja niiden sijainti kentällä. Viimeinen ominaisuus antaa meille mahdollisuuden määrittää läheisyys kaksi solua toisiinsa. Tunnistaminen on solun vieressä voidaan tarkasti määritelty etäisyys ytimet syövän solun endoteelisolujen. Sellaisenaan, solut voidaan jaotella vieressä ja ei-vierekkäisten, ja erot näiden kahden ryhmän voidaan määrittää.

algoritmia on käytetty tunnistamaan vieressä ja ei-vierekkäisten LNCaP-soluja, suhteessa HUVEC-solut, kuten on esitetty kuviossa 1. kuviossa 1 A, LNCaP-solujen, jotka on leimattu anti-CDw75-vasta-aineen punainen, ympätään HUVEC, värjättiin anti-CD44-vasta-aineen vihreä. Intensiteetti CDw75-pohjainen fluoresenssi Kustakin solun alalla. Kukin solu on numeroitu, ja intensiteetti kullekin solulle on esitetty kuviossa 1B. Tämän mittauksen, solut voidaan luokitella joko syöpä tai endoteelisoluissa. Lisäksi CDw75 värjäys, muiden ominaisuuksien, jotka liittyvät syövän soluja voidaan käyttää tässä vaiheessa, mukaan lukien DNA-pitoisuus (monet syöpäsolulinjat, kuten LNCaP ovat aneuploidi ja on huomattavasti korkeampi DNA-pitoisuus kuin primäärisiä soluja). Nämä tiedot voidaan sisällyttää antigeenin kanssa intensiteetti viereen solujen syöpä tai ei, tai joissakin tapauksissa voidaan käyttää yhden parametrin tämän määrityksen (tietoja ei esitetty). Kun solut on tunnistettu, niiden paikkatietoja käytetään kartoittamaan kunkin solun sen sijainti. Todettuaan kunkin solun LNCaP tai HUVEC, kukin solu on sitten teki varten soluja, jotka ovat lähellä sitä, raja etäisyyden ollessa asetettu keskimääräinen halkaisija soluihin. Solut yhden tyypin, LNCaP tässä esimerkissä, on siksi lisäksi määritelty vieressä HUVEC vai ei. Solut tunnistettiin vieressä on esitetty kaavamaisesti kuviossa 1C keltainen, tai ei-vierekkäisten, punaisella. HUVEC-solut näkyvät vihreinä. Tästä hetkestä eteenpäin, määrälliset tiedot voidaan uuttaa ja analysoida kaksi subsets LNCaP. Erot näiden osajoukkojen ovat osoitus vastaus suoraan kosketukseen HUVEC-solujen.

yhteisviljelmä LNCaP ja HUVEC, LNCaP-solut leimattiin anti-CDw75 vasta-aineiden ja punaisella, HUVEC leimataan anti-CD44 vasta, vihreä. A. Esimerkki kentän kuva. B. kvantitointi CDw75 fluoresenssia käytetään luonteenomaiset soluissa joko LNCaP (korkea intensiteetti, punainen) tai HUVEC (lievää vihreä). C. Mapping LNCaP ja HUVECeja. Paikat voidaan verrata solujen paneelissa A. Solut tunnistetaan viereisten LNCaP keltainen, ei-vierekkäiset LNCaP punaisella ja HUVEC vihreä.

suuri haaste kehittää läheisyys algoritmi HUVEC voidaan nähdä kuviossa 1C. Heterogeenisyys sekä koko ja muoto solujen on vaikea määrittää etäisyys kahden solujen, joka perustuu sijainnin tumassa. Määrittäminen etäisyyden tuma, joka edustaa keskimääräinen säde solun kehon vääristelee väliset vuorovaikutukset monta solua. Solut, jotka vaihtelevat kooltaan, tai merkittävästi pitkänomainen, ei voida käsitellä useimmissa nykyisen kuvan analyysialgoritmien. Kaksi käytännön kysymykset (a) mihin toimiin voidaan vireille vaikutusten minimoimiseksi vaihtelua solun koko, ja (b) kuinka paljon virhe voi algoritmi sietää ennen vaikutusta ei voida havaita? Vaikutukset muuttaa tapaa, jolla solua maljataan tutkittiin seuraavaksi, kokonaisvaikutusta vaihtelevuuden yhteisviljelmä pinnoitus ehtoja kestävyydestä lähestymistavan yleisesti arvioitiin analyysissä osassa myöhemmin tässä tutkimuksessa.

Candidate geenejä endoteelisoluissa, jotka osoittavat muutoksia ekspressiotasoja, kun viljeltiin syöpäsoluja

useita tutkimuksia on julkaistu, joissa kuvataan muutoksia geenien ekspressiotasot syöpäsolulinjoissa kasvatettiin yhteisviljelmä [21] – [25]. Jokainen järjestelmä on tunnistettu erityisiä signalointireitin tapahtumia, sekä syövän ja stroomasoluja, jotka käynnistyvät solu-solu yhteyttä. Me pyrittiin selvittämään muutoksia solulinjoissa käytämme näissä tutkimuksissa kuin vahvin lähde ehdokas proteiineja voidaan käyttää oikeuttamaan järjestelmää olemme kuvailleet. Käytimme kylvetään LNCaP eturauhaskarsinoomasolua soluja ja HUVEC endoteelisolut kuin yhteisviljelmä järjestelmä kehittää luettelon kandidaattigeenit validointitutkimuksissa. Tämä saatiin aikaan käyttämällä perinteisiä menetelmiä suoraan yhteisviljelmä, solujen kasvu tietyn ajanjakson ajan, jota seuraa mekaaninen erotus kahden solutyypeissä. Tarkemmin, käytettiin CD31-konjugoituja helmiä nopeasti ja kvantitatiivisesti erottaa endoteelisolujen eturauhasen karsinoomasoluja jälkeen trypsinoinnilla sekaviljelmän. Kyky helmiä erottaa kahden solutyypin karakterisoitiin immunofluoresenssilla ja RT-PCR: llä. Nämä kaksi näytettä soluja tarkastettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla käyttäen CD31-vasta-aineita, ja se osoittaa, että solut erotetaan helmet olivat todellakin CD31 positiivinen, kun taas solut eivät sido helmet olivat CD31 negatiivisia. Nämä tulokset osoittivat, että menetelmä pystyi kvantitatiivisesti erottaa kahden solutyypin seuraavat yhteisviljelmä.

Transkription muutoksia, jotka tapahtuvat LNCaP-soluissa sen jälkeen, kun yhteisviljelmä HUVEC-solut tunnistettiin oligonukleotidisirujen, vertaamalla kasvua solujen yhteisviljelmä kanssa HUVEC-solut ja sen jälkeen kasvu kuin mock yhteisviljelmä; monokulttuuria soluja käsiteltiin helmiin perustuvat erotus protokolla tavalla identtinen todellisen yhteisviljelmä näytteitä. Ennen koko transkription profilointi oligonukleotidigeenisirumenetelmää, tarkastetaan erottaminen solutyypeissä RT-PCR kolme geeniä ilmaistuna endoteelisoluissa. Tiedot on esitetty kuviossa 2. Tässä tulokset kolme geeniä näkyvät varten yhteisviljelmä ja mock näytteitä. Kolme geenit, PECAM /CD31, KDR /MET ja VE kadheriinin ilmaistaan ​​hyvin HUVEC-soluissa, mutta huonosti LNCaP, kuten kuvassa on yksipuolinen (mock) kokeita kuviossa 2. Tiedot ovat peräisin yhteisviljelmä näytteistä osoittaa poistamista HUVEC soluja LNCaP supernatanteissa olevan oleellisesti täydellinen. Siksi olemme pystyneet kulttuurin LNCaP-soluja HUVEC-solut, ja sitten erottaa solutyyppejä transkription profilointiin analyysiä.

RT-PCR-analyysi entothelial geenien näytteitä mono- ja yhteisviljelmä eron jälkeen solun tyypit. Soluja viljellään monokulttuureja joko endoteelin tai eturauhasen solujen käsiteltiin samalla tavoin kuin käytetään erottamaan soluja jälkeen yhteisviljelmä. Solut otetaan talteen sitoutumalla ant-CD31-konjugoituja helmiä ja pelletöityä. Expression tiedot kunkin geenin /kunto on raportoitu sen ilmentymisen taso suhteessa kontrolliin geenin (β-2-makroglobuliini) kullekin näytteelle. Circles: pelletti; Kolmiot: supernatantti [riippuen Journal, he saattavat haluta tätä info on legenda; Kuvan alkuperäinen kuva on selite]

Transkription profilointi tunnistettu 44-geenit, jotka olivat voimistuvan yhteisviljelmä HUVEC-solujen ja 4-geenit, jotka olivat vaimentua, esitetään taulukossa 1. Neljä geeniä tunnistettiin kaksi määritteistä kunkin on oligonukleotidisirujen, MOBK1B, SASH1, TGOLN2 ja WIPI49; tarpeeton karsinnat poistettiin luettelosta. Vuodesta kandidaattigeeneihin tässä luettelossa, me seulotaan kaupallisilta toimittajilta vasta-aineille, jotka nimenomaan tunnistaa tavoitteet Western-blottauksella ja epäsuoralla immunofluoresenssilla. Monissa tapauksissa, kaupalliset vasta-aineet eivät olleet riittävän yksityiskohtaisia, kuten määrittävät sekä Western-blottauksella ja HCS. Yleensä vasta-aineet joko antoi merkittävän ristireagoiville band Western blot tai ei osoittanut titrattava värjäytymistä solurakenteeksi odotetaan antigeenin. Tämä päti TNFRSF19, jolla oli dramaattisin muutos mRNA ekspressiotasot. Kuitenkin jos kyseessä on WWOX, tunnistettu alas-säätelee solu-solu kosketuksiin LNCaP-soluissa, pystyimme tunnistamaan ja validoida sopivia reagensseja. WWOX on ollut hyvin tunnettu tuumorisuppressorina jälkeen tutkimukset, että sen ilmentyminen on usein seurauksena menetettyjen Translokaatiokantajat sisällä hauras sivusto FRA16D [26], [27], mukaan lukien eturauhasen syöpiä [28]. Vaikka ilmentyminen menetetään monissa syövissä, sen ilmentyminen voidaan usein havaita monissa syöpäsolulinjoissa [29]. WWOX on fosforyloitu Thr-33 tähteen hoitovastetta TNF-α ja hyaluranidase [30]. Fosforyloituu WWOX sitten aktivoida p53, mutta tämä apoptoosin induktio on tukahdutti JNK1, osittain suoralla yhdessä WWOX [31]. Sinänsä vähensi WWOX ilmaisu myös vaimentaa apoptoosin altistumisesta johtuvat ulkomaisten ympäristöissä, kuten ennalta metastaasien ennen uusien kasvaimen kasvua. Tunnistaminen vähensi merkitsevästi ilmaus WWOX LNCaP-soluissa kosketuksessa HUVEC esittelee biologisesti relevantti prosessi, joka voitiin analysoida järjestelmän kuvaamme.

Detection muutosten signaalitransduktioreitteihin eturauhasen syöpä tuloksena olevat solut solu-solu-kontakti

testaamiseksi vaste WWOX tasoilla yhteisviljelmä, menetelmiä tarvitaan muuttaa. Tarkemmin sanoen menetelmä ei ole tällä hetkellä vahvana neljä kanavaa, koska spektrin päällekkäisyyttä sininen oranssi erilaisia ​​spektrejä ja jotkut heikkous intensiteetin punainen alue. Sinänsä merkintöjä yhden antigeenin tarpeen jättää pois sisällyttää WWOX. Yritimme jättämällä CD31-antigeenin ja testataan onko CDw75 värjäytyminen oli riittävä erottamaan LNCaP ja HUVECeja. Monokulttuureja ja keraviljelmiä arvioitiin sen määrittämiseksi, jakelun CDw75 värjäytymisen tasot kussakin solutyypissä ja määrittää, missä vaiheessa HUVEC alettiin kutsua LNCaPs. Valikoima tasot kahden solutyypin oli samanlainen kuin mitä havaittiin ensimmäisen vaiheen tulokset (kuvio 1), jossa LNCaP-solut osoittivat laajaa värjäytymisen, mutta vain harvat solut kenttää kohti värjättiin kevyesti niin, että ne voitaisiin luokitella HUVEC, ja siksi tämä menetelmä erottamaan kahden solutyypin näytti riittävän vahva, jotta värjäys WWOX tai fosfo-WWOX samoin. Tunnistaminen solutyyppejä ja kvantitointi WWOX tasot on esitetty kuviossa 3. Association of signalointi intensiteetin oikean solutyypin on parantunut alkuperäiseen tutkimuksissa (kuvattu edellä) rajoittamalla solujen päällystetty, erityisesti HUVEC.

LNCaP ja HUVEC in yhteisviljelmä leimattiin käyttäen (paneeli A) DAPI, tunnistaa ytimet, (paneeli B) anti-CDw75 vasta, tunnistaa LNCaP, ja (paneeli C) anti-WWOX vasta-aineita. Paneelissa D, solut luokitellaan HUVEC näkyvät punaiset neliöt vieressä LNCaP keltaisina neliöitä ja ei-vierekkäiset LNCaP kuin sininen neliö.

Voit testata kuvan lähestymistapa olemme kehittäneet, me tutki muutokset WWOX ilmaisun tunnistimme transkription profilointiin tutkimukset voitaisiin toisteta LNCaP järjestelmässä olemme edellä kuvattu. WWOX proteiinin tasot LNCaP viereisten ja ei-vierekkäisten solujen verrattiin. Useita kaivoja käytettiin kulttuuriin LNCaP ja HUVECs ja sittemmin kiinnitettiin ja värjättiin DAPI ja vasta CDw75 ja joko WWOX tai fosfo-WWOX. LNCaP-solut määritettiin joko vieressä tai ei-vierekkäisten HUVEC ja analysoitiin kohdeproteiinin tasolla. Keskimäärin kohdeproteiinin tasolla ja keskihajonnat määritettiin. Näiden tietojen suhteen ja p-arvo on kohdeproteiinin tasojen vieressä ja ei-vierekkäisten LNCaP-solut laskettiin. Kun nämä tiedot vertailut esitetään kuviossa 4. Tulokset osoittavat, että vierekkäiset LNCaP-solut usein ovat alhaisempia sekä WWOX ja fosfo-WWOX ja ero tulee suuremmaksi, sitä suurempi merkitys mittauksen. Toisaalta, kaivot ei näy eroa ei ollut tilastollisesti varmana. Tämä näyttää osoittavan, että aina ei ole mahdollista tehdä määrittämistä siitä suorassa kosketuksessa on ollut vaikutusta, mutta kun voimme tehdä määrityksen tulokset osoittavat, että nämä antigeenit ovat alhaisemmat LNCaP että yhteyttä HUVEC. Wells että ei osoita vaikutusta on verrattu niitä vastaamattomat, ja havaitsemme, että kaivot, jotka eivät näyttämään ero niin seurauksena liian vähän LNCaP pisteytystä kuin viereisen, tyypillisesti läpi epätasainen jakautuminen solujen aikana pinnoitus .

Independent määrityksiä, usean kaivot, että suhde WWOX (mustat neliöt) ja fosfo-WWOX (punaiset neliöt) tasoja LNCaP, jotka ovat vierekkäin tai ei-vieressä HUVEC näkyvät. Kukin piste edustaa yksittäisen hyvin, jos ~350 vieressä ja ~1500 ei-vierekkäisten LNCaP-solut arvioitiin.

erillinen havainto on, että vaikka erot monissa kaivot ovat tilastollisesti merkittäviä (p-arvot alle 1 x 10

-3), suuruus vaikutus näyttää vaatimaton. Tässä vaiheessa pitää erilaisia ​​numeerisia testi ero kohdeproteiinin tasolla LNCaP populaatioissa. Testi käytimme oli Kolmogorov-Smirnov (tai KS) tilastotieto. Testi vertaa kahden populaation kuin murto osuus kokonaismäärästä antigeenin. Tulokset WWOX tasot on esitetty kuviossa 5A, ja fosforyloidun WWOX, mikä välittyy Src, kuten on esitetty kuviossa 5B. Ero kahden käyrän mukaan LNCaP vieressä HUVECeja vähemmän WWOX proteiinia kuin LNCaP-solut, jotka eivät ole lähellä HUVEC verrattuna on sijoittunut listalle.

määrä WWOX proteiinia (paneelissa A) ja fosfo-WWOX proteiini (paneelissa B), näkyvät LNCaP vieressä HUVEC (punaisella) ja niitä soluja ei-vieressä HUVEC (musta). Datapisteet edustavat (fosforia) proteiinipitoisuuden solua kohti kuin ne edistävät koko antigeenin intensiteetti koko kentän.

fosforylaatio WWOX Src tulokset sitoutumisessa JNK1, p53 ja p73 [31 ] – [33], ja näiden järjestöjen on liittynyt alennettu apoptoosin. Vähentäminen apoptoosin on olennainen askel kasvainten synnyssä [2], ja niiden odotetaan syöpäsoluja kohtaamiseen ei-natiivi solutyyppejä aikana ja metastaasit, ja itse asiassa tämä on suoraan sidoksissa JNK1 toiminto [34]. Koska WWOX ja pWWOX tasot vähennetään viereisen LNCaP-soluissa, päätimme tutkia tasot c-Jun, JNK1 ja p73 samoin. Tulokset näistä proteiineista on esitetty taulukossa 2. Nämä kolme proteiineilla eriasteiset herkkyys läheisyys HUVEC. c-Jun ja JNK1 näytteille vain vähäinen vaikutus, kuten on esitetty useimmissa testeissä osoittavat korkeat p-arvot ja suhteet lähellä 1. p73 näyttää voimakkaampi vaikutus, joka on verrattavissa siihen, mitä havaittiin WWOX ja fosfo-WWOX edellisessä määrityksissä.